Izolace, separace a detekce proteinů a nukleových kyselin a jejich význam VOJTĚCH ADAM

Izolace, separace a detekce proteinů a nukleových kyselin a jejich význam VOJTĚCH ADAM

Životní prostředí

Obranné mechanismy Rostlinná buňka Živočišná buňka 2GS - M M GSH VAKUOLA GSH GSH *Aktivace* PC - M 2GS - M Fytochelatin syntáza M PC - M (γ-glu-cys) n -gly Fytochelatiny MTF-1 MTI MTF-1 MRE (b) MTI MTF-1 (c) (a) M M mrna MT (d) Ionty kovů (M) O. Zitka, et al. (2011) Int. J. Electro. Sci., 192, 794-800. V. Adam, et al. (2010) TRAC-Trends Anal. Chem., 29, 409-418.

I. Genová exprese Obsah II. Rostlinné obranné mechanismy III. Živočišné obranné mechanismy

I. Genová exprese Obsah II. Rostlinné obranné mechanismy III. Živočišné obranné mechanismy

I. Genová exprese Pokročilé materiály v izolaci nukleových kyselin A. Přidání vzorku B. Izolace nukleové kyseliny C. Separace pomocí magnetu D. Promývání E. Ohřev 85 C F. Získání cílové molekuly G. Adsorpce na povrch molekuly H. Promytí I. Měření Referentní elektroda Pracovní elektroda Pomocná elektroda Potenciostat/ Galvanostat D. Huska et al. (2009) Talanta, 79, 402-411.

POTENCIOSTAT GALVANOSTAT Poloautomatická I. Genová exprese Izolace nukleových kyselin Automatická 6 10 11 4 4 5 3 Promývání 3x A 2 7 8 1 D 9 16 B 12 15 C 85 C 14 2 3 13 Promývání 3x A 7 6 5 Elektrochemická detekce potenciostat Elektrochemická detekce Signal D. Huska et al. (2009) Talanta, 79, 402-411.

Výška píku (%) I. Genová exprese Optimalizace elektrochemické detekce nukleových kyselin A B C 100 Square wave voltametrie 95 90 75 80 70 1000 (na) 55 60 Výška píku (%) Výška píku (%) 110 100 90 80-1.3-1.4-1.5-1.6-1.7 Potenciál (V) 35 170 220 270 320 Frekvence (Hz) D E F Výška píku (%) 110 100 90 80 70 60 Výška píku 50 8 6 4 2 0 100 200 300 Doba akumulace (s) y = 0.5302x + 0.1444 R 2 = 0.9901 70 40 35 30 25 20 15 10 Teplota ( C) 50 3.6 3.8 4.2 4.4 4.6 4.8 5 5.2 ph 0 0 5 10 15 Koncentrace poly(a) (µg/ml) D. Huska et al. (2009) Talanta, 79, 402-411.

I. Genová exprese Je separace založená na paramagnetických částicích v kombinaci s elektrochemickou detekcí využitelná pro analýzu reálných vzorků?

I. Genová exprese Izolace mrna z reálného vzorku Kontrolní rostliny 50 mm Cd(II) 105 0 5 10 25 50 100 Aplikovaná koncentrace kadmia (µm) kořen stonek Obsah mrna (%) 70 35 100 mm Cd(II) 0 0 5 10 25 50 100 Aplikovaná koncentrace kadmia (µm) 0 24 48 72 96 120 Doba kultivace (hod.) D. Huska et al. (2009) Talanta, 79, 402-411. D. Huska et al. (2009) Chem. Listy, 103, s167-s171.

I. Genová exprese Obsah II.Rostlinné obranné mechanismy III. Živočišné obranné mechanismy

II. Rostlinné obranné mechanismy Fytochelatiny Sírany Významný rostlinný peptid, který má základní strukturu ( -Glu-Cys) n -Gly. Dipeptidická repetice glutamové Methionin kyseliny a cysteinu ( -Glu-Cys) se cystein může opakovat 2 až 11krát. Molekula glutathionu (γ-glu-cys-gly) Protein je substrátem pro syntézu fytochelatinů. Redukovaný glutathion Hlavní funkce této skupiny peptidů je detoxikace těžkých kovů, která probíhá vazbou na thiolové skupiny peptidu schopnost interakce. Fytochelatin2

II. Rostlinné obranné mechanismy Fytochelatin syntáza 2GS - Cd GSH Cd 2+ VAKUOLA GSH PC - Cd 2GS - Cd GSH FYTOCHELATIN SYNTÁZA PC - Cd (γ-glu-cys) n -gly FYTOCHELATINY γ-glu-cys-gly + γ-glu-cys-gly γ-glu-cys-γ-glu-cys-gly + gly (γ-glu-cys) n=2 gly γ-glu-cys-gly *AKTIVACE* Cd 2+ Cd 2+ FYTOCHELATIN SYNTÁZA γ-glu-cys- γ-glu-cys-γ-glu-cys-gly + gly (γ-glu-cys) n=3 -gly γ-glu-cys-gly n = 4 O. Zitka, et al. (2011) Int. J. Electro. Sci., 6, 1367-1381. n = 5

II. Rostlinné obranné mechanismy Jak komplexně hodnotit reakci rostliny na přítomnost těžkého kovu?

II. Rostlinné obranné mechanismy Tabáková BY-2 buněčná line Kultivace BY-2 buněks přídavkem různých koncentrací Cd(II) iontů během třídenní kultivace v tekutém médiu Murashige and Skoog. 0 µm 5 µm 10 µm 25 µm 50 µm 100 µm Životnost buněk stanovena pomocí esterázové aktivity CelkovýobsahCd(II)vBY-2buňkách stanoven pomocí diferenční pulzní voltametrie Obsah fytochelatinu2 jako produktu fytochelatin syntázy stanoven pomocí vysoce účinné kapalinové chromatografie s elektrochemickou detekcí O. Zitka, et al. (2011) J. Hazard. Mat., 192, 794-800.

II. Rostlinné obranné mechanismy Aktivace fytochelatin syntázy Homogenizace Přídavek redukovaného glutathionu k alikvotům(mm) 0 0.05 0.1 N 2 (l) Fosfátový pufr s trikarboxy(ethyl) fosfinem Centrifugace Supernatant Postup přípravy vzorku 0.2 1.0 2.5 Přídavek Cd + inkubace 30 min. 35 C 5.0 Buňky BY-2 po kultivaci s Cd(II) ionty Vysoce účinná kapalinová chromatografie s elektrochemickou detekcí O. Zitka, et al. (2011) J. Hazard. Mat., 192, 794-800.

II. Rostlinné obranné mechanismy K m fytochelatin syntázy 2.5 2 K m [GSH (mm)] 1.5 1 0.5 0 0 5 10 25 50 100 Koncentrace Cd(II) (µm) O. Zitka, et al. (2011) J. Hazard. Mat., 192, 794-800.

I. Genová exprese Obsah II. Rostlinné obranné mechanismy III. Živočišné obranné mechanismy

III. Živočišné obranné mechanismy Metalothionein protein Intracelulární, nízkomolekulární, na cystein velmi bohatý protein (6 10 kda). Metalothionein se skládá ze dvou vazebných domén α a β. N-terminální část peptidu β-doména; tři vazebná místa pro dvojmocné ionty. C-terminální část peptidu -doména; čtyři vazebná místa pro dvojmocné ionty kovů. Nejčastější repetice: cystein(c) serin(s) cystein(c). Počet aminokyselin 20 9 8 5 5 3 2 2 2 2 1 1 1 β - doména α - doména C S K G A T N E M P D Q I Aminokyseliny (C cystein, S serin, K lysin, G glycin, A alanin, T threonin, N asparagin, E kyselina glutamová, M methionin, P prolin, D kyselina asparagová, Q glutamin, I isoleucin) J. Petrlova, et al. (2006) Electrochim. Acta, 51, 5112-5119.

III. Živočišné obranné mechanismy Detoxikace těžkých kovů těžké kovy (Zn, Cd, Pb, Cu?) (a) MT (f) (e) ledvina vyloučení fosforylace?? MTF-1 MTI MTF-1 MRE (b) MTI MTF-1 (c) jádro cytoplasma MT mrna (d) (a) Vstup iontů kovu do buňky. (b) Ionty interagují s inhibitorem syntézy metalothioneinu (MTI). (c) Spuštění transkripčního faktoru (MTF-1) spojeného s metaloresponsivním elementem (MRE). (d) (e) Syntéza mrna pro translaci MT. MT se váží ion těžkých kovů, komplex MT-iont těžkého kovu je transportován do ledviny nebo k regulačním proteinům závislým na těžkém kovu (f). V. Adam, et al. (2010) TRAC-Trends Anal. Chem., 29, 409-418.

III. Živočišné obranné mechanismy Jak studovat úlohu tohoto proteinu v buňce?

III. Živočišné obranné mechanismy Tepelná denaturace a přenosová technika 15 min. kapka vzorku po tepelné denaturaci visící rtuťová kapková elektroda parafilm mikroskopické sklo 2 C Co(II) Adsorpce při 10 C 250 na RS 2 Co Cat1 Cat2 Co1-0.3 0.8 1.3 1.8 Potenciál (V) Uhlíková elektroda Brdičkova reakce Ag/AgCl/ 3M KCl omývání J. Petrlova, et al. (2006) Electrochim. Acta, 51, 5112-5119. V. Adam, et al. (2008) Sensors, 8, 2293-2305.

III. Živočišné obranné mechanismy Cisplatina a buněčné linie A B a Mateřská linie b Rezistentni linie c UKF-NB4 rezistentní k cisplatině 100 na sken 1 µg cddp/ml media 0 µg cddp/ml media MT 300 ng n.d. MT 300 ng MT v buněčném extraku MT 300 ng n.d. C D E Množství MT (%) Množství MT (%) Množství MT (%) Buněčná linie Koncentrace cisplatiny (µm) Koncentrace karboplatiny (µm) I. Fabrik, et al. (2008) Electroanalysis, 20, 1521-1532.

III. Živočišné obranné mechanismy Pokročilé materiály v izolaci metalothioneinu A. Navázání protilátek B. Přidání vzorku C. Izolace cílové molekuly D. Separace pomocí magnetu E. Promývání F. Ohřev G. Získání cílové molekuly H. Adsorpce na povrch molekuly I. Promytí J. Měření Referentní elektroda Pracovní elektroda Pomocná elektroda Potenciostat/ Galvanostat M. Masarik et al. (2011) Electrophoresis, 32, 3576-3588.

III. Živočišné obranné mechanismy Optimalizace postupu izolace Normalizovaný signál (%) Normalizovaný signál (%) Normalizovaný signál (%) Normalizovaný signál (%) Myší IgG Králičí IgG Vzorek Čas (min.) 22Rv1 Teplota ( C) ph M. Masarik et al. (2011) Electrophoresis, 32, 3576-3588.

III. Živočišné obranné mechanismy Analýza prostatické buněčné linie 22Rv1 Metalothionein/viabilita (%) MT mrna Koncentrace Cd(II) (µm) Lyzát: tepelný Lyzát: RIPA Koncentrace Cd(II) (µm) Metalothionein/viabilita (%) MT mrna Koncentrace Cu(II) (µm) Lyzát: tepelný Lyzát: RIPA Koncentrace Cu(II) (µm) M. Masarik et al. (2011) Electrophoresis, 32, 3576-3588.

Shrnutí Multi-instrumentální přístup Nové materiály založené na nanotechnologiích In situ a on line detekce Praktické aplikace

Pedagogický rozvoj oborů vyučovaných na Agronomické fakultě Využití moderní a robustní analytické, biochemické a biologické instrumentace v základní výuce Anorganické a Analytické chemie a Biochemie. Unikátní přístroje ve specializovaných chemických a biochemických předmětech (Bioanalytická chemie, Biotechnologie životního prostředí, Biosenzory, Biochemické pokročilé praktikum). Bakalářské a diplomové práce.

Pedagogický rozvoj oborů vyučovaných na Agronomické fakultě Odborné vedení Moderní instrumentace Nadaní studenti Biotechnologie rostlin Biotechnologie živočichů Zootechnika Chemie a technologie potravin Jakost a zdravotní nezávadnost potravin Pedagogický rozvoj

Pedagogický rozvoj oboru Zemědělská chemie na Agronomické fakultě Výchova mladých vědeckých pracovníků Rozvoj izolačních a separačních postupů založených na pokročilých materiálech. Lab-on-chip technologie, aplikace in situ. Praktická aplikace, studium biochemických procesů v organismech všech úrovní.

Vědecký rozvoj oboru Zemědělská chemie na Agronomické fakultě Základní výzkum (grantové projekty národní i evropské) GA ČR 522/07/0692 Studium tvorby thiolových sloučenin u rostlin uplatnění při remediačních technologiích EU 7H10021 MAS, Nanoelectronics for mobile AAL-Systems Zemědělská chemie Aplikovaný výzkum NAZV QI91A032 Výběr rezistentních genotypů meruněk k PPV s tržní kvalitou plodů Zahraniční spolupráce John Innes Institute (Prof. Kopřiva) The estación experimental del Zaidín (Dr. Ferrol)

Pedagogický a vědecký rozvoj oboru Zemědělská chemie na Agronomické fakultě In vivo zobrazovací technologie Kvantová tečka quantum dot, ohraničená oblast polovodiče oprůměru kolem 30 nm a výšce 8 nm, schopná v důsledku nižší energie ve srovnání s energií vodivostního pásu okolního polovodiče vázat elektrony. Důležitou vlastností je také optická schopnost teček se zabarvovat. http://www.carestream.com Intenzita signálu > 100 000 Excitace (440 nm), Emise (790 nm) kontrola 10 µm 100 µm

PODĚKOVÁNÍ

Prosinec 2005 PODĚKOVÁNÍ Laboratoř metalomiky a nanotechnologií Červen 2007 Duben 2008 Duben 2006 Listopad 2007 Září 2010 Květen 2011 Březen 2009

Děkuji za pozornost