UPLATNĚNÁ CERTIFIKOVANÁ METODIKA č. 41

UPLATNĚNÁ CERTIFIKOVANÁ METODIKA č. 41 SYSTÉM KOMPLEXNÍ DIAGNOSTIKY RESPIRAČNÍCH INFEKCÍ PRASAT Autoři: Smola, J. 1, Celer, V. 1, Nedbalcová, K. 2, Toman, M. 1,2 1 Veterinární a farmaceutická univerzita, Brno, 2 Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v.v.i., Brno Certifikovaná metodika vznikla v rámci řešení projektu QJ1210120 Program zdravotní kontroly ekonomicky významných infekcí v chovech prasat, projektu OP VaVpI AdmireVet CZ1.05/2.1.00/01.0006; ED0006/01/01 a projektu CEITEC CZ.1.05/1.1.00/02.0068 ISBN 978-80-86895-39-0 2014

CERTIFIKOVANÁ METODIKA SYSTÉM KOMPLEXNÍ DIAGNOSTIKY RESPIRAČNÍCH INFEKCÍ PRASAT Smola, J., Celer, V., Nedbalcová, K., Toman, M. Certifikovaná metodika vznikla v rámci řešení projektu QJ1210120 Program zdravotní kontroly ekonomicky významných infekcí v chovech prasat, projektu OP VaVpI AdmireVet CZ1.05/2.1.00/01.0006; ED0006/01/01 a projektu CEITEC CZ.1.05/1.1.00/02.0068 I. Cíl metodiky Cílem metodiky je podat souhrnný návod komplexní diagnostiky nejvýznamnějších respiračních infekcí prasat v našich chovech. Zahrnuje základní posouzení zdravotní úrovně chovu, dále možnosti klinické diagnostiky a v návaznosti na to doporučení pro výběr a odběru vzorků pro laboratorní vyšetřovací metody vedoucí k průkazu původce a tím i stanovení diagnózy. Zahrnuje také možnosti monitorování zdravotního stavu ve stádě prostém sledovaných původců, ale i ve stádě, kde se uplatňuje program tlumení určité infekce. Bude sloužit jak chovatelům, tak praktickým veterinárním lékařům, specialistům na chovy prasat. Komplexní přístup a kvalitní diagnostika těchto onemocnění, které představují jednu z nejvýznamnějších příčin ekonomických ztrát, je základem pro kontrolu respiračních infekcí v chovech prasat. Bez úspěšné kontroly respiračních infekcí, která je založena na vysoké úrovni diagnostiky chorob, ale i jejich prevenci a striktně uplatňovaných moderních požadavcích na biosekuritu, nelze dosáhnout ekonomické efektivity a rentability v chovech prasat. II. Vlastní popis metodiky 1. Vymezení infekcí, zahrnutých v metodice Certifikovaná metodika se týká nejvýznamnějších infekcí, vyvolávající komplex respiračních onemocnění (porcine respiratory disease complex PRDC) a následně i nemalé ekonomické ztráty v našich současných chovech. Jsou to: Reprodukční a respirační syndrom prasat (PRRS) Infekce cirkovirem prasat (PCV-2) Chřipka prasat Sípavka prasat progresivní atrofická rinitida (PAR) Enzootická pneumonie (EP) Pleuropneumonie prasat (PP) Gläserova choroba Infekce kmeny Streptococcus suis- Streptokoková meningitida a bronchopneumonie 1

Reprodukční a respirační syndrom prasat Definice onemocnění: Infekce, při které dojde k dlouhodobému výskytu patogenního viru v krvi (virémie) a následné intersticiální pneumonii a poruchám reprodukce v podobě abortů nebo mrtvě rozených plodů. Původce: Virus z rodu Arterivirus, je znám se ve dvou typech: evropském (typ 1), který se vyskytuje v Evropě a také v Kanadě a americkém (typ 2), který se vyskytuje v Americe, Asii a také v Evropě. V Evropě se zjišťuje subtyp 1a, zatímco v Litvě subtyp 1b. Citlivost a schopnost původce přežívat: Mimo organismus je virus citlivý k teplotám prostředí, např. při 56 0 C hyne za 6-20 minut, při teplotách 25 0 C a více hyne týž den, při teplotách kolem 20-21 0 C ztrácí infekčnost během 1-6 dnů. V čerstvém krmivu přežívá při pokojové teplotě 48 h. Virus ztrácí infekciozitu v kyselém prostředí (méně než ph 6,0) nebo vyšším ph než 7,5. Je inaktivován chlorem v koncentraci 0,03% po 10 minutách za pokojové teploty a kvarterními amoniovými solemi za 1 minutu v koncentraci 0,0063%. Výskyt onemocnění: Onemocnění se vyskytuje ve většině států Evropy s výjimkou Norska, Švédska, Finska a Švýcarska. Dánsko výskyt na farmách přísně eviduje, zatímco jiné země vykazují podobně jako Česko více než 90% chovů PRRS pozitivních. Cesty šíření původce: K přenosu mezi stády dochází infikovanými zvířaty, ve stádě dále hmyzem a aerosolem ve směru větru od pozitivní farmy do vzdálenosti 4,7 až 9,2 km. K přenosu dochází také transplacentárně na selata infikovaných matek a semenem infikovaných kanců. Ve stádě se virus vyskytuje endemicky a trvale cirkuluje mezi při kontaktu infikovaných prasat s dosud neinfikovanými. Virus totiž perzistuje v tonzilách a mízních uzlinách prasat po infekci po dlouhou dobu (132-157 dnů). Infekce cirkovirem prasat Definice onemocnění: Generalizované onemocnění s rozhodující manifestací v lymfatickém a dýchacím systému. Příležitostně je virus odpovědný za reprodukční formu onemocnění. Původce: Cirkovirus prasat typ 2 (PCV-2), k vyvolání klinické podoby onemocnění je zpravidla důležitá přítomnost spouštěcího faktoru v podobě stresu, modulace imunitního systému, ko-infekce virem PRRS nebo parvovirem prasat. I když se virus vyskytuje v přinejmenším dvou genetických variantách, nebylo zatím prokázáno, že genotyp viru hraje roli při rozvoji klinické formy onemocnění. Citlivost a schopnost původce přežívat: Cirkovirus prasat patří mezi mimořádně rezistentní viry k faktorům vnějšího prostřední. V prostředí stáje, zvláště chráněn organickou nečistotou, zůstává plně infekční po dobu nejméně 6 měsíců. Dále je relativně rezistentní k ionizujícímu záření a není inaktivován tukovými rozpouštědly. K desinfekci prostředí a nářadí je proto možné použít pouze přípravky denaturující proteiny, jako jsou kvarterní amoniové soli, dusitanové sloučeniny a přípravky na bázi aldehydů. Výskyt onemocnění: Ve všech zemích s intenzivním chovem prasat. Cesty šíření původce: Zpravidla oro-fekální cestou, semenem, transplacentárně z matky na plod. Chřipka prasat Definice onemocnění: Choroba, při které dochází k infekci horních i dolních cest dýchacích virem chřipky prasat typu A za vzniku akutní pneumonie. Původce. Virus rodu Influenza A, má několika subtypů, z nichž aktuálně u nás se vyskytují aviární H1N1, pandemický H1N1 a prasečí H1N2 a H3N2. Výskyt onemocnění: Je globální, charakteristické je rychlé šíření nových subtypů jako byl pandemický kmen H1N1 během chladnějšího období roku na podzim a v zimě. 2

Cesty šíření původce: Infikovanými prasaty, aerosolem, vodním ptactvem a člověkem. Pokud se chřipka rozšíří na území státu, či v produkční pyramidě, můžeme očekávat šíření kontaktem mezi prasaty infikovanými a dosud vnímavými. Předpokládá se, že k zanesení viru do stáda dochází nejčastěji infikovanými zvířaty, méně často aerosolem, ve kterém se virus vyskytuje v době vrcholu infekce ve stádě. Virus se ve stádě šíří od prasnic směrem na selata sající a potom se dále šíří mezi selaty po odstavu. Podle subtypu viru lze očekávat šíření infekce od člověka na vnímavá prasata na farmách. Vylučování viru z infikovaných prasat může předcházet klinické příznaky, jak ukázaly případy pandemického viru ph1n1. Sípavka prasat progresivní atrofická rinitida Definice onemocnění: Progresivní atrofická rhinitida (PAR) je infekční onemocnění horních cest dýchacích, které se u neimunních prasat projevuje atrofií nosních konch a terminální distorzí septa s klasickou deformací tvaru dutiny nosní a tím i deformaci tváře. Původce: Infekce je způsobena toxinogenními kmeny Pasteurella multocida typu D, méně často také typu A, produkujícími dermonekrotický toxin (DNT). Kromě toho, mohou být prasata standardně kolonizována kmeny P. multocida, které neprodukují daný toxin (DNT-), a tudíž proto nemohou vyvolat sípavku prasat. Kolonizaci sliznice dutiny nosní toxigenními kmeny P. multocida a její zánět usnadňuje předchozí infekce druhem Bordetella bronchiseptica. Výskyt onemocnění: Onemocnění je popisováno standardně ve všech chovatelsky vyspělých zemích. Výskyt v rámci EU je udáván například v rozsahu od 5 do 40% chovů. Efektivní vakcinace a eradikační programy výrazně snížily počet postižených farem. Pokud se v chovu vyskytují aktuálně další původci respiratorních infekcí, je vznik sípavky pravděpodobnější. Cesty šíření původce: Infekce je na farmu nejčastěji zavlečena s nakupovanými zvířaty. Následně se šíří především horizontálně přímým kontaktem mezi infikovanými a neinfikovanými jedinci ( od nosu k nosu ). Šíření původce aerosolem je také možné, ale je limitováno především kratší vzdáleností a vnějšími podmínkami prostředí (vlhkost a teplota). Vertikální infekce a kolonizace imunitně naivních selat matkou je také možná. Infekce kmeny P. multocida DNT pozitivními může na farmě perzistovat měsíce až roky s mírnou klinickou manifestací onemocnění (enzootická forma infekce). Tato však může být narušena introdukcí imunitně naivních zvířat z jiného stáda. Enzootická pneumonie Definice onemocnění: V naivním stádě se projevuje jako akutně probíhající pneumonie, s kašlem. Později po několika měsících přechází v chronickou bronchopneumonii se suchým neproduktivním kašlem, která je pozorována běžně ve stádech s dlouhodobým výskytem původce. Probíhající infekce potlačuje u nemocných jedinců vrozenou imunitu. Původce: Bakterie druhu Mycoplasma hyopneumoniae, parazitující na epiteliálních buňkách dýchacího ústrojí, se považuje za primárního původce onemocnění. Nevyskytuje se proto u zdravých jedinců a ve stádě prostém onemocnění. Výskyt onemocnění: Jde o globální problém, protože patří k nejčastěji se vyskytujícím onemocněním prasat vůbec. Výjimkou je Švýcarsko, které chorobu na svém území eradikovalo. Cesty šíření původce: Kontaktem (z nosu do nosu) mezi infikovanými prasaty nejčastěji po odstavu a ve školkách, přičemž šíření je pomalé. Dále pak dochází k šíření aerosolem. K přenosu větrem dochází od pozitivní farmy do vzdálenosti až 20 km, běžně však několik km, pokud jsou nižší teploty a současně s tím i vysoká vlhkost. Důležitý je zde také reliéf okolí farmy, přítomnost přírodních větrolamů. Existují statistické modely na kvantifikaci rizika zavlečení enzootické pneumonie dle umístění farmy (standardně v Dánsku). Na farmě 3

dochází k přenosu od prasnic k jejich selatům a potom na odchovnách a předvýkrmech. Nejvyšší prevalence výskytu onemocnění je obvykle u výkrmových prasat. V plicích infikovaného prasete se patogen vyskytuje dlouhodobě (déle než 200 dnů). Ve stádě však cirkuluje trvale mezi jedinci a mezi turnusy. Pleuropneumonie prasat Definice onemocnění: Infekce dýchacího ústrojí, při které dochází k akutnímu zánětu plic (fibrino-hemoragická pneumonie a nekrotizující pneumonie) u naivních prasat v každém věku. V takových případech je onemocnění doprovázeno náhlými úhyny ve vysokém procentu. Původce: Bakterie Actinobacillus pleuropneumonie je adaptovaná na dýchací ústrojí prasat a patří k nejzávažnějším patogenům plic. Vyskytuje se více sérovarech (15 celkem) z nichž nevýznamnější (2; 9; 11 a 7) se popisují v západní Evropě a u nás. Jednotlivé sérovary se liší virulencí a infekciozitou. Stejný sérovar se však může chovat jinak v podmínkách různých stád. Citlivost a schopnost původce přežívat: Ve vnějším prostředí je velmi citlivý, pokud není chráněn organickým materiálem, kde přežívá po dobu několika dnů až týdnů. Delší schopnost přežívání (30 dnů) byla prokázána ve vodě při 4 0 C. Výskyt onemocnění: Choroba se vyskytuje globálně. Situace se odlišuje podle patogenity sérovarů, která je problém v Evropě, nikoliv však v USA a Kanadě. Cesty šíření původce: Na rozdíl od viru PRRS nelétá mezi farmami v aerosolu. Vlastní přenos aerosolem byl demonstrován maximálně na vzdálenost jednoho metru. Do naivních chovů se přenáší latentně infikovanými prasaty z pozitivních chovů. Zdroj infekce představují nemocná zvířata, k šíření dochází kontaktem z nosu do nosu a aerosolem na krátkou vzdálenost, ale i mezi budovami na farmě. Po překonání onemocnění se prasata různého věku stávají bacilonosiči bez klinických příznaků, procento latentně infikovaných nosičů může být vysoké (až 30%). Glässerova choroba Definice onemocnění: Glässerova choroba je systémové onemocnění, které charakterizují fibrinózní polyserositidy, artritidy a meningitidy s vysokým procentem úhynů, zejména u selat po odstavu. Mírnější forma onemocnění se vyskytuje často v kombinaci s působením jiných respiračních patogenů. Původce: Bakterie Haemophilus parasuis je součástí normální mikroflóry osídlující dutinu nosní selat. Výskyt ve stádě je ubikvitární v podobě několika odlišných kmenů. V rámci druhu Haemophilus parasuis, existuje velká antigenní heterogenita. Dosud je popsáno 15 sérovarů, ale velký počet kmenů je dostupnými metodami sérologicky netypizovatelný. Jednotlivé sérovary, ale dokonce i některé kmeny v rámci jednoho sérovaru se liší ve virulenci a schopnosti vyvolat onemocnění. Prevalentními patogenními sérovary v Evropě i u nás jsou sérovar 4 (nejčastější původce respiračních onemocnění) a sérovary 5 a 13 (mohou být původci závažnějších systémových onemocnění). Plíce se považují za místo primárního průniku původce, po kterém dochází k systémové infekci. Krví je pak transportován do dalších vnitřních orgánů, kde se množí na serózních površích za tvorby fibrinu a akumulace tekutin. Citlivost a schopnost původce přežívat: Ve vnějším prostředí je velmi citlivý, pokud není chráněn organickým materiálem, kde přežívá po dobu několika dnů až týdnů. Výskyt onemocnění. Onemocnění se vyskytuje globálně, má enzootický charakter. 4

Stále častěji se vyskytuje v moderních chovech s vysokou úrovní zdraví. V USA a v Dánsku je jednou z hlavních příčin infekcí selat na odchovnách. Byla popsána epidemiologická souvislost mezi infekcí H. parasuis a infekcí vyvolanou viry PRRS, PCV-2 a influenzy A. Cesty šíření původce: Do naivních chovů se přenáší latentně infikovanými prasaty z pozitivních chovů. Hlavním rezervoárem infekce jsou infikované prasnice, které po porodu kolonizují sající selata patogenními kmeny v době, kdy jsou selata chráněna mateřskou imunitou. Z nich se stávají subkliničtí nosiči a způsobují šíření původce onemocnění v chovu. Ke vzniku onemocnění přispívají kromě oslabení imunity také další faktory. Infekce vyvolaná bakterií Streptococcus suis Definice onemocnění: Akutně probíhají infekce převážně selat před a po odstavu a prasat v předvýkrmech, při které dochází k pneumoniím, septikémiím, menigitidám a infekčním artritidám. Původce: Gram pozitivní bakterie Streptococcus suis, vyskytující se v 35 sérovarech z nichž jen některé (1;2; ale i 7;9;14) se považují za patogenní pro prase. Mikrob je adaptován na prase, které kolonizuje v tonzilách, odkud může pronikat do krve. Citlivost původce: Patogenní sérovary přežívají ve výkalech prasat asi 8 dnů při teplotě 22-25 0 C, ale jen 24 h v suchém prachu. Při nižších teplotách se doba přežívání zvyšuje, takže v kontaminované vodě při 4 0 C je možné až 2 týdny. Citlivost k desinfekčním prostředkům s výjimkou detergentů je velmi dobrá, pokud se však mikrob vyskytuje v organickém materiále je účinnost nedostatečná. Výskyt onemocnění: Jde o globálně se vyskytující infekci, s mimořádným dopadem pro chovy prasat v Kanadě a Číně. V Evropě a u nás se vyskytuje endemicky v řadě chovů, kde neproběhla repopulace stáda v posledních letech. Cesty šíření původce: Nejčastěji přímým kontaktem mezi prasaty a to jak s klinickými příznaky onemocnění tak i bez nich v případě bacilonosičů. K přenosu dochází z prasnic na novorozená selata a potom po odstavu mezi selaty. Předpokládá se také šíření aerosolem na krátkou vzdálenost a prostřednictvím kontaminovaných pomůcek a oděvů. 2. Základní posouzení chovu Posouzení chovu musí proběhnout současně v několika oblastech, jako jsou: 1. Charakteristika stáda, jeho managementu, kvality ustájení a úrovně biosekurity, včetně nedostatků; 2. Vývoj a stav produkčních a reprodukčních ukazatelů dostupných v systému dat sbíraných na farmě za posledních 6 měsíců; 3. Vývoj a stav úrovně zdraví stáda z hlediska ekonomicky významných respiratorních infekcí na základě údajů shromažďovaných chovatelem a veterinárním lékařem pomocí programů. Dále pak na základě výsledků monitorovacích laboratorních vyšetření, kontrolních dnů, patologicko-anatomických pitev a laboratorních vyšetření ale i spotřeby antibiotik předepisovaných pro léčbu respiratorních infekcí během posledních 6 měsíců. Obecně platí, že striktní realizace opatření biologické bezpečnosti v podmínkách farmy zajišťuje statut zdraví prasat na farmě, ale i její produkci. Základní hodnocení zahrnuje skóre externí biosekurity (opatření zabraňující průniku agens do stáda) a vnitřní biosekurity (opatření zaměřená na snížení šíření patogenů uvnitř stáda). O úspěšném opatření externí biosekurity svědčí stabilita zdravotní situace stáda na úrovni SPF nebo stáda prostého PRRS. Výskyt většiny původců PRDC ve stádě svědčí o nízké úrovni externí biosekurity v minulosti a v přítomnosti. O nízké úrovni vnitřní biosekurity svědčí vysoká prevalence klinických případů onemocnění a intenzivní používání antibiotik. V neposlední řadě pak vysoká 5

frekvence ztrát prasat úhynem. Bez zásadních změn v systému vnější a vnitřní biosekurity farem nelze dosáhnout očekávaných změn ve zlepšení zdravotní situace stáda. Proto musí být tato opatření součástí organizačního řádu farem s tím, že se musí postupně upravovat, zlepšovat podle situace. 3. Obecné zásady odběru a transportu vzorků Ekonomicky významné infekce respiratorního ústrojí prasat mají v závislosti na jednotlivých původcích různě rychlý nástup a různou dobu perzistence v napadeném těle. To má kromě jiných faktorů, významný vliv na klinickou prezentaci onemocnění, ale i vylučování původce a jeho průkaz. Jasné pochopení mechanismů infekce organismu prasete jednotlivými původci je předpokladem pro optimální výběr a následný odběr vzorků potřebných pro průkaz původce infekce a stanovení diagnózy. Aby se zlepšil proces diagnostiky těchto závažných a velmi často se vyskytujících infekcí u nás, je nezbytné poskytnout praktickým veterinárním lékařům ale i specialistům ve veterinárních diagnostických laboratořích novější poznatky, které by více sjednotily požadavky proč, kdy, kde a jak nejlépe odebrat vzorky, pro stanovení diagnózy, jak z hlediska monokauzálního, tak i ko-infekcí v rámci PRDC. Právě ko-infekce jsou velmi časté v našich užitkových chovech, kde nebyla přerušena produkce prasat po mnoho let nazpět. Cílem této metodiky je zvýšit kvalitu diagnostického procesu a v návaznosti na to vytvořit podmínky pro účinnou prevenci a léčbu infekcí aktuálních v jednom chovu nebo celé kooperaci. Tato metodika nevylučuje rozdílnost v preferencích týkajících se odběru a zasílání vzorků v případě jednotlivých diagnostických laboratoří, proto doporučujeme konzultovat odběry s personálem diagnostické laboratoře za účelem objasnění možných odlišností v předstihu. PRRS Vzhledem k značné citlivosti PRRS viru k podmínkám vnějšího prostředí je rychlost transportu do diagnostické laboratoře důležitým faktorem ovlivňujícím spolehlivost vyšetření. Proto k odběru volíme pracovní dny na začátku týdne umožňující samotný odběr a následné vyšetření aniž by bylo nutné vzorky dlouhodobě uskladňovat, případně zamrazovat. Doručení vzorků do laboratoře by mělo být v den odběru, tj, v před koncem pracovní doby. Krevní sérum odebíráme za účelem přímého průkazu viru (RT-PCR, izolace viru), dále pro sérologické vyšetření na průkaz protilátek. Krevní sérum uchováváme při pokojové teplotě (po dobu prvních 24 hodin) aby došlo k dostatečné aktivaci krevních srážecích faktorů, teprve poté je možné separovat krevní koláč od séra (odstředěním) a samotné sérum můžeme uchovávat při teplotě 4 o C. Pro přímý průkaz viru sérum uchováváme při chladničkové teplotě (max. 1-2 dny), pro uchování po delší dobu je vhodnější materiál zamrazit. Vzhledem k tomu, že pro dlouhodobé uchování viru je nejvýhodnější teplota alespoň -50 o C, je zapotřebí vzorek urychleně transportovat do laboratoře, kde jsou zřízení umožňující toto dlouhodobé uchování viru. Vzorek séra pro účely sérologického vyšetření je možné uchovávat dlouhodobě při chladničkové teplotě, aniž by došlo k jeho znehodnocení. Oro-faryngeální tekutiny (sliny) odebíráme pomocí bavlněných provazů (nekonzervovaných) a to zpravidla jako směsný vzorek jak pro průkaz viru, tak protilátek. Provazy necháme v kotci po dobu alespoň 30 minut, kdy dojde k dostatečnému kontaktu s téměř všemi zvířaty v kotci. Sliny poté vymačkáme a slijeme do plastové nebo skleněné nádoby a uchováváme při 6

chladničkové teplotě. Mražení a následné rozmrazení synergicky inaktivuje virusprrs společně s působením mucinu obsaženém ve slinách. Tkáně (tkáň plic, seškraby mandlí, lymfatické uzliny, slezina) uchováváme podobně jako vzorky séra za účelem průkazu viru, tedy při chladničkové teplotě, zamrazujeme teprve při nezbytném uchování po dobu delší než 3-4 dny. Semeno nikdy nemrazíme, uchováváme pouze při chladničkové teplotě, a co nejrychleji transportujeme do laboratoře. Inseminační dávky obsahují kryoprezervační látky a jejich zamražení proto nemá negativní dopad na výsledek vyšetření. Sérologické vyšetření Větší počty vzorků zamýšlené pro serologické vyšetření musí být hlášené laboratoři v předstihu, nejlépe 2 dny. Všechny vzorky krví musí být označeny pořadovým číslem. (Veterinární lékař, který zasílá vzorky, je odpovědný za všechny informace potřebné pro laboratoř. Pokud vyžaduje speciální vyšetření v podobě určitého testu, musí tuto skutečnost uvést v žádance. Pokud má být provedeno několik serologických vyšetření z určitých vzorků, je třeba tyto požadavky uvést jmenovitě v žádance. Vzorky doručované majitelem nebo chovatelem musí být doprovázeny žádankou veterinárního lékaře. Odebrané vzorky krví by měly být dopraveny do laboratoře týž den ještě v pracovní době, aby bylo možno ze sražené krve získat sérum. Doručení krevního séra Do laboratoře se odesílá čiré sérum (nehemolytické) o obsahu minimálně 1 ml ve zkumavkách s celkovým objemem minimálně 2 ml. Pokud existuje předem dohoda s diagnostickou laboratoří a vzorky jsou dopraveny tentýž den po odběru, lze zasílat i odebranou krev bez odstředění séra, což se provede až v laboratoři. Pokud má být cílem průkaz sérokonverze, zasílají se současně vzorky sér akutních a rekonvalescentních, laboratoře běžně nedeponují séra mezi prvním a druhým odběrem. Do formuláře žádanky je třeba uvést požadovanou metodu serologického vyšetření (např. ELISA). Zásady odběru vzorků pro přímý průkaz virových a bakteriálních původců 1. Místo v těle a materiál určený k odběru jsou vybrány poté, co byla stanovena předběžná diagnóza choroby a předpokládaná potřeba diferenciální diagnostiky 2. Vzorky z živých prasat je třeba odebrat v raném stádiu klinického průběhu onemocnění tj. do 4. -5. dne. 3. Vzorky ze zvířat utracených musí být odebrány okamžitě po jejich skonu. Před utracením se odbírá vzorek krve. Vzorky tkání musí být odebrány co nejvíce asepticky, jednotlivě o velikosti (5x5x5 cm) a po té ukládány jednotlivě do plastikových sáčků, které musí být jasně označeny. 4. Stěry seróz, výtěry trachei a bronchů musí být provedeny asepticky, pokud možno ještě v těle utraceného zvířete. Vyjmutím orgánů z hrudníku dochází ke kontaminaci. K výtěrům a stěrům se používají sterilní bavlněné tampony. Výjimkou jsou odběry zaměřené na průkaz influenza viru A, kdy se musí použít tampony syntetické, které se ukládají do tekutého transportního média určeného pro viry. V případě bakteriálních původců se výtěry a stěry transportují v Amiesově médiu. 5. V případě pneumonie se z plic k odběru vybírá okrsek tkáně s výraznými patologickými změnami, přičemž přítomnost původce je více pravděpodobná na okrajích leze. Centrální nekrotické ložisko nemusí původce obsahovat. Pokud nejsou viditelná ložiska 7

(intersticiální pneumonie) odebírá se tkáň plic z laloků, které jsou nejlépe dostupné po otevření hrudníku. 6. Vybraný okrsek (rozměr 5x5x5 cm) plicní tkáně vyřízneme asepticky a uložíme do plastového sáčku za použití pinzety. 7. Vzorky pro virologické vyšetření musí být do laboratoře dopraveny co nejdříve v chlazeném stavu. V žádném případě by nemělo docházet k pomalému zamražování vzorku na ledu v přepravce během transportu. 8. Virologickou laboratoř je třeba včas upozornit před dodáním většího počtu vzorků současně. 9. Vzorky se dopravují jako chlazené, ale nemražené. 10. Žádné vzorky určené pro průkaz virů nebo bakterií se nefixují v 10% formalínu, tyto vzorky jsou vhodné pouze pro histologická vyšetření. Tab. č. 1. Doporučení pro odběr vzorků z živého prasete a použité metody průkazu původce Název onemocnění Původce Odebíraný vzorek Přímý průkaz původce Sérologické vyšetření PRRS Virus PRRS 1. krevní sérum 2. orální tekutiny 3. semeno 4. seškraby tkání 1.;2.;3: RT-PCR; qrt-pcr 1.; 2.: ELISA Chřipka prasat Pleuropneumonie prasat Progresivní atrofická rinitida SIV : subtypy H1N1;H1N2;H3N1; H3N2 A. pleuropneumoniae (sérovary: 2;7;9;11;) 1. nosní výtěr 2. tracheální výtěr 3. sérum (párově) 1.;2.: RT-PCR 3: HIT 1. krevní sérum 1.: ELISA P. multocida DNT+ 1. hluboký nosní výtěr 1.: kultivace Glasserova choroba H.parasuis (sérovary: 4;5;) 1. krevní sérum 1.:ELISA Cirkovirové onemocnění PCV-2 1. krevní sérum RT-PCR??? Streptokokóza S. suis (sérovary: 1;2;7) 1. aspirát z kloubu 1.: kultivace Enzootická pneumonie M. hyopneumoniae 1. výtěr průdušnice 2. tekutina po BAL 3. krevní sérum 1.;2.:PCR; Nested PCR; RT -PCR 3: ELISA Typizace bakteriálních izolátů Kultury bakteriálních původců získané ze suspektních případů by měly být v laboratoři dále typizovány s použitím fenotypových nebo genotypových metod, aby byl orientačně identifikován patogenní kmen. Všechny izolované kmeny S. suis by měly být vyšetřeny za účelem stanovení sérovarů 1 a 2. Rovněž tak izoláty A. pleuropneumonie a H. parasuis by měly být typizovány z hlediska příslušnosti k u nás prevalujícím patogenním sérovarům. Typizace virových izolátů Typizace kmene PRRS prokázaného v chovu je klíčovou záležitostí v případě zahájení ozdravovacích programů nebo monitorování jejich úspěšnosti. Typizace kmene se provádí sekvenováním zpravidla genu ORF5 viru. Tato informace je klíčová pro volbu správného druhu vakcíny. V další fázi ozdravovacího postupu je nebytná při sledování, zda dochází 8

k vytěsňování terénního kmene kmenem vakcinačním a dále například v případě, že existuje podezření na introdukci nového kmene do ozdravovaného nebo vakcinovaného chovu. Genetická vzdálenost mezi cirkulujícím kmenem viru v chovu a kmenem vakcinačním by neměla být větší než 3%. Také v případě viru influenzy je typizace virového kmene s ohledem na určení přítomnosti konkrétního typu hemagutininu a neuraminidázy zásadní pro zvolení správného typu vakcíny. I u tohoto viru tedy po jeho průkazu nutně následuje typizace sekvenováním. Odběry z utracených a uhynulých zvířat Odběry vzorků pro bakteriologické a virologické vyšetření musí být provedeny v souvislosti se suspektní diagnózou onemocnění, nejenom z nemocných žijících zvířat. Pokud to situace vyžaduje, používá se pro odběr potřebných materiálů post mortem, pečlivě vybrané prase, které se za tím účelem utratí. V tomto případě existuje záruka, že posmrtné změny nebudou znehodnocovat vzorek a na druhé straně je známo, jaký klinický obraz byl pozorován u zvířete před utracením. Uhynulá zvířata nejsou vhodná například ke kultivačnímu průkazu H. parasuis s ohledem na silnou kontaminaci. Tato je obecným problémem již několik hodin po úhynu. Odlišnosti mezi výběrem optimálních vzorků u živých a utracených zvířat jsou uvedeny v tabulkách č. 1 a č. 2. Tab. č. 2. Doporučení pro odběr vzorků z prasete po utracení nebo po čerstvém úhynu včetně doporučení metod průkazu původce a mikroskopických změn tkání Název onemocnění Původce Odebíraný vzorek Přímý průkaz původce Histologické vyšetření PRRS Virus PRRS 1. tkáně plic, sleziny 2. tkáň mízních uzlin 3. tkáň tonzil 1.;2.;3.: RT- PCR; qrt-pcr Chřipka prasat SIV: subtypy H1N1; H1N2; H3N1; H3N2 1. výtěr bronchů 2. tkáň plic 1.;2.: RT-PCR Pleuropneumonie prasat Progresivní atrofická rinitida Glasserova choroba Cirkovirová onemocnění A. pleuropneumoniae (sérovary*: 2;7;9;11;) 1. tkáň plic 2. výtěr bronchů 3. Stěr pleury 4. stěr osrdečníku P. multocida DNT+ 1. stěr z konch v dutině nosní H.parasuis (sérovary*: 4;5;13) PCV-2 1. stěr seróz se zánětem (fibrinem) 2. tkáň plic 3. stěr z plen mozku 1. tkáň mízních uzlin 2. tkáň sleziny 3. hrot srdce Streptokokóza S. suis (sérovary*: 1;2;7) 1. stěr z plen mozku 2. mozkomíšní mok 3. tkáň plic 4. stěr ze serozitid Enzootická pneumonie M. hyopneumoniae 1. výtěr průdušnice 2. výtěr z bronchů 3. tkáň plic 1.;2.;3.;4.: kultivace 1.;2.;3.;4.: PCR 1.: kultivace 1.;2.: kultivace pleny mozkové 1.;2.;3: RT-PCR mízní uzliny tkáň sleziny hrot srdce 1.;2.;3.;4: kultivace 1.;2.;3:PCR; nested PCR; RT -PCR tkáň plic 9

Požadavky na vyšetření vzorku metodou PCR Pokud je požadován průkaz původce metodou PCR (nikoliv kultivací), je nezbytné uvést daného původce přímo na žádance, (např. M. hyopneumoniae). Pokud má být v jednom odebraném vzorku detekováno pomocí PCR (výtěr, tkáň) více agens, musí to být uveden jejich výčet v žádance. Týká se to například smíšených infekcí, kdy z jednoho vzorku je možno požadovat průkaz viru PRRS, viru influenzy A, M. hyopneumoniae. V případě M. hyopneumoniae je třeba požadovat přímý průkaz pomocí PCR, protože kultivace v laboratoři není možná (viz. Tabulky č.1 a č. 2.). 4. Monitoring respiratorních onemocnění v chovu Cílem monitorování je určení výskytu respiratorních infekcí, které se v chovu projevují jako klinická a subklinická onemocnění a která mohou být příčinou snížené produkce v chovu. Monitoring je založen na systematickém sběru dat získaném klinickým pozorováním nemocných prasat, dále postmortálním vyšetřením utracených a uhynulých zvířat, doplněném o další laboratorní vyšetření (mikrobiologická) tvořícími základ diagnózy. Zvláštní část monitoringu tvoří sledování post infekčních protilátek v krevním séru prasat určitého chovu v pravidelných časových intervalech, které je organizované na národní úrovni nebo dobrovolně v rámci kooperace. Naproti tomu dříve často zdůrazňovaná kontrola hrudních orgánů prasat v době jejich porážky na jatkách se ukázala jako pracná, logisticky náročná, nesnadná v podmínkách rychle nastavené porážecí linky. Problematické jsou změny vzniklé postmortálně aspirací krve při porážce. Kontrola na jatkách se považuje za méně vypovídající také s ohledem na chronický charakter změn, které odráží infekce proběhlé v posledním období před porážkou. Podobný je přístup k hodnocení změn v nosní dutině v rámci skórování atrofické rinitidy, které se považuje za velmi subjektivní, tedy závisející na osobě. Tyto kontroly na jatkách umožňuje nahradit sérologické vyšetření za účelem stanovení sérologického profilu stáda, který odhalí i chronicky i subklinicky probíhající onemocnění respiratorního ústrojí. Náročné odběry krve mohou při monitorování výskytu infekcí ve stádě nahradit odběry orálních tekutin získané pomocí bavlněných provazů. V případě zásadní změny zdravotního stavu stáda zjištěné na základě vzniku akutního klinického průběhu onemocnění (podezření na infekci vprrs, nebo A. pleuropneumoniae), současně s tím i náhlých úhynů, musí být diagnostický postup neprodleně zaměřen na poznání příčin a stanovení diagnózy. Vysoce účinný může být jen tehdy, když se na řešení podílí všechny zainteresované strany, včetně dodavatelů prasat, protože komplexní posouzení situace včetně auditu biosekurity umožní zúžit hypotézu týkající se původce. Jako příklad je možno uvést podezření na PRRS v chovu, který byl do té doby vprrs prostý, stejně jako dalších ekonomicky významných infekcí reparačního ústrojí. V takovém případě je klinický obraz vyjádřen jednou příčinou. Zatímco v chovu s výskytem dalších patogenů respiratorního traktu bude tento obraz komplikovanější. Pro monitoring má zásadní význam rozdělení chovů na PRRS prosté a PRRS pozitivní. V PRRS prostých chovech je úroveň biologické bezpečnosti vyšší a počet případů s podezřením na průnik nepřítomného původce je daleko nižší. Chovy PRRS pozitivní, kde virus cirkuluje, mají méně důkladný systém biologické bezpečnosti a pravděpodobnost průniku dalšího původce je proto vyšší. Vedle patogenů hraje v biologické bezpečnosti zásadní roli člověk, který musí aktualizovat opatření týkající se biologické bezpečnosti podle podmínek chovu, ale především podle nových poznatků a zkušeností publikovaných u nás i v zahraničí. Respektuje se při tom skutečnost, že výskytu původců jako jsou PCV-2, nebo H. parasuis a S. suis ve stádě nelze zabránit. Tvorba stád prostých těchto původců, není zatím 10

možná, a proto musíme přepokládat jejich cirkulaci ve stádě, zejména pokud má otevřený obrat. Monitoring závažných respiratorních chorob prasat v chovu by měl být prováděn systematicky po dobu celého roku. Přehled v podobě tabulky by měl být trvale k dispozici managementu farmy a veterinárnímu lékaři, který jej vede. Současně s tím by mělo být zaznamenáváno, proti kterým chorobám vyskytujícím se na seznamu se prováděla vakcinace během roku, včetně případných změn výrobce vakcíny. Používání vakcín dává nejenom přehled o programu prevence ale i informaci, která vylučuje vakcinované subpopulace zvířat při výběru jedinců pro sérologické monitorování protilátek. 5. Klinická a laboratorní diagnostika jednotlivých infekcí Klinické vyšetřování v podmínkách chovu je základním kamenem postupu, který vede ke stanovení diagnózy některé z ekonomicky významných infekcí dýchacího ústrojí prasat všech kategorií. Tyto choroby se vyznačují klinickými příznaky, zejména v akutní fázi onemocnění, některé z nich přitom přetrvávají i ve fázi chronické. Předpokladem je důkladné vyšetření jedinců (jednotlivců), kteří vzhledem k manifestaci klinických příznaků, vykazují největší změny vůči normálu. Za tímto účelem je zapotřebí vyšetřit klinicky minimálně 5 jedinců se stejným respiratorním syndromem. Na základě shrnutí výsledků klinického vyšetření je třeba stanovit suspektní diagnózu, včetně potřebného rozsahu diferenciální diagnostiky. Např. u akutně probíhající pleuropneumonie u prasat ve výkrmu je nutností diferencovat PRRS. Tento diagnostický postup je snadnější v chovu s historií právě pozorovaného onemocnění, kde v důsledku cirkulace původce mezi turnusy s naivními zvířaty dochází k novým případům infekce Složitější je diagnostický postup ve stádě, které bylo do současnosti původce uvažovaného onemocnění prosté a kde v důsledku prolomení biologické bezpečnosti došlo k průniku nového a neznámého původce do stáda. Bez ohledu na tyto dvě možnosti je nezbytné při jakémkoliv podezření na nové onemocnění informovat okamžitě chovatele o diagnostické hypotéze (např. PRRS). V souvislosti s tím je třeba vyhlásit podezření a až do doby uzavření případu postupovat, jako kdyby se choroba, na kterou bylo vysloveno podezření, ve stádě vyskytovala. Kromě chovatele je třeba okamžitě informovat případné odběratele selat, prasniček a kanců, aby se zabránilo v šíření původce do dalších chovů, nebo v kooperaci. Pro potvrzení podezření, které bylo vysloveno, je zapotřebí úzké spolupráce mezi všemi zainteresovanými stranami, jako jsou chovatel, management podniku, veterinární lékaři (místní, poradci specialisté, specialisté z laboratoří státní veterinární lékaři), případně zástupci dalších služeb (plemenáři, dodavatelé a výrobci krmiv, dodavatelé technologií). Teprve v návaznosti na klinická vyšetření, podle kterých se vysloví diagnostická hypotéza, se rozhoduje o orientaci laboratorních vyšetření, které mají přinést důkaz v podobě průkazu původce. Pro laboratorní vyšetření je nezbytné odebrat vzorky klinického materiálu (pochází z živých pacientů), ale i vzorky sekčního materiálu, který pochází ze zvířat po jejich utracení nebo úhynu. V případě onemocnění, které se na farmě již vyskytlo, dáváme přednost klinickému materiálu z nemocných zvířat, která nebyla léčena. Jde o jedince, u nichž je onemocnění klinicky zjevné jen krátce, ne více než 5 dnů. V případě, že uvažovaný mikrobiální původce není dostupný v klinickém materiálu ze živého zvířete (H. parasuis), musí následovat utracení vybraných jedinců, způsobem, který není v rozporu s welfare a platným předpisy (injekce T61). Před utracením vybraných zvířat je však nutné odebrat krev pro účely možného průkazu původce, nebo sérologického vyšetření. Zvířata se utrácí postupně. Okamžitě po utracení jednotlivého zvířete následuje aseptický odběr vzorků, 11

například ze seróz dutiny hrudní nebo břišní, po otevření stěny hrudníku nebo břicha. Otevření dutiny hrudní nebo břišní musí být aseptické, aby nedošlo ke kontaminaci vnitřního prostoru dutin skalpelem, nebo nožem, který se znečistil na povrchu kůže nebo nečistými rukavicemi. Pokud je zapotřebí odebrat výtěr z trachei, nebo bronchů plic, můžeme jej provést in situ v hrudníku ve vzdálenosti asi 5 cm od příčného řezu směrem k zánětlivému ložisku. Získaný exudát odebraný asepticky do sterilní injekční stříkačky můžeme zhodnotit z hlediska obsahu hnisu nebo krve. Uhynulé prase ve s rovnání s jedincem, který byl utracen, neskýtá vždy jistou času, kdy došlo k úhynu, protože doba, která uplynula od úhynu, zvyšuje množství kontaminacích bakterií ve tkáních a snižuje životaschopnost některých původců (H. parasuis, vprrs), zejména v letním období. To zásadně komplikuje možnost odběru vzorků pro mikrobiologické vyšetření z hlediska kontaminace a histologické vyšetření z hlediska autolýzy tkání. V takovém případě se k odběru vzorků doporučuje prase, které uhynulo krátce před tím, což dosvědčí některý ze zaměstnanců. Pro odběr vzorků určených k bakteriologickému vyšetření nejsou vhodná zvířata, která byla léčena skupinově nebo individuálně antimikrobiálními léčivy (antibiotiky). Z léčených zvířat se odebírají vzorky pouze tehdy, pokud je součástí hypotézy předpoklad, že původce infekce je klinicky rezistentní k podávanému antimikrobiálnímu léčivu. Pro diagnostiku ko-infekcí v rámci PRDC je z hlediska kvality a rychlosti, diagnostického procesu základním předpokladem znalost zdravotní situace v daném chovu. Ve stádě s vysokou úrovní zdraví (SPF/minimální nemocnost), je pravděpodobnost výskytu smíšených infekcí velmi nízká, protože při porušení biologické bezpečnosti dochází zpravidla k průniku jednoho původce např. viru influenzy A. Naproti tomu ve stádě, kde se historicky vyskytuje virus PRRS a více původců respiratorního komplexu (PRDC) je pravděpodobnost průběhu smíšené infekce daleko větší a diagnostický proces musí být cílen tak, aby tuto ko-infekci prokázal. Běžná je tato situace v chovech s otevřeným obratem stáda s výskytem onemocnění PRRS. Nejčastěji předpokládanou koinfekcí s PRRS u prasete je současná infekce patogenními kmeny S. suis v případě, že se v chovu vyskytují, nebo smíšená infekce s patogenními sérovary druhu H. parasuis, případně kmeny P. multocida, M. hyopneumoniae a viru PCV-2. Ke ko-infekcím dochází u rizikových věkových kategorií, jako jsou odstavená selata v období od 7. týdne po odstavu, nebo prasničky před připuštěním, nebo prasata ve výkrmu kolem 90 dne života, dále pak u selat sajících pokud nejsou matky vakcinovány proti PRRS. Z praktického pohledu je proto nutné například orientovat vyšetření prasete s patologickým obrazem polyserozitidy (Glässerova choroba) současně na průkaz infekce virem PRRS v krvi, nebo ve tkáni plic. V případech streptokokových meningitid je potřebné prokazovat původce S. suis, nejenom v plenách ale i v plicích, současně s virem PRRS, pokud nebyl prokazován v krvi. Jestliže se v chovu vyskytuje chřipkové onemocnění prasat, je nezbytné provádět současné vyšetření na virus PRRS, virus influenzy A, protože nejvnímavější subpopulací jsou odstavená selata ve stáří sedmi týdnů. Je chybou v takovýchto situacích orientovat vyšetření pouze na jednoho z původců s odůvodněním, že to postačí pro vysvětlení ztrát. Takto získaná diagnóza, nejenže není úplná, ale neobjasňuje dostatečně ani klinický průběh, rychlost šíření a intenzitu vylučování původce z těla postižených jedinců. Pro takové chovy, kde se vyskytuje více původců PRDC je proto zásadní nastavení diagnostického procesu, který by vedl k poznání smíšených infekcí a stanovení jejich prevalencí. Ko-infekce jsou významné i u prasnic v případě, že ve stádu cirkuluje virus PRRS, M. hyopneumoniae a virus chřipky prasat. Průběh ko-infekce u prasnic je zvláště závažný v době jejich gravidity a krátce po porodu, kdy jsou pozorovány výrazné chronické příznaky. Pro kvalitu diagnózy PRDC je naprosto nezbytné identifikovat jednotlivé složky (patogeny) podílející se na respiratorním komplexu v daném stádě. V řadě případů dochází k chybným 12

diagnózám, jestliže se vychází pouze z klinických příznaků a diagnostické pitvy provedené u uhynulých prasat. Diagnóza respiratorního komplexu musí být založena na důkazech, kterými ve finální fázi je průkaz průvodců infekce v mikrobiologické laboratoři. Pokud není diagnóza potvrzena tímto průkazem, nejde o princip medicíny založené na důkazech a nelze předpokládat, že zvolený postup prevence onemocnění a léčby přispěje k vyřešení takové situace. Zásadou musí být, že diagnostický postup směřuje od primárních tj. ekonomicky nejzávažnějších chorob k těm sekundárním. Chronicky se vyskytující onemocnění, jako je EP, má však zásadní význam u starších kategorií prasat, počínaje prasaty na předvýkrmu a odchovnách, protože navozuje imunosupresi a podílí se na ko-infekci společně s dalšími agens. V první etapě tedy usilujeme o stanovení diagnózy hlavních infekčních onemocnění respiratorního traktu (PRRS a PP) odpovědných za ztráty úhynem a v další fázi se věnujeme chorobám, které mají chroničtější průběh (Glässerova choroba) a jejichž eliminace ze stáda není prakticky možná. Reprodukční a respirační syndrom prasat Inkubační doba. Dosahuje 3 až 14 dnů v závislosti na virulenci kmene. K viremii dochází asi 24 h po infekci a trvá po dobu 28 dnů. Klinické projevy. Závisí na virulenci (vysoké nebo nízké) virového kmene a řadě další podmínek. Klinické příznaky jsou odrazem jednak akutní virémie s množením patogenu v plicích, jednak jeho transplacentárního přenosu a infekce plodů. Epidemický průběh s výraznými klinickými příznaky jako jsou horečka, dyspnoe, hyperpnoe, anorexie a letargie má infekce virulentním kmenem v imunologicky naivním stádě. Na druhé straně endemický průběh infekce je charakteristický pro málo virulentní kmen nebo stádo, kde cirkulují protilátky homologní tj. schopné tlumit infikují virus. V takovém stádě lze pozorovat klinické příznaky pouze u prasat, kde mateřská imunita poklesla (odchovny, předvýkrm) v podobě záchvatů kašle (podobnému psímu štěkotu). Patologické nálezy. Nejčastěji je zjišťována intersticiální pneumonie (nekolabující plíce) s ohledem na místo reprodukce viru. Poškození plodů není specifické, dochází však k předčasným porodům, přičemž ve vrzích jsou vedle mumií, plody mrtvé o různé velikosti ale i normální selata. Počet selat však bývá v některých vrzích menší než 8. Některá živě rozená selata jsou viremická a hynou do 5 dnů po porodu. Laboratorní diagnostika PRRS infekce Nepřímý průkaz viru Sérologické vyšetření je uskutečňováno průkazem protilátek proti ORF7 proteinu viru, který je jako diagnostický antigen obsažen ve všech komerčně dostupných ELISA soupravách. Protilátky proti touto proteinu se v sérech prasat objevují za 7-10 dní po infekci a přetrvávají řadu týdnů až měsíců. Tyto protilátky nemají neutralizační charakter a nevypovídají nic o chráněnosti zvířete nebo o vzájemné příbuznosti různých PRRSv kmenů. Jejich prostřednictví také nelze odlišit postinfekční a postvakcinační protilátky. K sérologickému vyšetření lze jako antigeny dále využít i další virové proteiny. Nsp7 protein je produkován pouze u zvířat, která byla infikována terénním kmenem viru nebo vakcinována živou atenuovanou vakcínou. Protilátky proti tomuto proteinu tedy lze využít k odlišení zvířat, která byly vakcinována inaktivovanou vakcínou (tato budou ORF7 pozitivní, Nsp7 negativní) od zvířat infikovaných nebo vakcinovaných živou atenuovanou vakcínou (budou ORF7 pozitivní, Nsp7 pozitivní). Kombinace obou virových antigenů (ORF7 a Nsp7) zvyšuje citlivost i specifitu sérologického vyšetření. Ke konfirmaci výsledků získaných ELISA testem lze využít např. vysoce specifický nepřímý imunofluorescenční test nebo virus neutralizační test. 13

Přímý průkaz viru RT-PCR Vyšetřením lze prokázat živý virus a to od 4-5 dní po infekci (v závislosti na velikosti infekční dávky). Vyšetřovanými vzorky jsou především sérum, lymfatické uzliny, slezina, plíce, seškraby mandlí, tkáně zmetků, semeno. qrt-pcr test Umožňuje nejen detekci ale také kvantifikaci viru, je považován za citlivější a specifičtější než prosté RT-PCR vyšetření. Sekvenování (ORF5 oblasti genomu viru) je nezbytným zdrojem informací o viru nalezeném RT-PCR testem. Kromě konfirmace specificity RT-PCR testu je nezbytným prostředkem při odlišení vakcinačních a terénních kmenů viru a umožňuje stanovit genetickou příbuznost různých kmenů viru. Množství odebíraných vzorků a věkové kategorie Množství odebíraných vzorků při identifikaci PRRS pozitivního chovu je závislé na velikosti chovu a předpokládané prevalenci infikovaných zvířat v chovu. Následující tabulka vyjadřuje nezbytný počet vyšetřených zvířat abychom s jistou mírou pravděpodobnosti (konfidenční hodnoty) identifikovali pozitivní zvířata v chovu s danou prevalencí (1%, 5%, 10%, 30%...) v chovu s 500 zvířaty. Konfidenční hodnoty 80% 95% 99% 1% 162 302 463 5% 32 60 91 10% 16 29 45 30% 5 9 14 Tab. 3: Počty a charakter odebíraných vzorků při monitorování ozdravovaného chovu Typ chovu PRRS statut Věk zvířat Frekvence Typ vzorku Počet vzorků Dg. test Produkce selat (do odstavu) negativní Prasnice a prasničky čtvrtletně Sérum 10-30 ELISA Stabilní nebo pozitivní Odstavená selata měsíčně Sérum 30-60 PCR + sekvenování Produkce selat (do výkrmu) negativní Prasnice a prasničky čtvrtletně Sérum 10-30 ELISA Stabilní nebo pozitivní 10 týdenní selata měsíčně Sérum nebo sliny 10-30 30-60 PCR + sekvenování Porodna nebo výkrm negativní 4 týdny po naskladnění nebo pobytu Sérum nebo sliny 10-30 nebo 1-4 provazy ELISA pozitivní Sérum nebo sliny 10-30 nebo 1-4 provazy PCR + sekvenování 14

Cirkovirová onemocnění Klinické projevy. Cirkovirus prasat typ 2 (PCV2) vyvolává u prasete většinou subklinické infekce spojené s nízkou virémií a sérokonverzí. Za určitých okolností (imunomodulační faktor, stres, současná infekce virem PRRS nebo parvovirem prasat) se však tato infekce může stát klinicky manifestní a vyvolat onemocnění, jež nazýváme Cirkovirovým onemocněním prasat. Toto onemocnění se může projevovat v několika různých klinických podobách. Ve věku 5-15 týdnů se setkáváme nejčastěji s tzv. syndromem PMWS (cirkovirové chřadnutí selat po odstavu), které se projevuje jako chřadnutí a lymfadenopatie. Častými příznaky jsou progresivní dyspnoe, anemie, žloutenka, průjem, ztráta chuti, ztráta hmotnosti a progredující kachexie, provázené zvýšenou tělesnou teplotou a kašlem. Charakteristická je nápadně bledá kůže a výrazně zvětšené mízní uzliny (především inguinální, mezenteriální, bronchiální a mediastinální). Typické je, že současně onemocní pouze několik selat v kotci. Dalším známým syndromem pak je PDNS (syndrom dermatitidy a nefropatie), jež se však v kontinentální Evropě vyskytuje jen výjimečně. Zvířata jsou apatická, subfebrilní, bez chuti k příjmu potravy, obtížně dýchají. Charakteristická je též rychlá ztráta hmotnosti a strnulá chůze (důsledek postižení CNS). Nejvýraznějším a nejčastějším příznakem je výskyt skvrn různých velikostí, lokalizovaných na kůži hrudi, kýty a vnitřní strany stehen. Zbarvení těchto skvrn může být tmavě červené až fialové a jsou zvláště patrné u anemických prasat. Skvrny mohou splývat a časem je kůže pokryta krustou tmavé barvy. Tyto léze vznikají pravděpodobně v důsledku ukládání imunokomplexů v ledvinných glomerulech a stěně postižených cév. Reprodukční onemocnění se projevuje zvyšujícím se procentem předčasně narozených selat a selat s nízkou vitalitou, ale mohou se vyskytovat též aborty nebo mumifikace plodů. Patogeneze: Základní způsoby šíření infekce zůstávají zatím neznámé. Za hlavní mechanismus je považován kontakt mezi zdravým a nemocným zvířetem. Inkubační doba onemocnění se pohybuje kolem 7 10 dnů. Virus je vylučován do vnějšího prostředí především močí, ale také trusem a nosními sekrety12. Maximum vylučování viru nastává mezi 3. 13. dnem po infekci. Prokázáno bylo vylučování viru semenem infikovaných kanců a intrauterinní přenos infekce. Cirkoviry jsou v organismu lokalizovány především v lymfatické tkáni (mandle, slezina, brzlík), plicích, játrech a ledvinách. Jejich množení v těchto orgánech je provázeno snižováním počtu lymfocytů, deplecí lymfatických folikulů s následnou imunosupresí. K diseminaci viru v organismu dochází pravděpodobně prostřednictvím infikovaných monocytů. Patologické nálezy: Patologické změny jsou v případě onemocnění PMWS poměrně variabilní 5, 9, 10. Mízní uzliny jsou zvětšené, na řezu světlé a homogenní. Jsou infiltrovány histiocyty a multinukleárními buňkami, častá je deplece lymatických folikulů. V mononukleárních a dendritických buňkách pozorujeme intracytoplazmatické inkluze. Podobné změny jsou patrné ve slezině a Peyerových placích. Na povrchu plic pozorujeme světlé skvrny, plíce nekolabují. Typická je multifokální lymfohistiocytická až diseminovaná, granulomatózní intersticiální pneumonie. Častá je přítomnost multinukleárních buněk. Játra jsou fibrózní, mohou být ikterická, někdy výrazně atrofická s prominující interlobulární pojivovou tkání. Histologicky pozorujeme lymfohistiocytární infiltraci a nekrózu. Ledviny jsou zvětšené, často jsou edematózní, pozorujeme chronickou intersticiální nefritis. Histologicky jsou patrné multifokální až difúzní lymfohistiocytární a eosinofilní infiltrace. 15

Patologické změny v případě onemocnění PDNS se nejčastěji vyskytují na kůži, plicích, ledvinách a mízních uzlinách. Histologické změny jsou podobné změnám pozorovaným v případě PMWS s některými odchylkami. Ledviny jsou zvětšené, bledé, s petechiálními hemorrhagiemi v ledvinné koře. Lymfatické uzliny jsou zvětšené a mají tmavě červené zabarvení. Toto zabarvení je omezeno na subkapsulární a medulární sinusy a vzniká patrně spíše v důsledku jejich překrvení, než v důsledku přítomnosti hemorrhagií. U případů PDNS dále pozorujeme serózní výpotek v břišní dutině, podkožní edém a zvýšené množství synoviální tekutiny. Sporadicky se vyskytují infarkty sleziny. V mnoha orgánech pozorujeme nekrotizující vaskulitidu postihující malé až střední artérie a kapiláry. Vaskulitidu pozorujeme téměř ve všech orgánech včetně kůže, kde je patrně příčinou pozorovaných kožních změn. Ve slezině je pak příčinou již zmiňovaných infarktů. Patologické změny na mízních uzlinách, ledvinách a slezině, které pozorujeme u onemocnění PDNS jsou do jisté míry podobné změnám u klasického moru prasat, který je nutno diferenciálně diagnosticky vyloučit. Stanovení diagnózy syndromu PMWS je založeno na kombinaci klinického vyšetření, patologicko-morfologického vyšetření, imunohistochemického vyšetření a průkazu viru kvantitativním testem. Sérologické vyšetření je nutno považovat pouze za doplňkové vyšetření, umožňuje pouze sledovat účinnost vakcinace nebo stanovením poměru IgG a IgM protilátek orientačně stanovit věkovou kategorii, ve které kulminuje PCV2 virémie. Laboratorní diagnostika PMWS K stanovení diagnózy je nutno vyšetřit nejméně 5 selat ve věku 5-12 týdnů. K vyšetření lze nejlépe použít krev, krevní sérum pro kvantifikaci viru a dále mízní uzliny (inguinální, mezenteriální) nebo slezina pro histologické a imunohistochemické vyšetření. Kvantifikace viru je prováděna qpcr testem z krevního séra. Je dokumentována korelace mezi klinickou manifestací PMWS onemocnění a virémií s více než 10e7 virových partikulí v 1ml séra. Průkaz méně než 10e5 partikulí na 1ml séra je považován za subklinickou infekci. Klinické vyšetření zpravidla prokáže neprospívání selete, polypnoe až dyspnoe, anemický vzhled, v některých případech průjem nebo žloutenka. Patologické vyšetření prokáže většinou (ne však vždy) výrazně zvětšené mízní uzliny (především inguinální nebo mezenteriální). Zásadní je však imunohistochemické a histologické vyšetření které je prováděno na tkáni mízních uzlin nebo sleziny. Vyšetření v případě syndromu PMWS prokáže významnou lymfodepleci a histiocytární infiltraci a výraznou koncentraci PCV2 antigenu v tkáni mízních uzlin. PDNS Syndrom dermatitidy a nefropatie prasat se v ČR vyskytuje velmi ojediněle. Charakteristický je u tohoto syndromu výskyt kruhovým ložisek tmavě červené barvy na pánevních končetinách, břichu, ale i jiných částí těla a hemoragií na serózách a parenchymatických orgánech. Mikroskopicky nalézáme nehnisavou vaskulitidu a multifokální nehnisavou intersticiální nefritidu. Původ těchto změn je pravděpodobně důsledkem ukládání imunokomplexů. Tyto změny však nejsou specifické jen pro toto cirkovirové onemocnění. Pro diagnostiku této formy onemocnění jsou důležitá dvě kritéria: Přítomnost hemorrhagických a nekrotizujících kožních lézí na pánevních končetinách, perineu, zvětšené světlé ledviny s mnohočetnými petechiemi Přítomnost systémové nekrotizující vaskulitidy a nekrotizující a fibrinózní glomerulonefritidy. Průkaz cirkoviru nebo PCV2 specifických protilátek není pro stanovení diagnózy rozhodující. 16

Reprodukční problémy v důsledku PCV2 onemocnění In utero infekce virem PCV2 je většinou inaparentní, i když příčinná souvislost mezi tímto virem a různými typy reprodukčních problémů prasnic byla opakovaně dokumentována. Interpretace této formy onemocnění však vyžaduje mimořádnou obezřetnost a k uzavření diagnózy rozhodně nestačí samotný průkaz viru. Onemocnění bývá spojováno s aborty, předčasnými porody a mumifikacemi, takto získaný materiál je vhodný k provedení diagnostických testů. Průkaz viru nebo PCV2 specifických protilátek u prasnice není směrodatný. Diagnostickými kritérii jsou především: Aborty v druhé polovině březosti, předčasné porody Fibrinózní nebo nekrotizující myokarditida u potracených plodů Imunohistochemický průkaz velkých koncentrací PCV2 v myokardiálních lézích Subklinická infekce Ještě problematičtější je vyhodnocení situace v chovu jako probíhající subklinická infekce vzhledem k ubikvitární přítomnosti viru. Na sublinickou infekci můžeme velmi opatrně usuzovat při těchto splnění následujících kritérií Nepřítomnost klinických příznaků Žádné nebo minimální histopatologické léze Malé množství viru v lymfatické tkáni Vyhodnocení situace však vyžaduje vzít do úvahy epidemiologickou situaci, parametry užitkovosti v dlouhodobém horizontu Chřipka prasat Inkubační doba: Je velmi krátká a pohybuje se od 12 do 78 hodin. Klinické projevy: Obvykle se popisuje náhlý vznik a akutní průběh při prvním průniku původce do stáda. Pokud se virus v chovu vyskytuje endemicky a cirkuluje, klinické příznaky onemocnění nemusí být výrazné. Při infekci subpopulace prasat bez protilátek se objevuje zvýšená teplota, kašlání, ztížené dýchání, příjem krmiva se snižuje jen u některých zvířat s těžším průběhem infekce, jako jsou prasnice po porodu. Při průniku nového viru do stáda dochází ke klinickým projevům chřipky zejména u prasnic na březárnách a porodnách. Prasnice leží, vykazují depresi s výrazným nechutenstvím. Mají zvýšenou teplotu, pneumonii, ztíženého dýchání, krátký suchý kašel, při poslechu je patrná pneumonie. Tyto příznaky přetrvávají po dobu 7 dnů. U březích prasnic dochází k abortům v pozdní fázi gravidity nebo k opožděným porodům s mrtvě rozenými selaty. Prasnice infikované na porodně, vykazují nízké procento zabřezávání. Odstavená selata a prasata na předvýkrmech postižená chřipkou obtížně dýchají. Frekvence dechů je zrychlená, objevuje se dýchavičnost s kašlem při pohybu, teplota je zvýšená, deprese dosahuje středního stupně. K úhynu obvykle nedochází u nekomplikované formy, kdy nevzniká ko-infekce. U nejcitlivější kategorie, kterou jsou selata po odstavu (ve věku 7 týdnů) se však objeví zvýšené procento úhynů v případě smíšené infekce s jinými původci infekcí dýchadel (virus PRRS, A. pleuropneumoniae, H. parasuis), nebo dokonce sepsí (Salmonella spp.). Patologické nálezy: V nekomplikované formě dochází k intersticiální pneumonii postihující plíce v různém rozsahu, nejčastěji apikální laloky. Odběr materiálu pro laboratorní diagnostiku A. Monitoring ve stádě negativním. Pokud se stádo nevakcinuje, je vhodné provést sérologická vyšetření prasnic po odstavu a selat v době odstavu a později po 4 týdnech minimálně 1x, lépe 2x v roce. 17

B. Podezření z infekce virem influenzy A V případě akutního onemocnění s typickou dramatickou klinickou manifestací je nejvhodnějším způsobem stanovení diagnózy izolace viru. Pro tyto účely odebíráme hluboké nosní stěry nebo odebíráme čerstvé vzorky plicního parenchymu od alespoň 5 zvířat manifestujících klinické příznaky a zvýšenou tělesnou teplotu, vždy u zvířat u nichž tyto příznaky netrvají déle než 48 hodin. Nově probíhající infekci může potvrdit průkaz sérokonverze typově specifických protilátek. Proto je nutné odebrat vzorky krve při vzniku onemocnění a potom opakovaně (po 2 až 3 týdnech) u jedinců s příznaky chřipky. V případě endemického onemocnění volíme k potvrzení diagnózy detekci virus specifických protilátek v párových vzorcích sér. Tato séra odebíráme v intervalu 2-3 týdnů od 10-20 zvířat a to různých věkových kategorií aby bylo možné stanovit způsob cirkulace viru v chovu. Nejméně čtyřnásobný vzestup titru protilátek v těchto sérech indikuje nedávnou infekci. Izolaci viru z nosních stěrů v případě endemického výskytu viru volíme až jako dodatečnou možnost směřující hlavně k detailní typizaci cirkulujícího viru. Pleuropneumonie prasat Doba inkubace: Je rozdílná podle virulence kmenů i v rámci sérovarů. Pohybuje se od 3 hodin do několika dnů. Klinické projevy: Závisí na virulenci kmenů a dalších faktorech. Onemocnění probíhá v perakutní, akutní a chronické formě. Při perakutním průběhu prasata leží, nebo sedí, mají cyanoticky zbarvenou kůži rypáku, uší a končetin. Těžce dýchají tlamou a z nosních dutin se uvolňuje zpěněný výtok (podobný holicí pěně) načervenalé barvy. Pro akutní průběh je charakteristická horečka, těžké dýchání s kašlem a ztrátou kondice během jednoho dne a odmítání pohybu. Dochází ke kardiovaskulárnímu selhání a úhynu. Chronická forma se objevuje u jedinců, kteří přečkali akutní stádium. Jsou většinou bez horečky, příznačný je kašel různé frekvence a intenzity. Patologické nálezy: Patologické změny zjištěné na plicích mají větší význam pro stanovení diagnózy než klinické příznaky a závisí na virulenci kmene a vnímavosti jedince. Pro peraktuní průběh je charakteristický výskyt zpěněné tekutiny růžové až načervenalé barvy v dýchacích cestách. V plicích se nachází červenofialová ložiska o průměru několika centimetrů bez fibrinu. Pro akutní formu onemocnění je charakteristický výskyt fibrinových nálepů na pleuře a různý objem tekutiny zbarvené krví v hrudníku. Pro chronickou formu jsou charakteristické srůsty poplicnice a pohrudnice v různém rozsahu. Následkem toho nelze plíce snadno vyjmout z hrudního koše. Odběr materiálu pro laboratorní diagnostiku. A. Monitoring ve stádě prostém. Sleduje nepřítomnost typově specifických protilátek ELISA testem u co nejstarších skupin prasat ve stádě. Pozitivní výsledek testů je považován za důkaz kontaktu zvířat stáda s původcem. ELISA test je testem stádovým nikoliv individuálním. Sérologická diagnostika (ELISA) k průkazu specifických protilátek v krevním séru je založena na detekci protilátek proti toxinu ApxIV, který produkují všechny kmeny A. pleuropneumoniae nebo proti kapsulárním polysacharidům A. pleuropneumoniae, které jsou specifické pro určité skupiny sérotypů. Sérologická pozitivita zjištěná při monitorování však může být i nespecifická v důsledku infekce prasat příbuzným druhem Actinobacillus suis. B. Podezření z infekce. Klinické příznaky jsou nespecifické, zřejmá je vysoká horečka, ztížené dýchání, cyanóza rypáku a uší, krvavý zpěněný výtok z nosu, následovaný náhlým úhynem v důsledku septikémie. Vzhledem k tomu, že klinický ani patologický obraz není pro pleuropneumonii typický, je třeba nález patologických změn plic u 18