RIZIKOVÉ FAKTORY REKURENTNÍHO A TĚŽKÉHO PRŮBĚHU KOLITIDY VYVOLANÉ INFEKCÍ CLOSTRIDIUM DIFFICILE

MASARYKOVA UNIVERZITA LÉKAŘSKÁ FAKULTA KLINIKA INFEKČNÍCH CHOROB RIZIKOVÉ FAKTORY REKURENTNÍHO A TĚŽKÉHO PRŮBĚHU KOLITIDY VYVOLANÉ INFEKCÍ CLOSTRIDIUM DIFFICILE Disertační práce v oboru Vnitřní nemoci Školitel: Prof. MUDr. Petr Husa, CSc. Autor: MUDr. Lenka Vojtilová Brno, 2013 ddddddd 1

Anotace Kolitida vyvolaná infekcí Clostridium difficile představuje, vzhledem ke stoupajícímu počtu hlášených případů, významný zdravotnický problém ve vyspělých zemích. Na vzestupu je nejen incidence, ale i závažnost onemocnění, mortalita, počet léčebných selhání a rekurencí. Od roku 2003 jsou ve vyspělých zemích Ameriky, Evropy a Asie referovány epidemie infekce vyvolané C. difficile a v nemocnicích jsou identifikovány tzv. epidemické kmeny C. difficile. Infekce vyvolaná C. difficile je nyní nejčastější příčinou nozokomiálních infekčních průjmů u dospělých ve vyspělých zemích. Stoupající náklady spojené s prevencí, diagnostikou a léčbou této infekce jsou značnou finanční zátěží pro zdravotnictví. C. difficile patří k běžným komenzálům sliznice tlustého střeva člověka i zvířat, včetně toxigenních kmenů. K rozvoji infekce dochází jen za určitých okolností. Rizikové faktory vzniku onemocnění jsou dobře popsané, patří k nim střevní dysmikrobie po předchozím užívání antibiotik, věk pacienta nad 65 let, polymorbidita, poruchy celkové a zejména střevní slizniční imunity. Předchozí hospitalizace významně ohrožuje pacienta kolonizací nemocničními kmeny C. difficile. Méně jsou však popsány faktory disponující k rekurentnímu nebo těžkému průběhu klostridiové kolitidy, které jsou spojené s nepříznivou prognózou pro pacienta. Tato práce je zaměřena na identifikaci faktorů vedoucích k rekurentímu nebo těžkému průběhu kolitidy vyvolané infekcí C. difficile. 1

Annotation The colitis caused by Clostridium difficile infection represents a major health problem in the developed countries due to the increasing number of the reported cases. Not only is the incidence increasing, but on the rise it is also the severity of the disease, mortality, the number of treatment failures and relapses. Since 2003, in the developed countries of America, Europe and Asia are refered epidemics caused by C. difficile, in hospitals are identified the epidemic strains of C. difficile. The infection caused by C. difficile is now the leading cause of nosocomial infectious diarrhea in adults in the developed countries. The rising costs associated with prevention, diagnosis and treatment of this infection are a significant financial burden on the health care. C. difficile, including its toxigenic strains, is a common commensal of colonic mucosa in humans and animals. The infection occurs only under certain circumstances. The risk factors for developing of the disease are well described, these include intestinal dysmicrobia prior to antibiotic use, the patient age over 65, comorbidity, disorders of the immune system and mucosal immunity. The previous hospitalization threatens the patients with a significant risk of colonization with hospital C. difficile strains. Less known are factors determining relapsing or the severe course of CDI, which are associated with the unfavourable prediction for the patient. The focus of this work is to identify the factors leading to relapsing or severe colitis caused by CDI. 2

Prohlašuji, že jsem disertační práci vypracovala samostatně pod vedením prof. MUDr. Petra Husy, CSc. s využitím zdrojů uvedených v soupisu literatury.... podpis autora 3

Poděkování Chtěla bych poděkovat svému manželovi a dětem za podporu a trpělivost, kterou mi věnovali v průběhu přípravy této práce. Dále pak děkuji vedení Kliniky infekčních chorob Fakultní nemocnice Brno za podporu a vytvoření optimálních pracovních podmínek k plnění úkolů plynoucích z doktorského studijního programu. Paní MUDr. Michaele Freibergerové, vedoucí lékařce Oddělení 5 Kliniky infekčních chorob, děkuji za odborné rady z klinické praxe a obrazovou dokumentaci. Paní MUDr. Janě Juránkové, Ph.D., vedoucí lékařce Oddělení klinické mikrobiologie Fakultní nemocnice Brno, děkuji za poskytnutí souhrnných mikrobiologických výsledků. Panu prof. MUDr. Petru Husovi, CSc., mému školiteli, děkuji za četné konzultace, připomínky, rady, vedení a pomoc. MUDr. Lenka Vojtilová 4

Obsah 1. Úvod... 7 2. Kolitida vyvolaná Clostridium difficile... 9 2.1 Historie... 9 2.2 Krátká charakteristika rodu Clostridium... 9 2.3 Faktory virulence C. difficile... 9 2.4 Epidemický hypervirulentní kmen NAP1/027... 11 2.5 Epidemiologie C. difficile s důrazem na hypervirulentní kmen NAP1/027... 12 2.6 Epidemiologie C. difficile v Evropě a v České republice... 14 2.7 Zoonotický potenciál infekce C. difficile... 17 2.8 Rizikové faktory vzniku CDI... 17 2.8.1 Antibiotika... 17 2.8.2 Enviromentální rizika - nemocniční prostředí a dezinfekční prostředky... 18 2.8.3 Inhibitory protonové pumpy... 19 2.8.4 Imunita a polymorbidita pacienta... 19 2.9 Klinická charakteristika CDI a laboratorní nálezy... 20 2.10 Definice těžkého průběhu klostridiové kolitidy... 22 2.11 Diagnostika... 25 2.12 Rekurence CDI... 32 2.13 Terapie CDI a nové terapeutické aspekty... 33 2.13.1 Obecná terapeutická doporučení... 33 2.13.2 Metronidazol vs. vancomycin... 33 2.13.3 Standardní medikamentózní léčba... 35 2.13.4 Další možnosti terapie CDI... 36 2.13.5 Léčiva, u kterých je efekt přehodnocen... 38 2.14 Prevence vzniku a šíření CDI... 38 3. Cíl práce... 40 4. Materiál a metodika... 41 4.1 Soubor sledovaných osob... 41 4.1.1 Zařazující kritéria... 41 4.1.2 Kritéria pro nezařazení... 41 4.1.3 Definice rekurence... 41 4.1.4 Definice těžkého průběhu... 41 4.2 Mikrobiologické vyšetření... 42 4.3 Statistické vyhodnocení... 42 5. Výsledky... 43 5.1 Charakteristika souboru... 43 5.2 Komorbidity a konkomitantní medikace... 45 5.3 Nemocniční prostředí... 46 5.4 Vyvolávající antibiotika... 48 5.5 Terapie CDI... 49 5.6 Komplikace... 51 5.7 Výsledky statistické analýzy rizikových faktorů... 52 5.7.1 Rizikové faktory pro vznik rekurence CDI... 52 5.7.2 Rizikové faktory pro vznik těžkého průběhu CDI... 61 6. Diskuze... 65 7. Závěr... 69 7.1 Shrnutí... 71 8. Literatura... 73 5

9. Seznam zkratek... 81 10. Seznam obrázků... 83 11. Seznam tabulek... 84 12. Seznam příloh... 85 13. Seznam odborných publikací autora... 86 14. Souhrn poznatků disertační práce... 87 6

1. Úvod Postantibiotické průjmy jsou v medicíně známé již desítky let. Působením antibiotik dochází k porušení střevní mikroflóry a může nastat přemnožení původních komenzálů sliznice tlustého střeva. Původcem následných průjmů mohou být kvasinky, kmeny stafylokoků nebo klostridií. Kolitida vyvolaná bakterií Clostridium difficile je způsobená pouze jejími toxigenními kmeny. Může probíhat jako banální průjmové onemocnění nebo těžká kolitida s fatálními komplikacemi jako je ileus nebo toxické megakolon. Někdy má nemoc rekurentní průběh, kdy vícečetné ataky kolitidy postupně vyčerpávají pacienta. Diagnóza je potvrzena průkazem toxigenního kmene C. difficile ze stolice pacienta (pokud není prokázána jiná příčina průjmového stavu) nebo kolonoskopickým obrazem pseudomembranózní kolitidy. Onemocnění je potenciálně nakažlivé, spóry klostridií ve stolici vylučované nemocným kontaminují nemocniční prostředí a mohou být zdrojem infekce pro další pacienty. Možný je i komunitní přenos infekce. Názvosloví onemocnění vyvolaného infekcí C. difficile není jednotné. V české literatuře je zaužíván název kolitida vyvolaná C. difficile. V anglosaské literatuře se nemoc označuje širším pojmem Clostridium difficile infection (CDI). V zahraničních publikacích vydaných před rokem 2000 se setkáme s termínem Clostridium difficile -associated diarrhea (CDAD). Pseudomembranózní kolitida není synonymem klostridiové kolitidy, přestože se rozvinutá CDI projevuje rozvojem pablán na sliznici tračníku, které jsou detekovatelné endoskopicky. Tyto však nejsou přítomny v každé fázi CDI, navíc pseudomembranózní zánět střeva může mít i jinou příčinu. V éře moderní medicíny s rozsáhlým užíváním širokospektrých antibiotik, rostoucí řadou imunokompromitovaných, polymorbidních pacientů roste počet onemocnění CDI. V posledních letech stoupá nejen incidence, ale i závažnost onemocnění, mortalita a počet léčebných selhání. Od roku 2003 jsou ve vyspělých zemích Ameriky, Evropy a Asie referovány epidemie CDI a v nemocnicích jsou identifikovány tzv. epidemické kmeny C. difficile. CDI je nyní nejčastější příčinou nozokomiálních infekčních průjmů u dospělých ve vyspělých zemích. V České republice je rovněž zaznamenán vzestup počtu případů CDI [1, 2]. Prevence, diagnostika a léčba CDI se stává pro zdravotnictví značnou finanční zátěží, nemocnice ve Spojených státech odhadují náklady spojené s CDI na jeden až tři miliardy dolarů ročně [3]. Náklady na léčbu jedné epizody CDI se pohybují od 2500 do 9000 7

amerických dolarů [4]. Na zlepšení diagnostiky a léčby této nemoci se proto soustřeďuje značný vědecký potenciál. Infektologické společnosti publikují doporučené postupy pro lékaře přicházející do styku s CDI, epidemiologové a management nemocnic se zaměřují na prevenci jejího vzniku a šíření. 8

2. Kolitida vyvolaná Clostridium difficile 2.1 Historie Historie prvních popsaných postantibiotických průjmů se datuje již na začátek éry antibiotik. První zmínka o C. difficile jako původci pseudomembranózní kolitidy pochází z roku 1978, toxiny A a B byly popsány o tři roky později. Je potřeba si uvědomit, že ne všechny postantibiotické průjmy jsou spojené s infekcí C. difficile (jen 1/3 případů). Další příčinou může být přemnožení Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens nebo kvasinek na úkor střevní mikroflóry. V 70. letech byl jako příčina postantibiotických průjmů nejvíce obviňován klindamycin, v 80. letech v souvislosti s rozšířením jejich užívání to byly cefalosporiny. V posledních letech hrají důležitou roli v patogenezi postantibiotického průjmu a průjmu spojeného s C. difficile chinolony [5, 6]. 2.2 Krátká charakteristika rodu Clostridium Klostridie jsou grampozitivní sporulující anaerobní tyčky, které se vyskytují ve dvou formách: vegetativní a klidové (spory). V přírodě jsou hodně rozšířené, vyskytují se v půdě, v bahně sladkovodních toků i moří, v prachu, na rostlinách. U živočichů a člověka jsou některé druhy komenzálem v tlustém střevě. Patří mezi saprofyty. Jen málo druhů se může uplatnit jako patogen u lidí, jsou to druhy, které jsou schopny produkovat exotoxiny. Toxiny se do prostředí uvolňují buď plynule při množení klostridií, nebo až při rozpadu buněk. Klostridie vyvolávají tři typy onemocnění: neurointoxikace (C. tetani, C. botulinum), nekrotizující toxoinfekce měkkých tkání (C. perfringens, C. novyi, C. septicum, C. histolyticum a jiné, méně časté druhy) a toxoinfekce střev (C. difficile, C perfringens) [7]. 2.3 Faktory virulence C. difficile C. difficile patří mezi středně striktně anaerobní klostridie. Ve střevě sporuluje vydatně, in vitro je sporulace máločetná. Spory jsou sice jen málo termorezistentní, ale umožňují několikaměsíční přežívání spor v prostředí a jejich další šíření. Genom C. difficile je již kompletně zmapován. Vegetativní forma produkuje dva termolabilní proteinové toxiny, toxin A a toxin B, v české literatuře jsou někdy označovány jako enterotoxin a cytotoxin. Jsou kódované geny tcda pro toxin A a tcdb pro toxin B. Spolu se dvěma regulačními geny (tcdc a tcdd) a porinovým genem (tcde) tvoří chromozomový lokus patogenity (PaLoc). Exprese 9

genů tcda a tcdb je řízena principem down-regulace tcdc genem. Polymorfizmus nebo parciální delece tcdc může vést k výraznému vzestupu produkce toxinu A a B [8, 9]. Mnoho let se vedou diskuse o tom, který z toxinů je více odpovědný za příznaky onemocnění CDI u lidí. Toxiny A a B mají z 66 % podobnou strukturu a podobnou enzymovou aktivitu, toxin A má jiný buněčný tropismus a obecně má nižší cytotoxickou aktivitu než toxin B. V protikladu k tomu toxin A způsobuje u pokusných hlodavců zánět střeva mnohem efektivněji než toxin B, předpokládá se však, že receptory pro toxin B jsou u zvířat mnohem méně exprimovány než u lidí. Od pacientů s CDI nebyly nikdy izolovány kmeny klostridií toxin A+, B-, naproti tomu kmeny A-, B+ jsou izolovány rutinně (0,2 až 97 % v závislosti na lokalitě). Izoláty toxin A-, B+ způsobují stejné příznaky onemocnění jako kmeny toxin A+, B+, navíc často s mnohem těžším průběhem [10]. V laboratorních podmínkách lze genovou mutací inaktivovat geny pro oba toxiny, vznikne tak mutantní kmen s plně oslabenou virulencí. Recentní práce však znovu poukazují na význam obou toxinů v patogenezi onemocnění [11]. Podle nových poznatků patří toxin A a B mezi glukosylující toxiny, které přenáší glykosylové zbytky na Rho GTP-ázy, kovalentně je modifikují a inaktivují. Následkem je disagregace aktinového cytoskeletu, zaokrouhlení buňky, inhibice dělení a buněčná smrt, která vede ke ztrátě funkce střevní epiteliální bariéry. Toxiny dále stimulují uvolňování prozánětlivých cytokinů (IL-1β, TNF-α, IL-8) z epiteliálních buněk, to vede k influxu neutrofilů a další destrukci střevní bariéry. Vzestup neutrofilů v periferní krvi koreluje se špatnou prognózou CDI [3]. Toxiny A a B jsou velké 308 a 270 kda, patří do skupiny velkých klostridiových toxinů. Jejich N-konec tvoří glukosyltransferázová doména, odpovídající za aktivitu toxinu, C-konec je receptorová doména, kterou se toxiny vážou na buňky hostitele. I když konkrétní buněčné receptory těchto toxinů nejsou u lidí dosud známy, předpokládá se, že se mohou vázat na různé receptory cílových buněk. V oblasti receptorového C-konce obou toxinů existuje velká diversita, pozorována je zejména u toxinu B hypervirulentních kmenů. Z toho se usuzuje, že hypervirulentní kmeny mohou intoxikovat širší spektrum buněčných typů střeva [3, 12]. Za přenesení glukosylového konce toxinu do buňky odpovídá translokační oblast toxinu, která částečně funguje jako ph sensor. Neutrální ph její aktivitu inhibuje, nízké ph umožňuje přenos aktivního konce toxinu do buňky. Hypervirulentní kmeny produkují toxin B, který je schopen proniknout do buněk i při vyšším ph než toxiny historických kmenů. To 10

vysvětluje rychlejší kinetiku vstupu toxinu do buněk a větší cytotoxicitu hypervirulentních kmenů [3, 12]. Nově byl popsán binární toxin, neboli C. difficile transferáza, který je kódován geny cdta a cdtb, mimo uvedený lokus patogenity. Binární toxin je příbuzný toxinům jako je iota toxin C. perfringens a C2 toxin C. botulinum. Je to vlastně ADP-ribosyltransferáza, která blokuje polymerizaci aktinu, což opět vede k rozpadu aktinového cytoskeletu buňky a v jeho důsledku k buněčné smrti. Binární toxin navíc indukuje vytváření zvláštních výčnělků z mikrotubulů ve tvaru sítě na povrchu epiteliálních buněk, které zvyšují adherenci bakterií na povrch střevní sliznice. Role binárního toxinu v patogenezi CDI není zatím zcela objasněná. U hypervirulentních kmenů se geny pro binární toxin vyskytují mnohem častěji než u ostatních kmenů C. difficile. U zvířecích modelů infekce ale kmeny toxin A-, B- s pozitivním binárním toxinem nezpůsobují infekci i přes vysoké procento kolonizací. Epidemiologické analýzy však potvrzují, že kmeny produkující binární toxin způsobují onemocnění s úmrtností vyšší o 60 % [3]. Další faktory virulence se uplatňují při adherenci mikroorganizmů a kolonizaci střeva. Patří k nim proteiny S vrstvy (Cerquetti a kol., 2000), protein buněčné stěny Cwp66 (Waligora a kol., 2001), GroEL (Hennequin a kol., 2001), Fbp68 fibronektin vážící protein (Hennequin a kol., 2003) a FliC-FliD, komponenty flagely (Tasteyre a kol., 2001). Proteiny S vrstvy se podílejí na patogenitě porušením jemné rovnováhy prozánětlivých a regulačních cytokinů v monocytech a dentritických buňkách. Cwp84, cysteinová proteáza, přispívá k poškození integrity tkáně a disseminaci infekce [8, 9, 13, 14]. 2.4 Epidemický hypervirulentní kmen NAP1/027 Od roku 2002 je ve vyspělých zemích Severní Ameriky, Evropy a Asie referována vyšší incidence CDI s mnohem těžším průběhem onemocnění, vyšší letalitou, tendencí k relapsům, delší dobou hospitalizace a zvýšenými náklady na léčbu. Tyto epidemie jsou spojeny predominantně s infekcí jedním kmenem C. difficile, v literatuře uváděným jako NAP1 (North American pulsed-field type 1) podle specifického sledu linií, které vytváří při pulzní gelové elektroforéze (PFGE). Obsahuje ale nejméně další dva typy (NAP1a a NAP1b), které jsou shodné z 94 %. Poprvé byl kmen NAP1 izolován v Kanadě, vzápětí i ve Spojených státech a Evropě. Na základě PCR (polymerase chain reaction) ribotypizace je NAP1 označen jako ribotyp 027. Existuje více než 150 ribotypů C. difficile. Dalším způsobem identifikace je typizace pomocí PCR-REA (restriction endonuclease analysis), kde je kmen NAP1 ribotyp 11

027 řazen do toxinotypu III. Toxinotypů C. difficile je dosud popsáno kolem 25, jaká je jejich souvislost s potenciální virulencí kmene ještě není prokázáno [6, 15, 16]. Kmen NAP1/027 je hypertoxigenní, má schopnost epidemického šíření vzhledem k větší odolnosti jeho spor k běžným dezinfekčním prostředkům a vysokou rezistencí vůči různým antibiotikům. Kmen NAP1/027 má deleci 18 párů bazí a deleci na 117. místě tcdc genu, které ochromením down-regulace produkce toxinů A a B vedou k 16 až 23násobnému vzestupu jejich produkce oproti kontrolním kmenům toxinotypu 0. Epidemický kmen produkuje binární toxin, který byl v historických vzorcích klinických izolátů před rokem 2001 detekován jen v 6 % [9]. Dále je popisované rozšíření rezistence na nové chinolony, které se suponuje za hlavní příčinu širokého rozšíření NAP1/027. Navíc, jako i ostatní epidemické kmeny, má ve srovnání s neepidemickými kmeny tendenci k hypersporulaci, která umožňuje dlouhodobé přežívání v prostředí a gastrointestinálním traktu. Vzhledem k rezistenci spor k běžným dezinfekčním prostředkům je tímto umožněno přežívání bakterií a šíření infekce v nemocničním prostředí [6, 16, 17]. 2.5 Epidemiologie C. difficile s důrazem na hypervirulentní kmen NAP1/027 Jak bylo již zmíněno, klostridie jsou běžným komenzálem sliznice tlustého střeva. Osídlení C. difficile se u lidí během života a v závislosti na prostředí mění. Zhruba u poloviny novorozenců (15 70 %) se C. difficile, včetně toxigenních kmenů, vyskytuje jako součást střevní flóry. Většina kojenců je kolonizována do prvního roku života. Výskyt CDI je ale v kojeneckém a dětském věku ojedinělý. Možným vysvětlením dětského nosičství je nepřítomnost specifických receptorů vážících toxin A na enterocytech. Na druhou stranu hlavně u starších dětí a dětí s těžkými komorbiditami může C. difficile vyvolat zvýšenou morbiditu i mortalitu [18]. V dospělosti je nosičství toxigenních kmenů C. difficile pozorováno zhruba u 3 % zdravých jedinců. Netoxigenní kmeny kolonizují střevo dospělých v mnohem vyšším procentu. Kolonizace dále výrazně stoupá během pobytu v nemocnici až na 50 % hospitalizovaných pacientů, v závislosti na délce hospitalizace. Asymptomatický stav nosičství toxigenních kmenů se vysvětluje tvorbou protilátek IgG a IgA třídy proti toxinům A a B. Protilátky se začínají tvořit již během prvního roku života. Jedinci s vyšší hladinou protilátek se stávají nosiči toxigenních kmenů a jsou méně náchylní k manifestnímu CDI [19, 20]. 12

Nejčastěji citovanou studií o změně epidemiologie C. difficile v posledních letech je studie, kterou publikoval v srpnu r. 2004 Pepin et al., poukazuje na vzestup případů CDI v Québecu v Kanadě v letech 1991 2003. Incidence v roku 1991 byla 35,6 na 100 000 obyvatel, v roku 2003 stoupla na 56,3 na 100 000 obyvatel. Kromě vzestupu incidence CDI je popisován i vyšší počet komplikovaných případů (ze 7,1 % na 18,2 % ve stejném období) s hospitalizací na Jednotkách intenzivní péče (JIP), se vznikem toxického megakolon, s nutností kolektomie, nebo případů končících smrtí pacienta. Procento úmrtí do 30 dnů od stanovení diagnózy CDI stouplo ze 4,7 % v roce 1991-1992 na 13,8 % v roce 2003. Navíc bylo zaznamenáno vyšší procento vzniku komplikací CDI u pacientů léčených metronidazolem než u pacientů léčených vancomycinem [9, 21, 22]. V roce 2005 byla v Kanadě provedena prospektivní studie, která zahrnovala údaje z 88 nemocnic v provincii Québec. Bylo izolováno 478 nozokomiálních kmenů C. difficile, u kterých byla provedena PFGE typizace a vyšetření citlivosti na antibiotika. Byly zjištěny tři predominantní kmeny, ze kterých 57 % odpovídalo kmenu NAP1, 18 % kmenu NAP2/ribotyp 001. Dále 64 % kmenů mělo tcdc deleci a geny pro binární toxin. Co se týče citlivosti na antibiotika, kmeny byly dobře citlivé na vancomycin, metronidazol, meropenem a piperacilintazobaktam, méně citlivé na clindamycin a clarithromycin. Z chinolonů byl testován gatifloxacin, levofloxacin a ciprofloxacin. 79 % kmenů bylo rezistentních na všechny testované chinolony, 19 % bylo dobře citlivých a 1 % kmenů mělo rozdílnou citlivost [17]. Molekulární studie ukazují, že ribotypy 027 a 078, které způsobují epidemie v Severní Americe a Evropě, jsou vzácné v Asii. Nicméně variantní toxin A-negativní, toxin B-pozitivní kmeny ribotypu 017 způsobily již několik epidemií v některých asijských zemích. Ribotyp 018 je v posledním desetiletí široce rozšířen v Japonsku a nedávno byl objeven i v Koreji [23]. Další zprávy uvádějí onemocnění CDI i ve skupině lidí, která byla pokládána za minimálně rizikovou pro vznik onemocnění. Jsou to např. mladší pacienti, ženy po porodu, ambulantní pacienti, pacienti bez anamnézy užívání antibiotik. Rizikovou skupinou jsou i těhotné ženy, u kterých omezení pohybu střev a horší prokrvení střeva může přispívat k rozvoji onemocnění [6, 15]. V literatuře jsou ojedinělé zmínky i o komunitně akvírované CDI způsobené epidemickým kmenem NAP1/027. U někteřých pacientů byl potvrzen blízký kontakt s osobami nedávno hospitalizovanými, u ostatních se přenos infekce z nemocničního prostředí neprokázal. Část z nich navíc neměla v anamnéze ani užití antibiotik tři měsíce před začátkem onemocnění [16, 22]. 13

Na vyšší incidenci CDI v posledních letech se ale bezpochyby podílí i celosvětové zvýšení surveillance a zlepšení senzitivity laboratorních diagnostických metod. Studie provedené během epidemií CDI předpokládaly, že epidemické ribotypy jako např. 027 a 078 způsobují mnohem těžší klinický průběh onemocnění než běžné kmeny klostridií. Podle kanadské studie z roku 2012 nemusí být epidemický ribotyp jednoznačně spojen s těžkým průběhem onemocnění. Signifikantním předpovědním ukazatelem těžkého průběhu CDI byla jedině leukocytóza a snížená hladina albuminu v séru [24]. 2.6 Epidemiologie C. difficile v Evropě a v České republice Od roku 2002 jsou publikovány zprávy o epidemiích s těžkým průběhem CDI z dalších rozvinutých zemí: Velké Británie, Francie, Nizozemí, Belgie, Německa, Japonska, Singapuru. Kromě epidemického kmene NAP1/027 evropští vědci referují i o dalších epidemických kmenech, které vyvolaly epidemie v zemích západní Evropy. Jsou to ribotypy 001, 002, 014, 046, 078 a 106. Ve Velké Británii je častý ribotyp 106, byl odpovědný i za komunitně akvírované případy CDI. Ribotyp 078 převažuje v Holandsku [16, 25-27]. V roce 2006 byl ribotyp 027 izolován v jednom případě i v sousedním Rakousku (jednalo se o britskou turistku), v dalším roce to již byly desítky případů ve čtyřech nemocnicích ve Vídni [15, 20, 28]. Podle studie, která proběhla v roce 2008 v 34 zemích Evropy, se obávaný epidemický ribotyp 027 vyskytoval jen v 5 % případů [27]. Přehled identifikovaných ribotypů v jednotlivých zemích Evropy v listopadu 2008 je znázorněn na obrázku 1. Podle dostupných informací v České republice nebyl dosud izolován ribotyp 027. Častým zejména u těžkých forem CDI, je ribotyp 176, někdy označovaný jako 027 like [29]. Kromě České republiky byl detekován i během epidemií v Polsku. Analýza ribotypu 176 poukazuje na podobnost s epidemickým ribotypem 027. Oba ribotypy se vyznačují přítomností genu pro binární toxin a delecí nukleotidu 117 v rámci regulačního genu kódujícího negativně produkci toxinů [30]. Ochromení down-regulace produkce toxinů A a B vede in vitro k 16 až 23násobnému vzestupu jejich produkce [9]. Ze souboru pacientů, který popisuje tato práce, byly kultivovány a odeslány na ribotypizaci celkem čtyři vzorky stolic od pacientů s těžkými průběhy onemocnění. Ribotypizace byla provedena v Ústavu lékařské mikrobiologie FN Motol v Praze, kde byl u všech identifikován zmiňovaný ribotyp 176. 14

Obrázek 1. Geografické rozložení PCR ribotypů C. difficile v evropských zemích s více než pěti typy izolátů, stav k listopadu 2008. Koláčové grafy zobrazují podíl nejčastejších ribotypů v dané zemi. Číslo uprostřed koláčového grafu udává počet typů izolátů v dané zemi. Zdroj: http://www.sciencedirect.com Podle hlášení diagnózy A047 Enterokolitis, původce Clostridium difficile do databáze Epidat Státního zdravotního ústavu (SZÚ) je v České republice v posledních letech stoupající trend tohoto onemocnění [2]. V tabulce 1 je patrný vyšší výskyt onemocnění se stoupajícím věkem pacientů a nárust počtu hlášených onemocnění v posledních pěti letech. Na obrázku 2 je vidět prevalenci onemocnění v jednotlivých krajích České republiky za rok 2012. Nejnižší nemocnost byla v Ústeckém kraji (3,3 na 100 000 obyvatel), nejvyšší v kraji Vysočina (61,7 na 100 000 obyvatel). 15

Tabulka 1. Počet případů CDI v České republice v letech 2008-2012 rozdělené podle věku pacientů. Zdroj: databáze Epidat SZÚ. věk 0 1-4 5-9 10-14 15-19 20-24 25-29 30-34 35-39 40-44 rok 2008 0 1 0 0 3 10 0 3 7 10 rok 2009 1 0 4 1 4 7 4 4 8 11 rok 2010 4 2 4 0 5 7 4 12 12 6 rok 2011 5 11 3 3 6 15 13 16 20 20 rok 2012 2 11 4 3 10 14 15 23 27 29 věk 45-49 50-54 55-59 60-64 65-69 70-74 75-79 80-84 85+ Celkem rok 2008 5 11 22 26 28 38 50 51 38 303 rok 2009 9 21 28 34 41 43 81 87 85 473 rok 2010 10 20 23 66 81 85 128 149 143 761 rok 2011 30 29 65 133 179 200 225 308 271 1552 rok 2012 38 57 108 165 234 304 332 422 443 2241 Obrázek 2. Nemocnost CDI v jednotlivých krajích České republiky v roce 2012. Obrázek byl vytvořen podle údajů databáze Epidat SZÚ. 16

2.7 Zoonotický potenciál infekce C. difficile C. difficile vyvolává střevní onemocnění též u řady druhů zvířat např. u koní, psů, koček, ptáků, stejně tak je přítomné v zažívacím traktu asymptomatických zvířat. Zejména prasata a hovězí dobytek se pokládají za možný rezervoár pro lidskou infekci. Alimentární přenos infekce je hypoteticky možný u komunitně vzniklých infekcí, zatím však chybí důkazy k jeho potvrzení či vyvrácení. Izolace C. difficile v jídle nebo v mase určenému pro domácí zvířata byla již prokázána ve Spojených státech, Kanadě i Evropě [31]. V roce 2005 byla hlášena izolace C. difficile v 20 % vzorků mletého masa prodávaného v maloobchodní síti v Kanadě, z toho v 21 % mletého hovězího a v 14 % mletého telecího masa [32]. Ve Spojených státech bylo C. difficile izolováno až ze 42 % vzorků mletého hovězího, vepřového a krůtího masa [33]. Během studie u dojnic na farmách v Kanadě bylo PCR ribotypizací určeno osm ribotypů, z nichž dva měly epidemický potenciál (ribotyp 017 a 027) [13]. Je zřejmé, že v poslední době se zvětšuje překrývání zvířecích a lidských rezervoárů C. difficile. Genotypy produkující toxiny A, B a zároveň binární toxin byly mnohem častěji izolovány u zvířat (30-100 % izolátů, v závislosti na druhu zvířat), zatímco u lidí byly vzácné (10 %). Příkladem přenosu C. difficile ze zvířat na člověka je PCR ribotyp 078, který je považován za novou hrozbu u lidí kvůli vysoké virulenci. Ribotyp 078 byl často izolován u mnoha zvířat, zatímco u lidí byl dosud extrémně vzácný [34]. 2.8 Rizikové faktory vzniku CDI Existuje více různorodých faktorů, které zvyšují riziko akvírování CDI. Některé jsou již léta potvrzené, některé jsou suponované v poslední době. Rizikové faktory jsou komplexní, ve vzájemné součinnosti. Patří k nim střevní dysmikrobie navozená předchozím užíváním antibiotik, nízká hladina sérových imunoglobulinů a střevního IgA, porucha motility střeva, snížená kyselost žaludečního sekretu, vyšší věk a přidružená onemocnění pacienta. Předchozí hospitalizace významně ohrožuje pacienta kolonizací nemocničními kmeny C. difficile. 2.8.1 Antibiotika Užívání antibiotik je považováno za nejzávažnější rizikový faktor pro kolonizaci C. difficile. Všechna antibiotika porušují normální střevní mikroflóru, včetně antibiotik, která se používají k terapii CDI (metronidazol a perorální vancomycin). Nejrizikovější skupinou antibiotik je clindamycin, cefalosporiny a nově i chinolony. Obecně se předpokládá, 17

že antimikrobiální léky s aktivitou proti anaerobům jsou rizikovější. Dalším aspektem je délka podávání antibiotik a jejich kombinace [35]. Rovněž léky, které v poslední době přicházejí do širšího užívání, jsou procentuálně více spojeny se vznikem CDI. Kmeny klostridií, které jsou rezistentní na podávaná antibiotika, mají větší potenciál pro kolonizaci a pak rozvoj klinického onemocnění. Toto je prokázáno pro clindamycin a suponováno pro chinolony. Několik studií (Loo et al., Pépin et al., Muto et al.) již potvrdilo expozici chinolonům jako rizikový faktor pro CDI vyvolané NAP1 kmenem. Genetický mechanizmus rezistence na chinolony je vysvětlován mutací genu gyra, kódujícím DNAgyrázu, rezistence na makrolidy a clindamycin erm B geny. Chinolony se zdají být nevhodné pro soustavné užívání v nemocnicích. Rozvracejí přirozenou mikroflóru a podporují kolonizaci a infekci multirezistentními a nozokomiálními kmeny, kromě C. difficile i meticilin rezistentními stafylokoky (MRSA) a multirezistentními gramnegativními tyčkami. I přes úplnou nebo částečnou rezistenci C. difficile se za relativně bezpečnou skupinu antibiotik považují aminoglykosidy, co-trimoxazol, penicilin, karbapenemy a tetracykliny [6, 15, 17]. Užívání některých antibiotik by mohlo za určitých okolností dokonce snižovat výskyt CDI. U kohorte hospitalizovaných pacientů užívajících ceftriaxon zároveň s doxycyclinem (např. v indikaci komunitně akvirované pneumonie) bylo prokázáno výrazné snížení incidence CDI oproti pacientům, kteří dostávali pouze ceftriaxon [36]. 2.8.2 Enviromentální rizika - nemocniční prostředí a dezinfekční prostředky C. difficile může perzistovat v neživém prostředí ve vegetativní formě 24 hodin, díky sporulaci až pět měsíců. Příjem pacienta na nemocniční lůžko akutní péče nebo do léčebny pro dlouhodobě nemocné přináší vyšší riziko akvírování toxigenního kmene. Úzce s tím souvisí délka pobytu v nemocnici a možnost izolace symptomatických pacientů s rozvinutým CDI. Klostridie se můžou šířit rukama zdravotnických pracovníků při nedodržování hygienických opatření, společnými toaletami a sprchami pacientů. Zavedené pomůcky pro enterální výživu jsou rovněž rizikovým faktorem. Běžně užívané druhy dezinfekce rukou na alkoholovém základu nejsou účinné proti sporulujícím bakteriím. Podle studie mohou být při podání ruky po použití alkoholové gelové dezinfekce přeneseny spory C. difficile v 18 až 60 % případů. V další studii byla prokázána přítomnost C. difficile na rukou zdravotnického personálu po přímém kontaktu s kultivačně pozitivním pacientem v 59 %. Kolonizace byla nejčastější pod nehty (43 %), na konečcích prstů (37 %), na dlani (37 %) nebo pod prsteny (20 %) [37]. 18

Ve srovnání s dezinfekčními prostředky na alkoholové bázi je na odstranění spor C. difficile mnohem účinnější mechanické mytí rukou vodou s použitím mýdla. Ve Spojených státech je podle doporučení CDC (Center for Diesease Control and Prevention) používáno mytí rukou mýdlem v péči o všechny pacienty s CDI včetně bariérových opatření. U ostatních pacientů je nadále používaná dezinfekce rukou na alkoholové bázi [6]. Dezinfekční prostředky na bázi kvartérních amoniových solí, které se používají na dezinfekci povrchů, rovněž nejsou sporicidní. Při čištění toalet a pokojů pacientů s CDI musí být použité sporicidní přípravky s chlórovým základem. Léčebny pro dlouhodobě nemocné mají v expozici C. difficile zvláštní postavení. Odhaduje se, že jejich pacienti mají nejvyšší incidenci průjmových onemocnění u dospělých v rozvinutých zemích. Nejčastější infekční příčinou neepidemických akutních průjmů je C. difficile [38, 39]. Na šíření CDI se zde podílí více faktorů: častý transfer pacientů mezi léčebnami a nemocnicemi, množství pacientů s inkontinencí a kognitivními poruchami, pokoje s více lůžky, časté užívání antibiotik, velký počet pacientů na zdravotnický personál [40]. 2.8.3 Inhibitory protonové pumpy Snížená kyselost žaludečního sekretu predisponuje ke zvýšené náchylnosti k řadě infekcí. Užívání inhibitorů protonové pumpy (PPI) některé studie uvádějí jako rizikový faktor, jiné to však nepotvrdily [22, 41-43]. Howell a spol. dokládá zvýšené riziko nozokomiální infekce C. difficile v závislosti na farmakologické supresi tvorby žaludeční kyseliny. Jiná studie identifikuje PPI jako signifikantní rizikový faktor rekurence CDI [44]. V dalších studiích po zohlednění komorbidit pacientů však nebyla jako rizikový faktor uvedená terapie prokázána [22]. 2.8.4 Imunita a polymorbidita pacienta Ze strany hostitele hraje důležitou roli při infekci C. difficile jeho imunita, věk a komorbidity. Jedná se častěji o sekundární imunodeficience při přidružených onemocněních (malnutrice, maligní tumory, léčba cytostatiky) a o poruchy slizniční imunity (ulcerosní kolitida). Hostitelé, kteří nevytvoří během kolonizace C. difficile dostatečnou hladinu sérových IgG protilátek proti toxinu A, jsou 48násobně náchylnější k rozvoji manifestního CDI. Snížení počtu slizničních buněk produkujících slizniční IgA a makrofágů zase vede k zvýšenému počtu rekurencí CDI [6]. 19

Podle Sancheze bylo u pacientů s infekcí HIV (human imunodeficiency virus) v letech 1992 2002 C. difficile nejčastěji izolovanou bakterií způsobující průjem (53,6 % z celkem 1115 izolovaných bakterií). U této skupiny pacientů se na vysokém procentu kolonizace podepisuje časté profylaktické a terapeutické užívání antibiotik a časté návštěvy zdravotnických zařízení [22]. V novější analýze případů CDI u HIV infikovaných subjektů provedené v letech 2003-2010 v USA bylo prokázáno dvojnásobné zvýšení incidence CDI. Rizikovým faktorem vzniku CDI byl pokles počtu CD4+ lymfocytů 50 /mm3 [45]. Nejrizikovějí skupinou ke vzniku CDI jsou pacienti trpící onkologickým onemocněním, nespecifickým střevním zánětem (IBD), malnutriční pacienti a pacienti s utlumenou střevní motilitou. Rovněž pacienti s celkovou poruchou mobility dlouhodobě odkázaní na pobyt na lůžku, po operacích v celkové narkóze, s revmatickými a nervovými chorobami omezujícími hybnost [29]. Stárnutí imunitního systému s věkem pacienta, častější a delší hospitalizace, mnohočetné komorbidity a častější užívání antibiotik jsou příčinou většího procenta nemocných CDI ve vyšším věku (nad 65 let). Nad tuto věkovou hranici stoupá incidence i závažnost onemocnění, navíc se výrazně zvyšuje riziko rekurence onemocnění [46]. Měřitelné a progresivní zhoršení výsledků léčby CDI již u pacientů nad 40 let prokázal regresivní model dvou randomizovaných studií proběhlých v Evropě a Severní Americe. Model předpověděl 17% pokles pozitivní odpovědi na léčbu, 17% nárůst rekurence a 13% pokles setrvalého klinického vyléčení s každou následující dekádou po dovršení 40 let [47]. Souvislost CDI s exacerbací IBD se sice předpokládá, chybí však prospektivní studie odhalující podíl C. difficile na aktivitě onemocnění. V holandském průzkumu prevalence C. difficile ve stolici u symptomatických pacientů s IBD a u pacientů v remisi, nebylo C. difficile potvrzeno jako obvyklý spouštěč exacerbace IBD [48]. Rizikovým faktorem zůstává časté užívání imunosupresivní léčby u pacientů s IBD [49]. 2.9 Klinická charakteristika CDI a laboratorní nálezy Kolitida vyvolaná C. difficile se projevuje jako akutní průjmové onemocnění. Hlavními příznaky jsou průjmy a bolesti břicha, nemusí být provázena horečkami. Průjem není profuzní jako u alimentárních nákaz, konzistence stolice je kašovitá až vodnatá. Ve stolici je typicky příměs hlenu, někdy má hnilobný zápach, makroskopická příměs krve není konstantní. Stolice je vyměšována často jen v malých porcích, u starších a nespolupracujících pacientů může být zaměněna za inkontinenci. Břicho je často meteoristické, difusně bolestivé, zvracení není typickým příznakem. 20

Stav se může komplikovat vznikem subileu až ileu, rozvojem toxického megakolon, s možnou perforací střeva a peritonitidou. Rozvoj komplikací, zejména u starých a imunokompromitovaných pacientů, může být nečekaně rychlý, doprovázen narůstající apatií a kvantitativní poruchou vědomí. Nejtěžší formou onemocnění je toxické megakolon s paralytickým ileem, s dilatací kliček tlustého a posléze i tenkého střeva. Letalita je vysoká, 30-50 %. Podezření na CDI by mělo být vysloveno zejména v následujících situacích: - akutní průjmové onemocnění vzniklé u osob užívajících antibiotika (nebo do dvou týdnů po antibiotické kůře); - akutní průjmové onemocnění provázené nápadným meteorismem, subileózním stavem, bolestmi břicha a/nebo leukocytózou, přičemž chirurg vyloučil náhlou příhodu břišní; - akutní průjmové onemocnění vzniklé v nemocnici, zejména v případech, kdy jde o starší a imobilní osoby, a/nebo se na daném oddělení toto onemocnění vyskytlo již v minulosti [29]. Některé případy probíhají pod atypickým klinickým obrazem, bez dominujícího průjmu. Je přítomná jen horečka, meteorismus a bolesti břicha, laboratorně vzestup zánětlivých parametrů. U těchto pacientů může být mylně diagnostikován subileus neinfekční etiologie. Další variantou je plíživá CDI s občasnou kašovitou stolicí, lehkou elevací zánětlivých parametrů a rozvojem těžké malnutrice [15, 20]. Laboratorně je přítomna elevace zánětlivých parametrů, typicky leukocytóza přes 20,0 10 9 /l, neutrofílie s posunem doleva. Vzestup C-reaktivního proteinu (CRP) je přítomný, ale často paradoxně nízký oproti výrazné leukocytóze. U stavů s průjmem a dehydratací je častý minerálový rozvrat, prerenální hyperazotemie a pokles albuminu. Fulminantní průběh se laboratorně vyznačuje výraznou leukocytózou (nad 50,0 10 9 /l) a vysokou hladinou laktátu v krvi (nad 5,0 mmol/l). Ze zobrazovacích metod se podle stavu nemocného využívá nativní snímek břicha, abdominální ultrasonografie, eventuelně CT (počítačová tomografie) břicha. Při abdominální sonografii obdobně jako při CT vyšetření břicha je v těžších případech patrné ztluštění stěny tračníku a volná tekutina v dutině břišní. Nález není pro diagnózu CDI patognomický, pomáhá však posoudit závažnost stavu. Na nativním snímku břicha v pokročilých fázích onemocnění lze pozorovat vymizení plynu v tračníku a s tím související ileózní stav na kličkách tenkého střeva [20]. 21

2.10 Definice těžkého průběhu klostridiové kolitidy Vědecké společnosti usilují o definici stupně závažnosti klostridiové kolitidy, které by mohlo být použito jako prediktivní kritérium ke vzniku komplikací a letálního průběhu onemocnění, rovněž ke stratifikaci pacientů v klinických studiích. Těžké onemocnění CDI je v anglosaské literatuře charakterizované alespoň jednou z uvedených skutečností: hospitalizace na JIP k léčbě CDI nebo přidružených komplikací, chirurgický výkon pro toxické megakolon, perforace střeva nebo refrakterní kolitida, úmrtí do 30 dnů od diagnózy CDI (jako bezprostřední nebo vedlejší příčina smrti). Ve studiích jsou pacienti nejčastěji rozděleni podle nejvyšší dosažené hodnoty leukocytózy a kreatininu, sérového laktátu, eventuelně nejnižší hodnoty sérového albuminu. Dalším kritériem je určení stupně závažnosti průjmu u CDI. Rozdělení podle objemu vyměšované stolice (lehký průjem do 500 ml, středně težký průjem 501 2000 ml a těžký průjem nad 2000 ml stolice) naráží na praktické problémy s přesným měřením objemu stolice u inkontinentních a nespolupracujících pacientů, rovněž korelace s klinickým obrazem onemocnění nebyla ve studiích potvrzena. Jeden z prvních systémů třídění pacientů byl prezentován na kongresu Infectious Diseases Society of America v roce 2006. Vztahuje se nejen na symptomy průjmu, ale i na symptomy onemocnění. Skóruje se za horečku nad 38 C, ileus, systolický krevní tlak pod 100 mmhg, leukocytózu nad 15 10 9 /l, známky ztluštění střevní stěny na CT zobrazení [16]. Evropská společnost klinické mikrobiologie a infekčních nemocí (ESCMID) zpracovala v roce 2009 doporučený postup léčby infekce vyvolané C. difficile. Těžký průběh nemoci je definován jako přítomnost alespoň jednoho z uvedených příznaků: horečka 38,5, třesavka, hemodynamická nestabilita včetně septického šoku, známky peritonitidy, paralytický ileus, leukocytóza 15 10 9 /l, posun doleva ( 20 % tyčí v diferenciálu leukocytů), vzestup kreatininu v séru ( 50 % nad obvyklou hodnotu), vzestup hladiny laktátu v séru, pseudomembranózní kolitida zjištěná endoskopicky, rozpětí tračníku prokázané zobrazovacím vyšetřením, zkrucování perikolické tukové tkáně zjištěné zobrazovacím vyšetřením, ascites z jinak neobjasněné příčiny zjištěný zobrazovacím vyšetřením [50]. V České republice byl na jeho základě recentně zpracován Doporučený postup diagnostiky a léčby kolitidy vyvolané Clostridium difficile, garantovaný Společností infekčního lékařství ČLS JEP, Společností pro epidemiologii a mikrobiologii ČLS JEP a Společností pro lékařskou mikrobiologii ČLS JEP z roku 2012. Příznaky svědčící pro těžký průběh klostridiové kolitidy jsou přehledně zobrazeny v tabulce č. 2. Lehká forma CDI je definována počtem stolic 4/den a absencí známek těžké kolitidy. 22

Tabulka 2. Příznaky svědčící pro těžký průběh klostridiové kolitidy (převzaté z dokumentu Doporučený postup diagnostiky a léčby kolitidy vyvolané Clostridium difficile [29]). horečka 38 C zimnice a třesavky hemodynamická nestabilita včetně septického šoku známky peritonitidy paralytický ileus leukocytóza 15 10 9 /l posun doleva ( 20 % tyčí v diferenciálu leukocytů) vzestup kreatininu v séru ( 50 % nad obvyklou hodnotu) vzestup hladiny laktátu v séru pseudomembranózní kolitida zjištěná kolonoskopicky rozpětí tračníku prokázano zobrazovacím vyšetřením Více autorů se snažilo o sestavení skórovacího systému, který by byl schopný predikovat v začátku onemocnění těžký průběh a vyšší mortalitu. Jejich součástí je obvykle věk, klinický stav pacienta a vybrané laboratorní parametry. Bodovací systém podle Bhangu, odhadující v prvních 72 hodinách mortalitu pacientů s CDI, zahrnuje věk nad 80 let, klinické známky těžké kolitidy, leukocytózu, zvýšené CRP, ureu a nízký albumin [51]. Skórovací systém ATLAS byl zaveden do praxe během velké klinické studie hodnotící účinost fidaxomicinu. Skládá se z pěti složek: věk, tělesná teplota, počet leukocytů v periferní krvi, hladina albuminu v séru, celkové užívání antibiotik (tabulka 3). Díky své jednoduchosti je možno jej použít jako "bed-side" skóre v čase diagnózy CDI. Výše skóre predikuje mortalitu na infekci C. difficile (graf 1). Pacienti, kteří zemřeli, měli medián skóre 6 bodů (mezikvartilové rozpětí IQR 5-7), pacienti, kteří CDI přežili, měli medián 5 bodů (IQR 3-6), p = 0,0002 [52, 53]. 23

Tabulka 3. Skórovací systém ATLAS predikující mortalitu u pacientů s CDI [52]. Parametr 0 bodů 1 bod 2 body Věk (roky) < 60 60-79 > 80 Tělesná teplota ( o C) < 37.5 37.6 38.5 > 38.6 Leukocytóza ( 10 9 /l) < 16 16 25 > 25 Albumin (g/l) > 35 26 35 < 25 Celkové užívání antibiotik během CDI ( 1 den) Ne --------- Ano Graf 1. Úmrtnost na CDI udaná v procentech v závislosti na výši ATLAS skóre [52]. 24

2.11 Diagnostika Vzhledem k časté kolonizaci střeva netoxigenními kmeny C. difficile je diagnostika CDI postavená na průkazu produkce toxinu A nebo B. Vyšetření není indikováno u jedinců s formovanou stolicí a u dětí do dvou let věku. Vyšetřovaným materiálem je vzorek stolice pacienta, minimálně 2 ml, odebraný do sterilní nádobky. Vzorek by měl být vyšetřen do dvou hodin po odběru, zejména při průkazu toxinů imunochemickou metodou, protože toxiny nejsou stabilní. Vzorek je možno uchovat při teplotě 5 C 48 hodin, pro dlouhodobé zachování aktivity toxinů je nutné zmrazení na -70 C. Časné stanovení diagnózy má význam pro rychlé zahájení kauzální terapie, kterou je možné výrazně zlepšit prognózu pacientů. Proto se v klinické praxi klade důraz na rychlé diagnostické metody. Pro jejich variabilní senzitivitu se nyní preferuje kombinace dvou nebo více testů (schéma 1). U těžkých případů CDI a z epidemiologických důvodů se provádí časově náročnější kultivace a následná molekulární typizace izolovaného kmene na specializovaném pracovišti. Schéma 1. Diagnostický algoritmus při průkazu C. difficile ve stolici (převzaté z dokumentu Doporučený postup diagnostiky a léčby kolitidy vyvolané Clostridium difficile [29]) Vzorek stolice GDH negativní C. difficile neg. GDH pozitivní Toxiny pozitivní Toxigenní C. difficile GDH pozitivní Toxiny negativní Test produkce toxinů u kmene C. difficile získaného kultivací nebo PCR stolice Negativní test/y Netoxigenní C. difficile nebo falešně pozitivní Pozitivní test/y Toxigenní C. difficile 25

Přehled metod laboratorní diagnostiky CDI: Průkaz glutamátdehydrogenázy (GDH), exoenzymu tvořeného C. difficile, se používá v úvodu diagnostického algoritmu k rychlému určení C. difficile pozitivních vzorků. Nerozlišuje toxigenní a netoxigenní kmeny klostridií, je rychlý (15-45 minut) a vysoce senzitivní (90-100 %). Je zde však možnost zkřížené reakce s jinými anaeroby. Pro vysokou negativní prediktivní hodnotu se používá k rychlému vyloučení klostridiové infekce. Stanovení GDH může být i součástí testů prokazujících toxiny. Imunochemický průkaz toxinů A a B je nejjednodušší a nejrozšířenější metoda vyšetření CDI, výsledky jsou k dispozici už do dvou hodin. Nevýhodou je nižší citlivost testů, kolem 60-80 %. Pro zvýšení senzitivity se doporučuje vyšetřovat oba toxiny, A a B. Pozitivní výsledek má však vysokou pozitivní prediktivní hodnotu, tedy s velkou spolehlivostí prokazuje klostridiovou infekci. Detekce toxinů se provádí pomocí enzymové imunoeseje ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), imunofluorescenční eseje ELFA (enzyme linked fluorescent assay) nebo imunochromatograficky. Nevýhodou imunochromatografie je nižší citlivost oproti imunoeseji a nízké procento falešné pozitivity [20]. Selektivní kultivační vyšetření C. difficile je časově náročnější (dva až tři dny), není vhodné k rychlé diagnostice. Vzorek se před naočkováním inkubuje s 96% etanolem nebo 70% metanolem. Alkohol podporuje klíčení spór, zvyšuje se tím citlivost kultivace na 99-100 %. Používají se základní selektivní půdy za anaerobních podmínek, kultivační nález se konfirmuje biochemicky nebo latexaglutinačně. Kultivace se doporučuje provádět u vzorků GDH pozitivních, kde se primárně imunochemicky neprokázala produkce toxinů. Provádí se i u pacientů s těžkým průběhem CDI a z epidemiologických důvodů. Kultury C. difficile je možné imunochemicky retestovat k definitivnímu průkazu produkce toxinů. Dále je možné provedení testu citlivosti na antibiotika u klinicky suspektní rezistence a molekulární typizace kmene. Polymerázová řetězová reakce (PCR) je novější test k verifikaci CDI u nejasných výsledků jiných testů. Je to rychlé vyšetření (60 minut) s vysokou citlivostí (99-100 %), neumožňuje však rozlišení kolonizace od infekce. Komerční kity prokazují např. geny pro tvorbu toxinu B nebo charakteristické genové delece některých epidemických ribotypů (např. 027, 176). 26

Průkaz cytotoxicity na tkáňových kulturách a neutralizační test je specializované vyšetření vyhrazené specializovaným a referenčním pracovištím. Je náročné na laboratorní vybavení a interpretační zkušenosti. Test trvá dva dny a je zde riziko falešné pozitivity [29]. Pozitivní výsledek průkazu toxinu ze stolice při klinickém obrazu onemocnění je směrodatný pro diagnózu CDI. Při negativním výsledku a trvající klinické suspekci na CDI je podle doporučení z Evropského kongresu klinické mikrobiologie a infekčního lékařství (ECCMID) v roce 2008 doporučeno opakovat vyšetření stolice do 48 hodin, při další negativitě a trvajících klinických příznacích ještě zopakovat vyšetření třetího vzorku stolice. Ve dvou holandských nemocnicích během nozokomiální epidemie byl prokázán toxin z prvního vzorku u 86 % pacientů, z druhého vzorku u 5 % pacientů a u zbývajících 9 % byl toxin pozitivní až ve třetím vzorku [54]. Endoskopie není vzhledem k invazivní povaze vyšetření doporučována jako metoda první volby. Makroskopicky je pro CDI charakteristická hyperemická edematózní sliznice tračníku pokryta pablánami (žlutobílými povlaky o velikosti kolem 5 mm), které mohou splývat (obr. 3-6). Většinou se vyskytují na vrcholu řas a po stržení je na spodině patrný vřed. Sliznice mezi pablánami může vypadat makroskopicky zcela normálně. Není-li onemocnění ve fázi pablán (anebo při jeho mírném průběhu), je nález necharakteristický, jen s okrskovitými zánětlivými změnami ve smyslu edému a zarudnutí, což senzitivitu vyšetření výrazně snižuje. Vhodný je odběr bioptického vzorku, eventuelně vzorek pro vyšetření toxinu. Histologické vyšetření však oddaluje stanovení diagnózy. Maximum patologických změn sliznice střeva se nachází v sigmatu, proto je pro určení diagnózy někdy postačující sigmoideoskopie po rychlé přípravě klyzmatem. Hodnocení endoskopického nálezu je subjektivní, spolehlivost výsledku záleží na kvalitě a zkušenostech endoskopisty. Endoskopie je někdy uváděna u CDI za relativně kontraindikovanou pro možnost perforace střeva [20]. Histologické vyšetření bioptického vzorku sliznice střeva nachází v místě pablány nekrózy epitelu se zánětlivou infiltrací polymorfonukleárů. Pablány jsou tvořeny fibrinem, mucinem, leukocyty a buněčným detritem. Sliznice v okolí pablán může mít normální nález, nebo jsou přítomny jen edematózní změny. Mikroskopický obraz pseudomembranózní kolitidy při CDI je někdy obtížně odlišitelný od ulcerózní kolitidy. V diferenciální diagnostice CDI je z infektologického hlediska nutné vyloučit postantibiotické průjmy jiné etiologie (nejčastěji kvasinkové infekce), které mívají lehký průběh a chybí celkové zánětlivé projevy. Dále je u těžkého průběhu CDI nutné vyloučení 27

akutních chirurgických stavů jako je divertikulitida, fulminantně probíhající idiopatické střevní záněty nebo komplikace operací na tlustém střevě. Obrázek 3. Makroskopický obraz pseudomembranózní kolitidy v sekčním materiálu 81leté pacientky s CDI. Patrné pablány v celém rozsahu tlustého střeva od céka až po rektum. Cékum. 28