HOLOTYPE HLA 96/11 KONFIGURACE A & CE A KONFIGURACE B & CE (REF: H32 A REF: H34) NÁVOD K POUŽITÍ VERZE 1 2.5.2018 Pro diagnostické použití in vitro 0086 Příprava DNA pro sekvenční analýzu na Illumina MiSeq
Obsah INFORMACE O VÝROBCI... 7 KLÍČ K SYMBOLŮM... 7 OBSAH SOUPRAVY HOLOTYPE HLA-96/11 KONFIGURACE A & CE (REF:H32) NEBO KONFIGURACE B & CE (REF:H34)... 8 KRABIČKA S PRIMEROVÝMI KOMPONENTAMI... 8 KRABIČKA S REAGENCIEMI PRO PŘÍPRAVU KNIHOVNY... 8 96-WELL ADAPTOR PLATE (96JAMKOVÁ INDEXOVANÁ ADAPTÉROVÁ DESTIČKA)... 9 SEŠIT APLIKACE EXCEL... 9 SOFTWARE OMIXON HLA TWIN... 9 DOPRAVA A SKLADOVÁNÍ... 9 VAROVÁNÍ A OPATŘENÍ... 10 ZNÁMÁ OMEZENÍ PRODUKTU... 10 BEZPEČNOSTNÍ INFORMACE... 10 VÝKONNOSTNÍ PARAMETRY... 11 TECHNICKÁ PODPORA... 11 Podpora na telefonu:... 11 ZAŘÍZENÍ, REAGENCIE A SPOTŘEBNÍ MATERIÁL... 12 TECHNICKÁ DOPORUČENÍ A DOPORUČENÍ TÝKAJÍCÍ SE ZAŘÍZENÍ... 12 PŘIDRUŽENÁ DOPORUČENÍ TÝKAJÍCÍ SE REAGENCIÍ... 12 Kapacita soupravy reagencií MiSeq... 13 DOPORUČENÝ SPOTŘEBNÍ MATERIÁL... 13 PRÁVNÍ UPOZORNĚNÍ... 14 PŘEDPOKLÁDANÉ POUŽITÍ... 14 DŮLEŽITÉ UPOZORNĚNÍ PŘED SPUŠTĚNÍM... 15 DOPORUČENÁ IZOLACE GENOMOVÉ DNA... 15 PRINCIP METODY... 15 PŘEHLED KROKŮ... 17 SLOVNÍČEK/DEFINICE... 18 KROK 1 PŘÍPRAVA MASTER MIXU HLA ZESÍLENÍ... 19 SEZNAM REAGENCIÍ... 19 PROTOKOL... 19 Master mix: HLA-A, B, C, DRB1/DRB3, DRB5, DPA1, DPB1 a DQA1... 20 Master mix: HLA-DRB4... 20 Master mix: HLA-DQB1 sada 3... 20 KROK 2 ZESÍLENÍ HLA TŘÍDY I A II... 21 SEZNAM REAGENCIÍ... 21 PROTOKOL... 21 Master mix s Taq polymerázou: HLA-A, B, C, DRB1/3, DRB4, DRB5, DPA1, DPB1 a DQA1... 22 Master mix s Taq polymerázou: HLA-DQB1 sada 3... 22 Strana 2 49
Zesílení třídy I (HLA-A, B a C)... 22 Zesílení třídy II (HLA-DRB1/DRB3, DRB4, DRB5, DPA1, DPB1, DQA1 a DQB1)... 23 Očekávané velikosti amplikonu... 23 KROK 3 KVANTIFIKACE A NORMALIZACE AMPLIKONU (POMOCÍ DESTIČKOVÉHO FLUOROMETRU)... 24 SEZNAM REAGENCIÍ... 24 PROTOKOL... 25 Směšování amplikonů... 26 Purifikace PCR ExoSAP-iT Express... 26 KROK 4 PŘÍPRAVA KNIHOVNY... 27 SEZNAM REAGENCIÍ... 27 PROTOKOL... 27 Fragmentační master mix... 28 Fragmentační program... 28 Master mix opravy konců... 29 Program opravy konců... 29 Ligační master mix... 30 Ligační program... 30 Směšování a čištění knihovny... 31 KROK 5 VÝBĚR VELIKOSTI KNIHOVNY... 33 SEZNAM REAGENCIÍ... 33 PROTOKOL... 33 KROK 6 KVANTIFIKACE KNIHOVNY POMOCÍ PŘÍSTROJE QPCR... 34 SEZNAM REAGENCIÍ... 34 PROTOKOL... 34 Směs primerů qpcr... 34 Master mix qpcr... 35 KROK 7 SEKVENOVÁNÍ NA ILLUMINA MISEQ... 37 SEZNAM REAGENCIÍ... 37 Kapacita soupravy reagencií MiSeq... 37 PROTOKOL... 37 KROK 8 ANALÝZA SEKVENČNÍCH DAT HLA... 39 AUTOMATIZOVANÝ PROTOKOL... 39 Nastavení a konfigurace IT... 39 Protokol jednotlivých analýz... 39 MANUÁLNÍ SERVEROVÝ PROTOKOL... 39 Nastavení a konfigurace IT... 39 Protokol jednotlivých analýz... 39 MANUÁLNÍ PROTOKOL DESKTOP... 39 Nastavení a konfigurace IT... 39 Protokol jednotlivých analýz... 40 DOPLŇKOVÉ OBRÁZKY... 41 PŘÍKLADY AMPLIKONOVÝCH DESTIČEK, ZESILOVACÍ DESTIČKA, AMPLIKONOVÝCH KVANTIFIKAČNÍCH DESTIČEK (PRO JEDNOTLIVÉ LOKUSY) A REAKČNÍCH DESTIČEK... 41 PŘÍKLAD KVANTIFIKAČNÍ DESTIČKY STANDARDŮ... 41 PŘÍKLAD KVANTIFIKAČNÍ DESTIČKY QPCR KNIHOVNY KAPA... 42 Strana 3 49
PŘÍLOHA 1: PIPPIN PREP... 43 PROGRAMOVÁNÍ PIPPIN PREP... 43 SPUŠTĚNÍ PIPPIN PREP... 43 PŘÍLOHA 2: KVANTIFIKACE AMPLIKONU POMOCÍ PŘÍSTROJE QPCR... 46 SEZNAM REAGENCIÍ... 46 PROTOKOL... 46 PŘÍLOHA 3: KVANTIFIKACE KNIHOVNY POMOCÍ INTERKALAČNÍHO FLUORESCENČNÍHO BARVIVA DSDNA 48 SEZNAM REAGENCIÍ... 48 PROTOKOL... 48 Strana 4 49
Historie dokumentu důležité poznámky a aktualizace Verze Datum Autor Přehled změn Schválil Datum vydání V1 14.12.2017 Tünde Vágó první verze Efi Melista 2.5.2018 Strana 5 49
Odmítnutí odpovědnosti Společnost Omixon vyvinula veškeré úsilí, aby zajistila přesnost tohoto Návodu k použití (IFU). Společnost Omixon odmítá odpovědnost za případné nepřesnosti nebo opomenutí, ke kterým mohlo dojít. Informace v tomto IFU mohou být změněny bez předchozího upozornění. Společnost Omixon nenese žádnou odpovědnost za případné nepřesnosti v tomto IFU. Společnost Omixon si vyhrazuje právo vylepšit tento IFU a/nebo produkty popsané v tomto IFU kdykoli a bez upozornění. Pokud v této příručce naleznete informace, které jsou nesprávné, zavádějící nebo neúplné, ocenili bychom vaše připomínky a návrhy. Zašlete je prosím na adresu support@omixon.com. Strana 6 49
Informace o výrobci Název společnosti: Omixon Biocomputing Ltd Adresa pro návštěvy: Fehérvári út 50-52/6 Město: Budapešť Poštovní směrovací číslo: H-1117 Země: Maďarsko Klíč k symbolům Číslo šarže Referenční/katalogové číslo Přečtěte si Návod k použití Obsahuje reagencii pro N testů Legální výrobce. Datum spolu s tímto symbolem odkazuje na datum výroby Doporučená skladovací teplota Datum exspirace In vitro diagnostické zdravotnické zařízení Náhradní komponenta Obsahuje náhradní komponentu Strana 7 49
Obsah soupravy Holotype HLA-96/11 Konfigurace A & CE (REF:H32) nebo Konfigurace B & CE (REF:H34) Krabička s primerovými komponentami Primerová komponenta poskytuje specifické roztoky primerů připravené k okamžitému použití pro cílené LR-PCR zesílení genů HLA A, B, C, DRB1, DRB3, DRB4, DRB5, DPA, DPB1, DQA1 a DQB1. Dále obsahuje také dva typy aditiv PCR (Enhancer 1 a Enhancer 2). Směs primerů REF č. Rxns Objem/ zkumavka Počet zkumavek Barevný kód HLA-A P012 96 220 µl 1 Žlutá HLA-B P022 96 220 µl 1 Červená HLA-C P032 96 220 µl 1 Oranžová HLA-DRB1/3 P042 96 220 µl 1 Zelená HLA-DRB4 P072 96 220 µl 1 Bílá HLA-DRB5 P112 96 220 µl 1 Růžová HLA-DPA1 P132 96 220 µl 1 Černá HLA-DPB1 P072 96 220 µl 1 Fialová HLA-DQA1 P082 96 220 µl 1 Hnědá HLA-DQB1 (sada 3) P122 96 220 µl 1 Modrá Enhancer 1 E01 96 1100 µl 1 Průhledná Enhancer 2 E02 96 300 µl 1 Průhledná Krabička s reagenciemi pro přípravu knihovny Krabička s reagenciemi pro přípravu knihovny poskytuje reagencie pro přípravu knihovny (fragmentace, tupě zakončuje a adenyluje konce amplikonů a liguje k nim indexované adaptérové sekvence) z amplikonů HLA. Reagencie REF č. Rxns Objem/ zkumavka Počet zkumavek Barevný kód Fragmentační enzym (A) R11 96 278 µl 1 Žlutá Fragmentační pufr (B) R21 96 278 µl 1 Červená Enzym opravy konců (C) R31 96 162 µl 1 Zelená Pufr opravy konců (D) R41 96 324 µl 1 Oranžová Ligační enzym (E) R51 96 324 µl 1 Modrá Ligační pufr (F) R61 96 1800 µl 2 Černá Strana 8 49
96-well Adaptor Plate (96jamková indexovaná adaptérová destička) Komponenta 96jamkové indexované adaptérové destičky obsahuje indexované NGS adaptéry (dvouvláknové DNA oligonukleotidy) v 5 µl roztoku připravené k okamžitému použití pro generování jednotlivých NGS knihoven. 96jamková indexovaná adaptérová destička obsahuje dostatečné množství indexovaných adaptérů pro generaci 96 samostatných NGS knihoven a pro downstreamovou identifikaci vzorků. Verze soupravy Reagencie REF č. Rxns Objem/ jamka Počet destiček H32 Adaptérová destička A (i1-96) N1 96 5 µl 1 H34 Adaptérová destička B (i97-192) N2 96 5 µl 1 Sešit aplikace Excel Sešit aplikace Excel je k dispozici, aby podporoval protokol Holotype HLA 96/11 pomocí výpočtů, rozložením destiček, vedením záznamů, generováním listu vzorků MiSeq a mnoho dalšího. Pokud jeho kopii nemáte, kontaktujte prosím support@omixon.com. Software Omixon HLA Twin Kvůli kreditům Omixon HLA Twin spojeným s vaším nákupem soupravy Holotype HLA 96/11 kontaktujte sales@omixon.com. Důležitá poznámka: Používejte všechny tři komponenty soupravy Omixon Holotype HLA 96/11 a software Omixon HLA Twin ve stejném pracovním postupu, abyste vytvořili pracovní postup pro diagnostiku in vitro. Přečtěte si část Upozornění a bezpečnostní opatření týkající se omezení použití produktu. Náhradní komponenty jsou k dispozici na základě zvláštního požadavku uživatele. Vezměte prosím na vědomí, že společnost Omixon zajišťuje pouze výměnu krabiček s komponentami, nikoli jednotlivých lahviček. Pro více informací kontaktujte sales@omixon.com. Doprava a skladování Dodávají se v baleních se suchým ledem v přepravním boxu z polystyrénu Styrofoam a po příjezdu je třeba je skladovat při teplotě -20 C. Ověřte prosím regulaci teploty a proces monitorování vašich mrazniček a pravidelně je udržujte. Neotevřené soupravy jsou stabilní až do data exspirace soupravy (napsané na štítku sady), pokud jsou skladovány při teplotě -20 C. Po otevření produktu se doporučuje provést maximálně čtyři (4) cykly zmrazení/rozmrazení, aby se zajistila stabilita produktu. Otevřené soupravy jsou při skladování při -20 C stabilní až 3 měsíce. Strana 9 49
Varování a opatření Omezení použití produktu Pro dosažení nejlepšího výkonu prosím použijte pracovní postup soupravy Holotype HLA 24/7 a software Omixon HLA Twin pro HLA typizaci NGS s materiály, reagenciemi a vybavením doporučeným v sekci Vybavení a reagencie. Použití jiných materiálů, než které jsou uvedeny v části Vybavení a reagencie, musí uživatel ověřit a potvrdit. Reagencie nerekonstruujte ani neřeďte v jiných objemech, než jak je popsáno v tomto IFU. Nepoužívejte menší objem reagencií, než jak je uvedeno v tomto IFU. Takové aktivity mohou vést k chybám ve výkonu. Společnost Omixon nemůže poskytnout podporu v případě jakýchkoli problémů vyplývajících z nedodržení kroků protokolu popsaných v tomto IFU. Nepoužívejte tento produkt v případě, že dojde ke zjevnému poškození jeho komponent (rozbité lahvičky, destičky, volné uzávěry apod.). Známá omezení produktu Informace o známých nejednoznačnostech a známém omezení softwaru produktu Holotype HLA naleznete v dokumentu Product Known Limitations Guide (Průvodce známými omezeními produktu). Průvodce je distribuován s IFU, ale lze jej také nalézt na webové stránce společnosti Omixon pod MyHolotype/Support and Services/HLA Twin Instructions for Use, nebo si jej můžete vyžádat na adrese support@omixon.com. Bezpečnostní informace Před spuštěním si přečtěte sekce Bezpečnostní informace a Důležité poznámky všech reagencí nebo souprav uvedených v části Zařízení, reagencie a spotřební materiál. Při práci s chemikáliemi vždy noste vhodný laboratorní plášť, jednorázové rukavice a ochranné brýle. Další informace naleznete v příslušných bezpečnostních listech (SDS) dostupných u konkrétního dodavatele produktu. Přehled chemických komponent reagencií produktu naleznete v bezpečnostních listech soupravy Holotype HLA 96/11 a jsou k dispozici na vyžádání. Komponenty produktu likvidujte jako obecný zdravotnický odpad. Strana 10 49
Výkonnostní parametry Stanovené hlavní výkonnostní parametry podle ověření produktu. HLA-A HLA-B HLA-DRB1 HLA-C HLA-DPB1 HLA-DQA1 HLA-DQB1 Citlivost 99,054 % 99,171 % 98,335 % 96,310 % 98,818 % 98,927 % 95,724 % Specificita 99,966 % 99,982 % 99,956 % 99,863 % 99,946 % 99,881 % 99,775 % Přesnost 99,054 % 99,171 % 98,335 % 96,310 % 98,818 % 98,927 % 95,724 % Správnost 99,935 % 99,965 % 99,915 % 99,736 % 99,897 % 99,785 % 99,572 % Reprodukovatelnost 100,00 % 100,00 % 99,28 % 100,00 % 99,28 % 100,00 % 99,28 % Opakovatelnost 100,00 % 100,00 % 100,00 % 100,00 % 100,00 % 100,00 % 100,00 % Technická podpora Pokud potřebujete všeobecnou pomoc s tímto protokolem, kontaktujte support@omixon.com Podpora na telefonu: Spojené státy +1 (617) 500-0790 Evropa +36 70 574 8001 Zbytek světa +1 (617) 500-0790 Strana 11 49
Zařízení, reagencie a spotřební materiál Technická doporučení a doporučení týkající se zařízení Termocykler s 96jamkovým formátem Destičkový fluorometr (nebo jakýkoliv přístroj schopný detekovat fluorescenci ve 96jamkovém formátu destičky, pro použití se systémem Promega QuantiFluor dsdna) Pippin Prep (kat. č. PIP0001) nebo Blue Pippin (kat. č. BLU0001) od společnosti SAGE Science přístroj qpcr s 96 nebo 384jamkovým formátem destičky Qubit fluorometr (kat. č. Q33216, Thermo Fisher Scientific) (volitelný) Illumina MiSeq (kat. č. SY-410-1003) 64bitový počítač s minimálně 4 jádry a 16 GB paměti RAM Dlouhodobé úložiště dat (přibližně 2 TB dat na MiSeq za rok) Přidružená doporučení týkající se reagencií Soupravy pro LongRange PCR společnosti Qiagen (kat. č. 206401, 206402 nebo 206403) Každý vzorek vyžaduje 4,4 µl Taq polymerázy Kat. č. 206401 souprava LongRange PCR (20) obsahuje 8 µl Taq polymerázy Kat. č. 206402 souprava LongRange PCR (100) obsahuje 40 µl Taq polymerázy Kat. č. 206403 souprava LongRange PCR (250) obsahuje 100 µl Taq polymerázy ExoSAP-IT od společnosti Affymetrix (kat. č.75001-200, 75001-1ML, 75001-4X-1ML nebo 75001-10ML) Každý směsný vzorek vyžaduje 4 µl enzymu ExoSAP-IT Kat. č. 75001-200 obsahuje 200 µl enzymu ExoSAP-IT Express Kat. č. 75001-1-ML obsahuje 1 ml enzymu ExoSAP-IT Express Kat. č. 75001-4X-1ML obsahuje 4 ml enzymu ExoSAP-IT Express Kat. č. 75001-10ML obsahuje 10 ml enzymu ExoSAP-IT Express Library Quantification Kit (souprava kvantifikace knihovny) Illumina/Universal od společnosti KAPA Biosystems (kat. č. KK4824) Souprava Qubit dsdna BR Assay Kit (kat. č. Q32850 nebo Q32853) (volitelná) Kat. č. Q32850 obsahuje 100 testů Kat. č. Q32853 obsahuje 500 testů Systém QuantiFluor dsdna od společnosti Promega (kat. č. E2670) Kuličky Agencourt AMPure XP beads od společnosti Beckman Coulter (kat. č. A63880, A63881, nebo A63882) Každý pracovní cyklus Holotype HLA vyžaduje maximálně 900 µl kuliček AMpure XP beads. Kat. č. A63880 obsahuje 5 ml kuliček AMPure XP beads Kat. č. A63881 obsahuje 60 ml kuliček AMPure XP beads Kat. č. A63882 obsahuje 450 ml kuliček AMPure XP beads Gelová kazeta, 1,5% agaróza, bez barviv s vnitřním standardem (Marker K/R2), pro Pippin Prep/Blue Pippin (kat. č. CDF1510 pro Pippin Prep a BDF1510 pro Blue Pippin) Strana 12 49
Ultračistý ethanol (bezvodý alkohol) Ultračistá voda (bez DNázy a RNázy) Hydroxid sodný 1 TE pufr (ph 8,0) Souprava reagencií MiSeq od společnosti Illumina Kapacita soupravy reagencií MiSeq Souprava reagencií Illumina MiSeq Cyklus Std 500 (MS-102-2003) Cyklus Std 300 (MS-102-2002) Cyklus Micro 300 (MS-103-1002) Cyklus Nano 500 (MS-103-1003) Cyklus Nano 300 (MS-103-1001) Čas Hodiny Vzorky 96/11 ~39 96 ~24 72 ~19 20 ~28 8 ~17 4 Doporučený spotřební materiál Mikrocentrifugační zkumavky o objemu 1,5 ml Mikrocentrifugační zkumavky se sníženou vazností o objemu 1,5 ml Mikrocentrifugační zkumavky se sníženou vazností o objemu 2,0 ml (doporučují se Eppendorf DNA LoBind kat. č. 022431048) Tenkostěnné trubičky o objemu 0,5 ml pro nástroj Qubit (doporučují se Qubit Assay tubes kat. č. Q32856) Pipety s nastavitelným objemem (kapacita 1,0 1000 µl) 8kanálové pipety s nastavitelným objemem (kapacita 1,0 100 µl) 96jamkové destičky kompatibilní s termocyklerem 96jamkové optické destičky kompatibilní s destičkovým fluorometrem 96jamkové destičky kompatibilní s qpcr nástrojem Těsnění na destičky pro všeobecné použití Těsnění na destičky kompatibilní s termocyklerem (testované pro LR-PCR) Těsnění na optické destičky kompatibilní s qpcr nástrojem (volitelné) Magnetický stojan kompatibilní s mikrocentrifugačními zkumavkami o objemu 2 ml 96jamkové chladicí stojany (2 kusy) Kónické zkumavky o objemu 50 ml Zásobníky o objemu 50 ml Strana 13 49
Právní upozornění Návod k použití pro Holotype HLA 96/11 a veškerý obsah je majetkem společnosti Omixon Biocomputing Limited ( Omixon ) a jsou určeny výhradně pro smluvní užívání zákazníkem s ohledem na zde popsaný(é) produkt(y) a nikoli na jiné účely. Tento dokument a jeho obsah se nesmí používat nebo distribuovat pro žádný jiný účel a/nebo nesmí být jinak sdělován, zveřejněn nebo reprodukován jakýmkoli způsobem bez předchozího písemného souhlasu společnosti Omixon. Společnost Omixon tímto dokumentem neposkytuje žádnou licenci na základě patentu, ochranné známky, autorských práv nebo společných práv ani obdobných práv jakýchkoli třetích osob. Licence na Omixon HLA Twin ( Software ) je zákazníkovi poskytnuta za obchodních podmínek Omixon HLA Twin EULA (www.omixon.com/hla-twin-eula/). Pokud se zde uvedenými obchodními podmínkami nesouhlasíte, společnost Omixon vám na Software neposkytne licenci a vy byste tento Software neměli používat ani instalovat. Pokyny uvedené v tomto dokumentu musí přísně a jednoznačně dodržovat kvalifikovaní a řádně vyškolení pracovníci, aby se zajistilo správné a bezpečné používání zde popsaného produktu (popsaných produktů). Před použitím tohoto produktu (těchto produktů) si musíte přečíst a pochopit veškerý obsah tohoto dokumentu. NEPŘEČTENÍ CELÉHO DOKUMENTU A NEDODRŽOVÁNÍ VŠECH ZDE UVEDENÝCH POKYNŮ MŮŽE VÉST K POŠKOZENÍ PRODUKTU(Ů), ZRANĚNÍ OSOB, VČETNĚ UŽIVATELŮ NEBO JINÝCH OSOB, A POŠKOZENÍ MAJETKU JINÝCH OSOB. SPOLEČNOST OMIXON NEPŘEBÍRÁ ŽÁDNOU ODPOVĚDNOST VYPLÝVAJÍCÍ Z NESPRÁVNÉHO POUŽITÍ ZDE POPSANÉHO PRODUKTU (POPSANÝCH PRODUKTŮ) (VČETNĚ JEHO ČÁSTÍ NEBO SOFTWARU) NEBO JAKÉHOKOLI POUŽITÍ TAKOVÉHO PRODUKTU (PRODUKTŮ) MIMO ROZSAH VÝSLOVNÝCH PÍSEMNÝCH LICENCÍ NEBO POVOLENÍ UDĚLENÝCH SPOLEČNOSTÍ OMIXON V SOUVISLOSTI S NABYTÍM TAKOVÉHO PRODUKTU (PRODUKTŮ) ODBĚRATELEM. PRO DIAGNOSTICKÉ POUŽITÍ IN VITRO 2017 Omixon Biocomputing Ltd. Všechna práva vyhrazena. Předpokládané použití Produkt Holotype HLA 96/11 Konfigurace A & CE a Konfigurace B & CE (dále jen Holotype HLA ) je kombinací in vitro diagnostických reagencií testu a softwaru pro analýzu dat (Omixon HLA Twin ) a je určen k identifikaci a definici lidských leukocytárních antigenů (HLA) třídy I a II a je určen pro použití při HLA typizaci s využitím platformy sekvenování nové generace Illumina MiSeq. Holotype HLA poskytuje pomocí lidské genomové DNA informace o histokompatibilitě lidských lokusů HLA třídy I (A, B a C) a třídy II (DPA1, DPB1, DQA1, DQB1, DRB1, DRB3, DRB4 a DRB5). Software Omixon HLA Twin obsažený v produktu Holotype HLA má interpretovat a spárovat se se sekvenčními daty generovanými systémem Illumina MiSeq, což vede k velmi přesné jednoprůchodové HLA typizaci na úrovni alely s velmi nízkou mírou nejednoznačnosti na úrovni pole 2. Strana 14 49
Produkt Holotype HLA je určen k in vitro diagnostickému použití odborným zdravotnickým personálem, jako jsou laboratorní technici a lékaři, kteří byli vyškoleni k HLA typizaci v diagnostických laboratořích akreditovaných EFI nebo ASHI nebo v laboratořích, které jsou schopny pracovat podle specifikací EFI nebo ASHI. Důležité upozornění před spuštěním Doporučená izolace genomové DNA Lidská genomová DNA by se měla připravit za použití dobře testovaných komerčně dostupných souprav pro přípravu DNA, aby byla zajištěna konzistence přípravku. Pro důkladný výkon testu se bez ohledu na přístup požaduje přesné stanovení koncentrace a čistoty. DNA nesmí obsahovat kontaminující látky, které mohou ovlivnit pozdější zesílení, přípravu knihovny a sekvenční kroky (např. alkohol, soli, detergenty, formaldehyd a heparin). Krev by se neměla odebírat do heparinizovaných zkumavek a vzorky krve od pacientů léčených heparinem a lipemické nebo hemolyzované vzorky by se neměly používat. Připravená genomová DNA se může použít ihned, pokud je připravena ve vodě prosté nukleáz nebo je skladována po delší dobu při teplotě -20 C nebo nižší. Pro přípravu gdna doporučujeme použít vodu, protože EDTA v pufru TE může inhibovat reakce LR-PCR. Aby se snížila míra degradace, měli byste se vyhnout opakovanému zmrazování a rozpouštění. K poskytnutí vstupní genomové DNA 100 150 ng na PCR zesílení se důrazně doporučuje koncentrace DNA 20 30 ng/µl. Pro stanovení koncentrace gdna důrazně doporučujeme použít metodu kvantitativní analýzy na základě fluorescence. Důrazně se doporučuje poměr absorbance 260 nm/280 nm a 260 nm/230 nm hodnot 1,7 2. Pro zesílení HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1/DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1 a HLA-DQB1 se vyžaduje 1,0 1,5 µg gdna. Princip metody Komunita HLA už mnoho let pracuje na tvorbě metody, která přesně identifikuje rozsáhlý polymorfismus genů HLA a jejich genových produktů. Nástup PCR, kombinovaného s dalšími technologiemi (sekvenování Sanger, SSOP, SSP, Luminex), poskytl vzorec pro významné zlepšení detekce HLA polymorfismu, avšak s několika omezeními, které nadále potlačují naši schopnost komplexně charakterizovat HLA geny. Technologie vyvinuté v průběhu posledních několika let, kumulativně nazvané sekvenování nové generace (NGS), poskytly nové možnosti, které umožňují komplexní charakterizaci HLA genů haploidním způsobem. NGS má dva typické rysy: 1) klonové sekvenování fragmentů DNA a 2) mimořádně vysokou propustnost. NGS poskytuje schopnost fázovat polymorfismy, čímž eliminuje veškeré nejednoznačnosti a poskytuje HLA typizaci na úrovni tří až čtyř úrovní bez reflexního testování, čímž přináší potenciálně úplné řešení problému HLA typizace. Zde popsaný protokol využívá tuto technologii a kombinuje zesílení HLA genů pomocí Strana 15 49
LR-PCR se sekvenováním na platformě Illumina MiSeq. Konkrétněji jsou HLA geny A, B, C, DPA1, DQA1 a DQB1 zesíleny pro celou jejich kódovací délku, včetně prvků 5' a 3' netranslatovaných oblastí, zatímco DRB1, DRB3 a DRB4 se zesilují z intronu 1 na intron 4 a DRB5 a DPB1 se zesilují z intronu 1 na 3' netranslatované oblasti. Amplikony jsou pak zpracovány prostřednictvím řady kroků, které: 1. Fragmentují amplikony na velikost vhodnou pro sekvenování na platformě Illumina, 2. Tupě zakončují a adenylují konce fragmentovaných amplikonů 3. Ligují adaptérové sekvence, které se používají v procesu na MiSeq, aby došlo k zachycení, zesílení a sekvenaci DNA. Adaptéry také obsahují index, což je krátká sekvence, jedinečná pro každý adaptér, která identifikuje počátky knihovny (vzorek/lokus). Po smísení indexovaných knihoven, výběru velikosti a kvantifikaci je vzorek umístěn na MiSeq pro sekvenování. Celý proces trvá 3 5 dní v závislosti na výběru průtokové buňky na platformě Illumina. Přehled kroků protokolu je vyobrazeno na následujícím obrázku: Strana 16 49
Přehled kroků PŘÍPRAVA GDNA PŘÍPRAVA MASTER MIXU HLA TŘÍDY I A II ZESÍLENÍ PRACOVNÍ ČAS: 2H CELKOVÝ ČAS: 2H PRACOVNÍ ČAS: 2H 10, CELKOVÝ ČAS: 8H 10 KVANTIFIKACE A NORMALIZACE AMPLIKONU PŘÍPRAVA KNIHOVNY PRACOVNÍ ČAS: 2H CELKOVÝ ČAS: 2H PRACOVNÍ ČAS: 1 H 20, CELKOVÝ ČAS: 3H VÝBĚR VELIKOSTI KNIHOVNY KVANTIFIKACE KNIHOVNY PRACOVNÍ ČAS: 0H 15, CELKOVÝ ČAS: 1H PRACOVNÍ ČAS: 0H 15, CELKOVÝ ČAS: 1H 15 SEKVENOVÁNÍ ZAPNUTO ILLUMINA MISEQ HLA ANALÝZA SEKVENOVÁNÍ DAT PRACOVNÍ ČAS: 0H 20, CELKOVÝ ČAS: 40H PRACOVNÍ ČAS: 0H CELKOVÝ ČAS: 6H Strana 17 49
Slovníček/definice Amplikonová destička alternativní název pro Zesilovací destičku Amplikonová kvantifikační destička 96jamková destička kompatibilní s destičkovým fluorometrem, kde se zředěné amplikony kvantifikují Zesilovací destička 96jamková PCR destička, která se používá na zesílení lokusů HLA Konečná knihovna knihovna, která obsahuje všechny Knihovny vzorků připravené k sekvenování v jediném cyklu MiSeq Reakční destička destička, kde se provádějí sekvenční reakce, které fragmentují, opravují konce a ligují indexované adaptéry s Knihovnami vzorků Destička s reagenciemi destička, která se používá k přesnému rozdělení různých reagencií použitých pro přípravu Knihoven Knihovna vzorků knihovna připravená zkombinováním (smícháním) všech HLA lokusů pro daný vzorek Smíchaná amplikonová destička destička obsahující knihovnu vzorků (všechny lokusy jsou kombinované) na každou jamku Kvantifikační destička standardů 96jamková destička kompatibilní s destičkovým fluorometrem, kde jsou umístěny standardy DNA, které umožňují kvantifikaci amplikonu Strana 18 49
Krok 1 Příprava master mixu HLA zesílení Doba trvání: ~2 hodiny Účelem tohoto kroku je připravit lokusově specifické master mixy pro individuální zesílení každého cíleného HLA lokusu. Lokusy zesílené tímto protokolem jsou HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1/ DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1 a HLA-DQB1. Poznámka: Master mixy připravované v tomto kroku zahrnují všechny reagencie potřebné pro zesílení s výjimkou Taq polymerázy. Seznam reagencií Položka Skladování Dodal Směs primerů HLA-A -20 C Omixon Směs primerů HLA-B -20 C Omixon Směs primerů HLA-C -20 C Omixon Směs primerů HLA-DRB1/DRB3-20 C Omixon Směs primerů HLA-DRB4-20 C Omixon Směs primerů HLA-DRB5-20 C Omixon Směs primerů HLA-DPA1-20 C Omixon Směs primerů HLA-DPB1-20 C Omixon Směs primerů HLA-DQA1-20 C Omixon Směs primerů HLA-DQB1 (sada 3) -20 C Omixon Enhancer 1-20 C Omixon Enhancer 2-20 C Omixon LongRange PCR pufr (10 ) -20 C Qiagen dntps (10 mm každý) -20 C Qiagen Ultračistá H 2 O -20 C Qiagen Protokol 1.1 Vyjměte všechny směsi primerů, Enhancer 1 a 2, dntp a LR-PCR pufry (10 ) ze skladovacího prostoru a nechte je roztát při pokojové teplotě. 1.2 Připravte Kombinovaný Enhancer: přidejte 132 µl Enhanceru 2 do zkumavky Enhanceru 1. Přejmenujte zkumavku Enhancer 1 na Kombinovaný Enhancer. Schovejte zbývající Enhancer 2, který se použije při LR-PCR reakci DRB4. 1.3 Připravte master mix pro každou směs primerů podle tabulek níže: Strana 19 49
Master mix: HLA-A, B, C, DRB1/DRB3, DRB5, DPA1, DPB1 a DQA1 Reagencie Objem/vzorek/lokus Objem/96 vzorků/lokus Směs primerů 2 µl 204 µl LongRange PCR pufr (10 ) 2,5 µl 255 µl Směs dntp (10 mm každý) 1,25 µl 127,5 µl Ultračistá H 2 O 13,85 µl 1412,7 µl Celkový objem 19,6 µl 1999,2 µl Master mix: HLA-DRB4 Reagencie Objem/vzorek/lokus Objem/96 vzorků/lokus Směs primerů 2 µl 204 µl LongRange PCR pufr (10 ) 2,5 µl 255 µl Směs dntp (10 mm každý) 1,25 µl 127,5 µl Enhancer 2 0,6 µl 61,2 µl Ultračistá H 2 O 13,25 µl 1351,5 µl Celkový objem 19,6 µl 1999,2 µl Master mix: HLA-DQB1 sada 3 Reagencie Objem/vzorek/lokus Objem/96 vzorků/lokus Směs primerů 2 µl 204 µl LongRange PCR pufr (10 ) 2,5 µl 255 µl Směs dntp (10 mm každý) 1,25 µl 127,5 µl Kombinovaný Enhancer 5,6 µl 571,2 µl Ultračistá H 2 O 7,85 µl 800,7 µl Celkový objem 19,2 µl 1958,4 µl 1.4 Promíchejte každý master mix na vortexu a odstřeďte jej po dobu 1 sekundy. Uložte master mix na led. 1.5 Všechny gdna zřeďte na koncentraci 30 ng/µl (minimální objem je 55 µl). Poznámka: Holotype HLA obsahuje dostatečné množství reagencií na 96 reakcí plus další objem na ztrátu při pipetování a selhání zesílení. Strana 20 49
Krok 2 Zesílení HLA třídy I a II Doba trvání: ~8 hodin 10 minut Účelem kroku 2 je zesílení lokusů HLA. Zesílení HLA třídy I a II byla optimalizována pomocí dvou samostatných setů podmínek PCR. Jakmile jsou PCR reakce dokončeny, zesílení se ověří elektroforézou na agarózovém gelu (volitelně). Seznam reagencií Rychlý tip elektroforéza na agarózovém gelu (krok 2.5), přestože se doporučuje, není nutná, aby došlo k úspěšnému dokončení protokolu Holotype HLA. Když jsou amplikony kvantifikovány (Krok 3), považuje se jakákoliv koncentrace nad 50 ng/µl za úspěšné zesílení. Elektroforéza na agarózovém gelu je důležitým krokem kontroly kvality a neměla by se bez dostatečných zkušeností s kompletním protokolem Holotype HLA vynechávat. Položka Skladování Dodal Master mix HLA-A -20 C Krok 1 Master mix HLA-B -20 C Krok 1 Master mix HLA-C -20 C Krok 1 Master mix HLA-DRB1/DRB3-20 C Krok 1 Master mix HLA-DRB4-20 C Krok 1 Master mix HLA-DRB5-20 C Krok 1 Master mix HLA-DPA1-20 C Krok 1 Master mix HLA-DPB1-20 C Krok 1 Master mix HLA-DQA1-20 C Krok 1 Master mix HLA-DQB1 (sada 3) -20 C Krok 1 Taq polymeráza -20 C Qiagen gdna 4 C Uživatel Ultračistá H 2 O 20 C Uživatel Protokol 2.1 Vyjměte Taq polymerázu ze skladovacího prostoru, odstřeďte ji a přidejte ji do každého master mixu podle níže uvedených tabulek, přičemž důkladně opláchněte špičky pipety pipetováním: Strana 21 49
Master mix s Taq polymerázou: HLA-A, B, C, DRB1/3, DRB4, DRB5, DPA1, DPB1 a DQA1 Reagencie Objem/vzorek/lokus Objem/96 vzorků/lokus Master mix z Kroku 1 19,6 µl 1999,2 µl Taq polymeráza 0,4 µl 40,8 µl Celkem 20 µl 2040 µl Master mix s Taq polymerázou: HLA-DQB1 sada 3 Reagencie Objem/vzorek/lokus Objem/96 vzorků/lokus Master mix z Kroku 1 19,2 µl 1958,4 µl Taq polymeráza 0,8 µl 81,6 µl Celkem 20 µl 2040 µl 2.2 Krátce promíchejte a odstřeďte všechny master mixy s Taq polymerázou. Rozdělte 20 µl každého master mixu s Taq polymerázou do samostatných jamek 96jamkových PCR destiček. Poznámka: Zesílení třídy I a II bylo optimalizováno pomocí dvou rozdílných podmínek PCR, takže by master mixy třídy I a třídy II neměly být na stejné destičce. 2.3 Přidejte 5 µl každé zředěné gdna do příslušné jamky destiček připravených v předchozím kroku. Pipetováním promíchejte. Utěsněte je tepelným těsněním a vizuálně zkontrolujte všechny jamky. Odstřeďte všechny Zesilovací destičky v odstředivce. 2.4 Umístěte Zesilovací destičky do termocyklerů a spusťte programy pro zesílení třídy I a třídy II podle níže uvedených tabulek: Zesílení třídy I (HLA-A, B a C) Počet cyklů Teplota Čas 1 95 C 3 minuty 95 C 15 sekund 35 65 C 30 sekund 68 C 5 minut 1 68 C 10 minut 1 4 C Strana 22 49
Zesílení třídy II (HLA-DRB1/DRB3, DRB4, DRB5, DPA1, DPB1, DQA1 a DQB1) Počet cyklů Teplota Čas 1 95 C 3 minuty 93 C 15 sekund 35 60 C 30 sekund 68 C 9 minut 1 68 C 10 minut 1 4 C Poznámka: Úspěch zesílení lze ověřit tím, že se 2 µl z každého amplikonu otestují ve standardním 2% agarózovém gelu při 250 V po dobu 30 minut. (Volitelné) Očekávané velikosti amplikonu Lokus HLA Očekávaná velikost amplikonu (kb) HLA-A, B a C ~3 HLA-DRB1/DRB3 ~4,3 HLA-DRB4 ~4,2 HLA-DRB5 ~4,2 HLA-DPA1 ~5,7 HLA-DPB1 ~6,7 HLA-DQA1 ~6 HLA-DQB (sada 3) ~6,6 Bezpečné místo pro zastavení. Amplikony lze skladovat při teplotě 4 C přes noc nebo při -20 C po delší dobu. Strana 23 49
Krok 3 Kvantifikace a normalizace amplikonu (pomocí destičkového fluorometru) Doba trvání: ~2 hodiny Za účelem zajištění přesného vstupu do kroku přípravy knihovny se doporučuje provést kvantifikaci a normalizaci amplikonu (volitelné). Koncentrace amplikonu se měří za použití systému QuantiFluor dsdna, který obsahuje fluorescenční barvivo vázající DNA a DNA standard pro citlivou kvantifikaci malého množství dvouvláknové DNA (dsdna). Pokyny k provádění kvantifikace amplikonu pomocí přístroje qpcr naleznete v Příloze 2. Seznam reagencií Rychlý tip kvantifikace amplikonu, přestože se doporučuje, není nutná, aby došlo k úspěšnému dokončení protokolu Holotype HLA. Normalizace amplikonu nevyžaduje přesné měření koncentrace amplikonu. Namísto toho lze použít odhad koncentrací amplikonu provedený na základě zkušeností nebo elektroforézy na agarózovém gelu. Kvantifikace amplikonu by se neměla bez konzistentních zkušeností s kompletním protokolem Holotype HLA vynechávat. Položka Skladování Dodal Zesilovací destička třídy I 4 C Krok 2 Zesilovací destička třídy II 4 C Krok 2 DNA standard Lambda (100 ng/µl) 4 C Promega Barvivo QuantiFluor dsdna (200 ) 4 C Promega 20 pufr TE (ph 7,5) 4 C Promega Ultračistá H 2 O 20 až 25 C Uživatel ExoSAP-iT Express -20 C Affymetrix Strana 24 49
Protokol 3.1 Připravte DNA standardy sériovým ředěním DNA standardu Lambda (100 ng/µl), který se dodává v soupravě QuantiFluor, podle níže uvedené tabulky ředění: Štítek na zkumavce Vstupní DNA Objem DNA (µl) Objem 1 TE (µl) Finální koncentrace (ng/µl) Standard 1 Lambda DNA 7,5 µl 492,5 µl 1,5 ng/µl Standard 2 Standard 1 250 µl 250 µl 0,75 ng/µl Standard 3 Standard 2 250 µl 250 µl 0,38 ng/µl Standard 4 Standard 3 250 µl 250 µl 0,19 ng/µl Standard 5 Standard 4 250 µl 250 µl 0,09 ng/µl Standard 6 Standard 5 250 µl 250 µl 0,05 ng/µl Slepý roztok Slepý roztok 0 µl 250 µl 0 ng/µl 3.2 Připravte Kvantifikační destičky amplikonu (viz doplňkové obrázky). Rozdělte 99 µl 1 TE pufru do jamek 96jamkové optické destičky pro celkový počet amplikonů, které se mají kvantifikovat. 3.3 Přidejte 1 µl amplikonů z odpovídajících jamek na Amplikonových destičkách do jednotlivých jamek na Kvantifikačních destičkách amplikonu. Pipetováním promíchejte. 3.4 Připravte 1 pracovní roztok barviva QuantiFluor podle následujícího vzorce: 0,5 µl barviva QuantiFluor (200X) + 99,5 µl 1 pufru TE. Připravte dostatečné množství 1 pracovního roztoku barviva QuantiFluor tak, aby každý vzorek (celkový počet vzorků na Amplikonových destičkách) a standard (celkem 14) obdržel 100 µl alikvotního podílu. 3.5 Připravte Kvantifikační destičku standardů a Kvantifikační destičky amplikonu. Přidejte 100 µl 1 pracovního roztoku barviva QuantiFluor do jamek 96jamkové optické destičky, která bude Kvantifikační destičkou standardů, a do Kvantifikačních destiček amplikonu z Kroku 3.2. 3.6 Pomocí výše připravených standardů přidejte ve dvou duplikátech 100 µl každého standardu do jednotlivých jamek Kvantifikační destičky standardů (celkem 14 jamek). Pipetováním promíchejte. 3.7 Dobře promíchejte na vortexu a odstřeďte. 3.8 Otestujte Kvantifikační destičku standardů na destičkovém fluorometru a následně Kvantifikační destičky amplikonu. 3.9 Vypočítejte koncentraci DNA v Kvantifikačních destičkách amplikonu pomocí RFU dat generovaných destičkovým fluorometrem. Informace o kalkulacích naleznete v záložce Ředění v dodaném sešitu aplikace Excel. 3.10 Na Amplikonových destičkách zřeďte DNA ultračistou H 2 O tak, aby konečná koncentrace DNA byla přibližně 67 ng/µl. Pokud je koncentrace DNA 150 ng/µl nebo vyšší: přidejte 25 µl H 2 O Strana 25 49
Pokud je koncentrace DNA 100 150 ng/µl: přidejte 10 µl H 2 O Pokud je koncentrace DNA nižší než 100 ng/µl: žádnou H 2 O nepřidávejte Směšování amplikonů 3.11 U každého vzorku smíchejte všechny lokusy na jednu Smíchanou amplikonovou destičku. Abyste získali konečný objem 35 µl, zkombinujte objemy uvedené pro každý lokus, jak je uvedeno v následující tabulce: Lokus HLA Směsný objem A 3,5 µl B 3,5 µl C 3,5 µl DRB1/DRB3 3,5 µl DRB4 3,5 µl DRB5 3,5 µl DPA1 3,5 µl DPB1 3,5 µl DQA1 3,5 µl DQB1 sada 3 3,5 µl 3.12 Do každé knihovny vzorku přidejte 4 µl ExoSAP-iT Express. Opláchněte špičky pipety pipetováním. Utěsněte destičku tepelným těsněním a odstřeďte ji. 3.13 Umístěte Smíchanou amplikonovou destičku do termocykleru a spusťte následující program: Purifikace PCR ExoSAP-iT Express Počet cyklů Teplota Čas 1 37 C 4 minuty 1 80 C 1 minuta 1 4 C Bezpečné místo pro zastavení. Amplikony lze skladovat při teplotě 4 C přes noc nebo při -20 C po delší dobu. Strana 26 49
Krok 4 Příprava knihovny Doba trvání: ~3 hodiny Během tohoto kroku se smíchané amplikony připravují na sekvenování na Illumina MiSeq. Amplikony jsou enzymaticky fragmentovány, konce jsou opraveny a adenylovány a na konce jsou ligovány adaptérové indexy. Knihovny se poté shromažďují a následně se provádí jediný krok čištění a koncentrace za použití kuliček AMPure XP beads. Seznam reagencií Poznámka: Společnost Omixon doporučuje používat objemy větší, než je nutné pro 96 vzorků, protože mnoho enzymů a pufrů je viskózních, což vede k nadměrné ztrátě při pipetování. Položka Skladování Dodal Smíchaná amplikonová destička 4 C Krok 3 Fragmentační enzym (A) -20 C Omixon Fragmentační pufr (B) -20 C Omixon Enzym opravy konců (C) -20 C Omixon Pufr opravy konců (D) -20 C Omixon Ligační enzym (E) -20 C Omixon Ligační pufr (F) -20 C Omixon Adaptérová destička -20 C Omixon Kuličky AMPure XP beads 4 C Beckman Coulter 80% ethanol (čerstvě připravený) 20 až 25 C Uživatel Ultračistá H 2 O 20 až 25 C Uživatel Protokol 4.1 Zapněte termocykler. Ověřte, že se vyhřívané víko zahřívá. Poznámka: Nezapomeňte před použitím důkladně promíchat Fragmentační enzym (A). 4.2 Připravte fragmentační master mix podle tabulky níže: Strana 27 49
Fragmentační master mix Reagencie Objem na knihovnu (µl) Doporučené objemy pro 96 knihoven (µl) Barevný kód Fragmentační enzym (A) 2 µl 220,8 µl Žlutá Fragmentační pufr (B) 2 µl 220,8 µl Červená Celkový objem 4 µl 441,6 µl 4.3 Připravte Destičku s reagenciemi: umístěte novou 96jamkovou PCR destičku na poličku chladiče PCR a umístěte alikvotní podíl stejného množství fragmentačního master mixu do každé jamky jednoho sloupce. Poznámka: Fragmentační reakce byla navržena tak, aby poskytovala ideální velikost DNA pro sekvenování na Illumina MiSeq. Aby nedošlo k nadměrné fragmentaci, je důležité udržovat reagencie studené, dokud nezačne reakce v termocykleru. Pro dosažení minimalizace příležitostí k nadměrné fragmentaci se doporučuje používat vícekanálové pipety. 4.4 Smíchanou amplikonovou destičku odstřeďujte po dobu 10 sekund a umístěte ji na led nebo studený blok. 4.5 Připravte Reakční destičku: umístěte novou 96jamkovou PCR destičku na studený PCR blok. 4.6 Přidejte 4 µl fragmentačního master mixu z Destičky s reagenciemi do jamek Reakční destičky tak, aby to odpovídalo vzorkům na Smíchané amplikonové destičce. Doporučuje se používat vícekanálovou pipetu. 4.7 Pomocí multikanálové pipety přeneste 16 µl každého amplikonu ze Smíchané amplikonové destičky do odpovídající jamky na Reakční destičce. Pipetováním promíchejte. 4.8 Reakční destičku uzavřete tepelným těsněním a centrifugujte po dobu 10 sekund. 4.9 Reakční destičku inkubujte v termocykleru pomocí následujícího programu: Fragmentační program Počet cyklů Teplota Čas 1 37 C 10 minut 1 70 C 15 minut 1 4 C Bezpečné místo pro zastavení. Knihovny lze skladovat při teplotě 4 C přes noc nebo při -20 C po delší dobu. 4.10 Připravte master mix opravy konců podle tabulky níže: Strana 28 49
Master mix opravy konců Reagencie Objem na knihovnu (µl) Doporučené objemy pro 96 knihoven (µl) Barevný kód Ultračistá H 2 O 1,25 µl 139,2 µl Enzym opravy konců (C) 1,25 µl 139,2 µl Zelená Pufr opravy konců (D) 2,5 µl 278,4 µl Oranžová Celkový objem 5 µl µl 4.11 Přidejte stejné množství master mixu opravy konců do jednoho nepoužitého sloupce Destičky s reagenciemi. 4.12 Reakční destičku (obsahující fragmentované Vzorky) odstřeďujte po dobu 10 sekund. Přidejte 5 µl master mixu opravy konců z Destičky s reagenciemi do každé jamky reakční destičky. Doporučuje se používat vícekanálovou pipetu. Pipetováním promíchejte. 4.13 Reakční destičku uzavřete tepelným těsněním a centrifugujte po dobu 10 sekund. 4.14 Reakční destičku inkubujte v termocykleru pomocí následujícího programu: Program opravy konců Počet cyklů Teplota Čas 1 20 C 30 minut 1 70 C 5 minut 1 4 C Bezpečné místo pro zastavení. Knihovny lze skladovat při teplotě 4 C přes noc nebo při -20 C po delší dobu. 4.15 Ze skladovacích prostor vyjměte Destičku indexovaných adaptérů a rozmrazte ji při pokojové teplotě poté, co v termocykleru dojde k zahájení Programu opravy konců. Jakmile Adaptérová destička dosáhne pokojové teploty, centrifugujte ji 3 minuty při 3000 ot./min. 4.16 Opatrně z Adaptérové destičky sejměte těsnění. Netřeste s Adaptérovou destičkou po odstranění těsnění, aby nedošlo ke křížové kontaminaci. 4.17 Přeneste celý objem každé jamky z Reakční destičky (25 µl) do odpovídající jamky na Adaptérové destičce. Strana 29 49
Poznámka: Pokud nebude použita celá Adaptérová destička, lze použít pouze potřebný počet adaptérů. Odřízněte těsnění destičky mezi jamkami, které se mají používat, a jamkami, které se mají zachovat. Opatrně z Adaptérové destičky sejměte těsnění tak, aby zůstalo na místě nad jamkami, které se mají zachovat. a. Přeneste 25 µl z každého vzorku s opravenými konci z Reakční destičky do jamky na Adaptérové destičce a dobře promíchejte pipetou. b. Přeneste celý objem každého vzorku z Adaptérové destičky do původní jamky na Reakční destičce. c. Znovu utěsněte Adaptérovou destičku a vraťte ji do teploty -20 C. U zbývajících kroků v manuálu použijte Reakční destičku místo Adaptérové destičky. 4.18 Připravte ligační master mix. Připravte dostatečné množství ligačního master mixu pro každý vzorek. Ligační master mix Reagencie Objem (µl) Doporučené objemy pro 96 knihoven (µl) Barevný kód Ligační enzym (E) 2,5 µl 252,5 µl Modrá Ligační pufr (F) 30 µl 3030 µl Černá Celkový objem 32,5 3282,5 µl 4.19 Přidejte stejné množství ligačního master mixu do 3 nepoužitých sloupců Destičky s reagenciemi. Doporučuje se používat vícekanálovou pipetu. 4.20 Přidejte 32,5 µl ligačního master mixu do každé jamky reakční destičky. Doporučuje se používat vícekanálovou pipetu. Pipetováním promíchejte. 4.21 Reakční destičku uzavřete tepelným těsněním a centrifugujte po dobu 10 sekund. 4.22 Reakční destičku inkubujte v termocykleru pomocí následujícího programu: Ligační program Počet cyklů Teplota Čas 1 25 C 10 minut 1 70 C 10 minut 1 4 C Bezpečné místo pro zastavení. Knihovny lze skladovat při teplotě 4 C přes noc nebo při -20 C po delší dobu. Strana 30 49
Směšování a čištění knihovny 4.23 Umožněte kuličkám AMPure XP beads dosáhnout pokojové teploty. Zajistěte, aby byly homogenní (žádné shluky). Připravte 5 ml čerstvě připraveného 80% ethanolu (4 ml EtOH + 1 ml H 2 O). 4.24 Knihovnu vytvořte kombinací alikvotního podílu z každého smíseného amplikonu, nyní knihovny, která je pro vzorek specifická, do jedné mikrocentrifugační zkumavky se sníženou vazností o objemu 2,0 ml. I. Pro 16 nebo více vzorků vypočítejte množství každé knihovny vzorku, aby se společně smísily do jedné Knihovny s celkovým objemem 900 µl. Vydělte 900 µl počtem knihoven vzorků. To je objem alikvotního podílu, který se má odebrat z každé knihovny vzorku a napipetovat do Knihovny. II. Pro méně než 16 vzorků přeneste 60 µl z každé knihovny vzorku do Knihovny. 4.25 Do zkumavky s Knihovnou přidejte 900 µl kuliček AMPure XP beads. Pečlivě promíchejte na vortexu a krátce odstřeďte. Nedovolte, aby se kuličky oddělily. Knihovnu inkubujte po dobu 10 minut při pokojové teplotě. Poznámka: Pokud je v Konečné směsi méně než 900 µl knihovny, přidejte ekvivalentní množství kuliček AMPure XP beads. Mezi Konečnou směsí a kuličkami AMPure XP beads by měl vzniknout poměr 1:1. 4.26 Vložte zkumavku s Knihovnou do magnetického stojanu a inkubujte po dobu 10 minut. 4.27 Zatímco máte zkumavku na magnetickém stojanu, opatrně odejměte a zlikvidujte supernatant ze zkumavky s Knihovnou, aniž byste se dotkli kuliček. 4.28 Zatímco máte zkumavku na magnetickém stojanu, přidejte do zkumavky s Knihovou ~1,5 2 ml čerstvě připraveného 80% ethanolu. Objem přidaného ethanolu by měl být takový, aby zakryl kuličky. Poznámka: Aplikujte ethanol na stranu zkumavky, kde nejsou kuličky. 4.29 Inkubujte zkumavku s Knihovnou při pokojové teplotě po dobu 30 sekund; poté pečlivě odstraňte a zlikvidujte supernatant. 4.30 Zopakujte kroky 4.28 a 4.29. 4.31 Rychle odstřeďte zkumavku s Knihovnou a umístěte ji s otevřeným víkem zpět na magnetický stojan. Pomocí pipety odstraňte zbytkový ethanol. Nedotýkejte se kuliček. Strana 31 49
Poznámka: Ujistěte se, že shluk kuliček neobsahuje zbytkový ethanol. To může vyžadovat otáčení zkumavky na magnetickém stojanu tak, aby se odstranil ethanol bez narušení shluku kuliček. 4.32 Kuličky nechte na magnetickém podstavci oschnout po dobu 5 8 minut, dokud nebude shluk kuliček suchý. 4.33 Odstraňte zkumavku s Knihovnou z magnetického stojanu a eluujte Knihovnu 31 µl ultračisté vody. Nedovolte, aby se špička pipety dotkla kuliček, protože by se k ní přilepily. 4.34 Promíchejte Knihovnu na vortexu, aby došlo k úplné resuspenzi kuliček. Jestliže na bočních stěnách zůstávají kapičky, krátce odstřeďte. Ujistěte se, že kuličky zůstávají v suspenzi. 4.35 Knihovnu inkubujte po dobu 2 minut při pokojové teplotě. 4.36 Umístěte Knihovnu na 2 minuty na magnetický stojan. 4.37 Odeberte Knihovnu: zatímco máte zkumavku s Konečnou knihovnou na magnetickém stojanu, odeberte 31 µl supernatantu do nové mikrocentrifugační zkumavky se sníženou vazností o objemu 1,5 ml. Bezpečné místo pro zastavení. Knihovny lze skladovat při teplotě -20 C po delší dobu. Strana 32 49
Krok 5 Výběr velikosti Knihovny Doba trvání: ~1 hodina Krok 5 převezme Knihovnu z Kroku 4 a provede výběr velikosti pomocí Pippin Prep. Pippin Prep může automaticky vybrat rozsah velikostí fragmentů DNA a eluovat je do sběrné komory. Poznámka: Místo Pippin Prep lze použít Blue Pippin. Návod k použití Pippin Prep naleznete v Příloze 1. Seznam reagencií Položka Skladování Dodal Kazeta s 1,5% agarózovým gelem, bez barviv 20 až 25 C Sage Science Plnicí roztok Pippin/markerový mix (označený K) 4 C Sage Science Směsná knihovna 4 C Krok 4 Poznámka: Marker K se používá spolu s Pippin Prep. Blue Pippin používá Marker 2. Protokol 5.1 Uveďte plnicí roztok Marker K na pokojovou teplotu. 5.2 Zkombinujte 31 µl Směsi s 10 µl plnicího roztoku Marker K. 5.3 Promíchejte na vortexu a odstřeďte. 5.4 Nakonfigurujte Pippin Prep tak, abyste získali DNA fragmenty mezi 650 a 1300 bps. Vložte vzorek o velikosti 40 µl do portu pro vzorek a spusťte program. Doba běhu je 45 50 minut. 5.5 Odeberte celý obsah (přibližně 40 µl) z elučího portu Pippin Prep a přeneste jej do nové mikrocentrifugační zkumavky se sníženou vazností o objemu 1,5 ml. Toto je knihovna vybraná podle velikosti. Bezpečné místo pro zastavení. Knihovny lze skladovat při teplotě -20 C po delší dobu. Strana 33 49
Krok 6 Kvantifikace Knihovny pomocí přístroje qpcr Doba trvání: ~1 hodina 15 minut Aby se dosáhlo optimálního využití výstupu ze sekvenceru Illumina MiSeq, je nutné Knihovnu vybranou podle velikosti kvantifikovat. Koncentraci Knihovny vybrané podle velikosti lze přesně změřit pomocí qpcr. Volitelně můžete použít soupravu Qubit dsdna BR a přístroj pro měření koncentrace knihovny Qubit. Tento protokol naleznete v Příloze 3. Seznam reagencií Položka Skladování Dodal 10 Primerový premix Illumina -20 C KAPA Biosystems 2 Master mix KAPA SYBR FAST qpcr -20 C KAPA Biosystems Std 1 (20,00 pm) -20 C KAPA Biosystems Std 2 (2,00 pm) -20 C KAPA Biosystems Std 3 (0,20 pm) -20 C KAPA Biosystems Std 4 (0,02 pm) -20 C KAPA Biosystems DNA standard Illumina -20 C KAPA Biosystems Ultračistá H 2 O 20 až 25 C Uživatel 1 TE pufr (ph 8,0) 20 až 25 C Uživatel Knihovna vybraná na základě velikosti 4 C Krok 5 Protokol 1 Pomocí 10 primerového premixu Illumina a 2 master mixu KAPA SYBR FAST qpcr připravte směs primerů qpcr: Poznámka: Reagencie soupravy KAPA SYBR FAST qpcr (master mix qpcr, primerový premix a roztoky ROX) se zkombinují při prvním použití soupravy. Tento zkombinovaný roztok je stabilní v průběhu nejméně 30 cyklů zmrazení/rozmrazení. Postupujte podle dokumentace KAPA a zjistěte, zda se pro váš přístroj qpcr doporučuje ROX. Směs primerů qpcr Reagencie Objem (ml) 10 Primerový premix Illumina 1 ml 2 Master mix KAPA SYBR FAST qpcr 5 ml Celkový objem 6 ml 2 Připravte master mix qpcr. Strana 34 49
Master mix qpcr Reagencie Objem (µl) Směs primerů qpcr 228 µl Ultračistá H 2 O 76 µl Celkový objem 304 µl 3 Připravte sériové ředění Knihovny vybrané na základě velikosti. a. Připravte ředění 1:1000 přidáním 1 µl Knihovny vybrané na základě velikosti do 999 µl 1 TE pufru (ph 8,0), důkladně opláchněte špičku pipety. Promíchejte na vortexu a odstřeďte. b. Připravte ředění 1:2000 přidáním 100 µl 1:1000 roztoku do 100 µl 1 TE pufru (ph 8,0). Promíchejte na vortexu a odstřeďte. 4 Připravte Kvantifikační destičku qpcr na nové PCR destičce, která je kompatibilní s vaším systémem qpcr. 5 Rozdělte alikvotní podíl 16 µl master mixu qpcr ve třech kopiích pro standardy 1 4, ředění 1:1000 a ředění 1:2000 (viz doplňkové obrázky). 6 Rozdělte alikvotní podíl 4 µl standardů 1 4, ředění 1:1000 a ředění 1:2000 do odpovídajících jamek. 7 Utěsněte Kvantifikační destičku qpcr a odstřeďte ji po dobu 10 sekund. Poznámka: Vyhněte se tvorbě bublin v jamkách Kvantifikační destičky qpcr. Odstřeďujte podle potřeby, abyste odstranili bubliny. 8 Nastavte triplikáty 1:1000 a 1:2000 jako cílené vzorky a definujte standardy (body: 4, počáteční koncentrace: 20 pm, ředění: 1:10). Abyste určili koncentraci DNA Knihovny vybrané na základě velikosti, spusťte následující program na přístroji qpcr: Počet cyklů Teplota Čas 1 95 C 5 minut 25 (bez křivky tání) 95 C 30 sekund 60 C 90 sekund (získání dat) 9 Abyste mohli převést výsledek qpcr z koncentrace pm na nm, zadejte výsledky Quantity mean (průměrného množství) dvou replikátů knihoven do karty sešitu aplikace Excel společnosti Omixon, která se nazývá Library Quantification (Kvantifikace knihovny). 10 Pomocí objemů ze sešitu zřeďte 10 µl Knihovny vybrané na základě velikosti na koncentraci 2 nm sterilní H 2 O v nové mikrocentrifugační zkumavce se sníženou vazností o objemu 1,5 ml. Skladujte Knihovnu vybranou na základě velikosti při teplotě -20 C. Strana 35 49
Bezpečné místo pro zastavení. Knihovny lze skladovat při teplotě -20 C po delší dobu. V případě dlouhodobého skladování se důrazně doporučuje provést kvantifikaci knihovny předtím, než se spustí na MiSeq. Strana 36 49
Krok 7 Sekvenování na Illumina MiSeq Doba trvání: ~24 40 hodin Illumina MiSeq je automatizovaný přístroj NGS, který může sekvenovat Knihovnu vybranou podle velikosti, která byla připravena v předchozích krocích. Demultiplexování indexovaných vzorků se provádí automaticky po dokončení sekvenčního cyklu. Rychlý tip Jako další kontrolu sledování sekvenční reakce můžeme použít 1% PhiX spike-in. Další informace o kontrole PhiX naleznete v dokumentaci Illumina. Seznam reagencií Položka Skladování Dodal Kazeta reagencií -20 C Illumina HT1-20 C Illumina PR2 4 C Illumina MiSeq Flow Cell 4 C Illumina Knihovna při 2nM 4 C Krok 6 1 N nebo 2 N NaOH 20 až 25 C Uživatel Ultračistá H 2 O 20 až 25 C Uživatel Kapacita soupravy reagencií MiSeq Souprava reagencií Illumina MiSeq Cyklus Std 500 (MS-102-2003) Cyklus Std 300 (MS-102-2002) Cyklus Micro 300 (MS-103-1002) Cyklus Nano 500 (MS-103-1003) Cyklus Nano 300 (MS-103-1001) Čas Hodiny Vzorky 96/7 ~39 96 ~24 96 ~19 28 ~28 12 ~17 6 Protokol 7.1 Podle standardních Illumina protokolů připravte MiSeq. Strana 37 49
7.2 Připravte 1nM Denaturovanou knihovnu: V nové mikrocentrifugační zkumavce se sníženou vazností o objemu 1,5 ml smíchejte 10 µl čerstvě připraveného 0,2N NaOH a 10 µl 2nM zředěné Knihovny vybrané na základě velikosti. Promíchejte na vortexu a odstřeďte. Tuto 1nM Denaturovanou knihovnu inkubujte po dobu 5 minut při pokojové teplotě. 7.3 Připravte 20pM Denaturovanou knihovnu: Přidejte 980 µl chlazeného HT1 do 20 µl 1nM Denaturované knihovny. Promíchejte na vortexu a odstřeďte. 7.4 Připravte 9pM Denaturovanou knihovnu: Do nové mikrocentrifugační zkumavky se sníženou vazností o objemu 1,5 ml přidejte 550 µl chlazeného HT1 a 450 µl 20pM Denaturované knihovny. Promíchejte na vortexu a odstřeďte. 7.5 Přeneste 600 µl 9pM Denaturované knihovny do Plnicího rezervoáru na vzorky v kazetě reagencií MiSeq. Rychlý tip K vytvoření Listu vzorku, který požaduje Miseq., se doporučuje použít poskytnutý sešit. Strana 38 49
Krok 8 Analýza sekvenčních dat HLA Illumina MiSeq zpracuje 9pM Směsnou knihovnu a vygeneruje sekvenční data ve formátu souborů fastq. Informace o správné instalaci HLA Twin a informace o interpretaci genotypové analýzy vašich sekvenčních dat naleznete v příručce HLA Twin. Pro implementaci Automatizovaného protokolu a kvůli problémům týkajícím se instalace nebo analýzy dat kontaktujte support@omixon.com. Automatizovaný protokol Nastavení a konfigurace IT 1. Nainstalujte HLA Twin Server na Server. Nainstalujte Klienta HLA Twin na počítač klienta na server se může připojit více Klientů HLA Twin. Pro získání vlastních instalačních pokynů týkajících se Automatizace kontaktujte podporu společnosti Omixon (support@omixon.com). Protokol jednotlivých analýz 1. Spusťte Klienta HLA Twin a přihaste se. 2. Data jsou již zpracovávána nebo se zpracovávají. Zkontrolujte výsledky pomocí systému Traffic Light System v aplikaci HLA Twin. 3. Podle potřeby exportujte výsledky genotypizace a/nebo shodné sekvence. Manuální serverový protokol Nastavení a konfigurace IT Nainstalujte HLA Twin Server na Server. Nainstalujte Klienta HLA Twin na počítač klienta. Protokol jednotlivých analýz Spusťte Klienta HLA Twin a přihaste se. Ve formátu fastq nebo fastq.gz vyberte data MiSeq a spusťte cyklus typizace Holotype HLA typing. Po skončení cyklu typizace Holotype HLA typing zkontrolujte výsledky pomocí systému Traffic Light System v aplikaci HLA Twin. Podle potřeby exportujte výsledky genotypizace a/nebo shodné sekvence. Manuální protokol Desktop Nastavení a konfigurace IT Nainstalujte HLA Twin Desktop. Strana 39 49
Protokol jednotlivých analýz 6 Spusťte HLA Twin a přihaste se. 7 Ve formátu fastq nebo fastq.gz vyberte data MiSeq a spusťte cyklus typizace Holotype HLA typing. 8 Po skončení cyklu typizace Holotype HLA typing zkontrolujte výsledky pomocí systému Traffic Light System v aplikaci HLA Twin. 9 Podle potřeby exportujte výsledky genotypizace a/nebo shodné sekvence. Strana 40 49
Doplňkové obrázky Příklady Amplikonových destiček, Zesilovací destička, Amplikonových kvantifikačních destiček (pro jednotlivé lokusy) a Reakčních destiček Příklad Kvantifikační destičky standardů Strana 41 49
Příklad Kvantifikační destičky qpcr Knihovny KAPA Strana 42 49
Příloha 1: Pippin Prep Programování Pippin Prep 1. Klikněte na kartu Protocol Editor a klikněte na tlačítko New. 2. Klikněte na ikonu složky vedle pole Cassette a pro Pippin Prep vyberte 1.5%DF Marker K nebo 1.5%DF Marker R2 pro Blue Pippin. 3. Na dráze (lane), kde programujete: a. Zvýrazněte pole Range. b. Nastavte Ref Lane tak, aby odpovídalo číslu dráhy (lane), na které pracujete. c. Pole Start* nastavte na 650. d. Pole End* nastavte na 1300. 4. V poli Reference Lane vyberte dráhu, ve které pracujete: 5. Klikněte na tlačítko Save as a pojmenujte váš program. Spuštění Pippin Prep 1. Zapněte Pippin Prep zmáčknutím tlačítka napájení na zadní straně zařízení. 2. Vizuálně Pippin Prep zkontrolujte. Ujistěte se, že 5 LED kontrolek svítí a vnitřní část přístroje je čistá a suchá. 3. Vpravo dole na obrazovce klikněte na logo Sage Science. To vám umožní zadat heslo. Výchozí tovární heslo je pips. 4. Klikněte na záložku Factory Setup a ujistěte se, že hodnota Base-to-Threshold value je nastavená na 0.02. 5. Umístěte kalibrační zařízení do Pippin Prep a ujistěte se, že tmavý pás je umístěn lícem dolů a nad kontrolkami LED. 6. V hlavní záložce (Main tab) klikněte na tlačítko Calibration. 7. Ujistěte se, že v okně Calibration je pole Target I ph ma nastavené na 0.80 (0.60 u Blue Pippin) a pak klikněte na tlačítko Calibrate. 8. Jděte do záložky Protocols. Klikněte na tlačítko Load a vyberte program pro Holotype HLA a specifickou dráhu (lane), kterou použijete. Ujistěte se, že: a. Je zapnutá správný dráha (lane) b. Je zapnutý indikátor výběru širokého spektra (Broad spectrum selection indicator) c. Referenční dráha (reference lane) je stejná dráha (lane), která bude spuštěna. 9. Jděte do hlavní záložky (Main tab). Ujistěte se, že: a. Program, který jste vložili, je ten, který je vybrán. b. Je vybrána příslušná referenční dráha, cože je také dráha, ve které se bude vzorek testovat. Strana 43 49
10. Zkontrolujte kazetu. Předtím, než sejmete pásku, která utěsňuje jamky, podívejte se, zda nejsou za elučním otvorem bubliny. Pokud za elučním otvorem bubliny jsou, opatrně na kazetu poklepejte a otáčejte jí tak, aby se bubliny odstranily. 11. Umístěte kazetu, s páskou stále přes jamky, do přístroje Pippin Prep. 12. Opatrně odlepte pásku a dbejte na to, abyste sejmuli pásku směrem z čisté strany kazety (dráha (lane) 5) na použitou stranu kazety (dráha (lane) 1). Při odstraňování pásky dbejte na to, aby nedošlo k vystříknutí tekutiny a ke kontaminaci. 13. Odstraňte celý objem pufru z elučního portu dráhy, kterou používáte, a do tohoto elučního portu přidejte 40 µl čerstvého pufru pro elektroforézu. 14. Eluční porty zakryjte tenkým pruhem pásky. 15. Jakékoliv nádržky, které jsou plné z méně než 3/4, by měly být doplněny pufrem pro elektroforézu. Jamky nepřeplňujte! Okraj pufru by měl přesně dosáhnout plastu, neměl by přesahovat, aby se zabránilo jeho přetažení při sklopení víka. Aplikujte pufr z čistých jamek (dráha (lane) 5) do použitých jamek (dráha (lane) 1). 16. Ujistěte se, že každá plnicí jamka (jamka s agarózou) je naplněna pufrem pro elektroforézu. Pufr byl měl být přesně přes agarózu tak, aby vypadal zcela rovný. 17. Pomalu Pippin Prep zavřete a ujistěte se, že při zavírání zařízení nedojde ke kontaktu pufru a víčka. 18. Proveďte test kontinuity. Když senzory lehce vyschnou, je běžné, že test kontinuity jednou selže. Pokud test kontinuity selže, spusťte jej ještě jednou. Jakmile se test kontinuity dokončí, pomalu Pippin otevřete. Ujistěte se, že nedochází k přetažení kapaliny přes kazetu víkem Pippin prep. 19. Na vortexu krátce promíchejte plnicí roztok Marker K a odstřeďte jej. Přidejte 10 µl plnicího roztoku Marker K do vašich ~30 µl Knihovny. 20. Na vortexu vaši knihovnu krátce promíchejte a odstřeďte ji. 21. Odstraňte 40 µl pufru z jamky vzorku, kterou budete používat. 22. Přidejte ~40 µl vaší knihovny s Markerem K do jamky vzorku, kterou budete používat. 23. Označte dráhu (lane), který používáte, pomocí iniciál technika a data. 24. Zavřete Pippin Prep a zmáčkněte tlačítko Start. Ujistěte se, že se zapnula příslušná dráha (lane). Vzorek by se měl testovat přibližně 45 minut. 25. Po dokončení cyklu Pippin Prep opatrně otevřete. Podívejte se, jestli víko nepřetahuje kapalinu přes kazetu. 26. Odstraňte pásku umístěnou přes eluční porty a dbejte na to, aby nedošlo k vystříknutí kapaliny. 27. Přeneste veškerý objem z elučního portu do nové zkumavky se sníženou vazností o objemu 1,5 ml. Strana 44 49
28. Zakryjte všechny otevřené jamky pomocí dvou pásek k utěsnění jamek. Nezapomeňte na čisté straně nechat ohyb. Díky tomu je bude snadné odstranit směrem z čisté strany na použitou. 29. Vložte uzavřenou kazetu do sáčku a odložte ji stranou. 30. Vezměte promývací kazetu a naplňte ji vodou MiliQ. Opatrně zavřete víko přístroje Pippin Prep, a podívejte se, jestli nepřetahujete kapalinu přes promývací kazetu. 32. Nechte Pippin Prep několik sekund uzavřený. 33. Otevřete Pippin Prep, a podívejte se, jestli nepřetahujete kapalinu přes promývací kazetu. 34. Vyjměte promývací kazetu, vylijte z ní vodu a nechte i oschnout. 35. Odstraňte z přístroje Pippin Prep případnou vodu a jemně jej zavřete. 36. V menu přístroje Pippin Prep klikněte na tlačítko Shut Down. Strana 45 49
Příloha 2: Kvantifikace amplikonu pomocí přístroje qpcr Doba trvání: 2 hodiny Seznam reagencií Položka Skladování Dodal 20 pufr TE (ph 7,5) 4 C Promega DNA standard Lambda (100 ng/µl) 4 C Promega 200 Barvivo QuantiFluor dsdna 4 C Promega Sterilní H 2 O 20 až 25 C Uživatel Zesilovací destička(y) třídy I 4 C Krok 2 Zesilovací destička(y) třídy II 4 C Krok 2 Protokol 2. Vytvořte sériové ředění pomocí mikrocentrifugačních zkumavek o objemu 1,5 ml a DNA standardu QuantiFluor Lambda (100 ng/µl). Postupujte podle níže uvedené tabulky ředění: Štítek na zkumavce Vstupní DNA Objem DNA (µl) Objem 1 TE (µl) Finální koncentrace (ng/µl) Standard 1 Lambda DNA 7,5 µl 492,5 µl 1,5 ng/µl Standard 2 Standard 1 250 µl 250 µl 0,75 ng/µl Standard 3 Standard 2 250 µl 250 µl 0,38 ng/µl Standard 4 Standard 3 250 µl 250 µl 0,19 ng/µl Standard 5 Standard 4 250 µl 250 µl 0,09 ng/µl Standard 6 Standard 5 250 µl 250 µl 0,05 ng/µl Standard 7, Slepý roztok Slepý roztok 0 µl 250 µl 0 ng/µl 3. Připravte Kvantifikační destičky amplikonu (viz doplňkové obrázky). Rozdělte 49,5 µl 1x TE pufru do jamek čisté 96jamkové destičky pro celkový počet amplikonů, které se mají kvantifikovat. 4. Přidejte 0,5 µl amplikonů z odpovídajících jamek na Amplikonových destičkách do jednotlivých jamek na Kvantifikačních destičkách amplikonu. Pipetováním promíchejte. 5. Připravte 1 pracovní roztok barviva QuantiFluor podle následujícího vzorce: 0,25 µl barviva QuantiFluor (200X) + 49,75 µl 1 pufru TE. Připravte dostatečné množství 1 pracovního roztoku barviva QuantiFluor tak, aby každý vzorek (celkový počet vzorků na Amplikonových destičkách) a standard (celkem 14) obdržel 50 µl alikvotního podílu. Strana 46 49
6. Připravte Kvantifikační destičku standardů a Kvantifikační destičky amplikonu. Přidejte 50 µl 1 pracovního roztoku barviva QuantiFluor do jamek 96jamkových optických destiček pomocí formátu Kvantifikační destičky standardů a Kvantifikačních destiček amplikonu (viz doplňkové obrázky). 7. Pomocí výše připravených standardů přidejte ve dvou duplikátech 50 µl každého standardu do jednotlivých jamek Kvantifikační destičky standardů (celkem 14 jamek). 8. Dobře promíchejte na vortexu a odstřeďte. 9. Každou Kvantifikační destičku vložte do přístroje qpcr jednotlivě a spusťte následující program: Počet cyklů Teplota Čas 1 25 C 10 sekund 25 C 15 sekund 2 25 C 30 sekund (získání dat) 10. Vypočítejte koncentraci DNA v Kvantifikačních destičkách amplikonu pomocí hrubých RFU dat generovaných přístrojem qpcr. 11. Na Amplikonových destičkách zřeďte DNA sterilní H 2 O tak, aby konečná koncentrace DNA byla přibližně 67 ng/µl. Pokud je koncentrace DNA 150 ng/µl nebo vyšší: přidejte 25 µl H 2 O Pokud je koncentrace DNA 100 150 ng/µl: přidejte 10 µl H 2 O Pokud je koncentrace DNA nižší než 100 ng/µl: přidejte 0 µl H 2 O Strana 47 49
Příloha 3: Kvantifikace knihovny pomocí interkalačního fluorescenčního barviva dsdna Doba trvání: ~15 minut Koncentraci Knihovny vybrané podle velikosti lze přesně změřit pomocí interkalačního fluorescenčního barviva dsdna, jako je SYBR green nebo jeho ekvivalent. Pro tento účel komerčně dostupné soupravy a nástroje zahrnují Qubit reader společnosti Thermo Fisher (používá testovací soupravu dsdna Qubit Broad-Range), Quantus reader společnosti Promega (používá fluorescenční barvivo Quantifluor dsdna) a další. Zde je metoda Qubit popsána jako nejčastěji používaný nástroj. Pokud používáte jiný přístroj a soupravu, postupujte podle standardních pokynů výrobce. Seznam reagencií Poznámka: Tato fluorometrická dsdna metoda je rychlým, ale přesným způsobem, jak určit koncentraci konečné knihovny vybrané podle velikosti. Měří všechny dsdna, které jsou v knihovně přítomny. Položka Skladování Dodal Souprava Qubit dsdna BR Assay Kit pokojová teplota Thermo Fisher Standardy Qubit dsdna BR 4 C Thermo Fisher Knihovna vybraná na základě velikosti 4 C Krok 5 Protokol 6.1 Uveďte Standardy Qubit na pokojovou teplotu. Připravte ve dvou duplikátech testové zkumavky Qubit (500 µl, tenkostěnné) na vaši knihovnu a dva standardy. Promíchejte standardy i knihovnu na vortexu a odstřeďte je. 6.2 Do zkumavky odstředivky o objemu 1,5 ml přidejte 995 µl pufru a 5 µl barviva. Promíchejte na vortexu a odstřeďte. 6.3 Přeneste 190 µl reakční směsi do zkumavek Qubit pro tyto dva standardy. Přeneste 198 µl reakční směsi do dvou zkumavek Qubit pro duplikáty knihovny. 6.4 Přidejte 10 µl standardu 1 do odpovídající zkumavky Qubit a promíchejte ji na vortexu po dobu 2 sekund. Postup opakujte se standardem 2. 6.5 Přidejte 2 µl knihovny do těchto dvou odpovídajících zkumavek Qubit a promíchejte je na vortexu po dobu 2 sekund. 6.6 Zkumavky Qubit inkubujte po dobu 2 minut při pokojové teplotě. 6.7 Zapněte přístroj Qubit a vyberte protokol BR protocol. Strana 48 49