Genetická kontrola prenatálního vývoje Vývoj jedince Individuální vývoj začíná okamžikem oplození Předchází gametogeneze u obou pohlaví meióza, včetně procesu crosing over a rekombinace Vývoj jedince pak končí definitivně jeho smrtí Gametogeneze tvorba pohlavních buněk z primordiálních zárodečných buněk jsou haploidní oproti somatickým Spermatogeneze v semenných kanálcích testes od počátku pohlavní dospělosti spermatogonie 2n primární spermatocyt 2n sekundární spermatocyt 1n spermatida 1n spermie 1n přibližně 64 dní v jednom ejakulátu přibližně 200 milionů spermií Spermatogeneze Oogeneze na rozdíl od spermatogeneze probíhá převážně již v prenatální době oogonie 2n primární oocyt 2n sekundární oocyt 1n + 1 polární tělísko vajíčko + 1 polární tělísko při narození jsou primární oocyty ve stadiu profáze I (dictyoten) a tak setrvávají až do pohlavní dospělosti; primární oocyt pokračuje v meióze I a rozdělí se na sekundární oocyt (1n) s většinou cytoplazmy a organelami a na polární tělísko meioza II je dokončena pouze v případě oplodnění 1
Oogeneze Prenatální vývoj Reprodukce genotyp potomka je kombinace vloh rodičů Gameta - haploidní sada jaderných chromosomů; pro některé geny je důležitý původ (genomický imprinting) Vajíčko jaderné chromosomy, mitochondrie (2% obsahu DNA), cytoplasma se zásobními látkami Spermie sada jaderných chromosomů otce Nezbytnost kombinace mateřské a otcovské sady chromosomů Triploidie neslučitelná s vývojem embrya (2 spermie nadměrný růst trofoblastu; 2x sada chromosomů vajíčka porucha vývoje zárodku, malá placenta) Neplodnost, sterilita 15 % manželství bezdětných Sterilita (genetické příčiny, negenetické příčiny anatomie dělohy, patologické imunitní reakce, poruchy krevního oběhu v placentě) Spontánní potraty (např. poruchy regulace vývoje plodu; chromosomální aberace) Farmakologická léčba (např. úprava hladin hormonů) Asistovaná reprodukce, in vitro fertilizace Stádia prenatálního vývoje Preembryonální stádium do 6. dne po oplození zygota až blastocysta polární organizace cytoplasmatických struktur zygoty Embryonální stádium od 1. týdne do konce 8. týdne ektoderm, entoderm a mesoderm - jsou vytvořeny základy pro tvorbu tkání a orgánů nastává shlukování buněk, vytvářejí se tělní osy kranio-kaudální a dorso-ventrální, formují se tkáně a orgány embryonální vývoj je od počátku regulován skupinami HOX a PAX genů Fetální stádium od 8. týdne těhotenství do porodu charakterizováno rychlým růstem a zráním plodu Vývoj jedince Základní otázkou genetiky vývoje jak vznikají v průběhu vývoje jedince obrovské morfologické i funkční rozdíly mezi buňkami se stejným genomem Shodný genom ne-genetické (epigenetické) odlišení tím, které geny jsou u daného typu buněk aktivní diferenciální exprese genů Genová exprese musí být správně načasována a musí být specifická pro dané stadium složité regulační kaskády, které obsahují množství specifických transkripčních faktorů (bílkovin), které vazbou na DNA přímo ovlivňují expresi dalších genů Genetická kontrola vývoje Morfologické a funkční procesy přesně naprogramovány (dané pořadí, čas, rozsah, atd.) Mutace v DNA narušení posloupnosti totipotence/represe a dereprese genů Embryonální indukce interakce mezi různými buňkami a tkáněmi (př. chondromezodermové tkáně obratlovců ovlivňuje vývoj CNS z ektodermu, který leží nad ním) 2
Morfogeneze Tkáňově specifické transkripční faktory např.: PAX 3 se účastní tvorby neurální lišty a dermatomyotomálních segmentů (vznik kosterních svalů a dermis z buněk odvozených od mesodermu) PAX 6 - reguluje tvorbu neurální tkáně, která se podílí na formaci oka Vnitřní změny v expresi genů závisí na hladině transkripčních faktorů; mutace v transkripčních faktorech zásah do vývoje organismu genomický imprinting Hladiny signálních molekul např.: deficience enzymu 21-hydroxylázy je způsobena mutací genu, který je aktivní v nadledvinkách porucha vývoje gonád u ženského pohlaví (virilizace) Genetická kontrola vývoje Všechny klíčové procesy (proliferace, patterning, migrace, diferenciace a apoptóza) musí být řízeny spuštěny, zastaveny a modulovány Řídící signál může přicházet přímo z buňky autospecifikace; častěji přichází z okolních buněk indukce (proliferace, diferenciace, ) Signálem může být kontakt s jinou buňkou, s extracelulární matrix, s rozpuštěnými signálními molekulami (většinou z blízkého okolí - parakrinní signály Signály - mitogenní, pro apoptózu, poziční... Pro signalizaci je nezbytná interakce signální molekuly s cílovou buňkou; cílová buňka tedy musí být vnímavá tím, že obsahuje specifický receptor Cílová buňka často i zpětnovazebně ovlivňuje buňky vysílající signál, takže často se dvě skupiny buněk ovlivňují navzájem Na formování tkání podílí i fyzikální síly, které mají funkci signální a stavební (hydrostatický tlak tekutiny vytváří lumen dutých útvarů...) Genetická kontrola embryonálního vývoje Transkripční faktory, které hrají specifickou úlohu během embryonálního vývoje: HOX geny - homeotické ev. homeoboxové geny SRY (sex determining region of Y chromosome) oblast určující pohlaví na chromosomu Y SOX geny - evolučně starší autosomální homology (SRY- box obsahující geny). Např. SOX9 je nezbytný člen kaskády diferenciace varlete, spouštěný přímo SRY; je nezbytný faktor pro vytvoření chrupavčitých základů kostí z nediferencovaného mezenchymu (pod vlivem signalizace BMP). Mutace SOX9 způsobují poruchu vývoje skeletu s poruchou determinace pohlaví u mužů BMP kostní morfogenetické proteiny (bone morphogenetic proteins) PAX geny jsou skupina transkripčních faktorů odvozená od genu paired Drosophily; Pax geny jsou velmi důležité pro organogenezi MyoD = myogenic differentiation, je nezbytný pro diferenciaci buněk svalů TBX geny např. TBX4 je nezbytným faktorem pro vývoj zadní končetiny; TBX5 specifikuje končetinu přední a podílí se na vývoji srdce HOX geny (Homeobox geny) Komplexy regulačních genů (těsně vázané) přesná hierarchie jejich působení přímý lineární vztah mezi pozicí genů a jeho dočasnou prostorovou expresí Podmiňují embryonální vývoj ve směru předozadní tělové osy, vysoce konzervativní geny (identické sekvence u různých druhů organismů), exprese během časné gastrulace Produkty Hox genů: transkripční faktory pro různé cílové geny podmiňují organogenezi neurální trubice, ledvin, plic, střeva, zárodečných buněk apod., působí parakrinně, mohou spouštět několik vývojových programů jiných morfogenů v sousedních buňkách Kontrolují buněčnou migraci, diferenciaci, apoptózu HOX geny (Homeobox geny) Příklady mutací HOX genů mutace HOXA/ 7+ mutace v dalších genech: Wolf- Hirschhornův syndrom retardace růstu, mikrocefalie, rozštěp rtu/patra, defekty srdce, mentální retardace Hox geny - určují specifikaci jednotlivých segmentů (Labial(lab), Proboscipedia(pb), deformed(dfd), Sex combs reduced(scr), Antennapedia(Antp), Ultrabithorax(Ubx), Abdominal-A(abd-A) a Abdominal-B(Abd-B) mutace HOX D/13: Synpolydaktylie semidominantní znak - heterozygoti: srostlé články dvou prstů a navýšení prstů rukou i nohou - homozygoti: těžce postiženi Dolní část obrázku zobrazuje homologické Hox geny savců. Např. Abd-B je homologický HoxA/9-13. Tyto geny jsou potřeba pro vývoj ocasu a končetin. 3
PAX geny (Paired-box geny) regulační geny zásadní význam pro morfogenezi kódují transkripční faktory PAX 6 - reguluje tvorbu neurální tkáně, která se podílí na formaci oka mutace PAX 6: absence duhovky (aniridia) Housekeeping geny aktivní ve všech buňkách zajišťují základní funkce buněčného metabolismu: syntéza nukleových kyselin a proteosyntéza, transport živin a jejich zpracování, biosyntéza cytoskeletu a organel mutace PAX 3: Waardenburgův syndrom hluchota, bílý pramen vlasů, heterochromie iris (AD) Specializované geny Určují jedinečné rysy různých typů buněk Epigenetická regulace diferenciace - imprinting změny struktury chromatinu modifikace v sekvenci DNA (methylace) V dceřinných buňkách je udržována stabilní exprese shodných genů Epigenetická regulace reverzibilní změny funkce genů bez změny sekvence DNA (bez změny genotypu) Epigenetické faktory ovlivňují fenotyp Epigenetická informace je přenášena z jedné generace do další generace na buněčné úrovni (buněčná paměť) EPIGENETICKÁ REGULACE Regulace na úrovni transkripce má vliv na množství a časování výskytu funkčního produktu genu (RNA nebo proteinu) 1. DNA methylace - Přibližně 60 70% CpG je methylováno. CpG jsou seskupeny do shluků (CpG ostrůvky), které jsou přítomny v oblasti promotoru 2. Utlumení transkripční aktivity na úrovni modifikace histonů (neaktivní heterochromatin); NH2-skupina lysinu má basický charakter - proto se lysiny histonů mohou vázat s negativně nabitými fosfáty DNA a tím zamezí transkripci. Acetylace určitých histonů, které tvoří nukleosom eliminuje jejich positivní náboj a těsná interakce DNA-histon se poruší. Transkripční faktory tak mají k DNA přístup, umožní funkci RNApolymerasy a transkripce genu může nastat. CpG metylace Jeden z nejlépe prozkoumaných je CpG metylace CpG metylace je modifikace cytosinu na metylcytosin v místě sekvence 5 CG3 ; probíhá obvykle na obou řetězcích. Vysoce metylovaný promotor genu je obvykle neúčinný. CpG metylace je zodpovědná i za fenomén imprintingu. Imprinting transkripční aktivita daného genu závisí na tom, jestli je uložen na chromosomu mateřského nebo otcovského původu. Imprinting obvykle vzniká metylací daného genu během gametogeneze u jednoho pohlaví. U potomka je alela daného genu pocházející od tohoto rodiče neaktivní významný klinický důsledek při uniparentální disomii. Uniparentální disomie je stav, kdy oba chromosomy určitého páru jsou od jednoho rodiče (např. v buňkách maligních nádorů). Tento stav nebývá balancovaný, nýbrž má klinické projevy odpovídající chybění imprintovaných genů, které jsou sice přítomny ve dvou kopiích, obě jsou však metylovány a tudíž inaktivní. Specifikace buněk během časného vývoje Kmenové buňky nediferencované buňky s vysokou proliferační aktivitou Diferencované buňky krátká životnost (erytrocyty, krevní destičky) dlouhá životnost (neurony, endokrinní buňky) Fetální kmenové buňky - nové směry léčby : Parkinsonova choroba, cirrhosa jater, Diabetes mellitus I 4
Kmenové buňky Kmenové buňky nejsou jednoho typu, ale liší se tím, v jaké spektrum buněk se mohou diferencovat. Z časných embryí lze izolovat tzv. embryonální kmenové buňky (embryonal stem cells, ES cells), které jsou pluripotentní nejsou schopny dát vznik embryu (jedině zygota případně blastomery časné moruly jsou totipotentní), ale jsou schopny diferenciace ve všechny typy buněk s výjimkou trofoblastu. Snem transplantační medicíny je mít možnost takové kmenové buňky izolovat z konkrétního pacienta v kterémkoli okamžiku života, in vitro je pomnožit, vyrobit z nich orgán a ten transplantovat (a definitivně tak vyřešit nedostatek dárců i odhojování allogenních transplantátů). Hemoglobin 2 geny / 4 podjednotky (4 polypeptidické řetězce tetramer + hem (pigment obsahující železo) Rodina genů alfa (16 chr.) a beta (11 chr.) Transkripce genů během ontogeneze přepínání Hemoglobin: Embryonální zeta2 epsilon2 alfa2 epsilon2 zeta2 gama2 Fetální alfa2 gama2 Adultní alfa2 beta2 alfa2 delta2 Hb + 4O 2 Hb.O 2 Migrace buněk během diferenciace Teratogeny zejména před formací zárodečných vrstev na počátku organogeneze dochází ke snížení migrace v dospělosti buňky navzájem přiléhají tvoří buněčné klony Fyzikální vlivy záření, vysoká teplota, saunování, nadměrné slunění Chemické látky; pozor testování léků na teratogenní účinky (warfarin, antiepileptika, cytostatika, thalidomid ); alkohol, drogy Infekce (zarděnky, herpetické viry, HIV, toxoplasmóza) Nemoci matky cukrovka, fenylketonurie Působení teratogenu nevyvolá dědičnou vadu; závisí na době a intenzitě působení, na genotypu plodu i matky Teratogenní účinek thalidomidu Malformace končetin Neprůchodnost jícnu Ageneze ledvin.atd. Teratogenní účinek thalidomidu a) Postižení různých systémů člověka je dáno stadiem embryonálního vývoje, v němž látka působí. Souvisí s kritickým obdobím citlivosti cílových tkání na daný teratogen. b) Rozdíly v postižení dětí lze vysvětlit interakcí Thalidomidu s genetickými faktory. Postižení jedinci mohou být geneticky predisponováni např. přítomností zcitlivujících alel genů malého účinku. c) Teratogeny mohou vykazovat druhovou specifitu účinku, na Thalidomid jsou citliví především primáti. d) Interakce genetických faktorů s Thalidomidem. Vzhledem k mezidruhovým rozdílům, (např. v metabolismu teratogenu) je nutné provést testování teratogenicity na několika zvířecích modelech. Model s mutantní alelou jako součást testovacího systému může odhalit teratogenní účinek v důsledku zvýšené citlivosti. 30 5
Poruchy vývoje organismu Malformace - poruchy vývoje orgánů v důsledku změny genetické informace (monogenně nebo multifaktoriálně dědičné); vrozené vady postihující jen jednotlivé orgány např. srdeční vady, rozštěpy páteře, rozštěpy rtu nebo patra, polydaktylie Disrupce - poruchy vývoje orgánů vyvolané vnějšími vlivy; malformace končetin vyvolané amniovými pruhy, které mohou ovinout vyvíjející se končetinu a způsobit její zaškrcení Deformace - defekty vyvolané působením neobvyklých sil na normálně založený orgán; např. pes equinovarus při nedostatku plodové vody, způsobený vynuceným chybným postavením nohy plodu Dysplázie - způsobeny abnormální organ-zací buněk ve tkáních; příčinou je porucha indukce, diferenciace nebo apoptózy; např. osteogenesis imperfekta nebo dysplázie ledvin Sekvence - mnohočetné vady, které vznikají jako kaskáda následných dějů; např. při agenezi ledvin nedostatek plodové vody vede k mechanické deformaci obličeje tlakem stěn dělohy a k hypoplázii plic (bez dostatku plodové vody se nepřiměřeně vyvíjejí) Syndromy - zpravidla mnohačetné vady se známou příčinou (např. Downův syndrom); několik tisíc syndromů různé genetické etiologie (monogenně dědičné, chromosomální, vyvolané teratogeny) Asociace - kombinace více vad, které nejsou sekvencí ani syndromem; např. VATER asociace (vertebral- annal-tracheal-esophageal and renal abnormalities). VATER asocíace je vyvolána působením teratogenů na vývoj více orgánů současně Pohlavní dimorfismus 4 různé pohledy na biologické pohlaví chromosomy (XX, XY) pohlavní orgány (ovaria, testes) fenotyp psychika do 5.- 6. týdne embryonálního vývoje Wolfovy a Müllerovy vývody Y chromosom SRY gen pohlaví určující gen blízko pseudoautosomální oblasti, jeho produktem je transkripční faktor, který následně ovlivní tvorbu testes a zánik Müllerových vývodů TDF gen - testes determining factor semenné tubuly a Leydigovy buňky stimulace z placenty choriogonadotropním hormonem X chromosom u žen inaktivace jednoho chromosomu v mikroskopu patrný jako tzv. Baarovo tělísko lokalizace u jaderné membrány ve stadiu cca 100 buněk inaktivace = lyonizace inaktivované geny mají methylovaný cytosin v oblasti promotoru, inaktivace též provázena modifikací histonů 10-15% genů uniká inaktivaci XIST (X-inactive specific transcript) X-inaktivační centrum tvoří se nekódující RNA, zapojuje se do komplexu, který tvoří sex-chromatin ovaria se tvoří 12. týden za nepřítomnosti genů Y chromosomu mozaicismus 46, XX Porucha ontogeneze pohlaví Testikulární feminizace TF - dědičnost GR, při karyotypu 46, XY se vyvíjí ženský fenotyp, - jedinec nemá ovaria, dělohu ani vejcovody, nesestouplá testes produkují testosteron - tkáně postižených nejsou citlivé na testosteron - u jejich matek přibližně 50% buněk nemá příslušné androgenní receptory Jaký je genotyp matek? Jaké riziko postižení dětí TF? X TF X přenašečky mutované alely 1/2 dětí s karyotypem 46,XY postižených TF 6
Anhidrotická ektodermální dysplázie (GR) Projevy u mužů: poruchy dentice (hypodoncie) absence potních žláz -> hypertermie závažný průběh (jinak banálních) infekcí Anhidrotická ektodermální dysplázie Projevy u mužů: poruchy dentice (hypodoncie) absence potních žláz -> hypertermie závažný průběh (jinak banálních) infekcí Projevy u heterozygotních žen: absence potních žláz v ohraničených úsecích kůže, které se neshodují ani u monozygotických dvojčat Projevy u žen: absence potních žláz v ohraničených úsecích kůže, které se neshodují ani u monozygotických dvojčat + X eda X X + Y + X X + + X Y eda X X + eda X Y Jaké je vysvětlení pro fenotypickou variabilitu MZ dvojčat? Náhodná inaktivace chromozómu X Jaké by bylo rozložení postižených úseků kůže u MZ bratrů? Nemají žádné potní žlázy (hemizygoti pro chromozóm X nesoucí mutaci) 38 Anhidrotická ektodermální dysplázie je způsobena mutací genu EDA Tento gen kóduje protein ektodysplasin, který je členem TNF rodiny a působí jako signální molekula v morfogenezi epithelu Adrenogenitální syndrom (AR) vrozená porucha tvorby enzymu 21-hydroxylázy, důsledkem je porucha biosyntézy kortisolu (adrenální steroidní hormon) v nadledvinkách hyperplasie kůry nadledvinek; v důsledku poruchy syntézy kortisolu zvýšení hladiny adrenokortikotropního hormonu (ACTH) klinické dopady: - virilizace děvčat externí genitálie mužské (po akumulaci ACTH) - u chlapců silné ochlupení brady a hrudi, nádory varlat 7