1.6.1.4 Druhová diferenciace... 22 1.6.2 Rod Leuconostoc... 22 1.6.2.1 Víno a rod Leuconostoc... 23 1.6.2.2 Izolace z vína a uchovávání... 23 1.6.2.

OBSAH OBSAH... 1 1. ÚVOD... 5 1.1 Víno... 5 1.2 Historie vína a révy vinné... 5 1.3 Výroba červeného vína... 7 1.3.1 Sklizeň... 7 1.3.2 Doprava a příjem hroznů... 7 1.3.3 Zpracování hroznů... 7 1.3.3.1 Odstopkování... 7 1.3.3.2 Drcení... 8 1.3.3.3 Síření... 8 1.3.4 Kvašení... 8 1.3.5 Zrání vína v sudech... 9 1.3.6 Ošetřování a stabilizace vína... 9 1.3.6.1 Stáčení... 10 1.3.6.2 Číření vína... 10 1.3.6.3 Úprava obsahu oxidu uhličitého... 10 1.3.7 Čištění vína a filtrace... 10 1.4 Vady a choroby vína... 10 1.4.1 Choroby vína... 11 1.4.2 Vady vína... 11 1.5 Bakterie v procesu výroby vína... 12 1.5.1 Bakterie mléčného kvašení (BMK) a jablečno-mléčné kvašení... 13 1.5.2 Vzájemné vztahy mezi bakteriemi a dalšími mikroorganismy ve víně... 17 1.5.2.1 Výskyt mikroorganismů během výroby vína... 17 1.5.2.2 Vzájemné reakce mezi bakteriemi mléčného kvašení... 17 1.5.2.3 Vzájemné vztahy mezi bakteriemi mléčného kvašení a Saccharomyces... 18 1.6 Jednotlivé rody bakterií mléčného kvašení... 19 1.6.1 Rod Lactobacillus... 19 1.6.1.1 Víno a rod Lactobacillus... 19 1.6.1.2 Izolace z vína a uchovávání... 21 1.6.1.3 Odlišení rodu Lactobacillus od ostatních bakterií mléčného kvašení... 21 1

1.6.1.4 Druhová diferenciace... 22 1.6.2 Rod Leuconostoc... 22 1.6.2.1 Víno a rod Leuconostoc... 23 1.6.2.2 Izolace z vína a uchovávání... 23 1.6.2.3 Odlišení rodu Leuconostoc od ostatních bakterií mléčného kvašení... 24 1.6.2.4 Druhová diferenciace... 24 1.6.3 Rod Oenococcus... 25 1.6.3.1 Víno a rod Oenococcus... 25 1.6.3.2 Izolace z vína a uchovávání... 27 1.6.3.3 Odlišení rodu Oenococcus od ostatních bakterií mléčného kvašení... 27 1.6.3.4 Druhová diferenciace... 28 1.6.4 Rod Pediococcus... 28 1.6.4.1 Víno a rod Pediococcus... 29 1.6.4.2 Izolace z vína a uchovávání... 29 1.6.4.3 Odlišení rodu Pediococcuss od ostatních bakterií mléčného kvašení... 29 1.6.4.4 Druhová diferenciace... 30 1.7 Identifikace bakterií mléčného kvašení... 30 1.8 Schisosacchcaromyces pombe a Saccharomyces cerevisiae... 31 1.9 Bakterie octového kvašení... 32 1.9.1 Bakterie octového kvašení a víno... 32 1.9.1.1 Bakterie octového kvašení a červené víno... 34 1.9.1.2 Bakterie octového kvašení a kažení vína... 35 1.10 Metoda MALDI -TOF MS... 36 2. CÍLE DIPLOMOVÉ PRÁCE... 39 3. MATERIÁL A METODY... 40 3.1 Použité vzorky vína... 40 3.2 Kultivační média... 41 3.3.1 Testování citlivosti na antimykotikum nystatin... 43 3.4 Kultivace mikroorganismů... 44 3.5 Uchovávání mikroorganismů... 45 3.6 Použité přístroje... 45 3.7 Základní diagnostické testy... 46 3.7.1 Makroskopie kolonií... 46 3.7.2 Barvení dle Grama... 46 2

3.7.3 Mikroskopie kolonií... 47 3.7.4 Identifikace bakterií mléčného kvašení... 48 3.7.4.1 KOH test... 48 3.7.4.2 Růst v MPB... 48 3.7.4.3 Katalázový test... 48 3.7.4.4 Růst při 15 C a při 45 C... 49 3.7.4.5 Tvorba NH 3 z argininu... 49 3.7.4.6 Hydrolýza eskulinu... 50 3.7.4.7 Tvorba plynu z glukosy... 51 3.7.4.8 Tvorba plynu z glukonátu... 52 3.8 Metoda MALDI-MS... 53 3.8.1 Metoda etanolové extrakce... 53 3.9 Typové kultury... 54 3.10 Doplňující diagnostické testy... 54 3.10.1 Růst při ph 4,8... 54 3.10.2 Růst v 10 % etanolu... 55 3.10.3 Fermentace cukrů... 55 3.10.4 API 50 CH... 56 3.11 Identifikace bakterií octového kvašení... 58 4. VÝSLEDKY... 59 4.1 Izolace bakterií z vína... 59 4.2 Testování citlivosti na antimykotikum nystatin... 59 4.3 Základní diagnostické testy... 60 4.3.1 Makroskopie a mikroskopie kolonií... 60 4.3.2 KOH test, růst v MPB, katalázový test, růst při 15 C a při 45 C... 64 4.3.3 Tvorba plynu z glukosy a glukonátu... 67 4.3.4 Tvorba NH 3 z argininu a hydrolýza eskulinu... 69 4.4 MALDI MS... 72 4.5 Doplňující diagnostické testy... 82 4.5.1 Růst při ph 4,8 a růst v 10 % etanolu... 82 4.5.2 Tvorba kyselin z maltosy a ze sacharosy... 83 4.6 API 50CH... 83 4.7 Bakterie octového kvašení... 84 5. DISKUSE... 85 3

5.1 Izolace kmenů... 85 5.2 Optimalizace procesu izolace... 86 5.3 Testy k identifikaci izolovaných kmenů... 86 5.4 Identifikace izolovaných kmenů... 88 5.5 Počet a zastoupení jednotlivých kmenů... 91 6. ZÁVĚR... 94 7. SEZNAM LITERATURY... 96 PŘÍLOHY... 103 4

1.1 Víno 1. ÚVOD Víno je alkoholický nápoj vyrobený prokvašením moštu nebo rmutu révy vinné Vitis vinifera. Je to přirozený produkt, který není výsledkem vědecké práce. Staří Řekové jej nazývali darem Bohů (Priewe, 2003). Přiměřené pití vína příznivě působí na lidský organismus. Mnohé látky obsažené ve víně působí kladně na pevnost a průchodnost cév a vhodně upravují krevní tlak. Zaznamenány byly také antiseptické a baktericidní účinky (Cibulka, 2003). Pití červeného vína způsobuje tzv. francouzský paradox. Francouzská strava obsahuje 2-3 krát více nasycených tuků než americká strava, avšak poměr kardiovaskulárních chorob ve Francii je třetinový oproti Spojeným Státům. Jedním z vysvětlení je příznivé působení složek červeného vína (Araim a kol., 2002). Na nepřímou vazbu mezi konzumací alkoholu a kardiovaskulárními chorobami poprvé upozornil Cabot v roce 1904. Avšak snížení výskytu kardiovaskulárních chorob je omezeno na lidi ve středním věku a starší jedince. Také je známo, že ženy jsou chráněny proti kardiovaskulárním chorobám méně než muži (Vogel, 2003). Charakteristická chuť vína je ovlivňována spoustou složek a faktorů, mezi které patří odrůda révy vinné, způsoby obdělávání, složení půdy a hroznů a v nemalé míře také podmínky alkoholového kvašení. Při tomto kvašení se tvoří estery, které udávají charakteristickou ovocnou vůni vína. Patří mezi ně hexylacetát, etylkaproát, etylkaprylát (vůně po jablcích), isoamylacetát (vůně po banánech) a 2-fenyletylacetát (vůně po ovoci s medovým nádechem) (Lilly a kol., 2000). 1.2 Historie vína a révy vinné Nejstarší známky výskytu vína pocházejí z Gruzie, kde byly nalezeny džbány s reliéfy hroznů z doby kolem 6000 let před Kristem. Důkazy, že lidé uměli vyrábět víno již v ranných dobách, existují mezi Eufratem a Tigridem, na jižním Kavkaze a Nilu. Objev vína je zřejmě dílem náhody. V Přední Asii byla hroznová šťáva uchovávána ve džbánech nebo měších z kozí nebo velbloudí kůže, kde při vysoké teplotě začala rychle kvasit. Existence vína v těchto končinách svědčí o tom, že hrozny měly vysoký obsah 5

cukru a šťáva mohla zkvasit. Proto botanici tuto evropsko-blízkovýchodní révu později nazvali Vitis vinifera réva vhodná pro výrobu vína. Řecká civilizace pěstovala ve Středomoří révu od roku 1600 před Kristem. Hlavními středisky produkce vína byly Mykény a Sparta. Víno bylo kultovním nápojem, kterým se oslavovalo vítězství, uctívali bohové a slavily slavnosti. Metody výroby vína byly již tenkrát hodně pokročilé, k vínu byla přidávána mořská voda, aby bylo víno vláčnější. Řečtí kolonizátoři přinesli víno do Sýrie, Egypta, Cádizu a Marseille, později na Sicílii. Po úpadku Řecka se kult vína rychle rozšířil do Římské říše. Nejznámější odrůdou antiky bylo Bílé Falernské. Z Říma se znalost pěstování vína dostala do jižní Francie, na Moselu, do Porýní a některých částí Španělska. I v Itálii musel být tento nápoj znám již v době předřímské, alespoň ve střední Itálii. Zde totiž žili Etruskové, u kterých bylo víno symbolem blahobytu a hýřivého života již ve 3. století před Kristem. Ve stoletích po Kristu se pěstování révy šířilo po Evropě velmi rychle, hlavně díky mnichům, kteří dosáhli vysoké úrovně znalosti výroby vína. V době renesance byli průkopníky vinohradnictví osvícení panovníci a zámožní občané. Své největší rozšíření zažila réva v 16. století, kdy byla pěstována na čtyřnásobku dnešních ploch. Spotřeba vína tehdy musela činit 200 litrů na osobu za rok. Poté zlatá éra vína skončila. Války a nemoci, ale i ochlazení klimatu způsobily, že pěstování vína se omezilo na několik málo center, která jsou totožná s dnešními vinařskými oblastmi. Své nezapomenutelné místo v historii a zlepšování kvality vína má francouzský chemik Louis Pasteur (1822-1895). Jako první přesně popsal pochod alkoholového kvašení. V roce 1856 jej požádal císař Napoleon III. o pomoc, neboť kažení vína způsobovalo vinařskému průmyslu značné hospodářské ztráty. Pasteur jel do vinice v Arbois problém studovat. Zjistil, že kažení způsobují kvasné mikroorganismy, které se dostanou do vína z tekutin a ze vzduchu. Roku 1865 přišel na to, že tyto potraviny stačí po krátkou dobu zahřát na určitou teplotu a nežádoucí zárodky jsou zničeny. U vína je tato teplota 52,7 C. Po této proceduře mají takto upravené potraviny delší trvanlivost, protože většina škodlivých mikroorganismů je zničena, ne však všechny. Přežívají některé užitečné bakterie, jejichž činnost je ovšem zpomalována uchováváním těchto potravin v chladném prostředí (Priewe, 2003). 6

1.3 Výroba červeného vína Hlavní rozdíl mezi výrobou bílých a červených vín je v tom, že červené víno kvasí společně se slupkami, u bílého kvasí jenom šťáva. To má za následek, že se barvivo, které je obsažené pod slupkou, vyluhuje spolu s tříslovinami do vína. Hrozny pro červená vína se drtí, šťáva, dužina, slupka a pecičky tvoří drť, která se nakvašuje. Také u některých bílých vín se používá velmi krátké nakvášení. Záleží na typu a odrůdě vína (Priewe, 2003). 1.3.1 Sklizeň Termín sklizně (vinobraní) je závislý na vyzrálosti hroznů, jejich zdravotním stavu a požadovaném typu vína. 1.3.2 Doprava a příjem hroznů Hrozny by měly být dopraveny z vinice do místa zpracování pokud možno nepoškozené. Důvodem je možná nekontrolovatelná oxidace a vyluhování stejně jako nežádoucí mikrobiologický vývoj, jestliže se ve větším množství uvolní šťáva. 1.3.3 Zpracování hroznů Mezi sklizní hroznů a začátkem alkoholového kvašení proběhnou v průměru dva dny. Během tohoto období se musí uskutečnit řada opatření, která ovlivní hotové víno. Způsob zpracování hroznů a získávání moštu ovlivňuje kvalitu výsledného produktu z 80 %. 1.3.3.1 Odstopkování Odstopkováním se rozumí oddělení bobulí od třapin. Tento pracovní postup je výhodným krokem při zpracování hroznů. I když třapiny mají drenážní účinek při lisování hroznů a tím usnadňují odtok moštu, zelené stopky dodávají moštu nepříjemnou trávovitou chuť. 7

1.3.3.2 Drcení Při tomto pracovním postupu se mezi drtícími válci naruší bobule, aby mohla šťáva lépe odtékat. Pokud proběhne drcení až po odstopkování, snižuje se podíl kalů. 1.3.3.3 Síření Přídavek SO 2 způsobí útlum oxidačních enzymů, útlum divokých kvasinek a bakterií a vyvázání vzdušného kyslíku. Čím dříve se tento přídavek uskuteční, tím lépe bude rmut chráněn před účinky vzduchu, zabrání se hnědnutí a podpoří se vývoj buketu a čistých tónů (Steidl, 2002). 1.3.4 Kvašení Pomleté a odzrněné hrozny se docukřují a ponechají se v kádi kvasnému procesu. Při kvašení probíhá tzv. macerace, kdy se ze slupek hroznů louhují barviva a třísloviny. Tyto složky jsou v červeném víně žádané, vyšší množství je dobrým předpokladem pro jejich archivaci. Doba kvašení obvykle trvá 5-10 dní, záleží však na typu vína. Lehčí typy s menším obsahem tříslovin se oddělují od slupek dříve, naopak plnější vína s vyšším obsahem tříslovin a předpokladu delšího zrání leží na slupkách déle, 20-30 dní. Při kvašení v kádi vzniká na povrchu rmutový klobouk - slupky bobulí a zbytek třapin je nadnášen tvořícím se oxidem uhličitým. Vzniklý rmutový klobouk je potřeba ponořovat, běžně pomocí tyče, aby byly slupky neustále v kontaktu s moštem. Proces kvašení se podporuje: - zahříváním - pro lepší vylouhování barviva se rmut zahřívá až na 50 o C - přidáním pektolytických enzymů. Enzymy snáší teplotu do 35 o C. Vyrábí se tak vína k brzké spotřebě. - přidáním kulturních kvasinek. - tlakem CO 2 - prokvášením bez přístupu vzduchu se odbourávají také kyseliny a tím vzniká jemnější typ vín (Steidl, 2002). Při alkoholovém kvašení vzniká etanol za účasti kvasinek Saccharomyces ellipsoideus, používají se také S. chevalieri, S. oviformis a Torulopsis stellata (Priewe, 2003). V čerstvém moštu se taky vyskytují v nízkých hladinách rody Rhodotorula, Pichia, Candida a Metschnikowia, ale na začátku kvašení odumírají (Fleet a kol., 1984). Teplota 8

vyšší než 35 o C činnost kvasinek zpomaluje, nebo úplně zastavuje, navíc ničí aromatické látky. Činnost kvasinek přirozeně končí metabolizací všech cukrů. Při vyšších teplotách nad 25 o C navíc unikají aromatické a buketní látky a proto je doporučováno teplotu řídit - tzv. řízené kvašení, 18-21 o C. Kvasinky také zastavují svou činnost dosažením úrovně asi 16 % obj., kdy objem alkoholu je již pro kvasinky toxický (Stevenson, 2001). Alkoholové kvašení je složitý chemický proces, který probíhá v několika krocích. Jeho sumární rovnice je: C 6 H 12 O 6 2 C 2 H 5 OH + 2 CO 2. Etanol vzniká v 47-48 % a oxid uhličitý v 46-47 %. Jako vedlejší produkt vzniká glykol (2,5-3 %), kyselina jantarová (0,2-0,5 %), butylenglykol (0,05-0,1 %), kyselina octová (0-0,25 %), kyselina mléčná (0-0,2 %), acetaldehyd (0-0,01 %) a metanol (0,05-0,3 %). Oxid uhličitý může být přítomen i v rozpuštěné formě jako kyselina uhličitá. Vedlejší produkty představují 4-6 % vína. Z nich je nežádoucí například acetaldehyd, protože oxiduje víno a metanol, což je jedovatá látka (Priewe, 2003). Všechna červená vína po ukončení alkoholového kvašení prodělávají druhé kvašení, jablečno-mléčnou (malolaktickou) fermentaci. Při tomto typu kvašení dochází k přeměně kyseliny jablečné na kyselinu mléčnou a oxid uhličitý. Kyselina jablečná způsobuje vyšší kyselost a spolu s tříslovinami dodává vínu tvrdost, jejím odbouráním je víno zjemněno. Tento proces se málo využívá u výroby bílých vín, u výroby červených vín se však stává běžným postupem (Bourdineaud a kol., 2003; Jussier a kol., 2006; Priewe, 2003; Steidl, 2002; Stevenson, 2001). 1.3.5 Zrání vína v sudech Při zrání vína dochází k vyluhování látek obsažených ve dřevě pomocí alkoholu a k jejich oxidaci. Tak vznikají vlastní fenolické látky ve víně. Další způsob vyluhování je oxidace látek již ve dřevě, vlastní fenolické látky rozpouští až alkohol ve víně. 1.3.6 Ošetřování a stabilizace vína Pod tímto názvem se skrývají všechny pracovní postupy při přípravě vína: od mladého vína až po láhvování. Cílem je dosáhnout kvalitativně vysoce hodnotného a stabilního výsledného produktu. 9

1.3.6.1 Stáčení Stáčení je vyprázdnění původní nádoby s vínem a naplnění jiné nádoby s cílem oddělit usazené kaly od vína. Při stáčení dochází ke kontaktu vína se vzduchem, které je u červených vín žádoucí, přispívá ke zrání vína a stabilizaci barvy. 1.3.6.2 Číření vína Číření slouží k uchovávání vína a k jeho stabilizaci při skladování v různých podmínkách při různých teplotách. Také se používá místo filtrace a odstřeďování. 1.3.6.3 Úprava obsahu oxidu uhličitého Oxid uhličitý je významným znakem jakosti. Optimální množství pro červená vína je 0,2-0,4 g CO 2 /l. Přebytek oxidu uhličitého narušuje jemnost a sametovost, třísloviny mají hořčí chuť. 1.3.7 Čištění vína a filtrace Po ukončení kvašení by mělo být víno rychle vyčištěno. Kvasinky, dužina, bílkoviny a vinný kámen mohou ještě delší dobu způsobovat zákal. Odbourávání kyselin pomocí bakterií probíhá v takovém víně lépe než v jiskrně čistém víně. I z důvodu nebezpečí vzniku sirky by měla být mladá vína co nejdříve vyčištěna. Kalné částice zastírají aroma vín (Steidl, 2002). 1.4 Vady a choroby vína Choroba vína je stav vyvolaný mikroorganismy. Vada a nedostatek vína je nežádoucí změna způsobená technologickými, fyzikálními nebo chemickými zásahy. 10

1.4.1 Choroby vína Octovatění způsobují bakterie octového kvašení, které přeměňují alkohol na kyselinu octovou. Vůní připomíná víno ocet nebo acetonová ředidla. Slabé octění lze odstranit filtrací a zasířením. Křísovatění (šum, květ, rosol) bývá u vín s nízkým obsahem alkoholu, která byla málo sířená, nebo k nim měl přístup vzduch. Nemoc způsobují kvasinky, je doprovázena bílou povrchovou pokožkou. Důsledkem této choroby je rozklad alkoholu, kdy vzniká voda, oxid uhličitý a estery. Mléčné, máselné a manitové kvašení způsobují heterofermentativní bakterie mléčného kvašení. Ty rozkládající cukry na kyselinu mléčnou s menším množstvím kyseliny máselné a octové. Vytváří chuť kvašeného zelí. Vláčkovatění - slizovitost je způsobena napadením slizovými bakteriemi a některými slizotvornými kvasinkami. Víno má olejovitou, slizkou konzistenci. Myšina vzniká za vyšších teplot při kvašení a delší době ležení na kvasničních kalech. Víno má velmi nepříjemnou chuť, pach po myší moči díky acetamidu. Zvrhnutí nebo zlomení nastává, když se nechá víno dlouho na kvasnicích. Projevuje se vyšším obsahem oxidu uhličitého a štípavou chutí na patře. Hořknutí je nemoc červených vín způsobená mléčnými bakteriemi, které produkují hořké látky a ničí tak chuť vína (Cibulka, 2003). 1.4.2 Vady vína Černý zákal je způsoben delším stykem moštu nebo vína s železem a pozdějším ponecháním vína v neplných sudech, kde dochází ke vzniku tenátu železitého. Tato sůl se ve víně vysráží ve formě modročerných drobných vloček. 11

Šedý nebo bílý zákal se projevuje vylučováním drobných klků fosforečnanu železitého, který vzniká oxidací fosforečnanu železnatého. Po zatřepání lze vidět tzv. sněžení vína. Sirka ve víně se vyznačuje zápachem zkažených vajíček. Sirovodík vzniká činností kvasinek. Hnědnutí vína se projevuje zejména u mladých, málo sířených vín. Víno mění svou původní barvu, získává nahnědlý odstín. Hnědnutí je způsobeno přístupem vzduchu. Krystalický zákal vzniká vysrážením vinného kamene, je neškodný (Cibulka, 2003). 1.5 Bakterie v procesu výroby vína Výroby vína se účastní velké množství bakteriálních druhů. Rozsah, ve kterém tyto druhy rostou, určuje typ a koncentraci řady látek, které přispívají k tvorbě vůně a chuti vína (Fleet a kol., 1984). Růst bakteriálních rodů jako jsou Acetobacter, Gluconobacter, Lactobacillus a Pediococcus mohou způsobit kažení vína prostřednictvím produkce nechutných a zapáchajících látek. Některé bakteriální kmeny ve víně mohou také produkovat látky jako biogenní aminy a prekurzory etyl karbamátů. Na druhé straně, růst Oenococcus oeni je prospěšný, tato bakterie způsobuje jablečno-mléčné kvašení a tak přispívá k tvorbě žádoucí chuti a vůni vína. Nelze také opomenout vzájemné reakce mezi různými bakteriálními druhy a vinnými kvasinkami Saccharomyces. Tyto vzájemné reakce mohou být prospěšné nebo škodlivé pro kvalitu vína, záleží na zúčastněných druzích (Osborne a Edwards, 2005). Kvašení hroznové šťávy na víno představuje komplex biochemických reakcí zahrnující spoustu mikroorganismů. Různorodost těchto mikroorganismů a jejich složitá ekologie značně ovlivňují celkovou kvalitu vína (Fleet a kol., 1984). Mikroorganismy přítomné v hroznové šťávě před kvašením mají měnící se růstové požadavky a toleranci k potlačujícím látkám. Díky těmto vlastnostem převládají v různých časových obdobích během přirozeného kvašení. Rozmanité mikroorganismy se také ovlivňují ve vzájemných ekologických vztazích, které mohou být prospěšné i potlačující. Jako takové, vzájemné reakce mezi mikroorganismy ve víně jsou důležité, protože mohou ovlivňovat 12

úspěch nebo neúspěch alkoholového nebo jablečno-mléčného kvašení, a ty postupně ovlivňují konečnou kvalitu vína (Osborne a Edwards, 2005). Různé bakteriální druhy zvyšují nebo snižují kvalitu vína, záleží na jejich typu. Hroznová šťáva a víno představují drsné podmínky pro mikrobiální růst díky nízkému ph, minimálnímu množství kyslíku, přítomnosti etanolu a vysokému osmotickému tlaku. Díky tomu jen málo bakteriálních druhů je schopno růstu. Jako příklad slouží bakterie mléčného kvašení patřící do rodů Lactobacillus, Oenococcus a Pediococcus. Jsou běžně nalézány ve víně díky toleranci k výše uvedeným faktorům (Dicks a kol., 1995). Další bakterie jako jsou Acetobacter a Gluconobacter jsou běžně přítomny v hroznové šťávě (Du Toit a Lambrechts, 2002). 1.5.1 Bakterie mléčného kvašení (BMK) a jablečno-mléčné kvašení Důležitý faktor, který ovlivňuje kvalitu kyselého vína a moštu je jablečno-mléčné kvašení (MLF = malolactic fermentation). Při tomto kvašení dochází k přeměně L-kyseliny jablečné na L-kyselinu mléčnou a oxid uhličitý. (Dicks a kol., 1995; Henick-Kling a kol., 1989; Osborne a Edwards, 2005; Remize a kol., 2006; Rojo-Bezares a kol., 2006; Zapparoli a kol., 1998). Tato fermentace představuje dekarboxylaci a vede ke snížení kyselosti vína a ke zlepšení růstu bakterií a chuti vína (Cavin a kol., 1989; Miranda a kol., 1997). Výroba moštu je velmi podobná výrobě vína, používají se druhy ovoce obsahující stejné látky a zahrnují spoustu stejných výrobních postupů a kroků, proto se jablečnomléčné kvašení uskutečňuje ve víně i v moštu (Zhang a Lovitt, 2006). Zastoupení kyseliny jablečné ve víně je až 50 %, zbytek představuje kyselina vinná. Množství kyseliny jablečné je závislé na zralosti hroznů. Jak hrozny zrají, dochází k odbourávání této kyseliny, může být až všechna odbourána. K tomu však nedochází v chladnějších oblastech, hrozny zde nedokáží úplně dozrát, v bobulích zůstane velké množství kyseliny jablečné a tím dojde ke zvýšení kyselosti vína (Henick-Kling a kol., 1989). Jablečno-mléčné kvašení způsobují bakterie mléčného kvašení (BMK). Název této skupiny je odvozen od jejich schopnosti zkvašovat sacharidy na kyselinu mléčnou jako hlavní výsledný produkt. Obecně neprodukují katalázu. Na rozdíl od vyšších živočichů a rostlin, které produkují výlučně L(+)-kyselinu mléčnou, BMK tvoří buď L(+) nebo D(-) izomer, případně jejich směs. Typ izomeru je rodově i druhově specifický a je využíván pro klasifikaci BMK. Taxonomie BMK je provázena velkými změnami. Jedná se o velmi 13

heterogenní skupinu, do které patří rody Bifidobacterium, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Sporolactobacillus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus a Weissella (Štegnerová a kol., 2007). Tyto bakterie se běžně nacházejí v potravě, tvoří také přirozenou mikroflóru lidí a většiny zvířat. Mezi nejznámější rody bakterií mléčného kvašení nacházející se v hroznech a ve víně patří rody Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus a Oenococcus (Rojo-Bezares a kol., 2006). Tyto bakterie jsou schopny růstu na glukose, fruktose a ostatních sacharidech, ve víně a v moštu však často rostou jako mixotrofové (Zhang a Lovitt, 2006). Jablečno-mléčné kvašení se také nazývá sekundární kvašení, protože se nejčastěji vyskytuje po alkoholovém (primárním) kvašení, ale někdy se může vyskytovat zároveň s tímto kvašením (Liu, 2002; Osborne a Edwards, 2005). Jsou tři hlavní reakce spojené s přeměnou kyseliny jablečné na kyselinu mléčnou. Převládá přímá přeměna jablečnanu na mléčnan pomocí jablečno-mléčného enzymu produkovaného O. oeni. Další dvě možné reakce jsou řízeny ostatními bakteriemi mléčného kvašení, které využívají jablečný enzym. První reakce je přes pyruvát, který je pak redukován na mléčnan, druhá reakce je přes dekarboxylaci oxalacetátu na pyruvát a konečná redukce na mléčnan. Relativní zastoupení těchto reakcí závisí na celkové redoxní rovnováze. Ta je řízena uhlíkovými zdroji, které mohou působit jako donoři i akceptoři elektronů (Zhang a Lovitt, 2006). V alkoholických nápojích byly vyvinuty tři metody pro zlepšení jablečno-mléčného kvašení (obrázek č. 1- Zhang a Lovitt, 2006). Obr.1: Tři metody pro zlepšení jablečno-mléčného kvašení navozeného bakteriemi mléčného kvašení ve víně a v moštu. Upraveno dle Zhang a Lovitt, 2006. 1. spontánní jablečno-mléčné kvašení, 2. startovací kultura, 3. vysoká koncentrace buněk. 14

První metoda je spontánní jablečno-mléčné kvašení využívající původní BMK z moštu a vína. Pro uskutečnění jablečno-mléčného kvašení stačí nízká koncentrace buněk. Toto kvašení je velmi nespolehlivé a obvykle časově náročné, může trvat několik týdnů až měsíců. Vyskytuje se v pozdní fázi alkoholového kvašení (Nielsen a Richelieu, 1999). Druhá metoda zahrnuje používání startovací kultury. O. oeni, který je často používán, je přímo naočkován do vína nebo moštu. Pro uskutečnění jablečno-mléčného kvašení stačí nízká koncentrace buněk. Používání startovací kultury k navození jablečno-mléčného kvašení může v některých případech způsobit rychlejší zrání vína, snížení potenciálně škodlivých BMK, snížení útoků bakteriofágů (Zhang a Lovitt, 2006) a hlavně dovolují kontrolu a selekci kmenů zodpovědných za jablečno-mléčné kvašení a tím kontrolu chuti vína (Orduña a kol., 2001). Třetí metoda zahrnuje vysokou koncentraci buněk. Při ní dochází k oddělení produkce bakterií od jablečno-mléčného kvašení. Bakterie jsou pěstovány v příznivějších podmínkách předtím, než jsou očkovány do vína nebo do moštu. Dochází tak k vyloučení pomalého růstu a nízké koncentrace když je startovací kultura očkována. Samotné kvašení je lépe kontrolovatelné a je zajištěno, že jablečno-mléčné kvašení je dokončeno v požadovaném čase během výroby vína. Používání vysoké koncentrace buněk zajišťuje vyšší spolehlivost, lepší flexibilitu a snadnější spotřebu. Tato metoda může být rozdělena na dva systémy: dávkovací a kontinuální, které se dále dělí na 3 režimy: vysoká koncentrace volných buněk naočkovaná přímo dávkovacím systémem pro jablečno-mléčné kvašení, imobilizované buňky jako dávkovací nebo kontinuální systém, vysoká koncentrace buněk v membránovém bioreaktoru s úplnou recyklací buněk. Tyto systémy dovolují opakované používání kultur, kontrolu sekundárních produktů a navození nebo zastavení jablečno-mléčného kvašení (Zhang a Lovitt, 2006). Dřívější práce Korkese (1950) naznačují, že dekarboxylace při jablečnomléčném kvašení je katalyzovaná NAD + specifickým jablečno-mléčnými enzymy (Osborne a Edwards, 2005). Tyto enzymy jsou homodimery nebo tetramery s velikostí podjednotek 60 70 kda a s rozmezí K m 3 17 mm. Jejich maximální aktivita je při ph 5,5 6 a vyžadují NAD + a Mn 2+ jako kofaktory aktivity (Miranda a kol., 1997). Dlouhou dobu nebyl znám biochemický význam jablečno-mléčného kvašení. Během kvašení se netvoří pyruvát jako meziprodukt, díky tomu se vědci domnívali, že jablečno-mléčné kvašení neslouží k získávání energie (Osborne a Edwards, 2005). I přes nedostatek důkazů pro laktát/protonový symport v O. oeni (Olsen a kolektiv, 1991), Cox a Henick-Kling publikovali, že laktátový efflux neprodukuje ATP během jablečno-mléčného kvašení při nízkých hodnotách ph. Jiní autoři zase navrhovali, že ATP 15

je produkováno během katabolismu jablečnanu a je spojeno s p, které se tvoří během přenosu jablečnanu a difúze kyseliny mléčné (Osborne a Edwards, 2005). Na podporu této teorie Poolman a kolektiv publikovali, že Lactococcus lactis produkuje p, které je složeno z membránového potenciálu a ph gradientu přes příjem elektronů z jablečnanu společně se spotřebou protonů jako výsledek dekarboxylace L-mléčnanu (Poolman a kol., 1991). Salema a kolektiv navrhli model znázorňující přenos L-jablečnanu na monoaniontovou formu s využitím uniportu (obrázek č. 2). Tento přenos způsobí vnitřní síťový negativní náboj a tak dochází k vytvoření elektrického potenciálu. L-jablečnan je pak dekarboxylován uvnitř buňky na L-kyselinu mléčnou a oxid uhličitý v reakci, která vyžaduje jeden proton. Spotřeba tohoto protonu v cytoplasmě může vytvořit ph gradient, takže se změnou elektrického potenciálu se může vytvořit p přechodem přes cytoplasmatickou membránu. Následná tvorba ATP je přes ATPasu vázanou na membráně. Salema a kolektiv navrhovali, že L-kyselina mléčná a oxid uhličitý opustí buňku jako neutrální látky, které jsou později aktivně transportovány (Salema a kol., 1994). Později tento autor navrhl model, kde p je tvořeno in vitro činností elektronového uniportu v souvislosti se spotřebou protonů při dekarboxylaci L-jablečnanu (Salema a kol., 1996). Obr. 2: Navržený model pro získávání energie (ATP) u Oenococcus oeni přes přeměnu kyseliny jablečné na kyselinu mléčnou a oxid uhličitý. Upraveno dle Osborne a Edwards, 2005. Složitost a rozmanitost metabolické aktivity bakterií mléčného kvašení naznačuje, že tyto bakterie mohou ovlivňovat jablečno-mléčné kvašení pozitivně i negativně (Liu, 2002). 16

1.5.2 Vzájemné vztahy mezi bakteriemi a dalšími mikroorganismy ve víně 1.5.2.1 Výskyt mikroorganismů během výroby vína Některé rody kvasinek a bakterií se přirozeně vyskytují na bobulích hroznů v době sklizně nebo se nacházejí na vinařském zařízení. Díky odlišným tolerancím k inhibičním látkám a různým růstovým požadavkům mohou tyto mikroorganismy úspěšně růst během alkoholového a jablečno-mléčného kvašení (obrázek č. 3 - Fleet a kolektiv, 1984). Během počátečních fází alkoholového kvašení převládají ve víně rody kvasinek, které nepatří do rodu Saccharomyces. Jejich životaschopnost ovšem rapidně klesá díky nedostatku kyslíku a zvýšené koncentraci etanolu kvůli růstu Saccharomyces cerevisiae, které provádí alkoholového kvašení (Heard a Fleet, 1985). Při dokončení tohoto kvašení vstupuje Saccharomyces do stacionární fáze a fáze odumírání, dochází ke zvýšení počtu Oenococcus oeni a začíná jablečno-mléčné kvašení. Další bakterie jako jsou Acetobacter, Lactobacillus a Pediococcus mohou růst po jablečno-mléčném kvašení během uchovávání nebo stárnutí vína (Osborne a Edwards, 2005). Obr. 3: Hlavní výskyt vybraných mikroorganismů během výroby vína. Upraveno dle Osborne a Edwards, 2005. 1.5.2.2 Vzájemné reakce mezi bakteriemi mléčného kvašení Během výroby vína se vyskytují antagonistické vztahy mezi bakteriemi mléčného kvašení. Například rod Pediococcus, konkrétně P. pentosaceus působí jako antagonista O. oeni, protože dokáže akumulovat malé proteolyticky senzitivní a termostabilní složky. Na základě těchto informací se usuzuje, že růst některých druhů rodu Pediococcus ve víně 17

ještě před jablečno-mléčným kvašením může způsobit značné problémy při začátcích tohoto sekundárního kvašení (Osborne a Edwards, 2005). Některé bakterie mléčného kvašení produkují antibakteriální látky proteinové povahy nazývané bakteriociny. Bakteriociny mají úzké spektrum účinku proti blízce příbuzným druhům (Jack a kolektiv, 1995). Například kmeny P. pentosaceus produkují inhibiční látky proti některým kmenům rodu Lactobacillus, Oenococcus a Pediococcus. Bakteriociny by mohly v budoucnu sloužit jako kontrolní agens bakterií způsobujících kažení vína (Osborne a Edwards, 2005). 1.5.2.3 Vzájemné vztahy mezi bakteriemi mléčného kvašení a Saccharomyces Nekontrolovatelný růst neznámých laktobacilů může ovlivnit alkoholové kvašení. Často tyto bakterie způsobují zpomalení alkoholového kvašení, tzv. loudavé kvašení. Boulton publikoval, že zrychlený růst divokých laktobacilů způsobuje nadměrnou produkci kyseliny octové během 2-3 dnů a tím inhibuje metabolismus kvasinek. Kyselina octová však nemusí být jediná příčina inhibice kvasinek, působí zde řada dalších neznámých inhibičních faktorů. Vztahy mezi Saccharomyces a O. oeni během výroby vína mohou být jak pozitivní, tak i negativní (Osborne a Edwards, 2005). Příjem a uvolňování živin kvasinkami může značně ovlivnit další vývoj bakterií mléčného kvašení. Během alkoholového kvašení kvasinky vyčerpávají z média snadno asimilovatelné živiny, jako jsou amoniak, hexosy, aminokyseliny a vitamíny (Remize a kol., 2006). Negativní vztahy se vyskytují po naočkování O. oeni do vína a před dosažením koncentrace životaschopných buněk 10 5-10 7 na ml. Je to vysvětlováno tím, že Sacchromyces rychleji roste a tak vyčerpá živiny z moštu. Dalším vysvětlením je produkce toxických metabolitů a inhibičních látek jako jsou etanol, SO 2, středně větvené mastné kyseliny a antibakteriální proteiny nebo peptidy (Osborne a Edwards, 2005). 18

1.6 Jednotlivé rody bakterií mléčného kvašení 1.6.1 Rod Lactobacillus Zástupci tohoto rodu jsou grampozitivní, nesporulující bakterie, které mohou být dlouhé a štíhlé tyčinky, někdy mohou být zahnuté, krátké nebo koryneformní kokobacily. Buňky se vyskytují v řetízcích, jsou mikroaerofilní. Tvoří malé kolonie (2-5 mm), které mají celistvé okraje, jsou vypouklé, hladké, lesklé a bez pigmentu. Teplotní optimum je 30-40 C, ale mohou růst v teplotním rozmezí 2-53 C. K růstu vyžadují aminokyseliny, peptidy, deriváty nukleových kyselin, vitamíny, soli mastných kyselin nebo estery mastných kyselin a cukry ke kvašení. Tyto nutriční požadavky jsou charakteristické pro každý druh, často pro každý kmen. Jsou striktně sacharolytické, často je konečným produktem mléčnan (Kandler a Weiss, 1986; Osborne a Edwards, 2005). Laktobacily jsou kataláza a cytochrom negativní, jen některé kmeny mohou rozkládat peroxid vodíku na pseudokatalázu (Johnston a Delwiche, 1962). Obsah G + C v DNA je 32-53 molárních %. Hlavní dráhy při fermentaci hexóz jsou Embden-Meyerhofova, která přeměňuje 1 mol hexózy na dva moly kyseliny mléčné (homofermentativní kvašení) a 6-fosfoglukonátová, při které se tvoří 1 mol CO 2 a jeden mol etanolu (nebo kyseliny octové) a jeden mol kyseliny mléčné (heterofermentativní kvašení) (Hammes a kol., 1992; Kandler a Weiss, 1986). Laktobacily jsou acidofilní, jsou důležité pro tvorbu i kažení kvašených rostlinných krmiv, potravin a nápojů. Nacházejí se v mléčných a kvašených mléčných produktech, v mase a mastných výrobcích, v rybách a marinovaných výrobcích, v lidském i zvířecím těle, v odpadních vodách a hnojivech (Kandler a Weiss, 1986). Další místo výskytu laktobacilů je rostlinný materiál. Bakterie mléčného kvašení se nacházejí na listnatých površích v počtu 10-1000 na gram, což je 0,01 % celkové mikroflory. Některé druhy rodu Lactobacillus mohou tvořit antagonistické látky, které inhibují Xanthomonas campestris, Erwina carotovora a Pseudomonas syringe (Hammes a kol., 1992). 1.6.1.1 Víno a rod Lactobacillus Mezi celosvětově rozšířené druhy rodu Lactobacillus izolované z hroznů a vína patří L. brevis, L. buchneri, L. casei, L. cellobisus, L. curvatus, L. fermentum, L. fructivorans, L. hilgardii, L. homohiochii, L. jensenii, L. leichmanii, L. plantarum, 19

L. sake a L. trichodes (Davis a kol., 1986). L. cellobiosus je považován za biotyp L. fermentum, zatímco L. leichmanii je teď uváděn jako L. delbrueckii subspecies lactis (Kandler a Weiss, 1986). L. trichodes je považován za synonymum L. fructivorans (Osborne a Edwards, 2005). Edwards a kolektiv izolovali dva nové druhy Lactobacillus z hroznů v obchodních řetězcích, které způsobují loudavé kvašení - L. kunkeei a L. nagelii (Edwards a kol., 1998). Výskyt a přežívání druhů Lactobacillus ve víně je vysoce závislé na ph a obsahu etanolu (Davis a kol., 1986), na přítomnosti SO 2, teplotě a dostupnosti živin (Du Plessis a kol., 2004). Při vysokém ph (>3,5) druhy rodu Lactobacillus často převládají, zatímco při nižších hodnotách ph převládají jiné bakterie mléčného kvašení jako je Oenococcus oeni. Tolerance k etanolu závisí na druhu Lactobacillus (Osborne a Edwards, 2005). Rod Lactobacillus se vyskytuje v alkoholických nápojích po alkoholovém kvašení a může přispívat ke zlepšení kvality těchto nápojů, ale také může způsobovat kažení (Hammes a kol., 1992), záleží na druhu a kmeni laktobacilů a také na tom, v které fázi výroby vína se nachází (Du Plessis a kol., 2004). Jeho nekontrolovatelný růst může vést ke zvýšení kyselosti vína nebo k tvorbě dalších nežádoucích pachů a chutí. Některé druhy produkují velké množství kyseliny octové. Další nežádoucí účinek laktobacillů je pomalé nebo váznoucí kvašení (Osborne a Edwards, 2005). Některé kmeny L.hilgardii byly zapojeny do tohoto kvašení (Edwards a kol., 1998). V mnoha případech, ve kterých divoké laktobacilly způsobují kažení vína, nepoužívají vinaři přidávání oxidu siřičitého a počáteční ph vín bylo kolem 3,5, což jsou podmínky podporující růst rodu Lactobacillus (Osborne a Edwards, 2005). Heterofermentativní laktobacily jsou spojeny s myšinovým defektem vína. Tento typ kažení vína je charakterizován jako rozvoj zapáchajících látek, které způsobují nechutnost vína. Laktobacily spojené s tímto defektem jsou L. brevis, L. higardii a L. celobiosus, mohou tvořit N-heterocyklické báze, jako jsou 2-etyltetrahydropyridin, 2-acetyltetrahydropyridin a 2-acetyl-1-pyrolin. Tvora těchto látek vyžaduje přítomnost etanolu, proto je tento defekt častější ve vínech než v moštech. Některé laktobacily také způsobují alkoholizování vína. Je známé jako Fresno forma. Tento typ kažení je charakterizován myceliálním/vláknitým růstem ve víně a je způsobeno L. trichodes (L. fructivorans). Tyto druhy jsou relativně citlivé k oxidu siřičitému, proto užívání antiseptických látek může předejít růstu těchto mikroorganismů (Osborne a Edwards, 2005). 20

Další nežádoucí účinek heterofermentativních laktobacilů ve víně je jejich schopnost degradovat arginin. Dochází k tvorbě amoniaku, citrulinu, ornitinu, ATP a CO 2. Tvorba amoniaku způsobí zvýšení ph vína a tím dojde ke zvýšenému růstu nežádoucích bakterií, které mohou využívat tvořící se ATP. Citrulin je toxický, je totiž prekurzorem tvorby karcinogenního uretanu (Orduña a kol., 2001). Některé rody Lactobacillus se také účastní jablečno-mléčného kvašení (Orduña a kol., 2001; Ansanay a kol., 1993), patří mezi ně L. plantarum, L. casei (Ansanay a kol., 1993), L. brevis, L. buchneri, L. hilgardii, L. trichodes, L. fructivorans, L.desidiosus a L. mali (Hammes a kol., 1992). 1.6.1.2 Izolace z vína a uchovávání Při izolaci laktobacilů se bere ohled na jejich acidofilní povahu a na komplex jejich růstových požadavků. Všechna média musí obsahovat požadované růstové faktory, obvykle s kvasničným extraktem jako zdrojem vitamínů, také pepton, manganázu, acetát a Tween 80. Někdy se také přidává rajčatový džus a etanol (Hammes a kol., 1992). Pro krátkodobé uchovávání (měsíc) se mohou tyto rody uchovávat v chladničce při 4-7 C na MRS agaru. Někdy se také mohou uchovávat kultury narostlé do stacionární fáze hluboce zamražené v růstovém médiu a uchovávané při 20 C. Pro dlouhodobější uchovávání se používá lyofilizace buněk narostlých do logaritmické fáze (Kandler a Weiss, 1986). 1.6.1.3 Odlišení rodu Lactobacillus od ostatních bakterií mléčného kvašení Laktobacily jsou metabolicky velmi podobné dalším rodům bakterií mléčného kvašení. Jen jejich tvar je dokáže rychle odlišit od kulovitých tvarů rodů Streptococcus, Leuconostoc a Pediococcus, ačkoliv některé striktně heterofermentativní laktobacily tvoří kokotyčinky a tak mohou být zaměněny s rodem Leuconostoc. Tyto druhy jsou odlišeny od leukonostoků produkcí D, L-kyseliny mléčné a tvorbou amoniaku z argininu (Kandler a Weiss, 1986; Hammes a kol., 1992). Heterofermentativní laktobacily tvořící plyn mohou být odlišeny na základě jejich schopnosti hydrolyzovat arginin a tvořit D, L-mléčnan (Holzapfel a Schillinger, 1992). 21

1.6.1.4 Druhová diferenciace Rod Lactobacillus je tradičně dělen do tří skupin podle schopnosti zkvašování cukrů: Skupina I: obligátně homofermentativní laktobacily: dokáží zkvašovat hexosy na kyselinu mléčnou pomocí Embden-Meyerhofovy dráhy, pentosy a glukonát nejsou zkvašovány (Kandler a Weiss, 1986). Kyselina mléčná se tvoří ve více než 85 % (Hammes a kol., 1992). Skupina II: fakultativně heterofermentativní laktobacily: dokáží zkvašovat hexosy na kyselinu mléčnou pomocí Embden-Meyerhofovy dráhy, kromě této kyseliny se ještě tvoří kyselinu octovou, etanol a kyselinu mravenčí při limitaci glukosou. Pentosy zkvašují na kyselinu mléčnou a octovou skrz fosfoketolázovou dráhu. Skupina III: obligátně heterofermentativní laktobacily: dokáží zkvašovat hexosy na kyselinu mléčnou, kyselinu octovou (etanol) a CO 2. Pentosy zkvašují na kyselinu mléčnou a octovou. Oba tyto typy kvašení zahrnují fosfoketolázovu dráhu (Kandler a Weiss, 1986). Druhová identifikace rodu Lactobacillus je poměrně složitá. Komerčně dostupné testy na zkvašování cukrů nemusí být 100 % spolehlivé. Častěji se používá SDS-PAGE, což je identifikace buněčných proteinů na polyakrylamidovém gelu pomocí dodecylsulfátu sodného (Felten a kol., 1999). Může se také používat sekvencování 16S rrna a PCR reakce s druhově specifickými primery (Du Plessis a kol., 2004). 1.6.2 Rod Leuconostoc Zástupci tohoto rodu jsou grampozitivní, nepohyblivé, nesporulující bakterie, které mají kulatý až čočkovitý tvar, zvláště rostou-li na agaru. Buňky se vyskytují v párech nebo v řetízcích, jsou fakultativně anaerobní (Garvie, 1986; Thunell, 1995). Jsou relativně necitlivé ke kyslíku, avšak lepší růst je pozorován v redukované atmosféře (Holzapfel a Schillinger, 1992). Tvoří malé kolonie, obvykle menší než 1 mm, které jsou hladké, kulaté, bílošedé. Teplotní optimum je 20-30 C, ale mohou růst v teplotním rozmezí 5-30 C po dobu 2 až 10 dnů. Jsou chemoorganotrofní, k růstu vyžadují bohaté médium s komplexem růstových faktorů a požadavků na aminokyseliny. Všechny druhy vyžadují kyselinu nikotinovou, thiamin, biotin a kyselinu pantotenovou nebo její deriváty. Růst je závislý na 22

přítomnosti fermentovaných cukrů a glukosy v kombinaci hexosa-monofosfátové a fosfoketolázové cesty. Leukonostoky jsou kataláza negativní, neobsahují cytochromy a nehydrolyzují arginin. Obsah G + C v DNA je 38-44 molárních % (Garvie, 1986). Rod Leuconostoc má podobnou fyziologii s rodem Lactobacillus, Pediococcus i s ostatními bakteriemi mléčného kvašení. Fyziologicky jsou tyto rody považovány za smíšené. Samotný rod Leuconostoc netvoří jednotnou skupinu. Studie 23S rrna prokázaly, že Lc. mesenteroides subsp. mesenteroides a Lc. paramesenteroides patří do dvou značně odlišných skupin (Holzapfel a Schillinger, 1992). V roce 1993 byl Lc. paramesenteroides reklasifikován do rodu Weissella (Thunell, 1995). Leukonostoky sdílejí spoustu přirozených i umělých míst s laktobacily, upřednostňují neutrální nebo lekce kyselá média. Nacházejí se v nejrůznějších nápojích, v moštu, v mase a v mastných výrobcích, v mléce a v mléčných nápojích, v rostlinných materiálech a fermentovaných výrobcích rostlinného původu (Thunell, 1995). 1.6.2.1 Víno a rod Leuconostoc Lc. mesenteroides subsp. mesenteroides a další bakterie mléčného kvašení se nacházejí na povrchu bobulí i listů révy vinné a jsou přítomny i v moštu, avšak nedokáží přežít alkoholové kvašení, nejsou uzpůsobeny růstu při vysoké koncentraci etanolu (Holzapfel a Schillinger, 1992). 1.6.2.2 Izolace z vína a uchovávání Leukonostoky nacházející se ve víně se od ostatních leukonostoků liší fyziologickými vlastnostmi. Média pro jejich selekci jsou založena na jejich acidofilní povaze, toleranci k alkoholu a k adaptaci na prostředí vína. Pro krátkodobé uchovávání (1-2 týdny) se mohou tyto rody uchovávat v chladničce při 4 C vpichem na šikmém MRS agaru. Pro dlouhodobější uchovávání Lc. mesenteroides subsp. mesenteroieds se používá lyofilizace v roztoku přírodního dextranu, ve kterém dochází k potlačení schopnosti tohoto druhu tvořit tento polysacharid (Holzapfel a Schillinger, 1992). 23

1.6.2.3 Odlišení rodu Leuconostoc od ostatních bakterií mléčného kvašení Odlišení rodu Leuconostoc od ostatních bakterií mléčného kvašení se provádí na základě fenotypických odlišností jako jsou kulovitý tvar, tvorba plynu, neschopnost hydrolyzovat arginin a produkce D(-)-mléčnanu z glukosy. Často se využívá i tvorba dextranu ze sacharosy a složení buněčné stěny (tabulka č. 1). Morfologické odlišení je často obtížné, leukonostoky, laktokoky a streptokoky mohou totiž tvořit jak koky, tak i tyčinky, laktobacily mohou zase tvořit krátké tyčinky až elipsoidní buňky. Tvorba plynu je základní rozlišující znak, který umožňuje odlišení homofermentativních laktobacilů, pediokoků, laktokoků, enterokoků a streptokoků od leukonostoků (Holzapfel a Schillinger, 1992). Tab. 1: Odlišení rodu Leuconostoc od ostatních bakterií mléčného kvašení. Upraveno dle Holzapfel a Schillinger, 1992. Leukonostoky Heterofermentativní Homofermentativní Streptokoky Pediokoky Carnobakterie laktobacily laktobacily morfologie Koky nebo Kokobacily nebo Tyčinky Koky Koky v Tyčinky kokobacily tyčinky (kokobacily) tetrádách Plyn z glukosy + + - - - (+) Hydrolýza - ± -/+ - nebo + - nebo + + argininu Dextran ze - nebo + -/+ -/+ -/+ - - sacharosy Kyselina mléčná D (-) DL D(-), DL nebo L(+) L(+) DL nebo L(+) L(+) + pozitivní reakce, (+) slabá pozitivní reakce, ± většinou pozitivní reakce -/+ většinou negativní reakce, - negativní reakce 1.6.2.4 Druhová diferenciace Odlišení jednotlivých druhů rodu Leuconostoc se provádí na základě růstu při různých teplotách, při ph 4,8, v 10 % etanolu, na základě hydrolýzy eskulinu, tvorby dextranu ze sacharosy, pigmentu a tvorby kyselin z cukrů (tabulka č. 2 - Holzapfel a Schillinger, 1992). 24

Tab. 2: Odlišení jednotlivých druhů rodu Leuconostoc. Upraveno dle Holzapfel a Schillinger, 1992. + pozitivní reakce, - negativní reakce, ± většinou pozitivní reakce d variabilní reakce, ND žádná data, -/+ většinou negativní reakce 1.6.3 Rod Oenococcus Kmeny nacházející se ve víně patřící do rodu Leuconostoc byly původně klasifikovány jako Leuconostoc oenos Garviesem v roce 1967. Později fylogenetické studie odhalily, že L. oenos tvoří odlišný dílčí článek mezi dalšími druhy Leuconostoc, proto v roce 1995 byl zpětně reklasifikován Dicksem a kolektivem na nový rod Oenococcus (Dicks a kol., 1995). Zástupci tohoto rodu jsou grampozitivní, nepohyblivé, nesporulující bakterie, které mají elipsoidní nebo kulovitý tvar a vyskytují se obvykle v párech nebo v řetězcích. Tvoří kolonie menší než 1 mm, které jsou hladké, kulaté, šedobílé (Garvie, 1986). Jsou acidofilní, preferují ph 4,8, dokáží však růst i při ph 3,5, a na médiích obsahující 10 % etanolu. Mají stejné požadavky na komplex růstových faktorů a aminokyselin jako leukonostoky, navíc vyžadují glukoso-deriváty kyseliny pantotenové, které jsou známé jako tomato juice faktor. Jsou fakultativně anaerobní až mikroaerofilní, ale mohou růst i v anaerobním prostředí. Optimální teplota růstu je 20-25 ºC, preferují spíše 20 C (Holzapfel a Schillinger, 1992), ale dokáží růst v teplotním rozmezí 5-30 C. Jsou kataláza i cytochrom negativní, obsah G + C je 37-39 molárních % (Garvie, 1986). 1.6.3.1 Víno a rod Oenococcus O. oeni se spolu s dalšími bakteriemi mléčného kvašení vyskytuje na površích listů, bobulí révy vinné a také v nízkých hladinách v moštu, ale pouze jako jediný dokáže přežít 25

během alkoholového kvašení. Je nejvíce zapojen v jablečno-mléčném kvašení ve víně. To je v závislosti na typu vína, regionu a výrobních technikách považováno za prospěšné nebo škodlivé (Holzapfel a Schillinger, 1992). Přeměna kyseliny jablečné na kyselinu mléčnou vede k přirozenému snížení kyselosti vína, zajišťuje i biologickou stabilitu vína před napouštěním do lahví a ovlivňuje chuť a vůni vína (Cavin a kol., 1989; Miranda a kol., 1997). Jablečno-mléčné kvašení je škodlivé u australských vín, která mají vysoké ph. Dochází u nich ke snížení kvality a růstu bakterií, které způsobují kažení vína. Růst O. oeni a poměr jablečno-mléčného kvašení je ovlivňován ph vína, koncentrací etanolu, SO 2, kmenem kvasinek používaných při alkoholovém kvašení (Holzapfel a Schillinger, 1992), teplotou, a inhibičními složkami jako jsou mastné kyseliny, fenolové kyseliny a taniny (Bourdineaud a kol., 2003). Pro jablečno-mléčné kvašení je optimální ph 3,5 a 45 mm saturační koncentrace substrátu (Miranda a kol., 1997). K opoždění nebo k úplnému vymizení tohoto kvašení dochází, když koncentrace O. oeni nedosáhne 10 6 cfu na ml (Remize a kol., 2006). Glukosa a fruktosa, dva hlavní sacharidy zastoupené ve víně, mohou sloužit jako zdroj energie pro růst O. oeni (Miranda a kol., 1997). Také dusíkaté požadavky na výživu hrají roli při optimalizaci jablečno-mléčného kvašení (Remize a kol., 2006) a je nutné vzít v úvahu interakce jablečnanového metabolismu a metabolismu dalších uhlíkových zdrojů, které jsou přítomny ve víně po alkoholovém kvašení. Kofermentace sacharidů a jablečnanu je závislá na kmeni O. oeni a na kultivačních podmínkách, jako jsou ph a koncentrace biomasy. V přítomnosti 5 mm glukosy dochází k potlačení jablečno-mléčného kvašení v 65 70 %. Také galaktosa, manosa, maltosa a trehalosa dokáží potlačovat tento typ kvašení v 60 % (Miranda a kol., 1997). Během jablečno-mléčného kvašení O. oeni dochází k degradaci kyseliny citrónové (obrázek č. 4). Při této degradaci vzniká jako meziprodukt diacetyl, který je považován za důležitou látku, která ovlivňuje vůni vína. Ve vysokých koncentracích způsobuje máslové nebo oříškové aroma. Zdroj diacetylu je α-acetomléčná kyselina (ALA), což je nestabilní složka, která podléhá spontánní nebo bakteriální dekarboxylaci na acetoin, který je oxidován na diacetyl. Diacetyl je redukován O. oeni na acetoin a 2,3-butandiol, které v normálních koncentracích neovlivňují vůni vína (Nielsen a Richelieu, 1999). 26

Obr. 4: Odbourávání kyseliny citrónové u O. oeni. Upraveno dle Nielsen Richelieu, 1999. 1.6.3.2 Izolace z vína a uchovávání Izolace se provádí na stejných médiích jako pro leukonostoky, někdy se může do média přidat 40 80 % vína ke zlepšení růstu O. oeni. Pro krátkodobé uchovávání se může tento rod uchovávat v chladničce při 4 C vpichem na šikmém Acidic Tomato agaru (Holzapfel a Schillinger, 1992). Pro dlouhodobé uchovávání se používá lyofilizace v koňském séru se 7,5 % glukosy, buňky musí být narostlé do pozdní logaritmické nebo rané stacionární fáze (Garvie, 1986). 1.6.3.3 Odlišení rodu Oenococcus od ostatních bakterií mléčného kvašení O. oeni a Lc. mesenteroides jsou si hodně podobné, obě jsou to heterofermentativní bakterie mléčného kvašení (Dicks a kol., 1995). Jsou schopny kvasit pyruvát jako zdroj uhlíku (2 pyruvát 1 mléčnan + 1 octan + 1 CO 2 ) (Wagner a kol., 2005). Byly řazeny do stejné skupiny na základě fyziologických a genetických podobností (Dicks a kol., 1995; Wagner a kol. 2005). Odlišení rodu Oenococcus od ostatních bakterií mléčného kvašení je poměrně snadné díky jeho růstu při nízkém ph (4,2-4,8) a růstu v 10 % etanolu v médiu s rajčatovým džusem (Holzapfel a Schillinger, 1992). Růst je velmi pomalý, při 22 C rostou zástupci tohoto rodu 5-7 dnů. Odlišení O. oeni od ostatních leukonostoků je možné na základě RNA/DNA hybridizace, protože leukonostoky patří do jednotné RNA skupiny 27

(Garvie, 1986), nebo pomocí druhově specifické PCR s primery o velikosti 1025 bp (Zapparoli a kol., 1998). 1.6.3.4 Druhová diferenciace Do rodu Oenococcus patří zatím dva druhy: O. oeni od roku 1995 a O. kitahariae od roku 2006. O. oeni se nachází ve víně, je acidofilní, alkoholtolerantní a je zodpovědný za jablečno-mléčné kvašení, zatímco O. kitahariae není acidofilní, ani nezpůsobuje jeblečno-mléčné kvašení a nachází se v kompostovaných zbytcích, proto odlišení těchto druhů není problém (Endo a Okada, 2006). 1.6.4 Rod Pediococcus Zástupci tohoto rodu jsou grampozitivní, nepohyblivé, nesporulující bakterie, které mají kulovitý tvar. Jsou to jediní zástupci bakterií mléčného kvašení, kteří se dělí ve dvou rovinách a tak tvoří tetrády nebo shluky buněk. Jsou aerobní až mikroaerofilní, chemoorganotrofní a vyžadují komplex růstových faktorů a aminokyselin. Všechny druhy vyžadují kyselinu nikotinovou, pantotenovou a biotin. Jsou kataláza i cytochrom negativní, avšak některé kmeny mohou tvořit pseudokatalázu, zvláště když rostou na médiích s nízkým obsahem sacharidů (Weiss, 1992; Osborne a Edwards, 2005). Pediokoky jsou homofermentativní, zkvašují glukosu na D, L- a v případě P. dextranicus a P. halophilus na L(+)-mléčnan přes Embden-Meyerhofovu dráhu bez tvorby CO 2. Rostoucí kultury jsou také schopny tvořit L(+)-mléčnan z kyseliny jablečné. Netvoří plyn z glukosy. Nacházejí se na rostlinách a ovoci, ale jen v malém počtu. Můžeme je také najít ve kvašeném rostlinném materiálu, jako jsou siláže, okurky nebo olivy, zde se rychle pomnožují a převládnou nad ostatními bakteriemi mléčného kvašení v počátečních fázích alkoholového kvašení. Dalším přirozeným místem výskytu pediokoků jsou sýry, sojová omáčka, pivo, čerstvé i konzervované maso, syrové klobásy, čerstvé a marinované ryby (Weiss, 1992). 28

1.6.4.1 Víno a rod Pediococcus Pediococcus se může dostávat do vína z půdy, z bobulí révy vinné, z vinařského vybavení. Jejich přežívání ve víně je zvýhodněno při ph vyšším než 3,5 (Davis a kol., 1986). Druhy, které se nacházejí ve víně, jsou P. damnosus, P. inopinatus, P. pentosaceus a P. parvulus (Lafon-Lafourcade a kol., 1983). Růst pediokoků ve víně je považován za nežádoucí, produkují totiž zapáchající a nechutné látky, mezi které patří acetoin a diacetyl. Ty vznikají ve vysoké koncentraci. Některé druhy rodu Pediococcus jsou schopny degradovat glycerol na akroletin, látku, která reaguje s fenolovou složkou antokyanů. Tak vzniká hořká chuť vína (Osborne a Edwards, 2005). Za určitých podmínek však může být růst pediokoků ve víně prospěšný, někdy totiž mohou tvořit vůně a příchutě pro víno žádoucí (Fleet a kol., 1984). Kromě produkce nežádoucích látek ve víně může tento rod tvořit β-d-glukany, což jsou extracelulární polysacharidy. Tyto glukany jsou tvořeny z glukosy a obsahují trisacharidovou opakující se jednotku spojenou 1 3 vazbou v hlavním řetězci a 1 2 vazbu, která připojuje vedlejší řetězce jedné D-glukopyranosyl skupiny. Způsobují zvýšení viskozity vína a mají zvýšenou odolnost k etanolu (Osborne a Edwards, 2005). 1.6.4.2 Izolace z vína a uchovávání Pro izolaci pediokoků z rostlin a kvašených rostlinných materiálů se používá MRS agar. Ke krátkodobému uchovávání těchto rodů (měsíc) se používají příslušná média naočkovaná vpichem a uchovávaná v chladničce při 4 C. K dlouhodobějšímu uchovávání se používají konzervační média s glycerolem uchovávaná při 20 C. Pro dlouhodobé uchovávání slouží lyofilizace (Weiss, 1992). 1.6.4.3 Odlišení rodu Pediococcuss od ostatních bakterií mléčného kvašení K odlišení pediokoků od ostatních bakterií mléčného kvašení se využívá jejich charakteristických vlastností. Tyto vlastnosti umožňují jejich odlišení od ostatních grampozitivních koků s vysokou spolehlivostí (Weiss, 1992). 29

1.6.4.4 Druhová diferenciace Druhová diferenciace je založena na schopnosti růstu v teplotním rozmezí, při různém ph, při koncentraci solí, na schopnosti kvasit cukry, hydrolyzovat arginin a tvořit isomery kyseliny mléčné (tabulka č. 3 - Weiss, 1992). Tab. 3: Vlastnosti k odlišení druhů rodu Pediococcus. Upraveno dle Weiss, 1992. P. damnosus P. parvulus P. inopinatus P. dextrinicus P. pentoseceus P. acidilactici P. halophilus P. urinaeequi Růst při ph 4,5 + + ND - + + - - Růst při ph 7 - + + + + + + + Růst při 45 C - - - - d + - - Růst při 10% NaCl - - - - d - + - Pseudokataláza - - ND - + + - - NH 3 z argininu - - - - + + - - Kyselina z ribosy - - - - + + + ND Kyselina z arabinosy - - - - + d + d Kyselina z xylosy - - - - d + - d Kyselina z manitolu - - - - - - - d Kyselina z laktosy - - + d d d - d Kyselina z maltosy d + + + + - + + Kyselina ze sacharosy d - d d - - + + Kyselina z trehalosy + d + - + d - - Kyselina z melesitosy d - - - - - - + Kyselina z dextrinu - - d + - - - + Kyselina ze škrobu - - - + - - - - Isomer mléčnanu DL DL DL L(+) DL DL L(-) L(+) + 90% a více kmenů pozitivní - 90% a více kmenů negativních d 11-89% kmenů pozitivních ND žádná data 1.7 Identifikace bakterií mléčného kvašení Rodová diferenciace: morfologická charakteristika na základě makroskopického vzhledu a mikroskopie za pomocí Gramova barvení. V návaznosti jsou používány biochemické testy: katalázová reakce, růst při odlišných koncentracích, tvorba CO 2 z glukosy, tvorba NH 3 z argininu, růst při teplotách 45 C a 15 C aerobně, růst na masopeptonovém agaru při 30 C. 30

Druhová identifikace: komerční souprava API 50CH (biomérieux), zejména pro druhy rodů Lactobacillus, Lactococcus a Leuconostoc. Principem testu je fermentace 49 odlišných substrátů, která se projevuje různě intenzivní změnou barvy indikátoru. Konečné vyhodnocení se provádí pomocí identifikačního programu BACTSELEKT pro numerickou identifikaci bakterií mléčného kvašení s použitím matrice LAB API 50 CHL V8.0. (Štegnerová a kol., 2007). 1.8 Schisosacchcaromyces pombe a Saccharomyces cerevisiae Některé kmeny kvasinek, konkrétně Sch. pombe mohou účinně odbourávat vysoké koncentrace kyseliny jablečné. Schopnost této kvasinky odbourávat extracelulární kyselinu jablečnou je závislá na transportu dikarboxylových kyselin a na účinnosti intracelulárních jablečných enzymů. Tyto jablečné enzymy přeměňují kyselinu jablečnou na kyselinu pyrohroznovou, která je později metabolizována na etanol a CO 2 při kvašení skrz jablečnoetanolovou dráhu. Mezi jablečné enzymy patří malátpermeasa, cytoplasmatický jablečný enzym a mitochondriální malátdehydrogenasa. Transport L-kyseliny jablečné u některých kmenů Sch. pombe je aktivní pouze v přítomnosti glukosy a dalších využitelných zdrojů uhlíku a není závislý na substrátu. Tento druh je vysoce tolerantní k vysoké koncentraci L-kyseliny jablečné, až 29 g na litr může být odbouráno bez jakéhokoliv účinku na buněčný růst. Tento vysoce aktivní metabolismus odbourávání nijak neovlivňuje metabolismus cukrů nebo schopnosti produkovat etanol (Volschenk a kol., 2003). K úplnému jablečno-mléčnému kvašení se také používá geneticky modifikovaná S. cerevisiae (Camarasa a kol., 2001; Husnik a kol., 2006), která obsahuje gen mles z Lactococcus lactis kódující jablečnomléčný enzym a gen mae1 pro malátpermeasu ze Sch. pombe. Všechny tyto geny jsou pod kontrolou kvasinkového promotru. Pak dochází k souběžnému alkoholovému a jablečno-mléčnému kvašení (Bony a kol., 1997), přičemž nedochází ke snížení účinnosti jablečného kvašení. Rekombinantní kmeny S. cerevisiae jsou pak schopny dekarboxylovat až 4,5 g na litr jablečnanu na mléčnan a CO 2 během 4 dnů (Husnik a kol., 2006). 31

1.9 Bakterie octového kvašení Bakterie octového kvašení (AAB = acetic acid bacteria) jsou gramnegativní nebo gramvariabilní, aerobní, chemoorganotrofní, kataláza pozitivní, tyčinky nebo elipsoidní bakterie, které se vyskytují v párech nebo v řetízcích. Mohou být pohyblivé pomocí peritrichálních bičíků nebo pomocí 1-8 polárních bičíků nebo nepohyblivé. Jejich teplotní optimum je 25-30 C, optimální ph je 5-6, obsah G + C v DNA je 51-65 molárních % (De Ley a kol., 2005). Patří do čeledi Acetobacteraceae, její nejvýznamnější rody jsou Acetobacter, Acidomonas, Gluconobacter a Gluconacetobacter (Ruiz a kol., 2000). Acetobacter a Gluconobacter byly izolovány z květin, ovoce, vína, moštu, piva, včel a medu. Jsou to primární mikroorganismy zahrnuty v produkci octa. Acetobacter může být také nalezen v zahradní půdě a odpadní vodě (De Ley a kol., 2005). 1.9.1 Bakterie octového kvašení a víno Gluconobacter oxydans, Acetobacter aceti, Acetobacter pasteurianus, Gluconacetobacter liquefaciens a Gluconacetobacter hansenii jsou přidruženy s hrozny a vínem (Du Toit a Lambrechts, 2002; Joyeux a kol., 1984). Během kvašení a skladování převládají rody G. oxydans, A. pesteurianus a A. aceti. Druhy rodu Gluconobacter jsou běžně izolovány z hroznů a šťávy, ale vymizí na počátku alkoholového kvašení díky jejich nízké toleranci k etanolu nebo díky ztrátě kyslíku. Gluconobacter oxydans je nejvýznamnější druh, který se nachází na zdravých, nehnilých hroznech. Acetobacter je více tolerantní k etanolu než Gluconobacter a může přežívat i během alkoholového kvašení. A. aceti a A. pasteurianus izolovány z hroznů a šťávy běžně dosahují populace 10 6 buněk na gram poškozených hroznů. Tyto druhy jsou časté na kazících se hroznech. (Joyeux a kol., 1984). Kvasinky přítomné na poškozených hroznech mohou metabolizovat hroznové cukry a tak produkovat etanol, který je těmito bakteriemi oxidován na kyselinu octovou. Vysoká koncentrace bakterií octového kvašení jako 3,9 g na litr může být nalezena ve šťávě z poškozených hroznů (Osborne a Edwards, 2005). Hustota bakterií octového kvašení je spojena se stupněm napadení révy vinné. Čím více jsou hrozny napadeny a poškozeny, tím více se na nich nachází bakterií octového kvašení. Čerstvá hroznová šťáva na počátku sklizně obsahuje průměrně 10 2 buněk na 1 ml bakterií octového kvašení (Joyeux a kol., 1984). 32

Protože jsou bakterie octového kvašení aerobní povahy, jsou přirozeně potlačovány v anaerobním prostředí, které je spojeno s alkoholovým kvašením (Osborne a Edwards, 2005). Ačkoliv A. pasteurianus a A. aceti jsou častěji izolovány z vín uskladňovaných v sudech nebo dalších nádržích ve vinařských závodech v semiaerobních podmínkách (Joyeux a kol., 1984). Přežívání bakterií octového kvašení v těchto vínech může být způsobeno vystavením vína na vzduch během čerpání a přenosu. Například Drysdale a Fleet uvedli, že bakterie octového kvašení mohou dosáhnout ve víně počtu 10 8 cfu na ml po vystavení kyslíku během přečerpávání. Kromě přítomnosti kyslíku je růst bakterií octového kvašení značně ovlivňován ph moštu (Osborne a Edwards, 2005). Ve studii Du Toita a Lambrechta je uvedeno, že počet bakterií octového kvašení se snížil z 10 5 cfu na ml na 10 2 cfu na ml v moštu s ph menším než 3,5, zatímco v moštu s ph 3,7 byla zjištěna vyšší buněčná životaschopnost (Du Toit a Lambrechts, 2002). Bakterie octového kvašení tvoří kyselinu octovou skrz oxidaci etanolu pomocí dvou enzymů vázaných na membránu, alkoholdehydrogenasy a aldehyddehydrogenasy. Alkoholdehydrogenasa oxiduje etanol na acetaldehyd, který je dále oxidován na kyselinu octovou pomocí aldehyddehydrogenasy (Saeki a kol., 1997). Některé kmeny bakterií octového kvašení mohou produkovat více než 50 g na litr z etanolu, což je dělá důležitými v produkci vinného octa (Lu a kol., 1999). Během růstu ve víně využívají bakterie octového kvašení glukosu jako zdroj uhlíku, ačkoliv glukosa je lepší zdroj uhlíku pro Gluconobacter než pro Acetobacter, protože ne všechny kmeny Acetobacter mohou účinně využívat tento cukr. Druhy Acetobacter metabolizují cukry skrz hexosa-monofosfátovou cestu, také přes Embden-Meyerhof- Parnasovu cestu a Entner-Doudoroffovu cestu a produkují octan a mléčnan. Tyto látky mohou být později oxidovány některými kmeny na oxid uhličitý a vodu skrz cestu trikarbonových kyselin. Na rozdíl od rodu Acetobacter, druhy rodu Gluconobacter využívají jen pentosa-fosfátovou cestu k tvorbě energie. Tyto organismy neobsahují funkční cyklus trikarbonových kyselin, proto nemohou oxidovat octan a mléčnan až na oxid uhličitý a vodu. Kromě glukosy mohou bakterie octového kvašení využívat i další cukry, které se mohou nacházet ve víně, jako jsou arabinosa, fruktosa, galaktosa, manitol, manosa, ribosa, sorbitol a xylosa (De Ley a kol., 2005). 33

1.9.1.1 Bakterie octového kvašení a červené víno Čerstvě vylisovaný mošt obsahuje zhruba 10 4 buněk na ml G. oxydans. Populace se značně sníží během alkoholového kvašení a na konci tohoto kvašení (10 dnů) víno obsahuje jen asi 20 buněk na ml (tabulka č. 4). Poměr G. oxydans v populaci se snižuje a naopak poměr A. pasteurianus v populaci se zvyšuje. Při odtoku vína z kvasných tanků dojde ke zvýšení populace na 3 x 10 4 buněk na ml. Na počátku jablečno-mléčného kvašení je ve víně počet bakterií octového kvašení 10 2-10 3 na ml, převažuje hlavně A. pasteurianus a v menším množství G. oxydans a A. aceti (tabulka č. 5). Po dokončení jablečno-mléčného kvašení (3 měsíce) počet buněk zůstává na 10 2 na ml v zastoupení hlavně A. aceti a v menším procentu A. pasteurianus. Pak dochází k přidávání SO 2 do vína, k filtraci a skladování vína. Po 11 měsících skladování je počet buněk 10 2-10 3 na ml a skládá se hlavně z A. aceti a z menšího množství A. pasteurianus. Množství těchto mikroorganismů je skoro stejné na povrchu i ve spodu barelů. Na konci této fáze převládá A. aceti subsp. aceti (Joyeux a kol., 1984). Tab. 4: Vývoj bakterií octového kvašení během výroby červeného vína. Upraveno dle Joyeux a kol., 1984. Tab. 5: Vývoj bakterií octového kvašení během jablečno-mléčného kvašení a skladování červeného vína v barelech. Upraveno dle Joyeux a kol., 1984. 34

1.9.1.2 Bakterie octového kvašení a kažení vína A. aceti a A. pasteurianus jsou často spojeny s kažením vína pomocí produkce vysoce těkavých kyselin. Tyto bakterie jsou aerobní, ale jsou běžně izolovány z vína ze dna tanků a barelů, proto jsou schopny přežívat a možná i růst v anaerobních a semi-anaerobních podmínkách (Bartowsky a kol., 2003). Hlavní význam bakterií octového kvašení při kažení vína je v produkci nadměrného množství kyseliny octové v přítomnosti nízké koncentrace kyslíku (Bartowsky a kol., 2003). Zákonem udávaný limit pro kyselinu octovou je 1,2 1,4 g na litr, je to koncentrace, která také značně snižuje kvalitu vína. Drysdale a Fleet uvedli, že až 50 60 % obsahu etanolu ve víně může být oxidováno těmito bakteriemi s produkcí kyseliny octové 1,5 3,75 g na litr (Osborne a Edwards, 2005). Další hlavní produkt, který ovlivňuje kvalitu vína je etylacetát. Tato látka je vysoce nežádoucí již při obsahu 10 mg na litr. Bylo prokázáno, že bakterie octového kvašení produkují etylacetát až do koncentrace 140 mg na litr ve víně a 30 mg na litr v moštu. Další nežádoucí látky pro kvalitu vína kromě kyseliny octové a etylacetátu, které produkují bakterie octového kvašení, jsou acetaldehyd (Osborne a Edwards, 2005), acetoin a dihydroxyaceton (Wixom, 1965). Drysdale a Fleet uvedli, že byla zjištěna zvýšená koncentrace acetaldehydu ve víně, kde rostly bakterie octového kvašení. Koncentrace acetaldehydu nad smyslový práh ve víně (což je 100 125 mg na litr) je nepříjemná kvůli zelené, travnaté a rostlinné vůni. Dihydroxyaceton může být produkován A. aceti a G. oxydans přes metabolismus glycerolu v aerobních podmínkách. Tato látka může ovlivňovat smyslovou kvalitu vína sladkou/esterickou chutí a může také reagovat s prolinem za tvorby kůrové vůně. Kromě toho acetaldehyd a dihydroxyaceton mohou vázat oxid siřičitý ve víně za tvorby látek, které jsou neúčinné jako antimikrobiální agens. Na závěr, některé druhy Acetobacter mohou využívat laktát za produkce acetoinu, prekurzoru diacetylu (Osborne a Edwards, 2005). Nejvyšší riziko kažení vína bakteriemi octového kvašení je během rozsáhlého skladování ve sklepě před stáčením do lahví. Toto riziko může být sníženo zabráněním vystavení vína kyslíku, nebo přidáváním SO 2 (Bartowsky a kol., 2003). 35

1.10 Metoda MALDI -TOF MS Metoda MALDI-TOF (Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry) hmotnostní spektrometrie je vysoce výkonná a spolehlivá metoda pro klasifikaci a identifikaci mikroorganismů (Fenselau a Demlrev, 2001; Krishnamurthy a Ross, 1996; Lay, 2001), která využívá přímý přístup (obrázek č. 5 - Lay, 2001). Jako první použila hmotnostní spektrometrii k charakterizaci bakterií Fenselau v roce 1975. V roce 1994 Cain uvedl, že používání off-line chromatografie v kombinaci s metodou MALDI- TOF MS rozlišuje bakterie v závislosti na analýze proteinů (Liu a kol., 2007). Obr. 5: Hlavní zpracování mikroorganismů k identifikaci a ke klasifikaci. Upraveno dle Maier a kol., 2006b. Tato metoda se využívá k fylogenetické klasifikaci a identifikaci bakterií, kvasinek i hub, dokonce i k identifikaci a klasifikaci problémových mikroorganismů (Bacillus cereus) (Maier a kol., 2006a) ze vzorků životního prostředí. Je schopna rozlišit mikroorganismy až na úroveň kmenů (Jones a kol., 2003). Na rozdíl od PCR nebo analýzy metabolitů nepotřebuje MALDI žádné počáteční určování jako je výběr primerů, oxidázový test nebo barvení dle Grama. Tato metoda je jednoduchá, rychlá, vyžaduje jen malé množství biologického materiálu a je vysoce reprodukovatelná. Díky těmto vlastnostem, nízkým nákladům a vysoké rozlišovací schopnosti je tato metoda skvělou alternativou ke klasickým mikrobiologickým technikám (Krishnamurthy a Ross, 1996; Liu a kol., 2007; Maier a kol., 2006a). 36

Při této technice jsou rostoucí bakteriální kolonie přímo přemístěny z povrchu agaru na MALDI destičku, na které jsou překryty mikroobjemem matrixového roztoku a pak jsou ozářeny N 2 laezrem (Ishida a kol., 2005). Počáteční materiál pro přípravu vzorků může být jedna kolonie (Fenselau a Demlrev, 2001) nebo pelet zcentrifugované tekuté kultury. Optimální koncentrace buněk pro přesné měření je 10 5 na ml, detekční limit spor je uváděn 10 3 na ml (Maier a kol., 2006b). Vzorek se nanáší jako tenký film přímo na MALDI destičku, kde se překryje 2 µl matrixového roztoku a vysuší se (Fenselau a Demlrev, 2001). Jako MALDI matrixový roztok je doporučován nasycený roztok HCCA (alfa-kyano-4- hydroxy kyselina skořicová) v organickém rozpouštědle (OS), které je složeno z 50% acetonitrilu (ACN), 2,5% trifluorooctové kyseliny (TFA) a destilované vody (Maier a kol., 2006b). Hmotnostní spektra jsou získána s využitím FLEX řady MALDI-TOF hmotnostního spektrometru v lineárním positivním režimu při maximální frekvenci (20 až 200 Hz). Hmotnostní rozmezí spektra je 2000 až 20 000 Da. Automatizovaná spektra jsou získaná pomocí automatizovaného Bruker softwaru s kontrolou intenzity laezru. Většinou se vystřeluje 500 x laezrem v 50-ti různých pozicích nanesené kapky. Energie laezru je nastavena mírně pod práh ionizace k získání spektra o maximálním rozlišení a širokém hmotnostním rozmezí (Maier a kol., 2006b). Výhodou metody MALDI-TOF je její vysoká opakovatelnost (Fenselau a Demlrev, 2001). Různé složení růstového média jen málo ovlivňuje rozložení píků, zvláště v rozmezí 4000 až 12 000 Da, nedochází k žádnému ovlivňování. Ani přítomnost média, které adheruje na bakteriální kolonie nemá vliv na vzniklé signály. Růstová fáze buněk má malý vliv na píky, buňky v lag fázi vykazují velmi podobné vlastnosti jako buňky ve stacionární fázi nebo ve fázi odumírání. Navíc příprava vzorků a jejich měření jsou prováděny za standardizovaných podmínek, proto získaná spektra jsou vysoce srovnatelná při různých měřeních metodou MALDI-TOF (Maier a kol., 2006b). Pro přípravu vzorků k charakterizaci grampozitivních i gramnegativních bakterií byly vyvinuty univerzální postupy (Krishnamurthy a Ross, 1996; Liu a kol., 2007). Získaná spektra mohou být použita k vytvoření velké a spolehlivé databáze. Významná opakovatelnost této metody je založena na měření konstantně tvořených vysokomolekulárních proteinů, například ribosomálních proteinů. Hmotnostní rozmezí spektra je 2000 až 20 000 Da, analýzy při tomto rozmezí obsahují málo měřitelných metabolitů (Maier a kol., 2006b). Analyzační BioTyper software obsahuje zařízení pro získávání hmotnostních spekter a zařízení pro identifikaci a klasifikaci mikroorganismů. Identifikace neznámých 37

mikroorganismů se provádí porovnáváním vytvořených píků s knihovnou uložených spekter, které obsahují charakteristické spektra druhů a poddruhů. Tyto knihovny jsou získány měřením známých bakteriálních druhů a kmenů v různých dnech v úzce definovaných podmínkách. Software automaticky vybírá píky z celé řady spekter a vygeneruje typické píky, které jsou zastoupeny v určitém počtu spekter jednoho druhu (Maier a kol., 2006b). 38

2. CÍLE DIPLOMOVÉ PRÁCE Cílem této diplomové práce jsou mikroorganismy v procesu výroby červeného vína, práce je zaměřena na bakterie podílející se na vzniku charakteristických senzorických vlastností, tak na bakterie nežádoucí. Vlastní provedení zahrnuje: - izolaci bakterií v různých fázích výroby červeného vína - přečištění vyizolovaných kmenů a jejich uchování tak, aby byly nezměněny pro další použití a studium - taxonomickou charakterizaci izolovaných kmenů (např. na základě MALDI-MS profilu) - ověření vhodnosti vyžití MALDI-MS metody pro charakterizaci a identifikaci izolátů z vína - získání přehledu o tom, které rody bakterií mléčného kvašení se nacházejí v jednotlivých fázích výroby vína, zda se tyto rody opakují a zda jsou rozdíly v počtu a zastoupení jednotlivých rodů ve vzorcích vína 39

3. MATERIÁL A METODY 3.1 Použité vzorky vína V diplomové práci byly použity vzorky moštu a červeného vína ze zahradnické fakulty v Lednici, která je součástí Mendlovy zemědělské a lesnické univerzity v Brně. Vzorky byly odebírány do plastových zkumavek s víčkem o objemu 50 ml. Doby odběrů vzorků byly přizpůsobeny jednotlivým fázím výroby vína. Tab. 6: Vzorky vína, obsah cukru, a datum sběru jednotlivých odrůd. Vzorek Obsah cukru Datum sběru Frankovka 19 º NM 11. 10. 2006 Ariana 19,5 º NM 13. 10. 2006 Cerason 22 º NM 26. 10. 2006 Mi-5-70 21 º NM 26. 10. 2006 Cabernet Sauvignon 21,5 º NM 2005 Tab. 7: Fáze výroby vína, při kterých byly odebírány vzorky, datumy jednotlivých odběrů. Odběr číslo Fáze výroby Datum odběru 1 Fáze macerace, alkoholové kvašení 6. 11. 2006 2 Po vylisování hroznů 13. 11. 2006 3 Začátek jablečno-mléčného kvašení 20. 11. 2006 4 Probíhá jablečno-mléčné kvašení 4. 12. 2006 5 Ukončení jablečno-mléčného kvašení, stočení vína 24. 1. 2007 Vzorek Ariana byl uchováván v KEG sudu, vzorky Frankovka, Cerason a Mi-5-70 byly uchovávány v kovových kádích a vzorek Cabernet Sauvignon byl uchováván ve skleněném demižonu. Cabernet Sauvignon sloužil jako srovnávací vzorek, jedná se o hotové víno po hrubé filtraci z roku 2005. Do všech vzorků kromě vzorku Ariana byly přidávány bakterie mléčného kvašení O. oeni BioStar Oenos sk1, které distribuje německá firma Erbslöich Gaisen. 40

3.2 Kultivační média ACETOBACTER-GLUCONOBACTER AGAR Kvasničný extrakt. 10 g Glukosa...100 g CaCO 3... 20 g Agar..25 g Destilovaná voda 1000 ml ph = 7,4 ± 0,2 ACETOBACTER AGAR (GLUCOSE) Kvasničný extrakt......,...10 g CaCO 3....10 g Glukosa....3 g Agar....15 g Destilovaná voda.1000 ml ph = 7,4 ± 0,2 K izolaci bakterií octového kvašení (Yamada a kol., 1999). LACTOBACILLUS AGAR (M.R.S. = de Man, Rogosa, Sharpe) Pepton...10 g Lab-Lemco prášek.. 8 g Kvasničný extrakt...... 4 g Glukosa.........20 g Tween 80..1 ml Hydrogenfosfát draselný....2 g Acetát sodný x 3H 2 O.....5 g Citrát amonný....2 g Sulfát hořečnatý x 7H 2 O.......0,2 g Sulfát manganatý x 4H 2 O........0,05 g Agar..........15 g Destilovaná voda....1000 ml ph = 6,2 ± 0,2 K izolaci bakterií mléčného kvašení (Hammes a kol., 1992). 41

TOMATO JUICE AGAR Pepton... 10 g Peptonové mléko..10 g Rajčatový džus. 400 ml Agar..20 g Destilovaná voda..600 ml ph = 6,1 ± 0,2 TOMATO JUICE AGAR Rajčatový džus..20 g Pepton... 10 g Peptonové mléko..10 g Agar..12 g Destilovaná voda.1000 ml ph = 6,1 ± 0,2 K izolaci bakterií rodu Oenococcus, Leuconostoc a Pediococcus (Holzapfel a Schillinger, 1992). NUTRIENT AGAR (MPA 1) Pepton...5 g NaCl...5 g Hovězí extrakt.1,5 g Kvasničný extrakt 1,5 g Agar..15 g Destilovaná voda 1000 ml ph = 7,4 ± 0,2 Sterilizace kultivačních médií byla prováděna autoklávováním po dobu 15-20 minut při teplotě 121 C. Na vysterilizovaná média se pipetovalo 0,1 ml vína sterilními špičkami, následovalo rovnoměrné rozetření pomocí sterilních skleněných hokejek. Pro ukládání mikroorganismů do glycerolových konzerv byly použity roztoky sterilního Acetobacter média, MPB, MRS média, Tomato juice broth a sterilního 15 % glycerolu ve výsledném objemu 1ml. 42

Pro ukládání mikroorganismů na korálcích byly použity ochranná sterilní Acetobacter média, MPB, MRS média a Tomato juice broth s 15% glycerolem. 3.3 Antimykotika K potlačení růstu kvasinek byl použit nystatin, což je polyenové antimykotikum s velmi dobrou účinností. Je poměrně toxický, váže se na ergosterol a tak ovlivňuje permeabilitu buněčné stěny a cytoplasmatické membrány (Votava, 2001). 30 mg práškového nystatinu bylo naředěno 6ti ml dimetylsulfoxidu. Po rozpuštění se pipetovalo 0,1 ml sterilními špičkami na misky, následovalo rovnoměrné rozetření pomocí sterilních skleněných hokejek. Nystatin se používal od druhého odběru v Lednici (13. 11. 2006). 3.3.1 Testování citlivosti na antimykotikum nystatin Zkoušely se tři typy ředění nystatinu dimetylsulfoxidem u vzorku Ariana, odběr 2: Zkumavka č.1: 15 mg nystatinu + 3 ml dimetylsulfoxidu, pipetovat 0,1 ml sterilními špičkami na misku. Zkumavka č.2: 100 µl směsi ze zkumavky č.1 + 100 µl dimetylsulfoxidu, pipetovat 0,1 ml sterilními špičkami na misku. Zkumavka č.3: 100 µl směsi ze zkumavky č.2 + 100 µl dimetylsulfoxidu, pipetovat 0,1 ml sterilními špičkami na misku. Napipetované antimykotikum se rovnoměrně rozetřelo po miskách pomocí sterilních skleněných hokejek. 43

3.4 Kultivace mikroorganismů Kultivace mikroorganismů z moštu a červeného vína probíhala na miskách s uvedenými médii s nystatinem. Tomato agar se používal od druhého odběru (13. 11. 2006), MRS agar se nepoužíval v posledním odběru (24. 1. 2007), antimykotikum nystatin se používalo od druhého odběru (13. 11. 2006). Pro přehlednost jsou použitá média v jednotlivých odběrech shrnuty v tabulce č. 8. Tab. 8: Použitá média při izolaci mikroorganismů z moštu a červeného vína. Odběr Datum Použitá média / počet jednotlivých izolátů nystatin číslo odběru Acetobacter agar MPA MRS agar Tomato agar 1 6. 11. 2006 + + + - - 2 13. 11. 2006 + + + + ± 3 20. 11. 2006 + + + + + 4 4. 12. 2006 + + + + + 5 24. 1. 2007 + + - + ± Obr. 6: Izolace z Mi-5-70 Obr.7: Izolace z Frankovky horní řada Tomato, Aceto, MPA a MRS agar, dolní řada - Tomato, Aceto, MPA a MRS agar s přídavkem nystatinu horní řada Tomato, Aceto, MPA a MRS agar, dolní řada - Tomato, Aceto, MPA a MRS agar s přídavkem nystatinu Kultivace probíhala při 30 ºC po dobu 7 dnů, nárůst byl hodnocen po 24. hod, 48. hod, 72. hod, 96. hod, 120. hod, 144. hod a 168. hod. 44

3.5 Uchovávání mikroorganismů Vyizolované a přečištěné kultury byly uchovávány na šikmých agarech při 4 C po dobu 1 2 týdnů v chladničce a následně uchovávány jako tzv. glycerolové konzervy a na korálcích. Glycerolové konzervy byly připraveny resuspendováním 2-3 kliček 48. hodinové nebo 72. hodinové kultury v 850 µl Acetobacter média, MPB, MRS média, Tomato broth a 150 µl sterilního glycerolu. Zamražení bylo provedeno při teplotě 70 C, uchovávání při 25 C. Při uchovávání na korálcích se do sterilních kryozkumavek se saponátem omytými 22. korálky pipetovalo cca 2 ml ochranného Acetobacter média, MPB, MRS média a Tomato juice broth s glycerolem. Na 100 ml média se přidávalo 15 g glycerolu. Do ochranného média se přidaly 2-3 kličky 48. hodinové nebo 72. hodinové kultury, poté se médium odsálo pomocí pipety a kultury se zamrazily při teplotě 70 C, poté byly uchovávány při 25 C. 3.6 Použité přístroje Autokláv PS 20 A (Chirana, ČR) Autokláv Sanyo (Japonsko) Centrifuga T24 (Janetzki) Flow box Schoeller instruments clean air EH 12469 (Nizozemí) Fotoaparát Nikon (Japonsko) Chladničky (Gorenje, Calex, Liebherr) Laboratorní váhy Sartorius Excellence, E 2000 D (Gottlingen AG, Německo) Mikroskop OLYMPUS (Japonsko) Termostat BT 120 (Liebher, Švýcarsko) Vortex (Heidolph) Zařízení Reflex IV (Bruker, Brémy, Německo) 45

3.7 Základní diagnostické testy Vyizolované a přečištěné kultury byly zamraženy a připraveny pro identifikaci pomocí základních diagnostických testů a metody MALDI-TOF. 3.7.1 Makroskopie kolonií Byl hodnocen vzhled kolonií, tvar, velikost, barva a přibližný počet. Makroskopie se prováděla u kultur narostlých na Acetobacter agaru, MRS agaru, Tomato juice agaru a MPA. Příklady dokumentace nárůstu izolátů na agarových médiích: Obr.8: Frankovka + nystatin, odběr 5, Obr.9: Mi-5-70 + nystatin, odběr 4, kolonie č. 2, Tomato agar kolonie č. 2, Tomato agar 3.7.2 Barvení dle Grama Barvení dle Grama se provádělo u kultur narostlých na Acetobacter agaru, MRS agaru a Tomato juice agaru. Na podložní sklíčko se nanesla kapka vody, přidala se klička kultury, sklíčko se nechalo usušit. Fixace v plameni. Fixovaný preparát se barvil krystalovou violetí, která obarvila buňky tmavěmodře až fialově. Následovalo barvení Lugolovým roztokem, což v buňkách vedlo ke vzniku komplexu barviva s jodem. Dalším krokem bylo působení 96% etanolu, grampozitivní bakterie si podržely komplex krystalové violeti s jodem, gramnegativní bakterie se odbarvily. Poslední barvení bylo safraninem (Votava, 2001). 46

3.7.3 Mikroskopie kolonií Usušená a nabarvená sklíčka se pozorovala pod světelným mikroskopem při zvětšení 10 x 100 pomocí imerzního oleje. Příklady kultur po barvení dle Grama: Obr.10: Ariana + nystatin, odběr 5, Obr.11: Cerason + nystatin, odběr 5, kolonie č.1, Tomato agar kolonie č.3, Tomato agar Obr.12: Mi-5-70 + nystatin, odběr 4, Obr.13: Frankovka + nystatin, odběr 5, kolonie č. 2, Tomato agar kolonie č.2, Tomato agar 47