Laboratorní cvičení z lékařské chemie III 1. ročník, všeobecné lékařství Ústav lékařské chemie a biochemie Lékařská fakulta v Plzni, Univerzita Karlova Jméno: Potvrzení o účasti na praktikách Studijní skupina: Datum: (razítko, podpis) Protokol odevzdán dne: Protokol uznán vrácen k přepracování (podpis asistenta)
Před zahájením praktika si vyzvednete klíč od skříňky (stejné, jako v předchozím praktiku, viz. seznam). Bez pláště nebudete do laboratoře vpuštěni/ny. 3 pracoviště (skupiny úloh) na zvládnutí úloh na každém pracovišti je vymezen čas 45 minut PO SKONČENÍ PRÁCE NA KAŽDÉM PRACOVIŠTI VYPLÁCHNĚTE LABORATORNÍ SKLO TEPLOU VODOU A VRAŤTE NA MÍSTO Náplň laboratorního cvičení: a) kolorimetrické měření ph - univerzálním indikátorovým papírkem - papírkem "MULTIPHAN" - pomocí acidobazického indikátoru a srovnávacích pufrů b) demonstrace funkce pufrů - demonstrace odolnosti roztoků pufrů ke změnám ph (v porovnání s nepufrovaným roztokem) c) pufrovací schopnost acetátového pufru - nalezení ph, při kterém má acetátový pufr nejlepší pufrovací schopnost Po dokončení práce po sobě ukliďte pracovní místo (uveďte do původního stavu), což potvrdí laborantka razítkem na čelní stranu protokolu! Potom, před odchodem, požádejte asistentku/asistenta o stvrzení účasti jejím/jeho podpisem! Vraťte zapůjčený klíč od skříňky (pověste jej na desku u dveří)
a) Kolorimetrické měření ph Acidobazické indikátory (ph indikátory) jsou látky, jejichž zbarvení závisí na ph roztoku, ve kterém se nacházejí. Bývají to slabé kyseliny nebo slabé baze, jejichž konjugované formy se liší barvou. Ve vodném roztoku se ustavuje rovnováha HI H + + I - Množství přítomné nedisociované formy HI a disociované formy I - je určeno ph roztoku, do kterého byl indikátor přidán. Toho můžeme využít pro měření ph. Henderson-Hasselbalchova rovnice pro tento systém: [ I - ] ph = pk i + log [HI] Formy HI a I - mají různou barvu, tedy absorbují světlo různých vlnových délek, což je způsobeno rozdíly v jejich molekulární struktuře. Změny ph jdou ruku v ruce se změnami poměru [I - ] / [HI] a tedy i se změnou pozorované barvy. Změnu barvy lze rozlišit lidským okem, je-li přítomno alespoň 10% jedné z forem indikátoru. K výrazným barevným změnám daného indikátoru tedy dochází jen v relativně úzkém rozmezí kolem pk i. methylová červeň ph = pk i ± 1 Univerzální indikátorové papírky většinou pokrývají celý rozsah stupnice 0 14 ph jednotek, ale mají nízkou přesnost, 0,5 1 ph jednotky. Papírky o středním rozsahu poskytují přesnost 0,3 0,5 jednotek ph a papírky o úzkém rozsahu až 0,2 0,3 ph jednotky. Papírky o úzkém rozsahu jsou často vyráběny pro jasně definované speciální použití, např. měření ph moči. Krajní extrémní hodnoty pro ph moči jsou asi 4,5 8,0. Indikátorový papírek pro tento účel může být cíleně zaměřen jen na toto rozmezí. Úkol: Určete ph vzorku Ve stojánku na pracovním stole je zkumavka označená číslem vzorku, jehož ph máte určit. Zkumavka obsahuje přesně 10,0 vzorku. Úkolem bude určit jeho ph třemi různými metodami (univerální indikátorový papírek, "MULTIPHAN" indikátorový papírek, pomocí indikátoru a srovnávacích pufrů). Pozor - žádný další vzorek nedostanete! Číslo vzorku: 1. univerální indikátorové papírky široký rozsah: 0 12 limitovaná přesnost ( ± 0,5 ph jednotek) Použití univerzálního indikátorového papírku je zcela určitě nejjednodušší způsob, jak zjistit ph. Uchopte kousek univerzálního indikátorového papírku do pinzety a krátce ponořte (asi na 1 sekundu) přímo do zkumavky s neznámým vzorkem, jehož ph máte změřit. Dejte si pozor, aby indikátorový papírek nespadl dolů do zkumavky. Pokud se tak stane, snažte se ho co nejdříve vytáhnout! Papírek je napuštěn indikátory, které se mohou uvolňovat do roztoku a měnit jeho barvu. To by mohlo narušit další měření prováděná se vzorkem. Zbarvení mokrého papírku porovnejte se stupnicí na obalu a odečtěte přibližné ph. ph určené univerzálním indikátorovým papírkem: 1
2. indikátorové papírky "MULTIPHAN" indikační segment porovnávací proužky úzký rozsah ph jednotlivých papírků ale zase lepší přesnost (± 0,2-0,3 ph jednotky) ph rozsah vybraného indikátorového papírku: Balení obsahuje více různých indikátorových papírků, každý určený pro jiné úzké rozmezí ph. Nejdřve je třeba vybrat správný papírek tak, aby ph, které očekáváte, leželo uvnitř jeho rozsahu. Přibližné ph vašeho vzorku už znáte (ph určené univerzálním indikátorovým papírkem). Uchopte vybraný indikátorový papírek do pinzety a ponořte ho krátce (asi na 1 sekundu) přímo do zkumavky s neznámým vzorkem, jehož ph máte změřit. Papírek ponořte tak, aby se všechna políčka dostala do kontaktu s roztokem. Porovnejte barvu indikační zóny uprostřed s barvami porovnávacích proužků po stranách. Hledejte nejlepší shodu. Příslušnou hodnotu ph odečtěte z tabulek přiložených k balení papírků "MULTIPHAN". Do políček opište odpovídající hodnoty ph pro vybraný papírek (z obrázků, které jsou součástí balení "MULTIPHAN"). Označte proužek, jehož barva je nejpodobnější barvě střední indikační zóny ph určené indikátorovým papírkem "MULTIPHAN": 2
3. pomocí acidobazického indikátoru a srovnávacích pufrů Podle tabulky si připravte sadu 8 zkumavek s acetátovým pufrem: Roztoky kyseliny octové (CH 3 COOH) a octanu sodného (CH 3 COONa) potřebné k přípravě pufrů jsou připraveny na pracovním stole v automatických byretách. Tyto roztoky jsou sdíleny se studentem pracujícím na místě "Pufrovací schopnost acetátového pufru". Automatická byreta Při plnění byrety musíte zakrýt prstem tento otvor. Vzduch je balónkem pumpován do zásobní lahve s roztokem, kde se zvyšuje tlak a roztok je vyháněn trubičkou nahoru, kde plní byretu. (Balónkem pumpujte rozumně! Sledujte, co se děje!) Když se roztok v byretě dostane nad nulovou hladinu, uvolněte pomalu prst zakrývající otvor. Hladina v byretě se automaticky nastaví na nulu. Standard číslo V(CH 3 COOH) (100 mmol/l) V(CH 3 COONa) (100 mmol/l) 1 9,0 1,0 2 8,0 2,0 3 7,0 3,0 4 6,0 4,0 5 5,0 5,0 6 4,0 6,0 7 3,0 7,0 8 2,0 8,0 ph Pomocí Henderson-Hasselbalchovy rovnice vypočítejte ph roztoků jednotlivých standardů. ph = pk a + log CH3COONa CH3COOH pk a = 4,75 Přidejte přesně 20 kapek bromkresolové zeleně (acidobazický indikátor) do všech osmi zkumavek. bromkresolová zeleň: oblast barevného přechodu: (kys.) žlutá 3,8 5,4 modrá (zás.) Přidejte přesně 20 kapek bromkresolové zeleně i do zkumavky s neznámým vzorkem. (Zkumavka již obsahuje přesně 10,0 vzorku =stejný objem jako je objem ve zkumavkách s ph standardy) Obsah všech zkumavek (včetně zkumavky s neznámým vzorkem) pečlivě zamíchejte. Uzavřete ústí zkumavky gumovou zátkou a pomalu zkumavku převracejte. Srovnejte barvu zkumavky se vzorkem se srovnávací škálou pufrů o známém ph. Hledejte nejlepší barevnou shodu. Můžete použít komparátor ("kostka s otvory pro zkumavky"). Do jednoho otvoru vložte zkumavku se vzorkem, do vedlejšího vkládejte srovnávací pufry a hledejte barevnou shodu. Barva ve zkumavce se vzorkem je nejpodobnější barvě standardu číslo: ph určené touto metodou: 3
b) Demonstrace funkce pufrů Pufry jsou roztoky, které udržují relativně stálé ph. Přesněji řečeno, ph se mění pouze velmi málo, jeli do roztoku pufru přidáno malé množství silné kyseliny nebo silné zásady. Pufry se vždy skládají ze dvou složek slabé kyseliny a její konjugované baze (nebo ze slabé baze a její konjugované kyseliny). Henderson Hasselbalchova rovnice popisuje chování pufrů, lze ji využít k výpočtům jejich ph: ph = pk a + log ph je určeno: pufrová baze pufrová kyselina kde pk a je záporný dekadický logaritmus disociační konstanty pk a slabé kyseliny, od níž je pufr odvozen poměrem složek pufrová baze / pufrová kyselina V této úloze budete pracovat s "fosfátovým pufrem" složeným z hydrogenfosforečnanu sodného a dihydrogenfosforečnanu sodného. Pomocí Henderson-Hasselbalchovy rovnice spočítejte, jaké objemy roztoků složek musíte smíchat, abyste dostali 10,0 fosfátového pufru o ph = 7,0. pk a = 7,21 Máte k dispozici: roztok hydrogenfosforečnanu sodného roztok dihydrogenfosforečnanu sodného Výpočet: c = 100 mmol/l c = 100 mmol/l Vypočítané objemy složek pufru zaokrouhlete na jedno desetinné místo. Složka Vzorec Potřebný objem () hydrogenfosforečnan sodný dihydrogenfosforečnan sodný Na pracovním místě jsou dvě titrační baňky. Do jedné titrační baňky napipetujte (pomocí skleněné pipety a balónku) přesně 10,0 vody. Do druhé titrační baňky napipetujte přesně vypočítané objemy obou složek fosfátového pufru. Přidejte 2-3 kapky indikátoru (methylová červeň) do obou titračních baněk. methylová červeň je ph indikátor s barevným přechodem: (kys.) červená 4,4 6,2 žlutá (zás.) Byretu naplňte titračním roztokem HCl (c = 0,100 mol/l) a titrujte do barevné změny indikátoru (růžově červená barva). Zaznamenejte objem HCl potřebný k dosažení tohoto bodu. Jak titrovat? To už byste měli sami vědět... Pokud si to nepamatujete: Titrační baňku je vhodné držet v pravé ruce a levou rukou ovládat kohout byrety. Za neustálého míchání pomalu přidávejte titrační roztok ke vzorku v titrační baňce. Neustále sledujte zbarvení roztoku v titrační baňce. Titraci ukončíte v ekvivalentním bodě (poznáte náhlou změnou zbarvení). V případě vody postupujte zvláště opatrně! 4
Objem v titrační baňce ph Objem HCl, který způsobil změnu ph voda 10,0 7.0 fosfátový pufr 10,0 7.0 Závěr: c) Pufrovací schopnost acetátového pufru ph pufru a jeho pufrovací vlastnosti jsou určeny hlavně disociační konstantou kyseliny (pk), od které je pufr odvozený, ale záleží i na poměru baze/kyselina. Nejlepší pufrovací schopnost má pufr při hodnotě ph = pk, v tom případě je poměr pufrová baze/pufrová kyselina = 1. Na pracovním místě máte připraveno 10 titračních baněk. Fixem je očíslujte od 1 do 10 (pokud už nejsou očíslované od předchozích studentů, kteří byli na tomto místě před vámi). Do každé titrační baňky připravte podle tabulky 10,0 acetátového pufru: Roztoky kyseliny octové (CH 3 COOH) a octanu sodného (CH 3 COONa) potřebné k přípravě pufrů jsou připraveny na pracovním stole v automatických byretách. Práce s automatickou byretou je popsána v části "Kolorimetrické měření ph". Pufr číslo V(CH 3 COOH) (100 mmol/l) 5 V(CH 3 COONa) (100 mmol/l) 1 9,9 0,1 2 9,5 0,5 3 9,0 1,0 4 7,5 2,5 5 6,0 4,0 6 4,0 6,0 7 2,5 7,5 8 1,0 9,0 9 0,5 9,5 10 0,1 9,9 Celkový objem roztoku je stejný ve všech připravených baňkách (10,0 ). Také celková koncentrace pufru je úplně stejná ve všech baňkách (c = 100 mmol/l). Pufry v titračních baňkách se liší v ph. Přidejte 2-3 kapky indikátoru (fenolftalein) do každé z titračních baněk s roztoky pufrů, které jste si připravili. Roztok zůstane bezbarvý. Byretu naplňte titračním roztokem NaOH (c = 0,100 mol/l) a ztitrujte všech 10 roztoků pufrů do barevné změny indikátoru (roztok změní barvu na růžovou). Zaznamenejte zjištěné objemy titračního roztoku NaOH (hodnoty si zapište do přiložené tabulky). V tabulce je zvýrazněn sloupec pro záznam dat, která musíte zjistit v laboratoři (objemy NaOH)! Ostatní sloupce v tabulce mohou být zpracovány i později v klidu doma. Vypočítané hodnoty rozumně zaokrouhlete na stejný počet desetinných míst. Spočítejte látkové množství NaOH, jehož přidáním došlo ke změně ph roztoku pufru, která způsobila barevnou změnu indikátoru během titrace. n(naoh) = c V(NaOH)
Podle Henderson-Hasselbalchovy rovnice vypočítejte ph jednotlivých pufrů. ph = pk a + log CH3COONa CH3COOH pk a = 4,75 Do přiloženého grafu vyneste následující body: osa x ph pufru Do grafu zaneste všech 10 bodů (křížkem nebo kroužkem). osa y látkové množství NaOH zjištěné "titrací" Proložte těmito body optimální plynulou křivku (zakreslete barevnou pastelkou). Ne všechny body musí nutně ležet na křivce! Jak proložit optimální plynulou křivku je ukázáno na obrázku na příkladu hyperbolické křivky. Žádná lomená nebo zvlněná čára spojující body! Pro lepší vyhodnocení je užitečné najít "inflexní bod" získané křivky. Inflexní bod je bod, kde křivka mění zakřivení z konkávního na konvexní (z "vypouklé" směrem nahoru na "vypouklou" směrem dolů) nebo naopak. Využijeme toho, že v inflexním bodě má první derivace extrémní hodnotu (lokální maximum nebo minimum). Pro vynesení první derivace do grafu si nejdříve spočítejte: (poslední dva sloupce napravo v tabulce) ph 1 + ph 2 ph 2 + ph 3 ph n-1 + ph n,,..., (průměrné ph dvou sousedních vzorků) 2 2 2 První diference (změna n(naoh) vztažená na změnu ph): n NaOH / ph n(naoh) 1 - n(naoh) 2 n(naoh) 2 - n(naoh) 3 n(naoh) n-1 - n(naoh) n,,....., ph 2 - ph 1 ph 3 - ph 2 ph n - ph n-1 Do přiloženého grafu vyneste ještě následující body: osa x průměrné ph dvou sousedních vzorků osa y příslušná první diference Těmito body opět proložte optimální plynulou křivku (zakreslete jinou barevnou pastelkou). Najděte maximum této křivky. V grafu barevně vyšrafujte (vybarvěte) oblast ph, ve které je pufr použitelný (tj. oblast ph = pk a 1). Najděte ph, při kterém má acetátový pufr nejlepší pufrovací schopnost: Závěr: 6
Tabulka pro záznam dat Pufr číslo V (CH 3 COOH) (100 mmol/l) V (CH 3 COONa) (100 mmol/l) ph V(NaOH) n(naoh) mmol ph n-1 + ph n 2 n(naoh) n-1 - n(naoh) n ph n - ph n-1 1 9,9 0,1 2 9,5 0,5 3 9,0 1,0 4 7,5 2,5 5 6,0 4,0 6 4,0 6,0 7 2,5 7,5 8 1,0 9,0 9 0,5 9,5 10 0,1 9,9 Hodnoty, které je nutno zjistit v laboratoři 7
n NaOH (mmol) 1,20 Pufrovací schopnost acetátového pufru Grafické vyhodnocení n NaOH / ph 1,20 1,15 1,15 1,10 1,10 1,05 1,05 1,00 1,00 0,95 0,95 0,90 0,90 0,85 0,85 0,80 0,80 0,75 0,75 0,70 0,70 0,65 0,65 0,60 0,60 0,55 0,55 0,50 0,50 0,45 0,45 0,40 0,40 0,35 0,35 0,30 0,30 0,25 0,25 0,20 0,20 0,15 0,15 0,10 0,10 0,05 0,05 0,00 0,00 2,50 2,75 3,00 3,25 3,50 3,75 4,00 4,25 4,50 4,75 5,00 5,25 5,50 5,75 6,00 6,25 6,50 6,75 7,00 ph 8