EXTRAKCE TUHOU FÁZÍ ADSORPČNÍ CHROMATOGRAFIE (LSC) -rozdělení směsi látek (primární extrakt) na sloupci sorbentu ve skleněné koloně s fritou (cca 50 cm x 1 cm) -obvykle jde o selektivní adsorpci nežádoucích látek (lipidy, pigmenty) a následnou eluci analytů vhodným rozpouštědlem -extrakt aplikován v rozpouštědle použitém na přípravu sloupce
EXTRAKCE TUHOU FÁZÍ ADSORPČNÍ CHROMATOGRAFIE (LSC) SORBENTY: - aktivace (odstranění vody žíháním v peci) - deaktivace (standardizace obsahu vody, zeslabení sorpce) Silikagel: SiO 2 x H 2 O, většinou deaktivovaný, slabě kyselý charakter - nevhodný pro separaci silně basických analytů (silná sorpce) někdy impregnace AgNO 3 Florisil: křemičitan hořečnatý, odstranění lipidů a dalších málo polárních látek, před použitím nutná aktivace záhřevem (130 o C, i po vyžíhání)
EXTRAKCE TUHOU FÁZÍ ADSORPČNÍ CHROMATOGRAFIE (LSC) SORBENTY: Oxid hlinitý: dělení nepříliš polárních látek (záchyt pigmentů), obvykle slabě alkalický (ph 10) - může rozkládat estery promytím HCl a H 2 O vznikne neutrální (ph 7,5) - slabší sorpce, kyselý (ph 4,5) -impregnace AgNO 3 Oxid hořečnatý: malá afinita ke sloučeninám s dvojnými vazbami většinou ve směsných sorbentech (s křemelinou) Aktivní uhlí: nepolární sorbent, často ireverzibilní sorpce, odstranění pigmentů
interakce 3 složek: TUHÁ FÁZE-ANALYT-ROZPOUŠTĚDLO CÍL = "DIGITÁLNÍ CHROMATOGRAFIE" a) zádrž analytu, průnik interferencí b) zádrž interferencí, průnik analytu S P E k o l o n k y : Tělo: polypropylen, sklo Frity: 20 µm, polyethylen, ocel Sorbent: převážně silikagel, velikost částic 40 µm, velikost pórů 60 A Objem kolonek: 1, 3, 6 ml Množství sorbentu v kolonce: 100, 500 mg, 1, 2, 5, 10 g Kapacita kolonky: 10-20 mg analytu / g náplně (koextrakty!!) Bod průniku (Breakthrough): sorbent saturován-nezadržuje analyt
MOŽNOSTI APLIKACE SPE (Extrakční módy) A) S e l e k t i v n í e x t r a k c e záchyt analytů, ostatní složky matrice bez zádrže eluce analytů B) S e l e k t i v n í e l u c e záchyt analytů i ostatních složek matrice eluce pouze analytů C) S e l e k t i v n í p r o m ý v á n í záchyt analytů i ostatních složek matrice vymytí interferujících látek (analyty sorbovány) eluce analytů D) O d s t r a n ě n í m a t r i c e záchyt interferencí, analyt prochází bez zádrže
O B E C N Á S P E M E T O D A REALIZACE: podtlak, přetlak, odstředění
O B E C N Á S P E M E T O D A 1. K o n d i c i o n a c e (1-2 ml / 100 mg náplně) vymytí nečistot (stejná síla jako vzorku) převedení do rozpouštědla vzorku (menší nebo stejná síla) SMÁČENÍ POVRCHU KAPALINOU: úhel dotyku menší než 90
O B E C N Á S P E M E T O D A 1. K o n d i c i o n a c e (1-2 ml / 100 mg náplně) vymytí nečistot (stejná síla jako vzorku) převedení do rozpouštědla vzorku (menší nebo stejná síla) 2. A p l i k a c e v z o r k u úprava (ph, iontová síla, ředění, snížení rozpustnosti analytu ve vzorku) objem ( objem odstranění kondic. rozpouštědla účinnost, výtěžnost) průtok (max. 5 ml/min, dostatečný kontakt vzorek / fáze) Objem ovlivňuje: - velikost a typ kolonky - koncentrace analytu - množství interferencí - zádrž analytu sorbentem
O B E C N Á S P E M E T O D A 1. K o n d i c i o n a c e (1-2 ml / 100 mg náplně) vymytí nečistot (stejná síla jako vzorku) převedení do rozpouštědla vzorku (menší nebo stejná síla) 2. A p l i k a c e v z o r k u úprava (ph, iontová síla, ředění, snížení rozpustnosti analytu ve vzorku) objem ( objem odstranění kondic. rozpouštědla účinnost, výtěžnost) průtok (max. 5 ml/min, dostatečný kontakt vzorek / fáze) 3. P r o m y t í (0,5 ml / 100 mg náplně) odstranění koextraktů (stejná nebo větší síla) 4. E l u c e a n a l y t u typ rozpouštědla (podobné rozpouští podobné, snadno odpařitelné) objem rozpouštědla (2 x mrtvý objem, cca 2 x 100 µl / 100 mg sorbentu )
odstranění interferujících látek zakoncentrace analytu skupinové frakcionace DŮVODY PRO POUŽITÍ SPE změna prostředí vzorku (t.j. rozpouštědla) odsolování cíl: odstranění interferencí nebo maximální citlivost (zakoncentrace)
VOLBA ROZPOUŠTĚDEL - "síla" rozpouštědla pro daný systém " s l a b é " rozpouštědlo = sorpce analytu " s i l n é " rozpouštědlo = eluce analytu
VAZEBNÉ INTERAKCE ANALYT - SORBENT A) Hydrofobní interakce - disperzní síly (van der Waals) nepolární fáze, energie 1-10 kcal/mol B) Polární interakce - vodíková vazba, dipól-dipól, polární fáze, energie 5-10 kcal/mol C) Iontové (elektrostatické) interakce - 50-200 kcal/mol VAZEBNÉ ENERGIE
VAZEBNÉ INTERAKCE ANALYT - SORBENT A) Hydrofobní interakce - disperzní síly (van der Waals) nepolární fáze, energie 1-10 kcal/mol interakce mezi nepolárními molekulami v důsledku vzniku indukovaných dipólů - přitažlivé i odpudivé - slabší než vodíková vazba či dipól-dipól interakce
VAZEBNÉ INTERAKCE ANALYT - SORBENT B) Polární interakce - polární fáze, energie 5-10 kcal/mol vodíková vazba mezi molekulami s vodíkem kovalentně vázaným k silně elektronegativnímu prvku (O, N, F) dipól-dipól mezi polárními molekulami s permanentním dipól momentem
VAZEBNÉ INTERAKCE ANALYT - SORBENT C) Iontové (elektrostatické) interakce - 50-200 kcal/mol mezi opačně nabitými skupinami iontoměniče a analytu
Výběr fáze ovlivňuje: - povaha analytu - rozpouštědlo vzorku - typ interferencí FÁZE POUŽÍVANÉ PRO SPE Nejlepší retence analytů: polarita analytu podobná polaritě fáze interference méně polární než analyt - normální fáze interference polárnější než analyt - reverzní fáze
A) N o r m á l n í f á z e - polární FÁZE POUŽÍVANÉ PRO SPE silikagel, oxid hlinitý, Florisil, polárně modif. silikagel (CN, diol, NH 2 ) B) R e v e r z n í f á z e - nepolární nepolárně modif. silikagel (C 18, C 8, C 4, CH, PH, CN) C) I o n t o m ě n i č e ANEX - silikagel s chemicky vázaným kladně nabitým modifikátorem (kvarternární amin, sekund. amin) KATEX - silikagel s chemicky vázaným záporně nabitým modifikátorem (benzen- či propylsulfonová kys.)
FÁZE POUŽÍVANÉ PRO SPE
SYNTÉZA CHEMICKY VÁZANÝCH SORBENTŮ SILIKAGEL + DERIVATIZAČNÍ ČINIDLO SILOXANY Derivatizační činidla : mono- až tri- halo či alkoxy silyl deriváty alkylchlorsilany
SYNTÉZA CHEMICKY VÁZANÝCH SORBENTŮ SILIKAGEL + DERIVATIZAČNÍ ČINIDLO SILOXANY Derivatizační činidla : mono- až tri- halo či alkoxy silyl deriváty alkylchlorsilany
OMEZENÍ SORBENTŮ NA BÁZI SILIKAGELU
OMEZENÍ SORBENTŮ NA BÁZI SILIKAGELU TRIMETHYLCHLORSILAN
OMEZENÍ SORBENTŮ NA BÁZI SILIKAGELU
OMEZENÍ SORBENTŮ NA BÁZI SILIKAGELU SILIKAGEL (normální fáze): silná sorpce velmi polárních sloučenin (glycerol) použití modifikovaných silikagelů (slabší retence) C18 (reverzní fáze): neselektivní, někdy příliš silné sorpce použití fází s polárnějšími modifikátory (C 8, C 4 ) část koextraktů projde bez zádrže POUŽITÍ FÁZÍ NA BÁZI PS-DVB: bez silanolů stabilní v širokém rozmezí ph lepší zádrž polárnějších analytů
TRENDY VE VÝVOJI SORBENTŮ PRO SPE Merck: 3 typy sorbentů na bázi C18 lišící se modifikací silikagelového nosiče porovnání na základě kapacity pro hydrofilní (kofein) a lipofilní (diisodecylftalát) látky (Kapacita = mg analytu / g sorbentu)
TRENDY VE VÝVOJI SORBENTŮ PRO SPE Waters: OASIS TM HLB hydrofilně-lipofilní sorbent kopolymer N-vinylpyrrolidonu (zvyšuje smočitelnost vodou) a divynylbenzenu (RP) -vyschnutí nesnižuje výtěžnost (automatizace) - větší stabilita ve větším rozsahu ph (x C18) - vyšší retence hlavně pro polární látky (x C18) - univerzální (i pro polární a zásadité analyty)
TRENDY SMĚSNÉ SORBENTY Supelclean TM ENVI-Carb II / PSA SPE - retence RP + ANEX chemický filtr odstranění klíčových interferencí při analýze pesticidů vrstva A Supelclean TM ENVI-Carb II: - neporézní grafitizovaný uhlík - plocha povrchu 100 m 2 /g - afinita k planárním molekulám - záchyt pigmentů (chlorofyl, karotenoidy) a sterolů vrstva A Supelclean TM PSA: - N-propyl ethylendiamin (primární-sekundární amin) - záchyt mastných kyselin, cukrů, polárních pigmentů
TRENDY VE VÝVOJI SORBENTŮ PRO SPE Carbograph - grafitizovaný uhlík retence RP + ANEX - neporézní, nepolární - plocha povrchu až100 m 2/ g (záhřev sazí na 2700 3000 C v inertní atmosféře) - povrch obsahuje kyslíkaté sloučeniny interagující s kyselými sloučeninami (separace od zásaditých a neutrálních bez úpravy ph) - kvantitativní extrakce i velmi polárních sloučenin z velkých objemů
IONTOMĚNIČE extrakce kyselin a zásad z vodných roztoků podle zásad iontové výměny (interakce nabitého analytu a opačně nabitého ionexu)
IONTOMĚNIČE ph - analyty musí být ionizovány - podle pk a analytu, ph se upravuje 2 jednotky nad či pod pk a (octová kyselina 4,75 cyklohexylamin 10,66) síla protiiontu KATEX : Li+, H+, Na+, NH4+...snadno nahraditelné Cu 2+, Ca 2+, Ba 2+...obtížně nahraditelné ANEX : OH -, F -...snadno nahraditelné HSO 3-, NO 3-, CN -, Cl -...obtížně nahraditelné iontová síla - celková koncentrace iontů ve vzorku - soutěž s analytem o místa na iontoměnči
IONTOMĚNIČE
IONTOMĚNIČE TYKADLOVÉ (tentacle) funkční skupiny umístěny podél pohyblivého, kovalentně vázaného řetězce složeného z 5-20 monomerních jednotek (XXX u klasických iontoměničů jsou funkční skupiny zakotveny přímo na nosič v rigidní pozici) dobrá přístupnost analytů k funkčním skupinám = rychlý přenos hmoty, vysoká kapacita, malé objemy elučních rozpouštědel