ORIGINÁLNÍ VYUŽITÍ REVERZNÍ OSMÓZY PŘI TESTOVÁNÍ TOXICITY ENVIRONMENTÁLNÍCH VZORKŮ

MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA CENTRUM PRO VÝZKUM TOXICKÝCH LÁTEK V PROSTŘEDÍ ORIGINÁLNÍ VYUŽITÍ REVERZNÍ OSMÓZY PŘI TESTOVÁNÍ TOXICITY ENVIRONMENTÁLNÍCH VZORKŮ Diplomová práce Kamila Krejčí VEDOUCÍ PRÁCE: RNDr. Mgr. MICHAL BITTNER, Ph.D. Brno 2013

BIBLIOGRAFICKÝ ZÁZNAM Autor: Bc. Kamila Krejčí Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie Název práce: Originální využití reverzní osmózy při testování toxicity environmentálních vzorků Studijní program: Experimentální biologie Studijní obor: Ekotoxikologie Vedoucí práce: RNDr. Mgr. Michal Bittner, Ph.D. Akademický rok: 2013 Počet stran: 71 Klíčová slova: estrogenní látky, endokrinní disrupce, reverzní osmóza, extrakce tuhou fází, in vitro testování

BIBLIOGRAPHIC ENTRY Author: Bc. Kamila Krejčí Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental biology Title of Thesis: Original use of reverse osmosis for preparation of environmental samples for toxicity testing Degree Programme: Experimental biology Field of Study: Ecotoxicology Supervisor: RNDr. Mgr. Michal Bittner, Ph.D. Academic Year: 2013 Number of Pages: 71 Keywords: estrogenic substances, endocrine disruption, reverse osmosis, solid phase extraction, in vitro testing

ABSTRAKT Látky vykazující estrogenní potenciál mají schopnost působit na endokrinní systém exponovaných organismů. Tyto látky jsou nezbytné pro přirozený vývoj všech organismů. Problém je však dávka, která se do organismů dostává. Estrogenní látky, které se vyskytují v odpadních vodách, a které čistírny odpadních vod neodfiltrují, mohou působit na organismy negativně. V rámci této studie byla navržena a optimalizována metoda hodnocení estrogenity vodných vzorků pomocí in vitro testu, ve kterých se využívala buněčná linie HeLa 9903, obsahující reportérový gen pro luciferázu. Dále byla navržena a testována reverzní osmóza (RO), a to jako metoda prekoncentrace vodného vzorku před samotným in vitro testováním. RO pro tyto účely nebyla doposud prostudována. Touto metodou byly připravovány vodné vzorky, a to zakoncentrováním vodného roztoku 17 -estradiolu, který byl sledován pro svůj estrogenní potenciál. Výtěžnost metody RO byla porovnávána s výtěžností metody extrakce tuhou fází (SPE). Během testů bylo zjištěno, že je RO schopna zakoncentrovat vodný vzorek přibližně 93x a metoda SPE je schopna vodný roztok zakoncentrovat přibližně 12x. Jedná se však o prvotní výsledky, které bude nutno upřesnit (neboť se rozchází teoretické výpočty účinnosti RO s experimentálními zjištěními).

ABSTRACT Substances exhibiting estrogenic potential have the ability to act on the endocrine system of exposed organisms. These substances are essential for the natural evolution of organisms. However, the problem is the amount of the substance which is entering the organism. Estrogenic substances, that are present in wastewater, which are not filtered during treatment, could have a negative effect on organisms. In this study, there was designed and optimized method of evaluation of estrogenic aqueous samples by in vitro assay using the cell line HeLa 9903, which contains the reporter luciferase gene. Furthemore, there was also designed and tested the use of reverse osmosis (RO) method, as a method of water sample preconcentration prior to in vitro testing. RO has not been studied yet for this purpose. By this method, aqueous samples were prepared by concentrating of 17β-estradiol water solution, which were then monitored for their estrogenic potential. The RO method was compared with the SPE method. During the tests it was found that the RO separation method is capable of concentrating the aqueous sample approximately 93x and the SPE method is able to concentrate the aqueous solution approximately 12x. There are preliminary results that is necessary to valide (because there is discrepancy in theoretical and experimentel results).

PODĚKOVÁNÍ Na tomto místě bych ráda poděkovala svému školiteli RNDr. Mgr. Michalovi Bittnerovi, Ph.D. za všestrannou podporu, velkou ochotu, trpělivost a odborné vedení. RNDr. Barboře Jarošové bych ráda poděkovala za zasvěcení do metody extrakce tuhou fází. Za pomoc při práci v laboratoři děkuji Roswitě Liškové. Děkuji také SFZP grantu za finanční podporu. Poděkování patří rovněž celé mé rodině, která mě neocenitelně podporovala a dodávala mi potřebnou energii. PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem svoji diplomovou práci vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány. Brno 17. května 2013..........................

SEZNAM ZKRATEK CA acetát celulózy, nejčastěji di- nebo tri-acetát (Cellulose acetate) CSTEE Vědecký výbor pro toxicitu, ekotoxicitu a životní prostředí (Comité Scientifique de Toxicologie, Ecotoxicologie et l'environnement) ČOV čistírna odpadních vod DAI daidzein DCC suspenze aktivního uhlí pokrytá dextranem (dextran coated charcoal) DES diethylstillbestrol dh 2 O deionizovaná voda (zbavena rozpuštěných minerálních látek) DMSO dimethylsulfoxid (dimethyl sulfoxide) DMEM kultivační médium (Dulbecco s Modified Eagle Medium) E1 estron E2 17 -estradiol E3 estriol EC 50 efektivní koncentrace pro 50% účinek EDCs látky, způsobující endokrinní disrupci (Endocrine Disrupting Compounds) EEQ estradiolový ekvivalent (estradiol equivalent) ELISA imunologická metoda sloužících k detekci protilátek (Enzyme- Linked ImmunoSorbent Assay) ERs estrogenní receptor (Estrogen Receptors) EtOH ethanol FBS fetální bovinní sérum GC plynová chromatografie (Gas Chromatography) GEN genistein GFP zelený fluorescenční protein (Green Fluorescent Protein) HeLa buněčná linie pocházející z lidského karcinomu děložního čípku (Henrietta Lakcs) HLB reverzní fáze sorbentu kolony SPE (Hydrophilic Lipophilic Balanced) HPLC vysokorozlišovací kapalinová chromatografie (High Performance Liquid Chromatography) M molární 9

MS mm Hg IPCS Log K OW Luc MeOH PBS RLU RO SDB SPE hmotnostní spektrometrie (Mass Spectrometry) jednotka měření tlaku mezinárodní program chemické bezpečnosti (International Programme on Chemical Safety) rozdeľovací koeficient n-oktanol/voda luciferáza methanol fyziologický roztok používaný pro práci s buněčnými kulturami jako pufr (Phosphate Buffered Saline) relativní luminiscenční jednotky (relative luminescence units) reverzní osmóza (Reverse Osmosis) styrendivinylbenzen extrakce tuhou fází (Solid Phase Extraction) 10

OBSAH ÚVOD... 14 1. TEORETICKÁ ČÁST... 15 1.1 HORMONY JAKO ENDOKRINNÍ DISRUPTORY... 15 1.1.1 Endokrinní estrogenní disruptory rozdělení... 16 1.1.2 Testované estrogenní látky... 18 1.1.3 Techniky detekce estrogenity... 20 1.2 EXTRAKCE TUHOU FÁZÍ (SPE)... 21 1.2.1 SPE vodných vzorků... 21 1.2.2 Jednotlivé kroky SPE... 22 1.3 REVERZNÍ OSMOZA (RO)... 24 1.3.1 Principy a rozdělení membránových metod... 24 1.3.2 Princip a vlastnosti RO... 25 1.3.3 Využití RO... 26 1.3.4 Srovnání výhod a nevýhod RO a SPE... 28 1.4 IN VITRO TEST... 30 1.4.1 Hodnocení estrogenity vodných vzorků... 30 1.4.2 In vitro metoda: Exprese reportérového genu... 30 1.4.3 Testování estrogenity na buněčné linii HeLa 9903... 31 1.4.4 Testování estrogenity na buněčné linii MVLN... 32 2. MATERIÁL A METODY... 33 2.1 CHEMIKÁLIE A MATERIÁL... 33 2.2 KULTIVACE HeLa 9903 A MVLN BUNĚK... 37 2.2.1 Pasážování buněk... 37 2.2.2 Nasazení, expozice buněk a měření... 37 2.3 PŘÍPRAVA A ZPRACOVÁNÍ VODNÝCH VZORKŮ METODOU SPE... 39 2.3.1 Příprava vodných vzorků... 39 2.4 PŘÍPRAVA A ZPRACOVÁNÍ VODNÝCH VZORKŮ METODOU RO... 41 2.4.1 Optimalizace in vitro metody pro testování vodných vzorků... 43 2.4.2 Ionizace E2 vlivem změny ph... 44 2.4.3 Testování estrogenní odpovědi připravovaných vzorků E2 ve vodném roztoku v závislosti na velikosti plastového povrchu a následných změnách ph... 44 11

2.4.4 Experiment založený na sorbování vodných vzorků E2 metodou RO v závislosti na ph... 45 2.4.5 Stanovení estrogenní odpovědi genisteinu a daidzeinu... 46 2.5 VYHODNOCOVÁNÍ... 47 2.5.1 Stanovení EC 50... 47 2.5.2 Statistické vyhodnocení dat... 47 2.5.3 Kalibrační křivka... 48 3. VÝSLEDKY... 49 3.1 TESTOVÁNÍ ESTROGENNÍHO POTENCIÁLU... 49 3.1.1 Testování estrogenní odpovědi 3x koncentrovanějšího média vůči standardnímu médiu... 49 3.1.2 Testování estrogenního potenicálu vodných roztoků E2 zakoncentrovaných metodou SPE... 50 3.1.3 Testování estrogenního potenicálu vodných roztoků E2 zakoncentrovaných metodou RO... 52 3.1.4 Testování estrogenního potenciálu vodných roztoků daidzeinu a genisteinu... 57 4. DISKUZE... 58 5. ZÁVĚR... 62 6. POUŽITÁ LITERATURA... 63 7. PŘÍLOHY... 71 12

CÍLE DIPLOMOVÉ PRÁCE TEORETICKÁ ČÁST:» Popis vlastností estrogenních látek» Popis principu a vlastností membránové separační metody reverzní osmózy (RO), stávající využití a možnosti RO v environmentální analýze» Popis principu a vlastností metody extrakce tuhou fází (SPE), stávající využití a možnosti SPE v environmentální analýze» Popis testování estrogenních látek pomocí in vitro biotestů buněčných kultur HeLa 9903 a MVLN EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST:» Optimalizace in vitro metod pro testování vodných vzorků ze životního prostředí (otestování estrogenních látek na tkáňových kulturách)» Otestování RO jako separační metody - Použití komerčně dostupného modulu RO pro přípravu vzorků vody» Optimalizace metody RO - Ověření výtěžnosti metody RO pro některé standardní látky» Srovnání výtěžnosti metody RO s výtěžností SPE 13

ÚVOD U mnoha nových typů znečišťujících látek vyskytujících se v životním prostředí není doposud prostudována jejich toxicita. Jde o látky rozšířené téměř po celém světě, vyskytující se již v nízkých, ale biologicky aktivních koncentracích. Tyto látky se vyskytují i v některých farmacích, konkrétně se jedná o steroidní hormony např: estrogeny (používaných např. jako antikoncepce, řízení menopauzy a léčba prostaty a rakoviny), které jsou především zodpovědné za vývoj samičích sekundárních pohlavních znaků, také se podílejí na růstu kostí, pomáhají regulovat produkci cholesterolu v játrech, a také regulují přípravu organizmu pro reprodukci (Rokyta 2000). Zároveň jsou zodpovědné za negativní účinky na hormonální regulaci necílových organismů. Negativní účinky se již projevují v množství několik desítek či dokonce jednotek ng l -1, a za takto nízkých koncentrací jsou těžko stanovitelné (Kidd et al. 2007). V komunálních odpadních vodách jsou detekovány látky estrogenního charakteru pocházející převážně z lidské moči. Mezi látky přítomné v ženské moči patří estriol, estradiol, estron a ethynylestradiol, který je součástí hormonálních antikoncepcí (D'Ascenzo et al. 2003). V odpadních vodách je ethynylestradiol přítomen řádově v koncentracích 10 1 ng.l 1 až 10 2 ng.l 1 (Hill and Janz 2003). Nejnovější standardizovanou biologickou metodou, která se využívá pro stanovení estrogenních látek ve vzorku je metoda extrakce tuhou fází (SPE). Principem metody je navázání znečišťujících látek na tuhý sorbent a poté se extrakcí organickým rozpouštědlem získá jejich zakoncentrovaný roztok. Metoda je finančně náročná a využívaná organická rozpouštědla mohou být toxická pro testovací buněčné linie, čímž dochází ke zkreslování výsledků. Z těchto důvodů se experimentálně zkoumají další možné metody, které by se daly pro tyto účely využít. Jeden z možných způsobů, jak získat zakoncentrované látky z vodních zdrojů, je možnost využití přípravy vzorků zakoncentrováním pomocí reverzní osmózy. Jde o separační metodu, která je běžně využívána pro jiné účely, např. odsolování mořské vody či filtraci brakické vody. Princip metody je založený na vytlačování rozpouštědla (nejčastěji vody) pomocí tlaku přes polopropustnou membránu, přes kterou projdou jen částice menší než 2 nm (Wagner 2001). 14

1. TEORETICKÁ ČÁST 1.1 HORMONY JAKO ENDOKRINNÍ DISRUPTORY Během posledních desetiletí jsou vyvolávány obavy, týkající se možných škodlivých účinků po expozici některými chemickými látkami (přírodními a syntetickými), které jsou schopny modulovat nebo narušovat endokrinní systém. Narušení činnosti endokrinního systému chemickými látkami je především zaměřena na pozorování nežádoucích účinků na reprodukci u volně žijících živočichů a člověka (Jardim et al. 2012). Nejvíce ohrožení jsou vodní organismy žijící v přírodních vodách (Sumpter and Johnson 2005; Jobling et al. 2006). Chemické látky vykazující estrogenní aktivitu ovlivňují endokrinní systém a způsobují vývojové a reprodukční poruchy. Tyto chemické látky se označují jako "endokrinní disruptory", toto označení stanovila Evropská unie, Vědecký výbor pro toxicitu, ekotoxicitu a životní prostředí (CSTEE). Podle definice Evropské komise (1999) jsou endokrinní disruptory antropogenní i přírodní látky, které přímo nebo nepřímo ovlivňují hormonální systém a mohou působit za velmi nízkých koncentrací. Pracovní skupina pro endokrinní disruptory se dohodla na definici mezinárodního programu chemické bezpečnosti (IPCS) definovat endokrinní disruptory (EDCs) jako: Exogenní látky nebo směsi, které mají potenciální schopnost způsobit endokrinní disrupci u zasaženého organismu, jeho potomků nebo (sub)populací. Hypotéza, že chemické látky v životním prostředí můžou způsobit estrogenní účinky, není nová (Allen et al. 1924; Burlington and Lindeman 1950). Nicméně, během posledních dvaceti let, úroveň zájmu o nežádoucí účinky některých látek s estrogenními účinky (ovlivnění reprodukčního chování spojené s expozicí chemickým látkám způsobující endokrinní disrupci) vzrostla (Baker 2001). Mezi endokrinní disruptory patří někteří zástupci pesticidů (Soto et al. 1995), změkčovačů plastů, farmaceutik (antikoncepce, antibiotika, léky), těžkých kovů nebo průmyslových chemikálií (bisfenol A) (Krishnan et al. 1993). Zasažení do reprodukčního a vývojového systému organismů může mít za následek: sníženou účinnost rozmnožování, feminizaci samců, maskulinizaci samic, embryonální malformaci, sníženou vitalitu spermií nebo jiné vývojové a růstové poruchy (Anděl 2011; Zou et al. 2010). 15

Signálem endokrinní disrupce jsou obvykle poruchy vývoje hormonálního systému (špatný vývoj ovarií, nedokonalý vývoj gonád) nebo zvýšená hladina vitellogeninu (proteinu vaječného žloutku produkovaný pouze samicemi) u dospívajících samců (Hansen 1998). Projevem endokrinní disrupce je např. vznik imposexu (to je změna v rozmnožovacím systému indukovaná estrogenními látkami, při které dochází ke sterilitě v závislost na vzniku samčích pohlavních znaků u samic (tvorba penisu a chámovodu). Tato změna se projevila u samic předožábrých plžů. Je to projev expozice organickou látkou organocínu, který je součástí protihnilobných nátěrů na trupech lodí (Stroben et al. 1992). 1.1.1 Endokrinní estrogenní disruptory rozdělení K ovlivnění funkčnosti endokrinního systému dochází za přítomnosti některých antropogenních i přírodních látek, které se dnes v ekosystému vyskytují, a působí tak chronickou expozici. Jeden typ ze skupiny látek s estrogenní povahou jsou tzv. environmentální estrogeny. Tyto látky mají shodný vliv na fyziologii a vývoj organismu s estrogenní kontrolou reprodukce organismů. Vyskytují se jak z antropogenních zdrojů (některé pesticidy, farmaka, odpadní produkty při různých výrobních procesech), tak z původu rostlinného, tzv: fytoestrogeny (Holoubek and Čadová 2000). Mezi nejčastěji vyskytující se estrogeny v odpadních vodách jsou přírodní estrogeny: estron (E1), 17β-estradiol (E2) a estriol (E3), a syntetický estrogen: 17α-ethinylestradiol (EE2) (Racz and Goel 2010). Přírodní estrogeny Mezi tyto přírodní estrogeny řadíme bioflavonoidy, různé mykotoxiny, vaječné steroidní hormony a taktéž lze zahrnout přírodní produkty rostlin a mikrobů (Holoubek and Čadová 2000). Přírodní estrogeny patří do skupiny steroidních hormonů, což je skupina biologicky aktivních sloučenin, které jsou syntetizovány z cholesterolu (Ying et al. 2002). E1, E2, E3 a jsou převážně ženské pohlavní hormony, vylučované především folikuly vaječníků, které jsou důležité pro udržení správných funkcí reprodukčních tkání, vitalitu prs, kůže a mozku, zatímco EE2 je syntetický steroid, který se používá jako součást antikoncepce. Všichni lidé, stejně jako zvířata, vylučují steroidní hormony (Desbrow et al. 1998; Hanselman et al. 2003; Zheng et al. 2008), v různých množstvích, v závislosti na věku, zdravotním stavu, stravě, nebo těhotenství (Lintelmann et al. 2003; Zheng et al. 2008). 16

Tyto hormony skončí v životním prostředí prostřednictvím vypouštění odpadních vod a likvidací živočišného odpadu. Estrogeny současně s gestageny (hormony ovlivňující druhou polovinu menstruačního cyklu a průběh těhotenství, nejvýznamnější z gestagenů je progesteron, produkovaný žlutým tělískem) řídí všechny důležité ženské reprodukční procesy, regulují menstruační (estrální) cyklus a hrají významnou roli v rozvoji endometria (děložní sliznice). Biologicky nejaktivnějším estrogenem je estradiol. Tyto látky se v organismu relativně rychle odbourávají, a proto byla syntetizována řada stabilnějších derivátů a analogů, jako jsou např. estradiol-valerát, EE2 (ten je spolu s gestageny součást celé řady kombinovaných preparátů používaných jako perorální antikoncepce, a mestranol, taktéž jako součást perorální antikoncepce (Hampl and Paleček 2002). Estrogeny se vyskytují, jak ve formě samičích pohlavních hormonech, tak částečně i v samčích pohlavních hormonech, kde regulují produkci a transport testikulární tekutiny. Estrogen v mužském reprodukčním systému je syntetizován nejméně třemi různými typy buněk; Sertoliho, Leydigovi a zárodečnými buňkami (Hess et al. 2001). Fytoestrogeny Fytoestrogeny jsou přírodní rostlinné látky, které jsou důležité pro správný vývoj a růst rostlin. Mají chemickou strukturu podobnou endogenním estrogenům. Díky této podobě se mohou vázat na estrogenní receptory (ERs) (Cassidy 2003; Pilsakova et al. 2010). Mnoho jedlých rostlin, z nichž některé jsou běžné v lidské stravě, jsou bohaté na fytoestrogeny. Nacházejí se v sojových bobech, v celozrnných cereálních výrobcích, v různých semenech a pravděpodobně v ořechách (Liu et al. 2010; Holoubek and Čadová 2000). Fytoestrogeny se dělí na dvě třídy: flavonoidy a lignany. Počet flavonoidů je větší než počet lignanů. Flavonoidy mají také vyšší relativní estrogenní aktivitu než lignany (Liu et al. 2010). Xenoestrogeny Xenoestrogeny jsou sloučeniny, které daný organismus sám neprodukuje. Jsou chemicky stabilní a schopné bioakumulovat se v organismech. Mezi tyto xenoestrogeny patří některá léčiva farmaceutické přípravky antropogenního původu a látky pro metabolismus organismu cizí, které vstupují do životního prostředí mající estrogenní povahu, např. antikoncepce. Xenoestrogen je například diethylstilbestrol (DES), který byl podávaný během 1950 a 1960 v těhotenství, jako lék proti spontánním potratům (Hatch et al. 2011). 17

1.1.2 Testované estrogenní látky Vybraný testovaný zástupce přírodních estrogenů: 17 -Estradiol V experimentální části se stanovoval, jako zástupce přirozených estrogenů, 17 -estradiol (l,3,5-estratetratrien-3,17-diol; E2), který je nejúčinnějším estrogenním steroidem. U žen je E2 syntetizován v Graafových folikulech vaječníku, kůře nadledvinek a placentě. U mužů je syntetizován v nízkých koncentracích ve varlatech (Liehr 1990). Fyzikální vlastnosti a systematické názvy této látky jsou uvedeny v Tab. č: 1. Vybraní testovaní zástupci fytoestrogenů: Daidzein a Genistein Daidzein a genistein jsou fytoestrogeny patřící do třídy flavonoidů, skupiny isoflavonů a byli vybráni do experimentální části pro srovnání s estradiolem. Genistein se v nemalém množství vyskytuje převážně v luštěninách a sojových bobech. V potravinách vyrobených ze sóji je obsažen v rozmezí 0,2 1 mg.g -1, záleží na druhu výrobku (Huang et al. 2008). Genistein (GEN) může způsobit apoptózu, a tak může inhibovat růst rakovinných buněk, tím že inhibuje buněčné dělení (Cornwell et al. 2004). Genistein a některé jiné fytoestrogeny mají antioxidačními vlastnosti. Možnost léčby rakoviny, menopauzy, osteoporózy nebo kardiovaskulárních onemocnění se prozkoumává již řadu let (Polkowski and Mazurek 2000). Předpokládá se, že isoflavony jsou schopné předcházet rakovině. Redukují příznaky menopauzy, aterosklerózy, či jsou schopny snížit hladinu cholesterolu v krvi (Birt et al. 2001; Duffy et al. 2003; Watanabe et al. 2002). Daidzein (DAI) je taktéž přítomen v rostlinách, jako jsou sójové boby nebo jetel, který byl intenzivně studován pro jeho biologickou aktivitu anti-/estrogenních účinků (Jia et al. 2003; Guo et al. 2004). Stejně jako GEN, tak i DAI disponuje antioxidačními účinky (Liu et al. 2006).. 18

Tab. č: 1 Fyzikálně-chemické vlastnosti estradiolu, genisteinu a daidzeinu (Cui et al. 2006; Vega- Morales et al. 2010; HMDB 2005-2013; Lewis and Archer 1979). Chemický název 17β-estradiolu (E2) Chemický vzorec M r log K OW log P pk a, Rozpustnost ve vodě (mg l -1 při 20 C) C 18 H 24 O 2 272,4 3,94 3,57 10,71 21 Genistein C 15 H 10 O 5 270,2 2.84 3,04 6,61 120 Daidzein C 15 H 10 O 4 254,1 2,78 3,30 6,48 85 Obr. č: 1 Molekulová struktura vybraných látek s estrogenním účinkem. Zástupce přírodních estrogenů: 17 -estradiol, a zástupci fytoestrogenů: genistein a daidzein (Holoubek and Čadová 2000). 19

1.1.3 Techniky detekce estrogenity Pro detekci estrogenity se již využívá řada biologických a chemických metod. Jedna z možných biologických metod, je metoda založena na aktivaci genu, kde jsou určité geny specificky regulovány působením estrogenů skrze estrogenový receptor. V jiné detekční metodě se využívá proliferace nádorových buněk. Je to např. hojně využívaná in vitro metoda tzv. E-SCREEN test, při které se používají buněčné linie odizolované z rakovinných buněk prsu. Buňky neproliferují, pokud jsou pěstovány bez estrogenních látek, jakmile se přidá látka s estrogenní aktivitou, proliferace se rozběhne. Často tato metoda slouží jako první screening estrogenity (Korner et al. 2001). Další možný způsob, jak detekovat estrogenitu, je využití vitellogeninu. Jako vaječný žloutek je přítomný u dospělých samic, jestliže je pak detekován u samců, pak to značí o expozici látkami s estrogenní aktivitou (Holoubek and Čadová 2000). Mezi nejpoužívanější chemické metody stanovení estrogenů z reálných vzorků vod patří metody chromatografické: vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) nebo plynová chromatografie (GC). Používají se různé způsoby detekce, nejčastěji je využíván hmotnostní detektor (MS). Při těchto metodách se často pro úpravu vzorku na analýzu využívá prekoncentračního kroku pomocí extrakce tuhou fází (SPE). Plynová chromatografie se vyznačuje vysokou separační účinností, rychlostí analýzy a možnosti použití vysoce citlivých detektorů. Je nutná derivatizace analytů. Derivatizací dochází ke zvýšení ionizační účinnosti analytů. Při kapalinové chromatografii lze analyzovat estrogeny přímo, bez derivatizačního kroku (Díaz-Cruz et al. 2003). V současnosti se také používají imunochemické metody založené na polyklonálních protilátkách, tzv. ELISA metody pro stanovení estrogenů. Vlastnímu stanovení většinou předchází úprava vzorků metodou SPE. Společně s SPE tvoří vysoce selektivní a citlivou metodu. V porovnání se stávajícími chromatografickými metodami není ELISA tak citlivá jako GC, ale nabízí výhody jednoduchosti v přípravě vzorků, jinak jsou výsledky metod srovnatelné (Cha et al. 2012; Fukata et al. 2006). 20

1.2 EXTRAKCE TUHOU FÁZÍ (SPE) Extrakce tuhou fází (SPE = Solid Phase Extraction) je běžně používanou technikou pro přípravu vzorků ze životního prostředí a vzorků potravin. Vzhledem k vysoké univerzálnosti je postup SPE využíván k mnoha účelům, jako je například k čištění, k izolaci stopových látek, také se využívá pro selektivní obohacení (zakoncentrování) vzorku či k odsolení vod (Paolo et al. 2012). Pro úpravu vodných vzorků se v současné době používá, díky své nenáročnosti. SPE se využívá při testování in vitro (i in vivo). Při SPE se látky naváží na tuhý sorbent, ze kterého jsou následně extrahovány malým množstvím methanolu či jiného rozpouštědla podobných vlastností, čímž dojde k významnému zkoncentrování látek. Takto zkoncentrovaný vzorek umožňuje dosáhnout již stanovitelných koncentrací látek v používaných biotestech (Guo et al. 2013; Paolo et al. 2012). 1.2.1 SPE vodných vzorků SPE je zavedená a hojně využívaná metoda pro extrakci estrogenů z vodných vzorků. Při SPE jsou používány disky nebo kolony (připomínající injekční stříkačky bez pohyblivého pístu) obsahující sorbent. Pokud bychom chtěli porovnat, jaký je rozdíl mezi diskem a kolonou, tak výhoda kolon je ta, že mají velkou možnost se přizpůsobit automatizaci jako je čištění, sušení, vyluhování látek (eluce) velkého množství vzorků. Naopak nevýhodou SPE s kolonami je ta, že vzorky mohou obsahovat nečistoty ze změkčovacích prostředků uvolňujících se z materiálů během vymývání. Použití disků při SPE má tu výhodu, že se nezanáší suspendovanou hmotou. Vykazují větší extrakční rychlost a lze dosáhnout co nejmenšího rizika možnosti kontaminace vzorků (Čechová 2010; Ingerslev et al. 2003). Pro analýzu povrchových vod jsou nejčastěji používány disky/kolony se sorbentem, který má polymerně vázanou oktadecylovou fázi. Takovéto disky/kolony jsou označované jako C18. Další dostupné disky/kolony mohou obsahovat sorbent z styrendivinylbenzenu (SDB) nebo grafitizovaného uhlíku, a které jsou komerčně dostupné jako Isolut ENV+, SDB-XC a HBL (Trenholm et al. 2006; Laganá et al. 2004; Hernando et al. 2004). Tyto disky/kolony se využívají pro analýzu odpadních vod (Ingerslev et al. 2003; Kinnberg 2003). 21

Typický SPE postup, jak je znázorněno na obrázku Obr. č: 2, se skládá ze čtyř hlavních kroků. Prvním krokem je předúprava (kondicionování) kolonky, druhým krokem je dávkování vzorku, poté proběhne promytí kolony a v posledním kroku dojde k samotné eluci (vymývání) analytu. 1.2.2 Jednotlivé kroky SPE Obr. č: 2 Schematické znázornění jednotlivých kroků metody SPE přes kolony (Paolo et al. 2012). KONDICIONACE Pokud má sorbent v SPE koloně zadržovat analyty, je důležité kolonu připravit tak, že na pevné fázi vytvoříme vrstvičku kapaliny. Příprava kolony na interakci složek vzorku s pevnou fází, která je umožněna solvatací (obalení částic rozpuštěné látky molekulami rozpouštědla) pevné fáze. Tento solvatačný proces je prvním krokem extrakce a zahrnuje promytí kolony rozpouštědlem. Toto rozpouštědlo zabezpečuje solvataci sorbentu, a tím i interaktivitu se vzorkem. Ekvilibrace (stabilizování) se provádí pomocí rozpouštědla, které je svojí chemickou povahou vhodné pro daný vzorek. Provede se aktivace potřebným množstvím organického rozpouštědla (2-3 ml na 100 mg sorbentu), kolony se naplní dh 2 O a následuje aplikace samotného vodného roztoku vzorku (Paolo et al. 2012). 22

PŘIDÁNÍ VZORKU Je podstatné zachovat dostatečnou délku doby kontaktu vzorku se sorbentem. Kdyby vzorek protékal kolonou příliš rychle, může to mít za následek sníženou výtěžnost. Vzorek se převádí za použití podtlaku (max. 10 mm Hg), průtok max. 15 ml/min (voda by měla z kolony vykapávat, ne vytékat) (Paolo et al. 2012). PROMYTÍ KOLONY Po aplikaci vzorku bývá kolona promývána jiným rozpouštědlem. Cílem tohoto kroku se selektivní eluování nežádoucích sloučenin ze sorbentu tak, aby nebyly vyplavené sledované analyty. Pro tento účel jsou nejvhodnější rozpouštědla, ve kterých analyty rozpuštěné nebyly (Paolo et al. 2012). ELUCE Posledním krokem je eluce analytu vhodným rozpouštědlem do zásobní vialky. I při tomto kroku je nezbytné kontrolovat rychlost průtoku. Kdyby byl příliš vysoký průtok, měl by za následek sníženou výtěžnost analytu. Eluce může být provedena různými rozpouštědly: MeOH (Thomas et al. 2004), DMSO (Murk et al. 2002) nebo ethyl-acetátem (Ying et al. 2008). Dochází tím k selektivní desorpci testovaných látek z pevné fáze a následnému vymytí látek z kolonky. Po extrakci na tuhou fázi je analyt v roztoku, obsahuje minimum interferujících látek. Pokud je potřeba analyt více zakoncentrovat používá se pro to vakuové odparky nebo je možné vzorek odfoukat dusíkem, záleží na vybavení laboratoře (Paolo et al. 2012; Lambda 2013). 23

1.3 REVERZNÍ OSMOZA (RO) Reverzní osmóza je separační metoda a zároveň proces, ve kterém je pomoci tlaku umožněn transport rozpouštědla (vody) membránou, kdy nízkomolekulární složky a rozpuštěné soli se na membráně zachytí. 1.3.1 Principy a rozdělení membránových metod Mezi hnací síly, které se využívají pro správnou funkci separace na polopropustné membráně, můžeme zařadit hnací síly založené na: rozdílu tlaku (k transportu látky přes membránu vede rozdílný tlak látky před a za membránou, odlišná rychlost transportu složek směsi vyplývá z rozdílné velikosti jejich molekul), na teplotním gradientu (teplotní rozdíl mezi fázemi), rozdílu koncentrací (látky mají různou rychlost pohybu přes membránu), síle elektrického pole (separace na základě polarity a sily náboje) (Jelínek and kol. 2009). Počet používaných membránových metod se neustále zvyšuje, mezi doposud nejvíce využívané patří: mikrofiltrace (MF), ultrafiltrace (UF), reverzní osmóza (RO), dělení plynů (GS), pervaporace (PV), membránová destilace a separace kapalnými membránami (LM), dialýza (D), elektrodialýza (ED) (Pohlová and Šafaříková 1998). Schéma rozdělení membránových metod, které jsou rozděleny podle využití hnacích sil, je znázorněno na Obr. č: 3. Obr. č: 3 Membránové procesy - základní rozdělení podle hnací síly transportu (Jelínek and kol. 2009) 24

1.3.2 Princip a vlastnosti RO Separační metody se obecně využívají k izolování (separaci) dokazované nebo stanovované složky z analyzované směsi a k odstranění rušivých (interferujících) komponent analyzovaného roztoku (účel získání čistých složek). U skupiny membránových separačních metod dochází k selektivnímu transportu jedné složky přes polopropustnou membránu. Metoda má jednoduché schéma: vstupující kapalinné látky (nástřik) jsou děleny na retentát (obsahuje všechny složky, které neprošly membránou) a permeát (látky prošlé přes membránu, téměř čisté rozpouštědlo), znázorňuje Obr. č: 4 (Jelínek and kol. 2009). Obr. č: 4 Schéma membránového procesu (Jelínek and kol. 2009). Membrána umožňuje průchod určitým částicím vlivem rozdílných vlastností dělených látek. Tato membrána musí splňovat určité požadavky: selektivitu (vysoká rozdělovací schopnost), permeabilitu (vysoký měrný výkon), chemickou stálost a mechanickou pevnost. Model vinuté membrány RO je znázorněn na Obr. č: 5. Obr. č: 5 Model trubkové membrány RO (Wagner 2001). 25

Důležitou roli zde také hrají velikost a tvar částic a pórů membrán, v některých případech je významný i vliv náboje nebo smáčivost povrchů separovaných částic a membrány a další faktory (Pohlová and Šafaříková 1998). Vlastnosti RO podle (Wagner 2001) jsou shrnuté v Tab. č: 2. Tab. č: 2 Vlastnosti RO podle (Wagner 2001). Tloušťka vrstvy Velikost póru Materiál membrány Membránový modul Provozní tlak REVERZNÍ OSMÓZA 1µm <0,002µm CA tenká vrstva Tubulární, spirálovitě vinutá, deska a rám 15-150 bar 1.3.3 Využití RO Membránové metody jsou separační metody, které se vyvíjely během posledních desítek let. Od té doby si RO získává pozornost pro mnohé využití. Dnes jsou membrány RO jednou z hlavních technologií pro odsolování slané vody, taktéž se využívá pro filtraci brakické vody a získání tak vody, která je pitná. Tato metoda je používána po celém světě a díky novým vylepšeným technologiím pro získávání energie a obnovitelných zdrojů, umožní větší využití v odsolování pro tuzemské i venkovské obce, a zároveň poskytuje cenově dostupnější vodu pro oblasti, kde se pitná voda vyskytuje jen zřídka (Greenlee et al. 2009). Jako separační metoda si RO našla široké uplatnění, jak v průmyslu chemickém, potravinářském, farmaceutickém, tak v biologii, energetice a elektrotechnickém průmyslu. Lze ji využít při technologické úpravě odpadních vod (Mikulášek 1995). V podzemních vodách se pomocí RO čistí vody i od těžkých kovů, např. arsenu, který byl odstraněn z 99%. Byly použity dva typy modulů, jeden spirálně vinutý s polyamidovou membránou, který byl účinný z 98,5 % druhý s dutými vlákny z kompozitního polyamidu, který byl účinnější, pomocí něj se arsen odstranil z 99,2 % (Pawlak et al. 2006). 26

Membránové separační procesy, jakožto filtační metody, jsou již dnes plně aplikovány po celém světě, jsou ekonomicky rovnocennými náhradami klasických separačních procesů a jsou kvalitativně zdokonalovány. Jejich trvale se snižující energetická náročnost a provozní i investiční náklady získávají potenciál, jak využít tuto technologii a uplatnit ji za různých podmínek (Greenlee et al. 2009). Například jako čištění podzemních vod kontaminovaných skládkovými vodami (Honzajková et al. 2011). Spirálově vinutá membrána RO je původně vyrobena výhradně pro odsolování vody, ale spojení velmi kompaktního designu a nízké ceny, začalo být atraktivní pro testování i v jiných odvětvích. Jde o využívání v řadě průmyslových aplikací, ať už v mlékárenském průmyslu, v průmyslu výroby papíru a celulózy, nebo pro získání vysoce čisté vody. Je odolná proti vysoké teplotě i proti vysokým hodnotám ph (Wagner 2001). VYUŽITÍ PERMEÁTU A RETENTÁTU JAKO ROZDÍLNÉ SLOŽKY RO Využití permeátu K odsolování vody a k čištění brakických vod je v mnoha zemních nezbytné využívání RO (Park et al. 2012; Henmi et al. 2010). Uplatnění permeátu RO najdeme i v odvětví farmaceutického průmyslu, např. výroba antibiotik (Belkacem et al. 2008). I v chemickém průmyslu se využívá RO k selektivní separaci odpadních vod (Bódalo-Santoyo et al. 2003). Stále roste rozsah využití RO při zakoncentrovávání, využívá se k částečné demineralizaci, separaci proteinů, likvidaci bakterií, chlazení a recyklaci odpadních vod (Into et al. 2004; Kelly and Fuquay 2011). Využití retentátu (koncentrátu) Koncentrát z RO se využívá již desítky let, a to hlavně v potravinářském průmyslu zakoncentrováním ovocných a zeleninových šťáv (Pepper et al. 1985; Alvarez et al. 1997). Membránová separace je široce používána v zařízeních na zpracování mléka či zakoncentrování syrovátky (Suárez et al. 1992). 27

1.3.4 Srovnání výhod a nevýhod RO a SPE Výhody RO Pro přípravu vodných vzorků k biologickému testování při využití RO není nutno používat žádná toxická rozpouštědla. Metoda je šetrná ke zpracování vzorku s rozpuštěnými analyzovanými látkami, proto je možné charakterizovat zatížení životního prostředí studovanými látkami. Další výhodou by mohly být náklady na přípravu jednoho vzorku metodou RO, ty se pohybují více než řádově níž než při použití metody SPE. Pokud bychom srovnali pořizovací cenu komerčně dostupného modulu RO a čerpadla, které je hnacím motorem systému RO, cena by se pohybovala kolem 10 tis. Kč. Náhradní výměnné separační membrány stojí okolo 1-1,5 tis. Kč. S takovou to separační membránou lze otestovat přibližně 100 vzorků, tedy náklady na zpracování jednoho vzorku jsou přibližně 10 Kč (Buonomenna 2013; Tuček 2009). Bude tedy možné za náklady, které by se vynaložily při přípravě vodných vzorků metodou SPE, zakoncentrovat větší počet vodných vzorků při využití metody RO, mohou být například rychleji odhaleny zdroje znečištění. Výhody SPE SPE je zavedená a optimalizovaná metoda pro přípravu vodných vzorků pro in vitro (i in vivo) testování. Významné zkoncentrování látek umožňuje dosáhnout již stanovitelných koncentrací látek v používaných biotestech (Guo et al. 2013). Nevýhody RO Dochází k nežádoucímu ukládání abiotických a biotických materiálů na povrch membrány, označované jako membránové znečištění, které může snížit účinnost systému (Lee et al.). Takto bioznečištěná membrána je vede k poklesu toku permeátu (Schneider et al. 2005). Zanesení vede k nezvratnému poškození reverzně osmotických modulů a je potřeba výměny filtrů. S touto potřebou vzrostou provozní náklady (Hubner and kol. 2006). 28

Nevýhody SPE Použitá rozpouštědla při SPE (MeOH, DMSO) jsou toxická pro testování buněčné linie, proto je nezbytné, aby nepřesáhl jejich obsah 2% v konečném médiu (v praxi využíváme 0,5%). I z finančních důvodů je žádoucí snížit spotřebu těchto organických rozpouštědel (Guo et al. 2013). Cena na pořízení aparatury SPE se pohybuje od 12 40 tis. Kč za manifold a 10 20 tis. Kč za vakuovou pumpu. Před SPE je někdy zapotřebí zfiltrování vzorku, čímž dojde k navýšení ceny. Přibližná cena přípravy jednoho vodného vzorku se pohybuje okolo 600Kč (Chrom 2011). 29

1.4 IN VITRO TEST 1.4.1 Hodnocení estrogenity vodných vzorků Existuje řada druhů in vitro testů, kterými je možno určovat estrogenní potenciál jednotlivých látek nebo komplexních směsí. Mezi zavedené metody patří testy využívající vazby ligandu na receptor, kde je sledována kompetice s radioaktivně označeným přirozeným ligandem (Kelce and Wilson 1997; Murk et al. 2002). Další metoda je založena na schopnosti látek stimulovat receptorově závislou transkripční aktivitu, tzv. test s reportérovými geny (Kinnberg 2003). Z často používaných in vitro testů se používá rekombinantní kvasinkový test (Li et al. 2008), např: RYA test (recombinant yeast-based assays), ve kterém se využívá geneticky modifikovaný kmen Saccharomyces cerevisiae (Kinnberg 2003). Na oddělení RECETOXu se v in vitro testech využívají dvě linie lidských nádorových buněk, a to Hela 9903 a MVLN, kde je jako reportérový gen používán gen enzymu luciferázy. Mimo tyto dvě kultury se k testování estrogeny používají kvasinkové testy YES, využívající buněčnou kulturu Saccheromyces cerevisiae (Murk et al. 2002; Kinnberg 2003). 1.4.2 In vitro metoda: Exprese reportérového genu Mezi in vitro metody využívající reportérové geny patří metoda pro detekci estrogenní aktivity látek. Plazmidem obsahující reportérový gen jsou transfekované savčí buněčné linie. Aktivace specifického receptoru estrogenní látkou a jeho následné navázání na responzivní element vyvolá expresi reportérového genu. Buď se měří míra exprese mrna nebo produkce specifického proteinového produktu (Joyeux et al. 1997). Využívají se reportérové geny kódující snadno detekovatelné proteiny, např. luciferáza (Luc), zelený fluorescenční protein (GFP, Green Fluorescent Protein), ß-galaktosidaza (Gal) aj. Pro expozici je možný výběr z buněčných linií, které jsou izolované z různých typů tkání, např. HeLa 9903 (lidský karcinom děložního čípku), linie BG-1 (lidský karcinom vaječníku), MVLN nebo T47D.luc (lidské linie karcinomu prsu) (NEIHS 2002). 30

1.4.3 Testování estrogenity na buněčné linii HeLa 9903 Autorka se v této diplomové práci zabývá testem in vitro, při kterém se využívá buněčná linie HeLa 9903. Podle laboratorních metod zavedených na oddělení RECETOXu využíváme metodu, která je založena na chemické aktivaci exprese genu pro luciferázu. Buněčná linie HeLa 9903 obsahuje reportérový gen kódující luciferázu. Látky estrogenní povahy se váží na endogenní estrogenní receptor přítomný v jádře, tím se aktivuje a vzniklý dimer se naváže na úseky DNA. Exprese luciferázového genu a vznik luciferázy je měřena v lyzovaných bunkách pomocí luminometru (Legler et al. 1999). Na Obr. č: 6 je schematicky znázorněn princip metody. Hladina luciferázy se detekuje chemiluminiscenčním stanovením enzymové aktivity, v buněčných liniích HeLa 9903 (Legler et al. 1999). Luciferáza je syntetizována a hned po aktivaci estrogenního receptoru za přítomnosti ATP katalyzuje luminiscenční reakci přeměny luciferinu (pigment emitující světlo) na oxidovanou formu, podle rovnic: luciferin + ATP luciferyladenylát + PPi luciferyladenylát + O 2 oxyluciferin + AMP + světlo (Freyberger and Schmuck 2005). 31

Obr. č: 6 Mechanismus reportérového testu v buněčných liniích kódující luciferázu (Hilscherova et al. 2000). HeLa 9903 je buněčná linie, patřící mezi nejstarší a nejpoužívanější lidské buněčné linie používané ve vědeckém výzkumu (Rahbari et al. 2009). Tato linie byla odizolována z buněk karcinomu děložního čípku 8. února 1951 (Scherer et al. 1953) od pacientky Henrietty Lacks, která nakonec rakovině podlehla. Buněčná linie je schopná za optimálních podmínek neomezeně proliferovat, ale zároveň je choulostivá ke kontaminaci, kterou by mohla způsobit cizí buněčná linie používaná ve výzkumu (Capes-Davis et al. 2010). 1.4.4 Testování estrogenity na buněčné linii MVLN Pro nedostatečnou estrogenní odpověď vzorků daidzeinu a genisteinu na buněčné linii HeLa 9903, se testovala estrogenní odpověď také na buněčné linii MVLN, která je taktéž nositelem reportérového genu pro luciferázu. Princip testování je zcela stejný jako u buněčné linie HeLa 9903. Jedná se o transgenní buněčnou linii odvozenou z buněk MCF-7, které pocházejí z lidského karcinomu prsu (De Wet et al. 1987; Pons et al. 1990; Demirpence et al. 1993). 32

2. MATERIÁL A METODY Součástí praktické části této diplomové práce bylo osvojení si zásad pro samostatnou práci s in vitro testováním, testu založeném na expresi reportérového genu. V převážné většině se estrogenita vodných vzorků testovala na buněčné linii HeLa 9903, testování na buněčné linii MVLN se uskutečnilo jen pro porovnání estrogenní odpovědi fytoestrogeních látek, dainzeinu a genisteinu. Na základě zavedeného postupu in vitro testu na oddělení RECETOXu byl dodržen postup testování vzorků. Při testování estrogenity látek jsou buňky exponovány testovanými vzorky. Buňky, které jsou exponovány připravenou koncentrační řadou E2 v rozpouštědle, slouží jako kontrolní. To umožňuje sledování estrogenní odpovědi buněk. V teoretické části jsou popsány principy a teoretické postupy popisující přípravu vodných vzorků pro testování estrogenního potenciálu látek s estrogenní povahou pomocí in vitro testu, při kterém se využívala buněčná kultura HeLa 9903 nebo buněčná kultura MVLN. 2.1 CHEMIKÁLIE A MATERIÁL Materiál běžného použití v laboratoři Sterilní 96jamkové mikrotitrační desky pro tkáňové kultury Médium DMEM, 10%FBS, dial. DCC Sterilní trypsin Sterilní PBS (pufrovaný fyziologický roztok) Kit pro stanovení luciferázy Steady-Glo (Promega, USA) Organická rozpouštědla: DMSO, EtOH, MeOH (100%) NaOH 1M, HCl 1M (na úpravu ph) Lyzační pufr (pro luciferázu) Expoziční roztoky E2 v EtOH ve výsledných koncentracích: 0,12pM; 0,41pM; 1,23pM; 3,7pM; 11,1pM; 33,3pM; 100pM; 500pM Expoziční roztoky daidzeinu a genisteinu v DMSO ve výsledných koncentracích: 0,1nM; 1nM; 10nM 33

LABORATORNÍ VYBAVENÍ Inkubátor CO 2 SANYO MCO 18AIC Flow-box BOX BIOHAZARD BIOBAN 48, BOX LAMINÁRNÍ SAFEFLOW 12 Optický mikroskop Multikanálová pipeta 8K na 50 1200 µl Cellometr (Auto T4) CHT4 Nexeclom Bioscience Třepačka Multi Functional Orbital Shaker PSU 20i Luminometr Luminoscan Acent DLReady TM ph metr Eutech Instruments ph 510 Analytické váhy RADWAG XA 82/220/2X Systém RO s vinutou membránou (FILMTEC) TW 30-1812-36 SPE aparatura (manifold s regulací tlaku, těsnící zátky, teflonové hadičky) Elektrická vývěva CDP 8800 AUATEC PŘÍPRAVA CHEMIKÁLIÍ Fosfátový pufr - Phosphate Buffered Saline (PBS) Pro přípravu tohoto fyziologické roztoku na 1l dh 2 O se připraví tyto navážky: 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 2,89 g Na2HPO 4. 2H2O a 0,2 g KH 2 PO 4. Po zhomogenizování roztoku se změří ph a pomocí 1M NaOH a1m HCl se upraví na hodnotu 7. Pro práci s tkáňovými kulturami je potřeba sterilního PBS, které se sterilizuje v zásobních láhvích autoklávováním. Příprava séra: dialýzovaný/stripovaný FBS (DCC FBS) Směs 500 ml stripovaného FBS a 10 g aktivního uhlí pokrytého dextranem se ve vodní lázni při 45 C protřepává přibližně 12 hod. Směs se druhý den rozlije do 50ml kyvet, které se poté 15 min centrifugují při otáčkách 2000 g (3400 ot. /min. s rotorem S40). Po zcentrifugování se opatrně přepipetuje sérum do nových 50 ml kyvet tak, abychom usazené aktivní uhlí nezvířili. Sérum se poté používá pro přípravu média. 34

Kultivační médium - Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mix. F-12 (DMEM-F12) Pro kultivaci buněčné linie HeLa 9903 se používá kultivační médium bez fenolové červeně s přídavkem 10% DCC FBS. Pro kultivaci buněčné linie MVLN se používá kultivační médium s přídavkem 10% DCC FBS a 1% L-glutaminu. Pro testování s buněčnou linií MVLN se používá médium s přídavkem 10% DCC FBS a 1% L-glutaminu. Postup přípravy 3x koncentrovaného média: 3x koncentrovanější médium bylo připravováno podle protokolu (PAA), kdy se využilo médium v pevném sypkém skupenství. Připravit 3x koncentrovanější médium znamená 3x znásobit potřebné množství látek, které se pro přípravu média přidávají. Navážilo se 3,37g DMEM a 1,11g NaHCO 3, přidaly se sterilně odebrané 3 ml L-glutaminu a doplnilo se na objem 100 ml dh 2 O. Podle protokolu se ph roztoku upravilo do rozmezí 6,8-7,5, poté se roztok ve flow-boxu zfiltroval přes sterilní filtr s póry o velikosti 0,22µm. Aby se minimalizovala možnost kontaminace, médium se obohatilo o antibiotikum gentamycin (4,5ml/100ml). Připravené 3x koncentrované médium se uchovalo v lednici při 4 C pro expoziční využití pouze při in vitro biotestech. Sérum pro stanovení luminiscence Na 1 mikrotitrační desku je potřeba směs 0,6 ml komerčně dodávaného kitu PROMEGA Steady-Glo + 3 ml chudého kultivačního média (Dulbeccos s Modified Eagle s Medium Base) + 3 ml lyzačního pufru. Lyzační pufr pro luciferázu Navážky potřebných chemikálií: 121,14 g 10nM tris-(hydroxymethyl)- aminomethanu, 30,8 g 2mM dithiothreitol (DTT) a 76,08 g 2mM kysliny ethylenglykoltetraoctové (EGTA), se doplní na 100 ml dh 2 O. Pomocí 1M NaOH a 1M HCl se upraví ph na hodnotu 7,8 a uchovává se v lednici při teplotě 4 C. 35

Příprava zásobního roztoku NaOH NaOH je silná jednosytná zásada, je v roztoku úplně disociovaná. Platí proto, že koncentrace iontů OH - je rovna koncentraci zásady: OH c NaOH. poh = 14 ph = 14 12 = 2 [OH - ] = 10 -poh = 10-2 = 0,01M NaOH c NaOH = 0,01M = 0,01mol/l (již potřebovaná koncentrace v roztoku E2), M NaOH = 39,997 g.mol -1, V roz. = 5.10-3 l (zásobní roztok) m = c V M = 1 mol l -1 5 10-3 l 39,997 g mol -1 = 0,2 g NaOH. Pro přípravu 100 ml koncentrovaného NaOH o ph 12 se 4 g NaOH rozpustilo ve 100 ml H 2 O. Tento koncentrovaný roztok NaOH poté sloužil k naředění vzorků a promývání aparatury RO. Na objem 2,5l zásobní láhve se po 100 µl NaOH přidával, tak aby výsledné ph bylo 11. Příprava kalibrační řady E2 v EtOH (0,13pM - 500pM) Koncentrace zásobního roztoku E2: c E2 = 1 mg/ml n E2 = 1 mg/272,4 mg mmol -1 = 3,67 µmol na 1 ml 0,00367 mol/l = 3,67 mm Ředění: n/200 = 3,67/200 = 0,01835 mm = 18,35 10 6 pm roztok E2 o konc. 1 mg/ml 100x naředit 1/100 (5 µl E2 + 495 µl rozt.) 100x naředit 1/10000 = 0,0001 g/l = 10 µg/l (ředění) 200x 0,5 µg/l Převedeno na molaritu: E2= 272,382 0,5/272,4 = 0,001835 µm = 1835 pm Mimo koncentrace 500pM a 100pM se kalibrační řada připravovala trojkovým ředěním: 33pM; 11pM; 3,7pM; 1,2pM; 0,4pM; 0,13pM. Kalibrační řada byla připravena v EtOH. Příprava roztoků daidzeinu a genisteinu o koncentracích 0,1nM, 1nM, 10nM v DMSO Získané vzorky roztoků genisteinu a daidzeinu měly výchozí koncentraci 1 mg/ml. Tyto koncentrace se naředily rozpouštědlem DMSO 1:1, koncentrace po zředění c = 0,5 mg/ml. Z této koncentrace se připravily roztoky daidzeinu a genisteinu o koncentracích 0,1nM, 1nM, 10nM. 36

2.2 KULTIVACE HeLa 9903 A MVLN BUNĚK V kultivačních lahvích s přidaným médiem DMEM s 10% FBS-DCC se tkáňové kultury kultivují, poté se uchovávají v inkubátoru s 5 % CO 2 při 37 C. Pasáž se provádí co dva až tři dny, dle míry konfluence (75-90 %), v poměru 1:3 až 1:6. Maximální počet pasáží buněk by neměla přesahovat 40 pasáží (potom je ohrožena integrita odpovědi na estrogen). 2.2.1 Pasážování buněk Buňky v kultivační láhvi se prohlíží pod mikroskopem a dle míry konfluence se provede pasáž. Další manipulace s buňkami probíhá ve sterilním flow-boxu, zde jsou třeba laboratorní rukavice a dezinfekční roztok. Do flow-boxu se umístí lahev s médiem, lahev se sterilním PBS, a mikrozkumavka s trypsinem. Je třeba dbát na to, aby nedošlo ke kontaminaci jak buněk, tak média nebo PBS. Skleněná vysterilizovaná Pasteurova pipeta se nad kahanem ožíhne a nasadí na hadičku odsávání. Obsah původního média kultivační lahve s buňkami se pipetou odsaje. Plastovou Pasteurovou pipetou se nasaje 2-3 ml PBS a buňky se opláchnou. Roztok se odsaje a oplach se zopakuje. Po odsátí pufru se do lahve napipetuje 0,5 ml trypsinu (malá kultivační lahev, 25 cm 3 ). Zhruba po 5 min by měly být vidět uvolněné shluky buněk. Láhev se suspenzí se otevře a připipetuje se potřebné médium, 2,5 ml (inhibuje činnost trypsinu). Nastává důkladné rozsuspendování, aby směs byla co možná nejvíce homogenní. 20 µl této suspenze se aplikuje na speciální sklíčko, které se vkládá do cellometru, abychom zjistili počet buněk v potřebném objemu. Potřebný objem buněčné suspenze se odpipetuje do sterilní 10ml skleničky. Zbytek objemu buněčné suspenze, která zůstala v kultivační láhvi, se doplní 5 ml média. U láhve se ožíhne hrdlo, uzavře a umístí do inkubátoru, zde jsou uchovávány při 37 C a 5 % CO 2 (OECD 2009). 2.2.2 Nasazení, expozice buněk a měření Buněčná suspenze o známé hustotě se doplní kultivačním médiem s 10% FBS na požadovaný objem, tak aby při pipetování 100 µl do každé jamky kultivační desky byla koncentrace buněk 15 tis. na jamku. Využívá se vnitřních 60 jamek z 96-jamkové desky a do krajních řad se pipetuje jen sterilní PBS pro udržení vlhkosti. Desky s buňkami se umístí do inkubátoru. Během inkubace (přibližně 3 hodiny) dojde k adherenci buněk na dno jamek a poté může být zahájena expozice. 37

Buňky se zkontrolují pod mikroskopem, aby se vyloučila akutní toxicita, kontaminace nebo jiný problém. Exponují se testované vzorky, negativní kontrola (čisté rozpouštědlo) a připravená koncentrační řada E2 v EtOH v koncentracích 0,13; 0,4; 1,23; 3,7; 11,1; 33,3; 100; 500 pm, jako pozitivní kontrola. Dávkování připravených vzorků je po 100 µl na jamku. Každá koncentrace vzorku se nanáší v triplikátu. Naexponované mikrotitrační desky se uchovají v inkubátoru. Po 24 hodinové expozici se přichystá reakční sérum pro stanovení luminiscence. Multiodsávačkou se odsaje původní médium a multipipetou se aplikuje 100 µl připraveného séra do každé jamky. Desky se umístí na třepačku a nechají se 20 minut třepat (130 ot/min). Neboť se používaly mikrotitrační desky s průhledným dnem, bylo zapotřebí dno podlepit bílou neprůhlednou páskou. Luminiscence se měří na luminometru - přesný postup podle návodu u přístroje. Aktivita luciferázy byla stanovena v relativních světelných jednotkách (RLU). 38