ANTIGEN HLA-B27 A JEHO VZTAH K CHOROBÁM

Masarykova univerzita Lékařská fakulta ANTIGEN HLA-B27 A JEHO VZTAH K CHOROBÁM Bakalářská práce Vedoucí bakalářské práce: RNDr: Alena Bartoníčková Autorka: Renáta Procházková obor zdravotní laborant Brno, duben 2008

Prohlášení Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Antigen HLA-B27 a jeho vztah k chorobám vypracovala samostatně pod vedením RNDr. Aleny Bartoníčkové a uvedla v seznamu literatury všechny použité literární a odborné zdroje. 20.dubna 2008 Renáta Procházková 2

Poděkování RNDr. Aleně Bartoníčkové za odborné vedení, připomínky a cenné rady při zpracování daného tématu. Dále chci poděkovat RNDr. Libuši Janků za cenné informace a čas, který mi poskytly. 3

OBSAH I. ÚVOD... 8 II. CÍL PRÁCE A HYPOTÉZY... 9 2.1 Cíle... 9 2.2 Hypotézy... 9 III. TEORETICKÁ ČÁST... 10 3.1 Hlavní histokompatibilní komplex... 10 3.2 Historie... 10 2.3 Struktura molekul HLA... 11 3.4 Genetická organizace HLA systému... 15 3.5 Polymorfismus HLA systému... 19 3.6 Typizace HLA... 20 3.6.1 Serologické metody... 20 3.6.2 Genotypizační vyšetření... 21 3.7 Nomenklatura... 25 3.8 Vztah HLA systému k chorobám... 26 3.9 Antigen HLA-B27 a choroby... 29 4

IV. MATERIÁL A METODY... 36 V. VÝSLEDKY... 40 VI. DISKUSE... 50 VII. ZÁVĚR... 52 5

Seznam použitých zkratek AMK APC AS B C1q C2 C4 CD CLIP DNA H2 HLA HSP70 LCT MHC NK PBR PCR RR aminokyselina buňky prezentující antigen (antigen-presenting cell) ankylozující spondylitida složka komplementu složka komplementu složka komplementu složka komplementu cluster of differentiation Class II associated invariant chain peptide deoxyribonukleotidová kyselina histokompatibilní systém myši hlavní histokompatibilní komplex člověka (Human Leukocyte Antigens) protein teplotního šoku (heat shock protein) lymfocytotoxický test hlavní histokompatibilní komplex (Major Histocompatibility Complex) přirozeně zabíječské buňky (natural killer cells) peptide binding region polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction) relativní riziko 6

SLA TAP TNF histokompatibilní systém prasete domácího peptidový transportér (transporter associated with antigen processing) tumor nekrotizující faktor (tumor necrosis factor) 7

I. ÚVOD Pro homeostázu organismu je důležitá správná funkce imunitního systému. Jeho základní funkcí je rozpoznání škodlivého od neškodného, cizího od vlastního. Při poruše imunitního systému může docházet ke vzniku autoimunitního onemocnění, což je proces při kterém jsou poškozovány vlastní struktury organismu. Při rozvoji těchto onemocnění hrají důležitou roli především genetické faktory, ale také vlivy prostředí. I přes velký rozvoj studia závislosti mezi HLA a autoimunitními nemocemi v posledních letech, není zatím u žádné z těchto chorob mechanismus vzniku zcela objasněn. Autoimunitní onemocnění postihují více jak 5% populace, a vytváří tak značný sociální problém. Původní studie poukazovaly na spojitost antigenů HLA I. třídy a určitého onemocnění. Později se však prokázala větší souvislost mezi nemocí a antigeny HLA II. třídy. Celkem bylo popsáno přes 100 chorob asociovaných se systémem HLA. Některá autoimunitní onemocnění asociované s HLA komplexem jsou spojena pouze s jednou alelou, jiná onemocnění jsou spojena s polymorfismem alel více genů. Silná asociace je mezi antigenem HLA-B27 a ankylozující spondylitidou. Ve své bakalářské práci uvádím poznatky o asociaci antigenu HLA-B27 s chorobami, především s ankylozující spondylitidou. 8

II. CÍL PRÁCE A HYPOTÉZY 2.1 Cíle 1. Zmapování výskytu antigenu HLA-B27 v moravské populaci zdravých osob, kdy soubor je tvořen z otypovaných dárců kostní dřeně. 2. Statistické srovnání frekvence výskytu antigenu HLA-B27 u zdravých osob s frekvencí výskytu tohoto antigenu u pacientů vyšetřených v HLA laboratořích TO a KB FN Brno. 3. Frekvence výskytu antigenu HLA-B27 ve vztahu k diagnóze pacienta. 2.2 Hypotézy 1. Antigen HLA-B27 se nachází u cca 9% kavkazské populace. 2. Antigen HLA-B27 se bude vyskytovat u pacientů častěji než u kontrolní skupiny, nejvyšší výskyt tohoto antigenu se očekává u pacientů s ankylozující spondylitidou (až 95%). 3. Antigen HLA-B27 je asociovaný především s nemocemi svalové a kosterní soustavy, a také s nemocemi oka a očních adnex. 9

III. TEORETICKÁ ČÁST 3.1 Hlavní histokompatibilní komplex HLA komplex je vysoce polymorfní a komplexní genetický systém, nacházející se u vyšších živočichů. Označení MHC ( Major Histocompatibility Complex) je obecný termín pro hlavní histokompatibilní systém všech živočišných druhů včetně člověka, přičemž u jednotlivých druhů je pojmenování rozličné, například u myši domácí jako H2 systém, u prasete domácího jako SLA systém (Krejsek, J., Kopecký, O., 2004) a u člověka je hlavní histokompatibilní systém označován jako HLA systém (Human Leukocyte Antigen). Produkty MHC genů jsou glykoproteiny, jenž se nachází na povrchu buněk, a hrají významnou úlohu v regulaci imunitní odpovědi. Organismus může díky těmto molekulám rozlišit tělu vlastní a cizí struktury. Každý jedinec má na svých buňkách HLA antigeny I., II. a III. třídy. Složení HLA antigenů je u každého jedince s výjimkou jednovaječných dvojčat odlišné, každý z nás má jedinečnou sestavu těchto znaků. 3.2 Historie V 50. letech 20. st. objevil francouzský imunolog J. Dausset první antigen tohoto systému, označovaný dnes HLA A2. 10

V 70. letech byly objeveny již tři základní lokusy HLA systému, lokusy HLA-A, HLA-B, HLA-C a podařilo se prokázat, že HLA systém je rozhodujícím prvkem, jenž udává individuální imunologickou reaktivitu (Krejsek, J., Kopecký, O., 2004). V 80. letech došlo k objevení antigenů lokusů HLA-DR, HLA-DQ, HLA- DP. Byl pochopen genetický základ HLA a jeho biologický význam (Krejsek, J., Kopecký, O., 2004). V 90. letech byly objeveny tzv. neklasické antigeny lokusů HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA-H, HLA-J, HLA-K, HLA-X. 2.3 Struktura molekul HLA Struktura molekul HLA I. třídy a HLA II. třídy je podobná, obě se skládají ze dvou různých bílkovinných řetězců a slouží k vazbě antigenu a jeho kontaktu s receptory T-lymfocytů (Jameson, J., Larry, 1998). Obr. č. 1 Schématická struktura molekuly HLA I. a II. třídy (upraveno dlezdroje: http://www.funpecrp.com.br/gmr/year2006/vol4-5/gmr0218_full_text.htm) 11

Struktura molekuly HLA I. třídy Antigeny HLA I. třídy se nacházejí na všech jaderných buňkách lidského organismu. Nejvíce tyto antigeny nalezneme na buňkách imunitního systému. Molekuly HLA I. třídy jsou heterodimery složené ze tří částí (obr. č. 1). Extracelulární částí je transmembránový glykoprotein, o molekulové hmotnosti 44 kda, nazývá se těžký α řetězec a je nekovalentně vázaný s β-2-mikroglobulinem (mol. hmotnost 12kDa), který membránou neprochází. Těžký α řetězec vytváří tři domény (α1, α2, α3), přičemž každá doména obsahuje přibližně 90 aminokyselin (Jameson, J., Larry 1998). α1 a α2 domény jsou polymorfní částí, jenž vytváří vazebné místo pro peptid. Toto vazebné místo vytváří rýhu na povrchu proteinu a dno této rýhy je tvořeno tzv. β-strukturou a boky jsou omezeny dvěma dlouhými α- šroubovicemi (Hořejší, V., Bartůňková J., 2005). Molekuly HLA I.třídy vážou peptidy o délce 8-10 aminokyselin. Jednotlivé molekuly HLA I. třídy ( HLA-A, -B, -C) se od sebe liší pouze v těžkém řetězci, β-2-mikroglobulin je vždy stejný. Vazba peptidů na HLA I. třídy Vazebné místo molekuly HLA I. třídy je na obou koncích uzavřeno, váže tedy pouze peptidy, které jsou takovému místu uzpůsobeny. HLA antigeny I. třídy prezentují především peptidy vzniklé z proteinů degradovaných v cytoplazmě proteasomem. Štěpení v proteasomu podléhají nejen normální buněčné proteiny, ale také proteiny virové. Z proteasomu jsou peptidy transportovány pomocí TAP (transporter associated with antigen processing, peptidový transportér) do endoplazmatického retikula. K vazbě endogenních peptidů s molekulou HLA dochází v endoplazmatickém retikulu. Po vzniku polypeptidového řetězce α a β 2 m dojde v endoplazmatickém retikulu k uspořádání do správné prostorové 12

konformace a vzájemné asociace, rovněž dojde k asociaci s odpovídajícím peptidem. Vzniklý komplex složený z α-řetězce, β 2 mikroglubulinu a peptidu je dále zpracován v Golgiho komplexu a na závěr vystaven na cytoplazmatické membráně (Hořejší, V., Bartůňková, J., 2005). Struktura molekuly HLA II. třídy Distribuce HLA antigenů I. a II. třídy je rozdílná. HLA antigeny II. třídy se vyskytují pouze na povrchu některých buněk imunitního systému - monocytytech, makrofázích, dendritických buňkách a Langerhansových buňkách, B-lymfocytech (Buc, M., 1997). Molekuly HLA II. třídy, HLA-DR, HLA-DQ a HLA-DP jsou také heterodimery složené ze dvou polymorfních řetězců. Jejich oba řetězce, α řetězec (mol. hmotnost 32 kda) a β-řetězec (mol. hmotnost 28 kda), jsou transmembránové glykoproteiny. Oba řetězce mají extracelulární domény označované jako α1 a α2, β1 a β2 (obr. č. 1) (Jameson, J., Larry 1998). N- terminální domény obou řetězců (α1 a β1) vytvářejí žlábek pro peptid, který se naváže a může být předložen imunokompetentním buňkám. Místo, do kterého se peptid váže, je strukturálně podobné vazebnému místu molekuly HLA I. třídy. Vazebné místo je však na obou koncích otevřené, takže se do něj mohou vázat i peptidy delší (obvykle 15-35 aminokyselin, ale i delší), které na jednom či obou koncích přečnívají (Hořejší, V., Bartůňková, J., 2005). Vazba peptidu na HLA II. třídy U vazby molekuly HLA II. třídy a peptidového fragmentu se uplatňuje jiný mechanizmus, než v případě molekuly HLA I.třídy a peptidu. V endoplazmatickém retikulu vzniká komplex α-řetězce, β-řetězce a invariantního řetězce. Invariantní 13

řetězec zabraňuje navázání endogenních antigenních fragmentů vlastního organismu do molekuly HLA. Vzniklý komplex je transportován přes Golgiho komplex a při cestě k cytoplazmatické membráně fúzuje s endosomy, ve kterých dochází k proteolytickému rozštěpení invariantního řetězce. Zbylá část invariantního řetězce, zvaná CLIP (Class II associated invariant chain peptide) je vyměněná za exogenní peptid. Výměně napomáhá protein označený DM. Tento vzniklý komplex je přesunut na povrch buňky (Hořejší, V., Bartůňková, J., 2005). Po přesunutí komplexů na povrch buňky dochází k expozici imunogenního fragmentu do extracelulárního prostoru. Vystavené komplexy mohou být rozpoznány T-lymfocyty. Endogenní fragmenty navázané na molekulách HLA I. třídy jsou rozlišeny T-lymfocyty CD8 +. Antigenní fragmenty vzniklé z exogenních částic jsou prezentovány molekulami HLA II. třídy a rozpoznány T-lymfocyty CD4 +. Exogenní proteiny nejsou zpracovávány všemi buňkami, ale pouze buňkami prezentujícími antigen APC (antigen-presenting cell) (Buc, M., 1997). Mezi tyto buňky patří hlavně: Dendritické buňky Makrofágy B-lymfocyty T-lymfocyt není schopen rozlišit cizorodý antigen, aniž by předem nebyl opracován buňkou. Jev, kdy T-lymfocyty jsou schopny rozlišit jen antigenní fragmenty navázané na HLA molekuly I. nebo II. třídy se nazývá HLA restrikce (Buc, M.,1997). 14

Tab.1. Srovnání antigenů HLA I. a II. třídy Antigeny HLA I. třídy Antigeny HLA II. třídy Název HLA-A, -B, -C HLA-DQ, -DR, -DP Struktura Heterodimery těžký řetězec 44 kda β2mikroglobulin 12 kda Heterodimery α řetězec 32 kda β řetězec 28 kda Výskyt Prakticky všechny buňky B-lymfocyty, makrofágy,aktivované T- lymfocyty Funkce Délka peptidu, který vážou Předkládání zpracovaných endogenních antigenů T- lymfocytům CD8+ Předkládání zpracovaných exogenních antigenů T- lymfocytům CD4+ 8-10 AMK 10 25 AMK (zpracováno podle tabulky z Principles of Molecular Medicine, Autor: J. Larry Jameson, 1998.) 3.4 Genetická organizace HLA systému Hlavní histokompatibilní komplex člověka (HLA) je geneticky lokalizován na krátkém raménku 6. chromozomu (6p21.3) a obsahuje více než dvě stě genů (128 funkčních genů a 96 pseudogenů) (obr. č. 2). HLA systém zaujímá přibližně 4 Mbp, což odpovídá asi 0,1% lidského genomu (Browning, M.J., McMichael, A.J., 1996). Většina genů v oblasti HLA má imunologickou funkci. Geny v HLA komplexu se dělí do I.třídy, II.třídy a III.třídy. 15

Obr. 2 Chromozomová lokalizace a umístění jednotlivých genů hlavního histokompatibilního komplexu člověka. (zdroj: Ferenčík, M., Rovenský, J., Shoenfeld,Y., 2005) 16

Geny HLA I. třídy Oblast I.třídy lidského histokompatibilního systému kóduje asi 20 genů (lokusů) z nichž nejdůležitější jsou lokusy HLA-A, HLA-B, HLA-C, které kódují klasické transplantační antigeny nacházející se v oblasti telomery. Mimo výše popsaných lokusů, se v oblasti I.třídy nacházejí také neklasické funkční geny, jež jsou sdruženy do lokusů HLA-E, HLA-F, HLA-G (Browning, M.J., McMichael, A.J., 1996). Tyto geny jsou mnohem méně polymorfní než HLA- A, -B, -C a distribuce těchto antigenů ve tkáních je omezená (Browning, M.J., McMichael, A.J., 1996). Molekuly HLA-G můžeme například naleznout na trofoblastových strukturách embryonálního původu. Jejich přítomnost tlumí nežádoucí cytotoxickou reaktivitu namířenou proti embryonálním tkáním. Společně HLA-G a -E molekuly tak chrání plod před napadením T a NK buňkami (Tesařová, E. et al., 2007). Oblast I. třídy obsahuje i další geny, které jsou však nefunkční, jedná se o pseudogeny nacházející se například na lokusech HLA-H, -J, -K (Browning, M.J., McMichael, A.J., 1996). Do I. třídy se také řadí skupina genů nazývajících se MIC a také PERB. Produkty těchto genů se nacházejí na buňkách epiteliálních, zvláště střeva (Browning, M.J., McMichael,A.J., 1996). Geny HLA II. třídy Jsou umístěny nejblíže k centromeře, oblast je složená z genů kódujících HLA-antigeny II. třídy. Je to místo HLA-D a je dlouhé přibližně 900kb (Passarge,E., 2001). Je tvořeno lokusy HLA-DR, HLA-DQ a HLA-DP. Geny těchto lokusů kódují α a β řetězce HLA molekul II. třídy. Dříve tyto geny byly 17

popisovány jako geny odpovědi organismu na antigen (Silver,J., 1990). Jsou to totiž geny podílející se na regulaci imunitní odpovědi. Geny HLA III. třídy V genové oblasti HLA mezi I. a II. třídou se nacházejí geny, označované jako HLA III. třída (Tesařová, E. et al., 2007). Jejich produkty jsou funkčně odlišné, neúčastní se prezentace antigenu. Jsou to geny pro složky komplementu C2, C4 a faktor B, tumor nekrotizující faktory TNF-α, TNF-β, geny pro stresové proteiny HSP70 a jiné (Buc, M., 1997). Dědičnost HLA komplexu Každý jedinec dědí geny HLA jako celou sadu, neboli haplotyp. Každý jedinec má dvě sady chromozomů, přičemž jedna je děděná od otce a druhá od matky. V rámci jednoho lokusu jsou vždy maximálně dvě alely, které jsou kodominantní, tudíž jsou obě dvě exprimovány. Pokud jedinec zdědí od každého z rodičů identické alely, je v daném lokusu homozygotní, pokud zdědí alely rozdílné, je v daném lokusu heterozygotní. V rodině se vyskytují dva mateřské a dva otcovské haplotypy, které mohou vytvářet 4 různé kombinace haplotypů u potomstva. Haplotypy jsou děděny podle Mendelových zákonů: 25% potomků je HLA identických, zdědili stejný haplotyp od otce a stejný haplotyp od matky 50% potomků se shoduje pouze v jednom haplotypu (haploidentičtí), zdědili stejný haplotyp od otce a jiný od matky, respektive naopak 18

25% potomků je HLA rozdílných, zdědili rozdílný haplotyp od otce i od matky (Tesařová, E. et al., 2007) 3.5 Polymorfismus HLA systému Typickou vlastností HLA antigenů je jejich polymorfnost. Znamená to, že u jednotlivých členů populace se na daném genovém lokusu nacházejí různé varianty genů, tzv. alely. Výjimkou je ovšem lokus kódující α řetězec molekuly HLA DR, jenž je monoformní (Krejsek, J., Kopecký, O., 2004). S vyjímkou tohoto genového lokusu se na zbývajících lokusech nalézá některá z mnoha alel. Například v lokusu HLA-A může být více než 200 různých alel, v lokusu HLA-B více než 400 alel, v lokusech HLA-DR více než 300 alel. Celkově se předpokládá, že všechny lokusy HLA komplexu kódují asi 1500 různých alel ( Ferenčík, M., Rovenský, J., Shoenfeld, Y., 2005). Biologický význam této obrovské polymorfnosti HLA antigenů spočívá nejen v zajištění jedinečnosti organismu, ale je i rozhodujícím faktorem umožňujícím přežití člověka jako biologického druhu v měnících se podmínkách životního prostředí. Určitá skladba HLA-antigenů souvisí se zvýšenou náchylností svých nositelů vůči některým chorobám, zatímco naopak jiná kombinace jim poskytuje zvláštní odolnost ( Ferenčík, M., Rovenský, J., Shoenfeld, Y., 2005). 19

3.6 Typizace HLA Určování lidských leukocytárních antigenů se rozvinulo především ve spojitosti s transplantační medicínou. Význam HLA typizace je však širší. Vyšetření HLA je také indikováno jako pomocné vyšetření u stavů, u nichž je známo, že jsou asociovány s určitými skupinami antigenů nebo konkrétními alelami HLA. Příkladem může být antigen HLA-B27 a Bechtěrevova choroba. Vyšetření HLA může být také použito k určení paternity nebo ve forenzní medicíně. Během posledních let došlo k velkému rozvoji v oblasti metod používaných pro identifikaci HLA. Nástup metod molekulární biologie vede k vyšší kvalitě a přesnosti rozlišení jednotlivých alel ( Bartůňková,J., Paulík, M., 2005). Metody stanovení můžeme tedy rozdělit na dvě základní, metody sérotypizace a genotypizační vyšetření (Krejsek, J., Kopecký, O., 2004). 3.6.1 Serologické metody Serologické metody detekují vlastnosti molekul na buněčném povrchu. K sérotypizaci používáme typizační séra, která se získávají z krve matek po vícečetných těhotenstvích a produkcí monoklonálních protilátek pomocí somatické hybridizace buněk. Monospecifická séra jsou velmi vzácná, častěji se tedy setkáváme se séry polyspecifickými, které reagují s větším počtem HLA antigenů. HLA typizace se provádí tzv. lymfocytotoxickým testem (LCT) na Terasakiho deskách s předkapanými typizačními séry, které tvoří testovací panel, 20

ve kterém jsou zastoupeny všechny dosud známé HLA antigeny. Tento test lze zjednodušeně popsat jako reakci, při které se smísí vyizolované lymfocyty (směs T a B lymfocytů u I. třídy, B lymfocyty u II. třídy) testované osoby s typizačním sérem, po inkubaci je přidán komplement. Došli-li k vazbě specifických protilátek přítomných v typizačním séru na buňky testované osoby, dojde po přidání komplementu k jeho aktivaci, vzniklý enzym fosfolypáza poruší buněčné membrány lymfocytyů. Buňky pak následně příjmou vitální barvivo (eosin, trypanová modř). Přidáním barviva se obarví pouze buňky usmrcené, které se jeví v mikroskopu jako červené nebo modré. Živé buňky zůstávají bezbarvé (Tesařová, E. et al., 2007). mserologická typizace je zatížena určitou mírou nepřesnosti. K falešně pozitivnímu výsledku může dojít v případě, když antigeny tvoří tzv. křížově reagující skupiny. Molekula HLA reaguje i s protilátkami proti jiným antigenům, například antigen HLA-B27 reaguje vedle séra anti-hla-b27 rovněž se séry anti- B22, anti-b40. K falešné negativitě může dojít například při slabé expresi HLA antigenu, nebo u buněk se změněnou morfologií. 3.6.2 Genotypizační vyšetření Typizace metodou PCR pracuje s DNA. Detekujeme genetickou informaci o struktuře povrchových molekul. Ve srovnání se sérotypizací jsou tyto metody přesnější, vhodnější k automatizaci, ale i více časově náročné. Metody jsou založeny na průkazu genových sekvencí. Pro vyšetření je nezbytné mít k dispozici 21

specifické genové primery, které specificky popisují konkrétní alely HLA systému (Krejsek, J., Kopecký, O., 2004). Nejdříve je určitý úsek DNA namnožen pomocí PCR. K této reakci jsou potřeba nejen specifické primery, ale také Taq polymeráza, deoxyribonukleotidy a PCR pufr. Vzniklý produkt je dále analyzován. Metoda PCR Princip této metody je založen na replikaci nukleových kyselin. Cyklicky se opakuje enzymová syntéza nových řetězců vybraných úseků dvouřetězcové DNA ve směru 5 3 prostřednictvím DNA-polymerázy. Daný úsek nukleotidové sekvence je vymezen připojením dvou primerů, které se vážou na protilehlé řetězce DNA. K syntéze DNA se využívá termostabilní Taq DNA-polymeráza, která odolává i teplotám, při kterých DNA denaturuje. V cyklickém procesu se pravidelně střídají 3 kroky (obr. č. 3): Denaturace dvouřětězcových molekul DNA, při 92-96 o C Připojení primerů (primerování, annealing) k rozděleným řetězcům DNA, při 45-65 o C Syntéza nových řetězců DNA prostřednictvím DNA-polymerázy, při 65-75 o C 22

Obr. č. 3 Polymerázová řetězová reakce 1. Krok Denaturace 2. Krok Připojení primerů 3. Krok Syntéza nové DNA (upraveno podle zdroje: http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html) Reakce probíhají v přístrojí, kde se teplota automaticky mění, v termocykleru. Produkty každého cyklu se stávají substráty dalšího cyklu. 23

Pro HLA typizaci metodou PCR se používají následující metody: PCR se sekvenčně specifickými oligonukleotidovými primery (PCR-SSOP) Namnoží se určitý typizovaný HLA lokus. Po té jsou amplifikované produkty denaturovány a fixovány na specifické membrány. Pro detekcí se používají syntetické DNA sondy, jež jsou značené enzymaticky nebo radioaktivně. PCR se sekvenčně specifickými primery (PCR-SSP) Tato metoda je vhodnější pro individuální typizování, používají se sady párových primerů, jež jsou komplementární k odpovídající alele nebo skupině alel. K amplifikaci dojde pouze v případě, kdy primery na vyšetřované DNA najdou komplementární úseky. Po elektroforetické separaci hodnotíme přítomnost či absenci specifických PCR produktů. Typizování založené na sekvenci HLA alel (SBT sequencing based typing) V této metodě je namnožen a sekvenován polymorfní úsek vyšetřovaných HLA genů. Získaná sekvence je porovnána s databází, která obsahuje dosud známé sekvence, a na základě shody je určena HLA molekula (Bartůňková, J., Paulík, M., 2005). 24

Metody mikročipu Tato metoda se dá považovat za revoluční pokrok v genotypizaci. Na tzv. mikročipu o velikosti 1cm 2 jsou až tisíce oligonukleotidových sond. Po přidání DNA probíhá hybridizace, která je vyhodnocena speciálními přístroji. Tato metoda zatím nepatří mezi rutinně používané v praxi. 3.7 Nomenklatura V dnešní době existují dva typy HLA nomenklatury. V roce 1975 byl zaveden první typ nomenklatury, nomenklatura serologická. Zavedení genotypizačních analýz vedlo ke vzniku nové nomenklatury. Serologická nomenklatura Pro označování jednotlivých antigenů existují platné zásady. Každý antigen je definován písemným označením lokusu (A, B, C, DR, DQ, DP), následuje číslo, které popisuje specifitu antigenu. Např.: HLA-A24 Molekulárně-genetická nomenklatura Na rozdíl od serologické nomenklatury, která má maximálně dva číslicové znaky označující HLA specifitu, může být označení HLA alel dvou či vícemístné. Např.: HLA-A*02, HLA-A*0201 První dvě číslice za * označují serologickou specifitu, poslední dvě číslice (příp. více) označují konkrétní alelu (Tesařová, E. et al., 2007). 25

3.8 Vztah HLA systému k chorobám Počátkem 70. let byl odhalen biologický význam HLA komplexu s ohledem na autoimunitní imunopatologickou reaktivitu člověka. Penetrace nemoci v přítomnosti alely, která podmiňuje rozvoj choroby není 100%. Ve většině případů je naopak nízká. Tuto skutečnost dokresluje i fakt, že monozygotní dvojčata, které nesou identické alely na všech lokusech, mají shodu v přítomnosti autoimunitních imunopatologických nemocí v rozmezí 15-30%. Genetická podmíněnost nemoci určuje, že pravděpodobnost rozvoje choroby v průběhu života je větší, je-li přítomna alela asociovaná s chorobou, než pokud tato alela přítomna není. Stejně tak jako existují lidé, kteří nesou alelu asociovanou s chorobou, a přesto se u nich onemocnění nevyvine, tak existují lidé, kteří nenesou asociovanou alelu a vyvine se u nich dané onemocnění (Tesařová, E.et al., 2007). Výrazným přelomem byl rok 1973, kdy se překvapivě našla vysoká asociace mezi antigenem W27 (dnes HLA-B27) a M. Bechtěrev prakticky všichni pacienti vlastnili tento antigen (Buc, M., 1997). Následovně bylo popisováno ještě mnoho dalších spojení mezi HLA komplexem a nemocemi, ačkoli patogenní mechanismus nemocí zůstává neurčený (Browning, M.J., McMichael, A.J., 1996). Jedná se o choroby, při kterých mají v etiopatogenezi důležitou úlohu imunitní mechanizmy, anebo se jejich autoimunitní původ předpokládá. Na druhé straně se asociace pozoruje i s chorobami, u kterých je etiopatogeneze neznámá, resp. s chorobami, při kterých se imunopatogenetický mechanizmus neuplatňuje vůbec. (Buc, M., 1997). 26

Tab.č. 2 Přehled nejdůležitějších asociací mezi HLA antigeny a chorobami Choroba HLA-antigen Pacienti HLA- B27 poz. % Kontroly HLA- B27 poz. % Relativní riziko Narkolepsie DQ6 100 25 297 Narkolepsie DR2(15) 98 26 130 Morbus Bechtěrev B27 96 9 87 Diabetes mellitus DR3/DR4 32 1 47 Morbus Reiter B27 79 9 37 (upraveno dle Buc, M., 1997: Klinická imunológia, 1997) Asociace některé choroby s HLA-antigeny se vyjadřuje relativním rizikem (RR). RR označuje, kolikrát se určité onemocnění vyskytuje častěji u lidí vlastnících příslušný antigen oproti osobám, které tento antigen nemají (Buc, M., 1997). Choroby asociované s HLA komplexem jsou polygenně podmíněné a multifaktoriální (obr. č. 4). Mezi geny, které se zúčastňují vnímavosti jedince k chorobě, patří jednak samotné geny HLA komplexu, jednak geny, které se nacházejí v HLA-genetické oblasti, ale k samotnému HLA systému nepatří (komplement, enzymy a jiné) a geny přítomné na jiných chromosomech (geny pro antigenový receptor T-lymfocytů, imunoglobuliny, adhezivní molekuly, cytokiny a jejich receptory). Genetická predispozice se projeví jenom tehdy, když se jedinec dostane do prostředí, ve kterém faktory působí jako spouštěcí mechanismus vedoucí ke klinickým projevům choroby (Buc, M., 1997). 27

Obr. č. 4 Vlivy působící na vznik choroby Non-HLA geny CHOROBA HLA geny Faktory prostředí (zpracováno dle Buce, M., 1997, Klinická imunológia) Asociací HLA komplexu s chorobami se využívá v medicíně: K diagnostice K prevenci a prognostice V léčbě K objasnění etiologie a patogeneze 28

K diagnostice se asociace nemocí s HLA antigeny využívá především u chorob, kde asociace dosahuje vysokých hodnot. Vyšetření se provádí u nejasných případů, nebo při začínajících příznacích onemocnění. Určení HLA antigenů může mít prognostickou a preventivní hodnotu. Např. u pacientů trpících sklerózou multiplex, kteří mají současně HLA-DR2 a HLA- DR3, onemocnění postupuje rychleji (Buc, M., 1997). U jiného onemocnění může přítomnost antigenu znamenat, že pacient bude lépe reagovat na určitou léčbu, ve srovnání s pacientem, který bude na stejný antigen negativní. 3.9 Antigen HLA-B27 a choroby Vztah mezi antigenem HLA-B27 a mnoha onemocněními doposud není plně objasněn. Kromě ankylozující spondylitidy (Bechtěrevova choroba, spondyloartritida) byl zvýšený výskyt antigenu HLA-B27 zjištěn i u dalších chorob, např. Reiterova syndromu a uveitidy. Populační studie potvrdily, že asociace mezi antigenem HLA-B27 a AS, respektive séronegativními spondylartritidami, je možné pozorovat ve všech rasových a etnických skupinách. Mezi populacemi však existují rozdíly ve frekvenci výskytu antigenu HLA-B27 (tab. č. 3), a v míře asociace. V populaci s vyšší frekvencí antigenu HLA-B27 je zpravidla vyšší i frekvence AS a výraznější asociace s HLA-B27 než u populací s nižší frekvencí antigenu HLA-B27. Incidence AS tedy přibližně koreluje s prevalencí antigenu HLA-B27. Nejvýraznější asociace s AS se pozoruje v bělošské populaci kavkazského původu, slabší u mongoloidů. U černochů se 29

vyskytuje zřídka antigen HLA-B27 i AS. V některých původních nesmíšených populacích v Jižní Americe, rovníkové Africe a Austrálii se dokonce nevyskytuje ani antigen HLA-B27 a pravděpodobně ani AS (Bošák, V., 1999). Rozdíly ve výskytu antigenu HLA-B27 v různých populacích popisuje tabulka číslo 3. Tab. č. 3 Zastoupení antigenu HLA-B27 v různých etnických skupinách Populace Frekvence výskytu antigenu HLA-B27 Kavkazská populace 7,50% Černoši Severní Ameriky 2,60% Japonci 0,80% Číňani 3,40% Hispánci 4,90% (Zdroj: The Central Data Analysis Committee, Allele Frequencies, Section 6,3, Splitis Comlined (Five loci), In: The Date Book of the 11th International Histocompatibility Workschop: Yokohame, 1991, 2, 807-14) V současné době je definováno dvanáct alelových variant antigenu HLA-B27 (Tesařová, E. et al., 2007). Základní subtypy, které se vyskytují v české populaci, jsou B*2705 a B*2702, obě alely jsou asociované s ankylozující spondylitidou (Tab. č. 4). Jednotlivé alelové varianty se mezi sebou liší pouze v aminokyselinách a v míře asociace s AS, což popisuje tabulka č. 4. 30

Tab.č. 4 Asociace alelových variant antigenu HLA-B27 Subtyp Asociace s AS *2701 Ano *2702 Ano *2703 Ne *2704 Ano *2705 Ano *2706 Ne *2707 Pravděpodobně ano *2708 Není známo *2709 Ne (Zdroj: Browning, M.J., McMichael, A.J., 1996: HLA and MHC: genes, molecules and function, 1996) Pro asociaci antigenu HLA-B27 s ankylozující spondylitidou existuje několik hypotéz, například Buc (1997) uvádí tyto hypotézy: Fenomén molekulového mimikri a křížové reaktivity Fenomén molekulového mimikri označuje identitu mezi některými HLAantigeny a infekčním agens. Tato teorie vychází z předpokladu, že proti antigenu se nevyvine imunologická reakce a mikroorganismus může patologicky působit. Tato úvaha je však spíše teoretická. Další možností je vznik imunitní odpovědi, která je namířená proti mikroorganismu i proti vlastním tkáním. Předpokládá napadení organismu baktérií, která má povrchové znaky podobné antigenu HLA-B27. Začne obranná reakce, při které se vytváří protilátky a dojde ke zničení bakterií. Pokud však nastane setkání protilátek s antigenem HLA-B27 budou zničeny i buňky tělu vlastní, jež nesou tento antigen. 31

Konkrétně u nitrogenázy bakterie Klebsiella pneumoniae, která byla izolována od nemocných s ankylozující spondylitidou, byl identifikován stejný epitop jako u antigenu HLA-B27. Také bylo zjištěno, že antiklebsielové protilátky s epitopem na antigenu HLA-B27 opravdu mohou reagovat, jelikož epitop se nachází ve vnější části α1-domény. Tyto závěry nasvědčují tomu, že ankylozující spondylitida je autoimunitním onemocněním. Předpokládá se, že proti bakterii vzniká imunitní odpověď, která je lokalizována v uzlinách v blízkosti lumbální páteře, dochází tak k velké koncentraci protilátek. Po vazbě protilátek na antigen dojde k aktivaci komplementu a vznikne zánětlivý proces. Prezentace patologického imunogenního peptidu Tato hypotéza předpokládá, že ve žlábku antigenu HLA, do kterého se váže prezentovaný imunogenní fragment, nastanou odlišnosti v biochemické struktuře. Tyto rozdíly zapříčiní nové antigenně-prezenční schopnosti, a tím zároveň také odlišnost v imunitní odpovědi. Žlábek molekuly HLA-B27, se v porovnání s jinými molekulami HLA I. třídy, navíc vyznačuje specifickým B-vřeckem, v kterém je lokalizováno 6 aminokyselin (His9, Glu45, Cys67, Lys70, Ala71, Asn97). Antigen tedy váže jen pro něj charakterisktický imunogenní fragment, předkládá jej T-lymfocytům, které tak začínají celý imunopatologický proces. Předpokládá se, že prezentovaný peptid pochází z proteinu nějakého mikroorganismu (chlamýdie, mykobakterie, enterobakterie) a při jeho opracování v APC se vytvoří takový fragment, který má stejnou strukturu jako imunogenní peptid některého autologního antigenu 32

Jednotlivé subtypy antigenu HLA-B27 se ve své struktuře liší v aminokyselině, což může mít vliv na vazbu imunogenního fragmentu a následné imunitní mechanismy. Je to také pravděpodobně důvod, proč např. subtyp HLA- B*2703 je s ankylozující spondylitidou negativně asociován. Ankylozující spondylitida je chronické systémové zánětlivé onemocnění pohybového ústrojí. Tato degenerativní choroba postihuje především páteř a sakroiliakální klouby, může způsobit až srůst obratlů. Patří do skupiny autoimunitních spondyloartropatií. Poprvé byla popsána v roce 1893 ruským neurologem Vladimírem Bechtěrevem. V celkové populaci se toto onemocněním vyskytuje přibližně v 0,5% a až 95% nemocných má antigen HLA-B27. Tato choroba postihuje obvykle mladé muže. Onemocnění se rozvíjí ve věku mezi 15 až 30 lety. Po 35. roce je začátek onemocnění velmi vzácný a po 40. roce se již prakticky nevyskytuje. Typický začátek onemocnění se projevuje chronickou bolestí v kříži a ranní ztuhlostí kloubů. Dochází k omezení pohybu páteře. V pokročilé fázi nemoci dochází k vyhlazení bederní lordózy, snížení hybnosti hrudníku, zvýraznění hrudní kyfózy a prohloubení lordózy krční s předsunutím hlavy. Jednotlivé obratle srůstají vlivem osifikace. U nemocných je typické shrbené držení těla. Při rentgenu kloubů zjišťujeme osteoporózu, v pokročilém stádiu nemoci zaniká kloubní štěrbina (Stites, D. P., Terr, A. I., 1991). U poloviny nemocných dochází také k postižení periferních kloubů, nejčastěji kyčelních (Marada, T., 2004). Ankylozující spondylitidu řadíme k revmatickým chorobám s autoimunní složkou, u těchto nemocí jsou typické komplikace, které jsou představovány zejména orgánovým postižením. Může tedy dojít také k srdečním abnormalitám, 33

jako je hypertrofie levé komory, fibrózní ztluštění stěny aorty a báze cípů chlopní. Výjmečně dochází k perikarditidě nebo myokarditidě. (Stites, D. P., Terr, A. I., 1991). Ve 40% případů je ankylozující spondylitidy sdružená s iridocyklitidou, která způsobuje oční bolest a fotofobii (zvýšená citlivost na světlo). Dále se mohou objevovat opakované ústní vředy (afty) a únava. Ankylozující spondylitida je také asociovaná s ulcerózní kolitidou, Crohnovou nemocí a Reiterovou chorobou. Vyšetření antigenu HLA-B27 je pomocným diagnostickým testem, zvláště v počátcích onemocnění a slouží jen pro vyloučení diagnózy AS. Ti, kteří antigen HLA-B27 mají, jsou ve vysokém riziku. Tento antigen má asi 7% bělochů, ovšem jen u 3% se onemocnění opravdu rozvine. Pokud jsou nemocní HLA-B27 pozitivní, tak choroba se projeví v mladším věku, než u nemocných se stejnou diagnozou, kteří jsou však HLA-B27 negativní. 34

Reiterův syndrom Patří k dalším onemocněním, u nichž byla zjištěna asociace s antigenem HLA-B27. Relativní riziko u této choroby je ovšem mnohem nižší než u ankylozující spondylitidy, např. dle Buce (1999), je relativní riziko 37. Reiterův syndrom je označení pro stav, kdy je u pacienta kromě artritidy přítomen také zánět močové trubice (uretritida) a zánět očních spojivek (konjunktivitida). Všechny tři projevy se nemusí vyskytovat současně, pokud je artritida spojena pouze s jedním projevem označujeme stav jako inkompletní Reiterův syndrom. O Reiterově tetrádě mluvíme naopak v případě, kdy je stav rozšířen o dermatózu, která se může projevit afty v ústech, kožními změnami na trupu nebo změnami na ploskách nohou a dlaních. Onemocnění postihuje převážně mladé muže. Uveitida Uveitida je obecný název pro zánětlivé onemocnění duhovky, řasnatého tělíska, cévnatky a sítnice. Uveitida je celosvětovým onemocněním, postiženi jsou především lidé středního věku (20-40 let). Postižení přední části oka (zánět řasnatého tělíska a duhovky) je asociováno s antigenem HLA-B27. Relativní riziko dle Buce (1999) je u této choroby 10,4. Mezi příznaky onemocnění patří zarudlé oči, rozostřené vidění, citlivost na světlo, oční bolest. 35

IV. MATERIÁL A METODY 4.1 Typizace antigenu HLA-B27 serologicky Princip metody: Typizace antigenu HLA-B27 metodou lymfocytotoxického testu. Reakce probíhá mezi specifickým sérem (protilátkou) a antigenem buněčné membrány lymfocytů. Na komplex antigen-protilátka se naváže komplement, dojde k porušení buňky, k jejímu usmrcení, mrtvá buňky se při vitálním barvení zabarví trypanovou modří na modro. Živé buňky zůstávají neobarveny. Vzorek: k vyšetření se používá žilní nesrážlivá krev pacienta (dárce kostní dřeně) Postup Příprava suspenze lymfocytů do zkumavky se napipetují 3 ml vrstvícího roztoku Ficcol-Urografin, po stěně zkumavky se opatrně navrství 5 ml krve ředěné 1:3 barbitalovým pufrem a centrifuguje se 20 min. při 3000 otáčkách za min. Po centrifugaci se Pasteurovou pipetou odsaje bílý prstenec lymfocytů do kónické zkumavky, naředí se barbitálovým pufrem (5 ml), promíchá se a centrifuguje se 10 min. při 2000 otáčkách za min. Poté se slije supernatant a vzorek se naředí 5 ml barbitalového pufru, promíchá se a opakovaně centrifuguje 10min. při 2000 otáčkách za min. Vzniklý supernatant se slije, odsaje do buničité vaty a sediment se resuspenduje v přibližně v 0,5 1ml barbitalového pufru, tak, aby při prohlížení 36

v mikroskopu v jednom středním čtverci Bürkerovy komůrky bylo 12 až 15 buněk. Vlastní provedení testu na Terasakiho plotny s předem rozkapanými typizačními anti-hla séry se rozkape Hamiltonovou pipetou 1µl lymfocytární suspenze. Nakapané desky se inkubují 30 min. v termostatu při teplotě 22 o C. Po inkubaci se přidá 5µl králičího komplementu a opět inkubujeme při stejné teplotě, nyní však 60 min. Po inkubaci se sklepne z Terasakiho desek olej a do jamek se napipetuje po 1µl naředěného pracovního roztoku trypanové modři a nechá se 10 min. probarvit. Hodnocení: hodnocení probíhá mikroskopicky, kdy v jednom zorném poli je vidět jedna jamka. Mrtvé buňky jsou pozorovány jako větší a tmavé, živé buňky jsou naopak světlé a menší. Reakce se v každé jamce hodnotí na základě číselného skórovacího systému (číselně je hodnoceno procento mrtvých buněk v jamce). Tab. č. 5 Hodnotící tabulka Procento mrtvých buněk Skóre Interpretace 0-20 1 negativní 21-30 2 pradvěpodobně negativní 31-50 4 slabě pozitivní 51-80 6 pozitivní 81-100 8 silně pozitivní nehodnotitelné 0 37

4.2 Zpracování získaných dat Ve své bakalářské práci jsem použila ke zpracování dat program Excel. Ve zpracování dat jsem vycházela ze dvou souborů: Kontrolní skupina tvořili ji zdraví, nepříbuzní jedinci, dárci kostní dřeně. V této skupině bylo celkově 1057 jedinců, u kterých byla provedená HLAtypizace. Pacienti soubor 1040 jedinců, kteří byli vyšetření na průkaz antigenu HLA- B27. Všichni jedinci zařazení do testu, dárci kostní dřeně i pacienti, byli vyšetřování serologickou metodou. Z časových důvodů jsem vyšetření u pacientů a dárců kostní dřeně neprováděla, ale zpracovala jsem pouze výsledky vyšetřených osob. Soubory byly tvořeny z jedinců, kteří se na vyšetření na TO a KB Brno dostavili v letech 2005, 2006 a 2007. Vycházela jsem ze souboru přibližně tisíce jedinců v každé skupině, z tohoto důvodu jsem do testu zahrnula všechny pacienty a dárce kostní dřeně z let 2006 a 2007, ale jen část pacientů a dárců kostní dřeně z roku 2005, kteří soubor doplnili. Pro výpočet relativního rizika u pacientů s ankylozující spondylitidou byl soubor pacientů rozšířen, jelikož v souboru 1040 pacientů se nevyskytoval dostatečný počet jedinců s diagnózou AS. Aby byl počet relevantní, rozšířila jsem základní soubor pacientů o 4535 pacientů, u kterých byl v letech 2004, 2005, 2006 a 2007 vyšetřen antigen HLA-B27 metodou PCR a o pacienty z roku 2004, jenž 38

byli vyšetřeni serologickou metodou. Z tohoto rozšířeného souboru, obsahujícího 5575 pacientů jsem pro výpočet relativního rizika a pro zjištění frekvence výskytu antigenu HLA-B27 u nemocných s ankylozující spondylitidou použila pouze pacienty s diagnózou AS (783 pacientů). Pro výpočet relativního rizika jsem použila následující vzorec: RR= (a / (a+c) / b /(b+d)) Pacienti s alelou...a Kontroly s alelou...b Pacienti bez alely...c Kontroly bez alely...d (Thompson end Thompson, 2004) 39

V. VÝSLEDKY 5.1 Zmapování výskytu antigenu HLA-B27 v moravské populaci zdravých osob a v populaci pacientů Tab. č.6 Výskyt antigenu HLA-B27 v kontrolní skupině a u pacientů Kontrolní skupina Pacienti Počet Procenta Počet Procenta HLA-B27 negativní 964 91,2% 837 80,5% HLA-B27 pozitivní 93 8,8% 203 19,5% Celkem 1057 100,0% 1040 100,0% Graf č.1 Výskyt antigenu HLA-B27 v kontrolní skupině a u pacientů 40

Ze souboru pacientů bylo HLA-B27 pozitivních 203 (19,5% ) jedinců a negativních 837 (80,5%) jedinců. V kontrolní skupině bylo pozitivních jedinců o 10,7% méně, pouze 93 (8,8%) a negativních bylo 964 (91,2%). 41

5.2 Výskyt antigenu HLA-B27 u pacientů s diagnózou ankylozující spondylitidy Tab. č.7 Výskyt antigenu HLA-B27 u pacientů s AS a v kontrolní skupině Kontrolní skupina Pacienti s AS Počet Procenta Počet Procenta HLA-B27 negativní 964 91,2% 635 81,1% HLA-B27 pozitivní 93 8,8% 148 18,9% Celkem 1057 100,0% 783 100,0% Graf č.2 Výskyt antigenu HLA-B27 u pacientů s AS a v kontrolní skupině 42

Z celkového počtu 5575 pacientů jich bylo 783 s diagnózou AS. Z těchto 783 pacientů bylo 635 (81,1%) pacientů negativních a 148 (18,9%) pacientů bylo pozitivních. Kontrolní skupina se shoduje se souborem použitým pro zmapování výskytu antigenu HLA-B27 v moravské populaci zdravých osob. Výpočet relativního rizika na základě získaných výsledků: RR=2,17. 43

5.3 Frekvence výskytu antigenu HLA-B27 ve vztahu k diagnóze pacienta Tab. č. 8 Přehled skupin diagnóz u HLA-B27 pozitivních pacientů Skupina diagnóz Počet Procenta Nemoci svalové a kosterní soustavy 178 87,7% Nemoci oka a očních adnex 22 10,8% Nemoci nervové soustavy 3 1,5% Celkem 203 100,0% Graf č. 3 Srovnání výskytu skupiny diagnóz u HLA-B27 pozitivních pacientů 44

Na základě sborníku Mezinárodní klasifikace nemocí bylo u celkově 203 HLA-B27 pozitivních pacientů stanoveno 47 odlišných diagnóz, které se dělí do tří skupin: 1. Nemoci svalové a kosterní soustavy (kód M) 2. Nemoci oka a očních adnex (kód H) 3. Nemoci nervové soustavy (kód G) Ve skupině nemocí svalové a kosterní soustavy je zastoupeno 36 různých diagnóz, které mělo 176 pacientů Ve skupině nemoci oka a očních adnex je zahrnuto 8 odlišných diagnóz, které mělo 22 pacientů V poslední skupině, nemoci nervové soustavy, byly pouze 3 diagnózy, které měly 3 pacienti Tab. č.9 Zastoupení jednotlivých diagnóz u HLA-B27 pozitivních pacientů Kód diagnózy Název Počet Procento M790 Revmatismus, NS 57 28,1% M545 Bolesti dolní části zad 28 13,8% M45 Ankylozující spondylitida 16 7,9% H200 Akutní a subakutní iridocyklitis 14 7,4% M139 Artritis, NS 11 5,4% M469 Zánětlivá spondylopatie 7 3,4% M468 Jiné určené zánětlivé spondylopatie 5 2,5% M549 Dorzalgie, NS 5 2,5% M460 Spinální entézopatie 4 1,9% M541 Radikulopatie 4 1,9% Ostatní 52 25,6% Celkem 203 100% 45

Graf č. 4 Zastoupení nejčastějších diagnóz u HLA B27 pozitivních pacientů Tabulka číslo 9 popisuje nejčastější diagnózy. Jsou v ní uvedeny počty jedinců, kteří byli HLA-B27 pozitivní a měli danou diagnózu. Procento je vztaženo ke všem HLA-B27 pozitivním pacientům. Nejčastější byla diagnóza M790-revmatismus, tuto diagnózu mělo 57 pacientů, další nejpočetnější diagnózou byla diagnóza M545-bolesti dolní části zad, která byla stanovena u 28 pacientů, 16 pacientů přišlo na vyšetření s diagnózou M45-ankylozující spondylitidy, 14 pacientů bylo s diagnózou H200-akutní a subakutní iridocyklitis, diagnózu M139-artritis mělo 11 pacientů, 7 pacientů bylo s diagnózou M469-zánětlivá spondylopatie, 5 pacientů mělo diagnózu M468-jiné určené zánětlivé spondylopatie, u dalších 5 pacientů byla diagnóza M549-46

dorzalgie, u 4 pacientů byla stanovena diagnóza M460-spinální entézopatie a diagnózu M541-radikulopatii měli také 4 pacienti. Z ostatních mělo 26 pacientů diagnózu, která se u HLA-B27 pozitivních pacientů vyskytovala jenom jednou, jednalo se tedy o 26 různých diagnóz, např. jiná reakční artropatie, séropozitivní revmatická artritida, juvenilní revmatická artritida, lordóza, cervikokraniální syndrom atd Některé diagnózy se vyskytovaly pouze dvakrát, např. reakční artropatie, bolest v hrudní páteři, iridocyklitis. Čtyři diagnózy se mezi vyšetřenými pacienty opakovaly třikrát, jednalo se o dnu, jiné určené artritidy, bolest v kloubu a dorzopatie Tab. č. 10 Frekvence výskytu antigenu HLA-B27 u jednotlivých diagnóz Diagnóza Pozitivní Negativní % Počet % Počet Celkem H200 Akutní a subakutní iridocyklitis 56,0% 14 44,0% 11 25 M469 Zánětlivá spondylopatie 53,9% 7 46,1% 6 13 M139 Artritis, NS 42,3% 11 57,7% 15 26 M541 Radikulopatie 40,0% 4 60,0% 6 10 M45 Ankylozující spondylitida 32,7% 16 67,3% 33 49 M545 Bolesti dolní části zad 27,7% 28 72,3% 73 101 M468 Jiné určené zánětlivé 26,3% 5 73,7% 14 19 spondylopatie M460 Spinální entézopatie 21,1% 4 79,0% 15 19 M790 Revmatismus, NS 18,8% 57 81,2% 246 303 M549 Dorzalgie, NS 15,6% 5 84,4% 27 32 Celkem 25,4% 151 74,6% 446 597 47

Graf č. 5 Frekvence výskytu antigenu HLA-B27 u nejčastějších diagnóz V tabulce číslo 10 je uvedeno, kolik pacientů bylo u deseti nejčastějších diagnóz HLA-B27 pozitivních a kolik jich bylo negativních, čísla jsou v procentech a v absolutních číslech. V tabulce je také uvedeno, s jakou diagnózou jsou pacienti nejčastěji posílání na vyšetření antigenu HLA-B27. V grafu č. 5 je znázorněno procento HLA-B27 negativních a pozitivních pacientů u každé diagnózy. U diagnózy H200-akutní a subakutní iridocyklitidy je nejvyšší procento HLA-B27 pozitivních jedinců (57,69%), vysoké procento pozitivních pacientů je také u jedinců s diagnózou zánětlivá spondylopatie. (53,85%) a u pacientů s radikulopatií, kde je pozitivních 40%. 48

Nejčastěji jsou na vyšetření antigenu HLA-B27 posílání pacienti s diagnózou revmatismu (303 pacientů), dále s bolestmi zad (101) a ankylozující spondylitidou (49). 49

VI. DISKUSE Prvním cílem v mé práci bylo zmapování výskytu antigenu HLA-B27 ve zdravé moravské populaci. Výsledek, který jsem získala (8,8%), se téměř shoduje s literárními údaji, např. Shoenfeld, Fučíková, Bartůňková, (2007) píší: frekvence v bělošské populaci je asi 9%. Bošák (1999) udává vyskyt antigenu v 8,9% ( u slovenské populace). Dále jsem se zaměřila na to, jaký bude rozdíl ve výskytu antigenu HLA-B27 u zdravých jedinců a u nemocných. Oba soubory byly přibližně stejně početné, ale ve skupině pacientů se antigen HLA-B27 vyskytoval 2krát častěji. U zdravých jedinců se tedy antigen HLA-B27 nacházel v 8,8%, u pacientů v 19,5% (Tab. č.6). Tento výsledek však nemohu porovnat s jinými výsledky, neboť jsem nenalezla práci zabývající se otázkou výskytu antigenu HLA-B27 u pacientů s různými diagnózami. Dalším cílem mé práce bylo zjistit frekvenci výskytu antigenu HLA-B27 u pacientů s AS. Vybrala jsem celkově 783 pacientů, kteří měli na žádance o vyšetření uvedenou diagnózu M45-Ankylozující spondylitida. V této skupině bylo 81,1% HLA-B27 negativních pacientů a pouze 18,9% pozitivních pacientů (Tab. č.7). Výsledek mého výzkumu v této oblasti se neshoduje s literárními údaji. Např. Bošák (1999) uvádí: průměrná frekvence HLA-B27 u nemocných je 97%, Buc (1997) uvádí, že 96% pacientů s AS má antigen HLA-B27. Přestože pouze 18,9% pacientů s diagnózou AS bylo HLA-B27 pozitivních, pokusila jsem se o vypočet relativního rizika u této choroby. V literatuře se udává relativní riziko u ankylozující spondylitidy 87,4 (podle Buce, M., 1997). Literární 50

údaje se však nepodařilo potvrdit. Relativní riziko bylo menší než 10. Tento výsledek může být ovlivněn udávanou diagnózou ze strany lékařů, příčinou může být také velikost zpracovávaného souboru a také fakt, že pacienti, u kterých se předpokládá onemocnění AS, mohou být na vyšetření posláni pod jinou diagnózou (např. bolesti zad apod.). Slavčev také píše, že testování antigenu HLA-B27 se používá pouze pro vyloučení diagnózy AS. V případě, že pacient má revmatické bolesti zad a je B27 negativní, je velmi nepravděpodobné, že bude mít AS. Naopak, pokud je pacient B27 pozitivní, diagnóza AS je možná, ne však prokázána Posledním cílem v mé práci bylo sledování frekvence výskytu antigenu HLA-B27 ve vztahu k diagnóze pacienta. Nejvíce byl antigen HLA-B27 zastoupen u diagnózy revmatismus (28,1% všech HLA-B27 pozitivních mělo tuto diagnózu), bolesti dolní části zad (13,8%), ankylozující spondylitida (7,9%) a akutní a subakutní iridocyklitida (7,4%). Ani tyto výsledky nemohu porovnat, protože jsem nenalezla žádnou práci zabývající se touto problematikou. 51

VII. ZÁVĚR V mé práci jsem si stanovila tři cíle, a ke každému cíli byla stanovena jedna hypotéza. V mé první hypotéze předpokládám, že výskyt antigenu HLA-B27 v moravské populaci je cca 9%. Tato hypotéza byla výsledky mého výzkumu potvrzena. V druhé hypotéze předpokládám, že antigen HLA-B27 se bude vyskytovat u pacientů častěji, než u kontrolní skupiny a více než 95% pacientů s ankylozující spondylitidou je HLA-B27 pozitivní. Druhá hypotéza se potvrdila pouze částečně. V souboru pacientů se antigen HLA-B27 vyskytoval ve vyšší frekvenci než u kontrolní skupiny (19,5% versus 8,8%), ale u pacientů s AS, kde se předpokládalo nejvyšší procento HLA-B27 pozitivních, se tato část hypotézy nepotvrdila. V mé třetí hypotéze předpokládám, že antigen HLA-B27 je asociovaný především s nemocemi svalové a kosterní soustavy, s nemocemi oka a očních adnex, a očekávám tak, že právě tyto diagnózy se budou vyskytovat nejčastěji. Tato hypotéza se potvrdila. I když je asociace mezi antigenem HLA-B27 a chorobami již dávno prokázaná, přesný mechanismus, který spojení mezi HLA systémem a nemocemi podmiňuje, stále nebyl odhalen. Výzkum v této oblasti povede k výraznému pokroku v objasnění původu, příčin a vývoje autoimunitních onemocnění a také v jejich léčbě. 52

Seznam použité literatury a pramenů BARTŮŇKOVÁ, J., PAULÍK, M., A KOL. Vyšetřovací metody v imunologii Praha: Grada Publishing, 2005 ISBN 80-247-0691-1, s.129-131 BROWNING, M.J.,, MCMICHAEL A.J. HLA and MHC: genes, molecules and function Oxford: Scientific Publishers Ltd, 1996, s 24-32 BUC, MILAN Klinická imunológia Bratislava: Veda, 1997 ISBN 80-220-0487-X, s. 32, 133, 134, 137, 138, 141, 148, 149 FERENČÍK M., ROVENSKÝ J., SHOENFELD Y. Imunitní systém Praha: Grada Publishing, 2005 HOŘEJŠÍ, VÁCLAV, BARTŮŇKOVÁ, JIŘINA Základy imunologie Praha: Triton, 2005 ISBN 80-7254-686-4, s. 66-75 JAMESON, J., LARRY Principles of Molecular Medicine Humana press, 1998 ISBN 0896035298, s. 273-274 KREJSEK, JAN, KOPECKÝ, OTAKAR Klinická imunologie Nucleus HK, 2004 ISBN 80-86225-50-X 53

SHOENFELD, Y., FUČÍKOVÁ, T., BARTŮŇKOVÁ, J., Autoimunita vnitřní nepřítel Praha: Grada Publishing, 2007 ISBN 978-80-247-2044-9 s. 26 PASSARGE, EBERHARD Color Atlas of Genetics Thieme, 2001 ISBN 0865779589 s. 308 SILVER, JACK Molecular Biology of HLA Class II Antigens CRC Press, 1990 ISBN 0849347858 s. 2-5 SMARDA, J., DOŠKAR, J., PANTŮČEK, R., RŮŽIČKOVÁ V. Metody molekulární biologie Brno: IMU, 2005 ISBN 210-3841-1, s.73 STITES, P., DANIEL, TERR, I., ABBA Základní a klinická imunologie Victoria Publishing, 1991, ISBN 80-85605-37-6 TAK W. MAK, JOHN J. L. SIMARD Handbook of Immune Response Genes Birkhäuser, 1998 ISBN 0306456478 TESAŘOVÁ, E. et al, Transfuzní lékařství a imunohematologie, Handout, 2007 s. 54, 56-65, 70-71 THOMPSON AND THOMPSON Klinická genetika Praha: Triton, 2004, s 289 54