MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA BAKALÁŘSKÁ PRÁCE

Transkript

1 MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA BAKALÁŘSKÁ PRÁCE BRNO 2011 LENKA MACHÁLKOVÁ

2 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výţivy rostlin Psychrotrofní mikroorganismy a jejich význam v mlékařství Bakalářská práce Vedoucí práce: Ing. Libor Kalhotka, Ph.D. Vypracovala: Lenka Machálková Brno 2011

3 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, ţe jsem bakalářskou práci na téma Psychrotrofní mikroorganismy a jejich význam v mlékařství vypracovala samostatně a pouţila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloţeném seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a můţe být pouţita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne podpis....

4 PODĚKOVÁNÍ: Touto cestou bych chtěla poděkovat vedoucímu mé bakalářské práce Ing. Liboru Kalhotkovi, Ph.D. za odborné vedení, konzultace a cenné rady při zpracování bakalářské práce. rostlin. Zároveň děkuji i celému Ústavu agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výţivy

5 Abstrakt Bakalářská práce se zabývá psychrotrofními mikroorganismy v mlékařství. Popisuje sloţení mléka, jeho mikrobiologickou kvalitu a kontaminaci neţádoucí mikroflórou - psychrotrofními mikroorganismy. Charakterizuje jejich negativní vliv v mlékařství, který se projevuje rozkladem mléčných bílkovin a tuku, čímţ způsobuje vady v chuti a vůni. Dále rozebírá jejich nejvýznamnější zástupce, kteří mohou způsobovat alimentární onemocnění u člověka, a zaměřuje se na sanitaci výrobního zařízení v mlékárnách. Závěrem této práce bylo experimentální stanovení psychrotrofních mikroorganismů pomocí kultivačních metod v mléce a sýrech. Klíčová slova: mléko, mikroorganismy, kontaminace, enzymy, chlazení, sanitace Abstract Bachelor thesis deals with Psychrotrophic microorganisms in Dairy. It covers describes the composition of milk, its quality and microbiological contamination of undesirable microflora - psychrotrophic microorganisms. Their negative influence in the Dairy is characterized reflected in the decomposition of milk protein and fat, causing defects in the taste and smell. It also describes the most important agents that can cause alimentary illness in humans, focusing on sanitation in the dairy production facilities. Finally the thesis presents an experimental determination of psychrotrophic microorganisms using cultivation methods in milk and cheese. Key words: milk, microorganisms, contamination, enzymes, refrigeration, sanitation

6 Obsah 1 ÚVOD CÍL PRÁCE LITERÁRNÍ PŘEHLED Význam produkce mléka pro výţivu člověka Tvorba mléka Sloţení a vlastnosti mléka Základní sloţení mléka Mléčné proteiny Mléčný tuk Mléčný cukr Minerální látky Vitaminy Enzymy a hormony Obecná charakteristika mikroorganismů Buňka a její základní struktury Mikroorganismy důleţité v mlékařství Fyziologické vlastnosti mikroorganismů Vnější vlivy působící na růst mikroorganismů Vliv teploty na růst bakterií Vztah mikroorganismů k teplotě Odolnost mikroorganismů Mikrobiologie mléka Mikrobiologie syrového mléka Mikrobiologie tepelně ošetřeného mléka Mikrobiologie smetany Bakteriální znečištění mléka Zdroje mikrobiálního znečištění Primární kontaminace mléka Sekundární kontaminace mléka Úprava syrového mléka v mlékárnách Hygienická kvalita mléka Chlazení mléka Hluboké zchlazování mléka Tepelné ošetření mléka Pasterace Ultrapasterace UHT ošetření (Ultra-High Temperature processing)... 30

7 3.7.4 Teplota skladování Mikrobiální rozklad mléka Rozklad tuku Mikrobiální lipázy Rozklad bílkovin Mikrobiální proteázy Význam v mlékařství Prevence rozkladu mléka Psychrotrofní mikroorganismy Psychrotrofní mikroorganismy v pasterovaném mléce Psychrotrofní mikroorganismy v trvanlivém mléce Vliv psychrotrofní mikroflóry na jakost sýrů Indikátorový význam psychrotrofních bakterií Eliminace rozvoje psychrotrofní mikroflóry Zástupci psychrotrofních mikroorganismů Rod Pseudomonas Rod Bacillus Rod Flavobacterium Rod Alcaligenes Rod Micrococcus Čištění a dezinfekce v mlékárenském průmyslu Druhy čištění MATERIÁL A METODIKA Mikrobiologický rozbor vzorků mléka a sýrů Analyzovaný materiál Příprava laboratorních pomůcek Příprava kultivačních půd Zpracování vzorků Způsob vyhodnocování výsledků VÝSLEDKY ZÁVĚR POUŢITÁ LITERATURA... 58

8 1 ÚVOD Mléko je téměř dokonalou potravinou obsahující vápník, laktózu, bílkoviny, minerální látky, vitaminy a další sloţky. Jsou zde tedy zastoupeny všechny látky nutné k normálnímu růstu a vývoji dětí a zároveň je významnou sloţkou výţivy dospělého člověka. Celosvětově je nejvíce vyuţíváno mléko kravské. Neopomenutelnou a velmi důleţitou součástí jak syrového, tak tepelně ošetřeného mléka jsou jeho mikroorganismy, které se v mléku vyskytují. Mikrobiální kontaminace syrového mléka má zásadní význam pro kvalitu mléka jako suroviny pro výrobu mléčných potravin a v této souvislosti je její redukce i jedním z faktorů ochrany zdraví konzumentů. Kvalita mléka a výrobků z něj se začíná odvíjet od hygienických podmínek a technologického vybavení zemědělské prvovýroby. Mezi mikroorganismy způsobující kromě zdravotních rizik i rizika vad mléka a mléčných výrobků patří skupina psychrotrofních mikroorganismů. Dostávají se do mléka primárně z krmiv, prachu a z kontaminované vody. Nejvýznamnějším sekundárním zdrojem psychrotrofních mikroorganismů jsou nedostatečně čištěné a dekontaminované plochy, které se stýkají s chlazeným mlékem, potrubí a chladící nádrţe, ve kterých se mléko současně chladí. Nebezpečnost těchto mikroorganismů se projevuje ve zvýšené kontaminaci mléka v důsledku dlouhodobého skladování mléka při nízkých teplotách. Psychrotrofní mikroorganismy jsou schopné růstu a metabolických projevů i při nízkých teplotách, kolem 4 C. Vzhledem k tomu, ţe nízké teploty neinhibují tvorbu a činnost enzymatických systémů proteáz a lipáz, můţe dojít ke změnám struktur bílkovin a tuků mléka, zvláště pak po delší době skladování. Nejčastějšími zástupci psychrotrofních mikroorganismů v syrovém mléce jsou bakterie rodů Pseudomonas, Flavobacterium, Alcaligenes, Micrococcus, Bacillus a další. Jsou příčinou nepříjemných pachů a vad v chuti mléka. Z těchto důvodů je velmi důleţitá mikrobiologická kontrola jak syrového mléka, tak i produktů z něj vyrobených. 8

9 2 CÍL PRÁCE Zpracovat literární rešerši, v níţ budou shrnuty poznatky o psychrotrofních mikroorganismech významných v mlékařství. Zaměřit se na mikroorganismy působící kaţení mléka a sýrů. Charakterizovat mikroorganismy a produkty jejich metabolismu. Charakterizovat opatření v boji proti neţádoucím mikroorganismům. Experimentálně stanovit psychrotrofní mikroorganismy ve vybraných vzorcích. 9

10 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Význam produkce mléka pro výţivu člověka Davidson (1999) uvádí, ţe je mléko nejuniverzálnější ze všech potravin. Čerstvé mléko a výrobky z něho (smetana, máslo, podmáslí, syrovátka, všechny druhy sýrů a nespočet zakysaných mléčných výrobků jako např. jogurt a zakysaná smetana) jsou hojně pouţívány v kuchyních celého světa. Ve výţivě člověka je historicky vyuţíváno mléko od řady savců. Vedle kravského mléka se jedná především o mléko ovčí, kozí, buvolí, velbloudí, kobylí, sobí, mléko jaka aj. (Gajdůšek, 1998). Mléko a mléčné výrobky jsou nenahraditelným zdrojem výţivných látek důleţitých pro růst lidského organismu všech věkových a zdravotních kategorií (Herian, 2006). Jeho důleţitost spočívá v tom, ţe obsahuje všechny sloţky, které kryjí potřeby organismu. Např. jeden kilogram plnotučného mléka v denní normě zabezpečuje jednotlivé výţivové sloţky přibliţně takto: téměř 22 % energie, 30 % bílkovin, 40 % tuku, 130 % Ca, 100 % P, 50 % K, 60 % Mg, 40 % Zn, 60 % J, 35 % vitaminu B 1, 80 % vit. B 2, 15 vit. B 6, 20 % vitaminu A, 60 % vitaminů skupiny D, 40 % biotinu, 15 % vitaminu C a je tedy v naší stravě zejména zdrojem vápníku a vitaminu B 2. Je také nutno zdůraznit, ţe kysané mléčné výrobky mají velký dietetický význam (Drdák et al., 1996) Tvorba mléka Mléko je produkt mléčné ţlázy dojnice a tvoří se v sekrečním parenchymu. Kompletní jednotkou pro tvorbu mléka je alveolus. Sekreční buňky alveolu jsou orientovány tak, ţe apikální konec přiléhá k luminu, zatímco bazální konec je oddělen bazální membránou od krve a lymfy. Metabolity vstupují z krevního řečiště přes bazální membránu a jsou vyuţívány k syntéze mléka pomocí endoplazmatického retikula. Energie je dodávána mitochondriemi. Kaseiny jsou tvořeny z glykoproteinových frakcí globulinu a částečně z doplňujících aminokyselin a kyseliny fosforečné. Pro tvorbu syrovátkových bílkovin jsou také základem aminokyseliny z krve. Tuk je tvořen z nízkomolekulárních mastných kyselin vznikajících v bachoru. Vyšší mastné kyseliny se tvoří redukční kondenzací a esterifikují s acylglycerolem. Ten se tvoří z glukózy. Z glukózy a galaktózy se syntetizuje laktóza. Prekursorem je glukóza v krvi (Lukášová, 10

11 1999). Galaktóza je tvořena přímo v sekrečním epitelu. Vitaminy a minerální látky přicházejí do mléka z krve. Pro vytvoření jednoho litru mléka je třeba, aby mléčnou ţlázou proteklo 500 litrů krve (Gajdůšek, Klíčník, 1993). 3.2 Sloţení a vlastnosti mléka Normální kravské mléko má bílou nebo mírně naţloutlou barvu a nasládlou, čistě mléčnou chuť. Mléko je sloţeno z vody, sušiny a plynů. V podstatě je mléko biologická tekutina velmi sloţitého charakteru. Látky v mléce obsaţené jsou v různém stupni disperze; např. mléčný cukr a převáţná část minerálních látek tvoří pravé roztoky, bílkoviny jsou v mléce ve formě koloidní a mléčný tuk ve formě tukových kuliček (Gajdůšek, Klíčník, 1993) Základní sloţení mléka Mléko je disperzní systém, který se skládá ze dvou základních částí, a to z vody a z malých částí rozptýlených ve vodě. Podle velikosti těchto částic se rozlišují fáze molekulární, koloidní a emulzní. Molekulární fázi tvoří sloţky, které s vodou tvoří pravé roztoky (chloridy, citráty, fosforečnany, laktóza atd.) (Lukášová, 1999). Koloidní fázi tvoří bílkoviny a emulzní fáze je tvořena mléčným tukem. Hlavními sloţkami mléka jsou voda, mléčný tuk, bílkoviny, minerální látky a laktóza (Drdák et al., 1996) Tab. 1 - Základní složení kravského mléka (Ingr, 2003) Sloţky mléka Průměrný obsah v % Voda 87,5 Sušina 12,5 Tuk 3,8 Bílkoviny 3,2 Laktóza 4,7 Minerální látky 0,7 11

12 Kozí mléko, stejně jako kravské patří mezi kaseinová mléka a v základním sloţení se mu i podobá. Bílkoviny resp. aminokyseliny obsaţené v mléce jsou pro mikroorganismy zdrojem dusíku. Kozí mléko obsahuje nepatrně více minerálních látek, vyjádřených jako popeloviny, neţ mléko kravské, obsahy stopových prvků jsou podobné (Gajdůšek, 1998) Mléčné proteiny Mléko je velmi dobrým zdrojem lehce stravitelných a výţivově kvalitních bílkovin (Grieger, Holec, 1990). Celkové bílkoviny (hrubé bílkoviny) mléka jsou tvořeny bílkovinami kaseinovými (2,50 2,65 %), bílkovinami syrovátkovými (0,75 0,85 %) a frakcemi dusíkatými nebílkovinného původu (volné aminokyseliny, kyselina močová, amoniak, vitaminy skupiny B, kreatin, nukleotidy, sulfokyanid, kyselina orotová apod.) v mnoţství 0,13 0,25 % celkových bílkovin mléka (Zadraţil, 2002). Bílkoviny mléka tvoří základní fyzikální a chemické vlastnosti mléka. Jsou z nutričního hlediska nejvýznamnější sloţkou mléka, jsou to vysokohodnotné bílkoviny, dodávající mléku významnou biologickou hodnotu (imunoglobuliny, laktoferin, enzymy aj.) (Gajdůšek, 2003; Zadraţil, 2002). Hodnota mléčných bílkovin vychází z nezastupitelnosti exogenních esenciálních aminokyselin. Mléčné bílkoviny obsahují 18 z 22 známých aminokyselin, potřebných pro stavbu a udrţování lidského organismu. Biologická hodnota bílkovin je určována aminokyselinou, která přichází v nejniţším potřebném mnoţství. Kromě vlastního obsahu aminokyselin je důleţitý i jejich poměr (Grieger, Holec, 1990; Herian, 2006). Základní rozdělení dusíkatých látek mléka: 1) Kasein - komplex fosfoproteinů, které jsou syntetizovány mléčnou ţlázou a tvoří v mléce přeţvýkavců převáţnou část bílkovin. Z mléka je moţno vysráţet okyselením při ph 4,6 a teplotě 20 C (Gajdůšek, 2003). Kasein obsahuje všechny nepostradatelné aminokyseliny. Z hlediska jejich kvantitativního zastoupení je zvláště cenný pro vysoký obsah lyzinu (Grieger, Holec 1990). 2) Syrovátkové bílkoviny (resp. bílkoviny mléčného séra) - globulární bílkoviny, rozpustné při ph 4,6. Některé z nich jsou syntetizovány mléčnou ţlázou (Gajdůšek, 2003). Laktalbumin a laktoglobulin jsou sloţením snad nejvhodnější bílkoviny vůbec. Obsah všech nepostradatelných aminokyselin je s výjimkou 12

13 metioninu vyšší neţ v kaseinu. Velmi cenný je vysoký obsah cystinu a tryptofanu, na které je kasein chudý (Grieger, Holec, 1990). 3) Proteoso-peptony - tepelně stabilní fosfoproteiny, rozpustné při ph 4,6. 4) Ostatní bílkoviny mléka - jedná se o řadu minoritních látek bílkovinné povahy (enzymů, lipoproteinů apod.) 5) Nebílkovinné dusíkaté látky - jedná se o velký počet látek, obsahujících dusík, které odpovídají 250 aţ 300 mg N v litru mléka (Gajdůšek, 2003). Obr. 1 Rozdělení a zastoupení základních dusíkatých látek kravského mléka (Ingr, 2003) Vlivy působící na mnoţství a sloţení bílkovin mléka Stavba jednotlivých bílkovinných frakcí mléka je dána geneticky, proto nelze předpokládat změny v primární struktuře, tj. v zastoupení aminokyselin. Významné změny však mohou nastat v zastoupení jednotlivých frakcí bílkovin, z nichţ z technologického hlediska je nejvýznamnější změna poměru kaseinu a sérových bílkovin. Nejvýznamnější fyziologické faktory: stadium laktace zdravotní stav dojnic vliv výţivy a krmení plemenná příslušnost Málo výrazný je vliv denní doby, počtu, případně intervalu dojení. Výraznější rozdíly v obsahu bílkovin jsou dány individualitou dojnice (Gajdůšek, Klíčník, 1993). 13

14 Mléčný tuk Mléčný tuk má velmi komplikované sloţení a strukturu. Základními sloţkami jsou: tri-, di-, a monoacylglyceroly, volné mastné kyseliny, fosfolipidy, steroly, estery sterolů, uhlovodíky a v tucích rozpustné vitaminy. Z celkových lipidů mléka však kolem 98 % tvoří triacylglyceroly. Mléčný tuk se převáţně vyskytuje ve formě tukových kuliček. (Gajdůšek, 2003). Tukové kapénky v mléce nejsou volné (nejde o pouhou emulzi), na povrchu jsou chráněny dvojvrstvou, přičemţ nepolární vrstva radiálně orientovaných fosfolipidů jsou orientovány směrem dovnitř tukové kapénky a polární vrstva (hydrofilní) je orientována směrem k vodní fázi mléka. Lipofilní část obsahuje kromě triacylglycerolů rovněţ cholesterol, karoteny a lipofilní vitaminy. Polární vrstva nese bílkovinné sloţky. Tyto fosfolipidové obaly tukových kapének zabraňují jejich vzájemnému splynutí. Z nutričního hlediska je velmi významné, ţe mléčný tuk je z větší části v mléce obsaţen v jemně rozptýleném, emulgovaném, a proto velmi dobře stravitelném stavu (Zadraţil, 2002). Důleţitým faktorem dobré stravitelnosti je i jeho chemické sloţení, a to vysoký obsah mastných kyselin s krátkým řetězcem, jejich uspořádání a vysoký obsah fosfolipidů (Herian, 2006). Střední průměr těchto tukových kuliček je 2-6 µm a jejich počet v 1 ml mléka činí 1,5-4, Velký specifický povrch kuliček je předpokladem pro vysokou reakční schopnost mléčného tuku. Homogenizace zabraňuje vyvstávání mléčného tuku, podstatně zvyšuje počet velmi jemných tukových kapének o průměru pod 1 µm. Mléčný tuk je vyuţitelný aţ z 99 % a z hlediska výţivy je jedním z nejvýhodnějších vůbec (Zadraţil, 2002). Obsah tuku, který udává do značné míry energetickou hodnotu mléka, se v konzumním mléce upravuje obvykle na 3,5 % (Grieger, Holec, 1990). Po delším skladování mléka nebo po některých zásazích (třepání, zmrznutí mléka, míchání teplého mléka s vychlazeným apod.) můţeme zejména na zahřátém mléce pozorovat tzv. volný tuk, tj. tuk, u kterého byla porušena membrána mechanickým zásahem nebo působením enzymů ze syrového mléka. Tento volný tuk podléhá snadněji dalšímu rozkladu. Není-li mléko odpovídajícím způsobem vychlazeno, můţe dojít k rychlému rozkladu tuku (lipolýze) působením přirozených popř. bakteriálních lipáz. Zvýšení obsahu volných mastných kyselin v mléce v důsledku lipolýzy znehodnocuje mléko jako surovinu, tzn. vznik technologických problémů při zpracování, senzorických vad 14

15 mléčných výrobků, rychlejšího kaţení a případně dietetických rizik pro konzumenty. Při normální, ale zejména neadekvátně zvýšené, bakteriální kontaminaci mléka (především psychrotrofními mikroorganismy) můţe dojít k lipolýze i u pasterovaného mléka vlivem termostabilních lipáz (Gajdůšek, 2003) Mléčný cukr Hlavním zástupcem sacharidů v mléce je disacharid laktóza, nazývaný téţ mléčný cukr. Disacharid je tvořen v mléčné ţláze z monosacharidů glukózy a galaktózy. Laktóza je rozpuštěna v přítomné vodě, dodává mléku nasládlou chuť a s ostatními rozpustnými sloţkami působí na osmotický tlak v mléce. Vedle laktózy jsou v mléce v malých mnoţstvích přítomny i další cukry (Gajdůšek, 2003). Laktóza se přirozeně vyskytuje pouze v mléce. Je lehce stravitelná a zároveň je výborným zdrojem energie. Při výrobě mléčných kvašených výrobků je fermentovaná mikroorganismy na kyseliny a další metabolity (Herian, 2006; Vlková et al., 2009) Minerální látky Mléko obsahuje 14 minerálních látek, z toho ve větším mnoţství vápník, fosfor, draslík, hořčík, síru, sodík a chlór a v menším mnoţství stopové prvky - ţelezo, měď, kobalt, mangan, jód, zinek, fluór. Důleţitý je vysoký obsah a příznivý poměr vápníku a fosforu v mléku. Z mléka a mléčných výrobků získává člověk aţ 56 % své potřeby vápníku (Herian, 2006). Minerální látky jsou do mléka přenášeny z krve. Z nutričního hlediska ovlivňují stupeň nabobtnání koloidů, regulují osmotický tlak a koncentraci vodíkových iontů. Mají také funkci aktivátoru některých enzymů a jsou důleţité pro udrţování acidobazické rovnováhy v organismu (Gajdůšek, 2003). Minerální látky (Ca, Mg, K) se v mléce vyskytují pouze vázané ve formě fosforečnanů, chloridů, uhličitanů a citrátů. Vápník se váţe především na kasein (Vlková et al., 2009). 15

16 Tab. 2 - Obsah majoritních minerálních prvků v mléce (Velíšek, 1999) Prvek Obsah v mg/kg Na K Cl Mg Ca P S Vitaminy V mléce jsou přítomny veškeré vitaminy, i kdyţ koncentrace některých je pouze minimální (zvýšená hladina vitaminů je v mlezivu). Významný vliv na obsah vitaminů hraje roční doba v souvislosti s výţivou dojnic. V letním období, v době zeleného krmení a pastvy, obsahuje mléko více karotenů a vitaminů A, D, E (Gajdůšek, 2003). Tab. 3 - Průměrné obsahy vitaminů v mléce (podle Velíšek, 1999) Vitamin Obsah vitaminů Označení Název (mg/kg) A Retinol 0,3-1,0 D Kalciferol 0,001 E Tokoferol 0,2-1,2 K Filochinon 0,01-0,03 B 1 Thiamin 0,3-0,7 B 2 Riboflavin 0,2-0,3 B 6 Pyridoxin 0,2-2,0 B 12 Korinoidy 0,01-0,03 B 5 Kys. pantothenová 0,4-4,0 H Biotin 0,02-0,05 PP Niacin 0,8-5,0 C Kys. askorbová 5,0-20 Rozpustnost Rozpustné v tucích Rozpustné ve vodě 16

17 Enzymy a hormony V kravském mléce byl detekován velký počet enzymů, které jsou syntetizovány v mléčné ţláze, a některé se dostávají do mléka z krve. Kromě nativních enzymů obsahuje mléko i mikrobiální enzymy z kontaminující mikroflóry. Některé enzymy jsou v mléce koncentrovány v povrchových vrstvách tukových kuliček a přechází do smetany, jiné jsou naopak vázány na bílkoviny mléka a společně s nimi se i sráţí. Záhřevem mléka dochází k denaturaci a inaktivaci enzymů. Enzym laktoperoxidáza má značnou tepelnou stabilitu. Podle přítomnosti a nepřítomnosti laktoperoxidázy v pasterovaném mléce se ověřuje správnost provedení vysoké pasterace mléka nebo smetany. Ţlázy s vnitřní sekrecí produkují chemické sloučeniny, které secernují do krve pro transport do různých cílových tkaní. Působí jako katalyzátory. Všechny hormony, které jsou produkovány v těle, nebo které byly dodány zvenčí (exogenní), jsou vylučovány i do mléka (Gajdůšek, 2003). 3.3 Obecná charakteristika mikroorganismů Buňka a její základní struktury Buňka je základní strukturní a funkční jednotkou všech ţivých systémů. Prokaryontní organismy (prokaryota) byly prvními ţivými systémy vzniklými během biologického vývoje. Vyznačují se všudypřítomným rozšířením, rychlým růstem a krátkým časem plození, úţasnou biochemickou mnohostranností a genetickou flexibilitou. Jsou to velmi malé a relativně primitivní buňky jednobuněčných mikroorganismů. Mají jediný membránový systém, buněčnou membránu, která je většinou obklopena pevnou buněčnou stěnou, oddělující buňku od okolí. Ani jaderná oblast, ani jiné části buňky nejsou ohraničené ani členěné membránami (Vodráţka, 1996). Základní součásti buňky: buněčná stěna, cytoplazmatická membrána, cytoplazma, jaderná hmota (=nukleoid) bez membrány ribozomy. 17

18 Obr. 2 Prokaryontní buňka (Kalhotka, Tesařová, 2009) Mikroorganismy důleţité v mlékařství Jsou to mikroskopické, jednobuněčné mikroorganismy, které se vyskytují ve formě kulovitých (koky), tyčinkovitých nebo spirálových buněk. Rozmnoţují se přímým dělením. V mlékárenském průmyslu převaţují koky a tyčinky. V přírodě jsou všude, kde se nacházejí organické látky jako zdroj výţivy. Koky jsou zřídkakdy větší neţ 1 µm, tyčinky jsou většinou v délce 1 aţ 2 µm. Mléko jich můţe obsahovat i milionová mnoţství. Bakterie jsou jednobuněčné a kaţdá buňka je schopna pokračovat nezávisle na fyziologickém procesu. Některé bakterie jsou schopny za nepříznivých podmínek zahušťovat svůj buněčný obsah do silnostěnné struktury, označené jako spora, která je velmi rezistentní vůči teplu, vysoušení, i působení chemických látek apod. Tento jev má mimořádný význam ve vztahu k efektu pasterace a sterilace mléka. Všechny bakterie jsou v kapalině pohyblivé (Brownův pohyb), některé jsou však schopny i skutečného, nezávislého pohybu pomocí bičíku. Buňky bakterií se mnoţí pouhým dělením přes střed, čímţ se z jedné buňky vytvoří dvě. To vysvětluje i nesmírnou rychlost mnoţení bakterií, které má spíše geometrický neţ aritmetický charakter. Za příznivých podmínek se můţe nová generace vytvořit jiţ za půl hodiny (Gajdůšek, Klíčník, 1993). 18

19 3.3.3 Fyziologické vlastnosti mikroorganismů Po fyziologické stránce jsou mikroorganismy velmi rozmanité. Jednotlivé skupiny mikroorganismů se vzájemně liší svými nároky na výţivu, kyslík, i způsobem získávání potřebné energie. Podle nároků na výţivu rozdělujeme mikroorganismy na: 1) Autotrofní - k výţivě jim stačí pouze anorganické sloučeniny. Přítomnost organických sloučenin často inhibuje jejich rozmnoţování. Patří sem řasy a některé bakterie. 2) Heterotrofní - vyţadují přítomnost organických sloučenin v ţivném prostředí, ať uţ jako zdroj uhlíku, vodíku nebo energie. Patří sem kvasinky, plísně a většina bakterií. Heterotrofní mikroorganismy rozdělujeme dále na prototrofní, kterým stačí k výţivě jednoduché organické uhlíkaté sloučeniny (např. sacharidy, ethanol, jednoduché organické kyseliny apod.) spolu s anorganickými solemi, a auxotrofní, které kromě toho vyţadují některé sloţité sloučeniny (např. vitaminy, aminokyseliny apod.) (Šilhánková, 2002). Podle nároků na kyslík dělíme mikroorganismy na: 1) Aerobní - vyţadují vzdušný kyslík, neboť mají vyvinutý pouze aerobní metabolismus. Patří sem plísně, octové bakterie (rod Acetobacter), některé hnilobné bakterie a některé kvasinky. 2) Anaerobní - nevyuţívají volný kyslík, neboť mají pouze anaerobní metabolismus. Vzdušný kyslík na ně působí inhibičně (např. u sporotvorných bakterií rodu Clostridium) nebo dokonce toxicky. 3) Mikroaerofilní - mají anaerobní metabolismus, avšak nízké koncentrace kyslíku urychlují jejich rozmnoţování (např. mléčné bakterie rodu Lactobacillus). 4) Fakultativně anaerobní - mají schopnost aerobního i anaerobního metabolismu. Mohou tedy růst za přítomnosti i nepřítomnosti vzdušného kyslíku (Šilhánková, 2002). 19

20 Podle zdroje přijímané energie dělíme mikroorganismy na: 1) Fototrofní mikroorganismy vyuţívají sluneční energii. 2) Chemotrofní mikroorganismy - získávají energii oxidací organických nebo anorganických sloučenin (Zehnálek, 2002). 3.4 Vnější vlivy působící na růst mikroorganismů Růst a mnoţení mikroorganismů je do značné míry závislé na podmínkách vnějšího prostředí. V něm musí být nejen dostatečné mnoţství surovin pro syntézu buněčné hmoty a zajištění dostatečného mnoţství vyuţitelné energie, ale pro optimální vývoj mikroorganismu musí prostředí zajišťovat i vhodné fyzikální, chemické a biologické podmínky (Vodráţka, 1996). Ţivotní činnost mikroorganismů je aktivní tehdy, jestliţe jsou všechny faktory v optimálním vzájemném poměru. Růst ochabuje tehdy, je-li jeden z vnějších činitelů v minimu. Tyto poznatky umoţňují záměrně měnit ţivotní činnost mikrobů (Gajdůšek, Klíčník, 1993). V praxi se nepříznivé vlivy prostředí pouţívají v boji proti neţádoucím mikroorganismům (Šilhánková, 2002) Vliv teploty na růst bakterií Teplota prostředí ovlivňuje intenzitu téměř všech ţivotních procesů mikrobních buněk. Zvyšování teploty má v podstatě dvojí účinek na činnost mikroorganismů; na jedné straně urychluje metabolické reakce jak syntetické, tak degradační, ale na druhé straně inaktivuje enzymy, které tyto reakce katalyzují. Při sniţování teploty klesá postupně i rychlost rozmnoţování aţ k úplnému zastavení růstu (Vodráţka, 1996). Teplotní rozmezí, v němţ mikrob roste, aniţ je poškozován, je tzv. biokinetické teplotní rozmezí a je vymezeno kardinálními hodnotami minima, optima a maxima (Gajdůšek, Klíčník, 1993). Mikroorganismy jsou schopny růst ve velmi širokém teplotním rozmezí. Účinnou ochranu potravin během výroby a skladování je tedy moţné zajistit jen za předpokladu znalostí teplotních nároků mikroorganismů (Vlková et al., 2009). 20

21 U kaţdého mikroorganismu rozeznáváme tři základní body teploty: 1) Minimální teplota: tj. nejniţší teplota, při které se daný mikroorganismus rozmnoţuje ještě zjistitelnou rychlostí. 2) Optimální teplota: teplota, při níţ se mikroorganismus rozmnoţuje největší rychlostí. 3) Maximální teplota: tj. nejvyšší teplota, při které je mikroorganismus ještě schopen se rozmnoţovat (Vodráţka, 1996). Stanovení minimální růstové teploty je poměrně obtíţné, neboť s klesající teplotou klesá postupně i rychlost rozmnoţování. Teplotní mez úplného zastavení růstu je proto zjistitelná velmi obtíţně. Zatímco optimální teplota je obvykle asi o 30 C vyšší neţ teplota minimální, převyšuje maximální teplota pouze o 5 aţ 10 C optimální teplotu určitého mikroorganismu. To znamená, ţe při zvýšení teploty nad optimální teplotu dochází k prudkému poklesu rychlosti rozmnoţování a nakonec k jeho zastavení. Další zvýšení teploty pak vede dokonce k usmrcení buněk (Šilhánková, 2002) Vztah mikroorganismů k teplotě Podle vztahu k teplotě rozdělujeme mikroorganismy do tří hlavních skupin: 1) Psychrofilní mikroorganismy - mají optimální teplotu niţší neţ 20 C a rostou ještě poměrně intenzivně při teplotě 0 C aţ 5 C. Generační doba těchto mikroorganismů dosahuje obvykle hodnot niţších neţ 48 hodin. Z potravinářského hlediska jsou důleţité tzv. psychrotrofní mikroorganismy, tj. takové, které se rozmnoţují ještě dosti rychle při teplotách 0 C aţ 10 C bez ohledu na jejich optimální teplotu. Vyskytují se hojně v půdě a ve vodě a způsobují rozklad masa, mléčných výrobků a jiných potravin, uchovávaných při nízkých teplotách. 2) Mezofilní mikroorganismy mají minimální teplotu vyšší neţ 5 C a optimální teplotu niţší neţ 45 C. Představují většinu všech mikroorganismů. 3) Termofilní mikroorganismy mají optimální teplotou růstu 45 C nebo vyšší. Pro růst většiny z nich je optimální teplota 50 aţ 60 C, pro některé dokonce ještě vyšší (Šilhánková, 2002). 21

22 Tab. 4 - Rozdělení bakterií podle jejich teplotních nároků (Vlková et al., 2009) Skupina Teplota v C mikroorganismů minimální optimální maximální Psychrofilní 0 a méně 10 aţ Psychrotrofní 0 aţ 7 20 aţ Mezofilní aţ Termofilní aţ Odolnost mikroorganismů Mikroorganismy kontaminující mléko lze rozdělit podle jejich odolností vůči technologickým postupům a hygienické významnosti do tří základních skupin: mikroorganismy termofilní, termorezistentní a psychrotrofní. 1) Termofilní bakterie se vyskytují v tepelně opracovaných mléčných konzervách a způsobují jejich kaţení při nevhodných skladovacích teplotách. 2) Termorezistentní mikroorganismy mají schopnost přeţívat pasterační teploty, mohou to být zástupci psychrofilních, mezofilních i termofilních mikroorganismů. V pasterovaném mléce jsou nejnebezpečnějšími kontaminanty právě psychrofilové a mezofilové, kteří způsobují kaţení pasterovaného mléka i při nízkých skladovacích teplotách. 3) Psychrotrofní mikroorganismy mají optimální teplotu růstu okolo C, ale jsou schopné se mnoţit i při teplotách niţších neţ 5 C. Z psychrotrofních mikroorganismů se v syrovém mléce nejčastěji vyskytují gramnegativní tyčinky rodů Pseudomonas, Flavobacterium, Alcaligenes a Aeromonas (Vlková et al., 2009). Ducková et Čanigová (2004) uvádí, ţe u některých rodů psychrotrofních bakterií se zjistila schopnost produkovat exopolysacharidy, kterými mohou lehce formovat biofilm. Jakmile se biofilm zformoval a mlékárenský systém zůstal delší čas bez čistění, pak se psychrotrofní bakterie nestávaly jen potencionálním bakteriálním zdrojem kontaminace, ale odolávaly i vlivu čistících a dezinfekčních prostředků. 22

23 3.5 Mikrobiologie mléka V průběhu rozvoje mlékařství se plně potvrdil význam mikroorganismů jako činitelů ovlivňujících vyuţitelnost a zpracovatelnost suroviny, průběh technologických procesů, fyzikálně chemické vlastnosti mléčných výrobků, jejich senzorické vlastnosti, skladovatelnost, trvanlivost a hygienickou nezávadnost. Při výrobě mléčných výrobků se vyuţívá tradičních biotechnologií zaloţených na vyuţití mikroorganismů a jejich enzymů (Ţiţka, Korbelová, 1992). Mikroorganismy v mléce mohou vyvolat různé změny, které jsou závislé především na druhu mikroorganismu a na sloţce mléka, které tyto mikroorganismy rozkládají. Mezi hlavní změny, které vyvolávají mikroorganismy v mléce, patří změny vyvolané fermentační činností mikroorganismů, dále změny způsobené proteolýzou, lipolýzou, tvorbou alkalické reakce mléka, případně slizovatění mléka, změny barvy aj. (Cempírková et al., 1997) Mikrobiologie syrového mléka Mikroorganismy nacházející se v mléce podmiňují nejen kvalitu a trvanlivost mléka dodávaného do mlékárny, ale i kvalitu mléčných výrobků z něho vyráběných (Ingr, 2003). Bílkoviny mléka jsou zdrojem dusíku, mléčný cukr zdrojem uhlíku a energie. Minerální látky se podílejí na stavbě buněčné hmoty, podílejí se na látkovém metabolismu, osmotickém tlaku, enzymatické činnosti aj. (Gajdůšek, Klíčník, 1993). Mléko můţe obsahovat patogenní, resp. podmíněně patogenní mikroorganismy, které mohou přenášet některé nemoci zvířat nebo lidí. Normy jakosti jsou proto doplňovány přípustným mnoţstvím některých skupin mikroorganismů. Znalost mikrobiologie mléka je tedy nezbytná nejen pro výrobce mléka, nýbrţ i pro technologa v mlékárně (Ingr, 2003). Mikrobiologické parametry pro syrové mléko: počet psychrotrofních mikroorganismů do v 1 ml, počet termorezistentních mikroorganismů do 2000 v 1 ml, počet koliformních bakterií nejvíce v 1 ml, sporotvorné anaerobní bakterie v 0,1 ml test negativní (Ingr, 2003). 23

24 Podle Nařízení ES č. 853/2004 by celkové počty mikroorganismů v syrovém kravském mléce neměly překročit KTJ v 1 ml. Norma ČSN uvádí jako doplňkový znak jakosti: počet psychrotrofních mikroorganismů, který musí být KTJ/ml. Limitní počet psychrotrofních mikroorganismů pro čerstvé pasterované mléko je KTJ/ml Mikrobiologie tepelně ošetřeného mléka Tepelné ošetření mléka patří mezi nejdůleţitější technologický postup zpracování mléka. Účelem je zničení patogenních a technologicky neţádoucích mikroorganismů a zajištění jeho zdravotní nezávadnosti a trvanlivosti (Lukášová, 2001). Syrové mléko se tepelně ošetřuje buď pasterací, ultrapasterací nebo UHT, tak aby došlo ke zničení všech vegetativních forem patogenních mikroorganismů a k podstatnému sníţení počtu ostatních mikroorganismů. Tepelné ošetření musí být natolik šetrné, aby byla zachována původní biologická a technologická kvalita mléka (Vlková et al., 2009) Mikrobiologie smetany Smetana je více zatíţena mikrobiální kontaminací neţ mléko. Ochranný vliv tuku na bakterie je zanedbatelný. Smetana není vhodným prostředím pro pomnoţování některých mikroorganismů. Pasterací jsou zničeny patogenní mikroorganismy, koliformní bakterie, psychrotrofní bakterie a většina spor. Přítomnost termolabilních mikroorganismů ve smetaně svědčí o rekontaminaci. Významné jsou především bakterie r. Pseudomonas. Namnoţí-li se do vysokých koncentrací, způsobují svými enzymy smyslové změny smetany. Rovněţ B. cereus se podílí na kaţení smetany. Údrţnost a jakost konzumní smetany závisí v zásadě na teplotních podmínkách během skladování a přepravy (Lukášová, 2001). Vady smetany - vady vůně Na změnách vůně se podílejí mikroorganismy svým metabolismem. Skladování smetany při chladírenských teplotách umoţňuje rozmnoţování psychrotrofních mikroorganismů, které činností svých lipáz a proteáz vyvolávají nečistou, hořkou aţ hnilobnou vůni. Cizí vůně je postřehnutelná za dnů skladování při 4-7 C. 24

25 Ovocná vůně je vyvolána Pseudomonas fragi jako důsledek postpasterační kontaminace (Lukášová, 2001). 3.6 Bakteriální znečištění mléka Při dojení a všech manipulacích s mlékem jsou mikroorganismy asociovány do mléka. Pro syrové mléko jako surovinu pro výrobu konzumního mléka a mléčných výrobků je nesporně velmi důleţitá hygiena při jeho získávání. Mléko získané asepticky ze zdravé mléčné ţlázy, po oddojení prvních střiků mléka, je mikrobiologicky velmi čisté, protoţe ve zdravé mléčné ţláze je mléko sterilní, přesněji vyjádřeno, vytváří se sterilně (Grieger, Holec, 1990). Počet mikroorganismů v mléce při opuštění vemene bývá v 1 ml mléka. Po nadojení dochází ke značné změně původních mikroorganismů syrového mléka a to v důsledku kontaminace různého původu (Cempírková et al., 1997) Zdroje mikrobiálního znečištění Zdravá mléčná ţláza produkuje mléko s minimálním počtem mikroorganismů a teprve stykem s vnějším prostředím dochází ke kontaminaci a zvyšování počtu bakterií. Mikroorganismy v mléce pocházejí buď z mléčné ţlázy nebo z vnějšího prostředí kontaminací během nebo po dojení (Gajdůšek, Klíčník, 1993). Kontaminace mléka můţe pocházet jednak primárně přímo z nemocných zvířat a to i bez zjevných klinických příznaků, nebo můţe jít o sekundární kontaminaci nedodrţením hygieny při získávání, uchovávání, přepravě a zpracovávání mléka (Němcová, Kalhotka, 2010) Primární kontaminace mléka Primární mikroflóra se do vemene dostává krevním oběhem, tzv. vnitřní cestou, nebo z povrchu struku strukovým kanálkem, vnější cestou. První způsob osídlování mléka je vzácný a přichází v úvahu jen u nemocných nebo jinak oslabených zvířat. Krev zdravých zvířat je sterilní a obranné imunitní systémy nedovolují pronikání mikroorganismů do vnitřních tkání a orgánů (Ţiţka, Korbelová, 1992). 25

26 Sekundární kontaminace mléka Zdrojem sekundární kontaminace můţe být vemeno (nemyté, umyté nečistou vodou, utřené nečistou utěrkou), tělo dojnic (při zanedbání hygieny podestýlání), stájové prostředí, ruce a oděv personálu, dojící zařízení, nádrţe a zařízení na chlazení a uchovávání mléka (Komprda, 1997). Heredia et al. (2009) uvádějí, ţe významná kontaminace mléka můţe vzniknout z nedostatečně dezinfikované plochy dojícího a skladovacího vybavení pro mléko, důsledkem je šíření mikroorganismů v mléce z reziduí zůstávajících v trhlinách, kloubech, gumových těsněních a slepých uličkách špatně čištěného dojícího zařízení. Jedinou ochranou před zavlečením bakterií do dodávky mléka při dojení je vhodná sanitace u veškerého vybavení. Účinnost sanitace do velké míry závisí na konstrukci zařízení i dalších faktorech, jako je tvrdost vody. Sekundární kontaminace závisí na: době počátku chlazení mléka po jeho nadojení, teplotě chlazení mléka, čase, za který mohou mikroorganismy v mléku růst a metabolizovat (Görner, Valík, 2004). Sekundární (postsekretorické) zdroje mikrobiálních kontaminací mléka se podílejí hlavní měrou na mikrobiálním stavu čerstvě nadojeného mléka. Kaţdý z uvedených zdrojů zvyšuje obsah mikroorganismů v mléce řádově o 10 3 aţ 10 6 v 1 ml. Záleţí pouze na hygienickém stavu prostředí, zařízení a organizaci činností spojených se získáváním mléka (Grieger, Holec, 1990). Mikrobiální jakost mléka Jakost mléka musí vyhovovat poţadavkům zákona č. 166/1999 Sb. o veterinární péči a nařízení rady ES č.852/2004, č. 853/2004 a č. 2073/

27 3.7 Úprava syrového mléka v mlékárnách Hygienická kvalita mléka Mikroorganismy v mlékařství mají významné poslání nejen zdravotní, ale také hygienické a technologické (Grieger, Holec, 1990). Mléko je svým vyváţeným sloţením ţivin a vysokým obsahem vody velmi vhodným prostředím pro růst mikroorganismů, které mohou svou činností kvalitu mléka a mléčných výrobků ovlivnit jak příznivě, tak nepříznivě (Vlková et al., 2009). Při zpracování mléka mají velký význam především gramnegativní bakterie, a to v důsledku dlouhodobého skladování mléka při nízkých teplotách. Psychrotrofní mikroflóra je zastoupena převáţně bakteriemi rodů Pseudomonas, Flavobacterium, Alcaligenes, Micrococcus, Brevibacterium, Bacillus a dalších (Ţiţka, Korbelová 1992) Chlazení mléka Grieger et Holec (1990) uvádějí, ţe ochlazením mléka lze uchovat jeho původní vlastnosti tím, ţe se omezuje rozvoj mikroorganismů, které se do mléka dostaly sekretorickými mechanismy nebo postsekretoricky z různých zdrojů. Avšak ţádným způsobem chlazení se neničí mikroorganismy obsaţené v mléce. Omezuje se pouze jejich mnoţení a aktivity exoenzymů a endoenzymů. Některé mikrobiální druhy se však mnoţí v mléce i při nízkých teplotách, na které se mléko chladí. Jsou to psychrotrofní mikroorganismy vyvolávající v mléce nepříznivé změny. Přesto však je včasné ochlazení mléka dobrá metoda k prodlouţení jeho trvanlivosti a zabraňuje striktně pomnoţení patogenů. Mléko má po nadojení teplotu kolem 35 C, která vyhovuje velkému počtu mikroorganismů v jejich růstu. Omezení růstu je u velkého počtu druhů při teplotách kolem 8 C. Některé druhy se však i při teplotách blízkých 0 C ještě mnoţí - psychrotolerantní a psychrofilní bakterie a plísně. Proto, kdyţ se zamezí růstu bakterií mléčného kvašení, mohou nastat ve vychlazeném mléce nepříznivé změny, postihující především mléčný tuk a bílkoviny (Gajdůšek, 2003). 27

28 Hluboké zchlazování mléka V současnosti zejména tam, kde se praktikuje méně častý svoz mléka (např. jednou za dva dny, popř. ještě řidčeji) je nezbytné nadojené mléko vychladit ihned po nadojení na 3 aţ 5 C. Tím se dosáhne stabilního mikrobiálního stavu trvajícího 48 aţ 72 h., podmínkou této stability však zůstává, podobně jako při méně razantním ochlazení, dodrţení hygienických podmínek produkce a dojení. Hluboké zchlazení mléka vede k ţádoucímu potlačení rozvoje prakticky všech mikroorganismů obsaţených v mléce. Avšak při nízkých teplotách se sloţení mikroflóry posunuje ve prospěch psychrotrofů. Jejich relativní podíl se zvětšuje, zejména pak prosperuje rod Pseudomonas. Někteří zástupci tohoto rodu (Pseudomonas fragi) způsobují ovocnou příchuť. S rozvojem psychrotrofů je spojena produkce škodlivých termorezistentních enzymů, které působí rozkladně i po pasterizaci mléka. V mléčných výrobcích jsou příčinou nečisté chuti (Grieger, Holec, 1990). Chlazení mléka je prakticky vţdy spojeno s mechanickou zátěţí. Nadměrné míchání a čerpání zvyšuje nebezpečí poškození tukových kuliček, coţ vede k lipolýze působením lipázami psychrotrofních mikroorganismů (Grieger, Holec, 1990). Poţadavky na chlazení mléka a mléčných produktů Kaţdý potravinářský produkt má určenou trvanlivost anebo minimální dobu spotřeby. Tyto lhůty jsou platné jen při dodrţení určité maximální anebo niţší teploty na jeho cestě z výroby do obchodu a neměly by být překročené ani na cestě z obchodu ke spotřebiteli a u něho aţ po konzumaci (Görner, Valík, 2004). Podmínky skladování syrového mléka jsou limitovány legislativními předpisy. Nařízení ES č. 853/2004 udává, ţe mléko bezprostředně po nadojení musí být ihned zchlazeno na teplotu 8 C nebo niţší v případě, kdyţ je sváţeno kaţdý den, nebo na 6 C, pokud svoz není prováděn kaţdý den. Během přepravy musí být zachován chladící řetězec. Dále nařízení ES č. 853/2004 ve znění pozdějších předpisů (Nařízení (ES) č. 1020/2008) udává, ţe mléko musí být po přijetí ve zpracovatelském závodě rychle zchlazeno na teplotu nepřekračující 6 C a tato teplota se musí udrţet aţ do doby zpracování. Provozovatelé potravinářských podniků však mohou uchovávat mléko i při vyšší teplotě, pokud ke zpracování dojde ihned po nadojení nebo do 4 hodin od přijetí ve zpracovatelském závodě. 28

29 3.7.3 Tepelné ošetření mléka Pasterace Pasterací rozumíme zahřátí na teploty pod 100 C po různě dlouhou dobu. Při pasteraci dochází k usmrcení převáţné části vegetativních forem mikroorganismů a chuť a vlastnosti mléka jsou ovlivněny jen minimálně (Vlková et al., 2009). Účinek pasterace závisí na těchto faktorech: výše pouţité teploty, doba trvání záhřevu, rychlost dosaţení teploty, síla vrstvy zahřívaného mléka, intenzita pohybu zahřívaného mléka během záhřevu (Šustová, 2010). V mlékařství se pouţívají tři základní druhy pasterace: 1) Dlouhodobá pasterace při teplotách C po dobu 30 minut (Vlková et al., 2009). Pouţívá se ojediněle například při přípravě směsi k výrobě mraţených smetanových krémů. Chemické vlastnosti mléka se téměř nemění (Lukášová, 2001). 2) Krátkodobá (šetrná, nízká) pasterace při teplotách C po dobu sekund (Vlková et al., 2009). Vznikají zde u mléka menší změny fyzikálně-chemických vlastností, a proto je vhodná na výrobu sýrů (Lukášová 2001). 3) Vysoká pasterace při teplotách C do 10 sekund (Vlková et al., 2009). Je nejúčinnější, a proto se pouţívá k výrobě konzumního mléka (Lukášová, 2001). Trvanlivost pasterovaného mléka závisí na kvalitě syrového mléka, platí, ţe čím více je v mléce mikroorganismů před pasterací, tím více jich pasteraci přeţívá. Dále pak na kvalitativním sloţení mikroflóry, na výši pasteračního záhřevu, na případné dekontaminaci a na teplotě uchovávání pasterovaného mléka (Vlková et al., 2009). Podle vyhlášky 203/2003 o veterinárních poţadavcích na mléko a mléčné výrobky musí být pasterované mléko získáno ošetřením zahrnujícím krátkodobý záhřev na teplotu vysokou přinejmenším 71,7 C po dobu 15 sekund nebo jakoukoli 29

30 rovnocennou kombinaci, nebo pasteračním procesem, pouţívajícím jiné kombinace času a teploty za účelem získání rovnocenného účinku. Účinnost pasteračního ošetření by se měla prokazovat negativní reakcí ve fosfatázovém testu Ultrapasterace Technologický postup ultrapasterace se pouţívá při výrobě mléka s prodlouţenou trvanlivostí. Jedná se o ošetření teplotami nad 100 C. Technologický postup je stejný jako při výrobě UHT mléka, jen podmínky záhřevu jsou šetrnější. Trvanlivost takto vyrobených mlék je aţ 6 týdnů při sníţené teplotě (4-6 C) (Vlková et al., 2009) UHT ošetření (Ultra-High Temperature processing) UHT je postup, při kterém jsou usmrceny veškeré formy mikroorganismů v mléce, dochází tedy k jeho sterilaci. Ošetření UHT se pouţívá při výrobě trvanlivého mléka a zahrnuje několik technologických operací. Nejprve je mléko předehřáto, aby došlo k jeho fyzikální stabilizaci, potom dochází k ultrazáhřevu na C po dobu 1-2 sekund, následuje rychlé zchlazení a aseptické plnění a balení mléka. Trvanlivé mléko má fyzikální, chemické a senzorické vlastnosti mléka pasterovaného, ale jeho trvanlivost je podstatně delší, většinou 12 týdnů (Vlková et al., 2009). Cíl sterilace a ultratepelného ošetření mléka: prodlouţení trvanlivosti mléka z několika dní aţ na několik měsíců, zničení všech mikroorganismů i spor, devitalizace anaerobních sporotvorných neurotoxických mikroorganismů (Šustová, 2010) Teplota skladování Skladovací teplota má rozhodný vliv na růst mikroorganismů v mléce. Rychlost růstu se sniţuje klesáním teploty. Pro zajištění dobré kvality mléka je potřeba je rychle zchladit a uchovávat při teplotě niţší jak 5 C. Pomalé zchlazování čerstvě nadojeného mléka dává velkou moţnost pomnoţení neţádoucí mikroflóry. Rovněţ zvyšování teploty zchlazeného mléka přiléváním mléka teplého zhoršuje jeho mikrobiální kvalitu (Grieger, Holec, 1990). 30

31 Mikroorganismy produkující kyseliny se rychle mnoţí při teplotě nad 25 C a způsobují sráţení mléka. Při niţších teplotách skladování se však jiţ bakterie mléčného kysání mnoţí jen velmi pomalu a mnoţí se jiné skupiny mikroorganismů schopných růstu - psychrotrofní. I při nízkých počtech před skladováním jsou po dvou aţ třídenním skladování tyto mikroorganismy dominantní (Gajdůšek, 2003). Psychrotrofní mikroorganismy jsou schopny účinně rozkládat sloţky mléka, mají velké proteolytické a lipolytické schopnosti, netvoří však kyseliny. Jsou velmi odolné proti působení desinfekčních činidel a hůře se chemicky likvidují. Ohroţují mléko skladované při nízkých teplotách a omezují tak uskladnění jak syrového tak i pasterovaného mléka (Gajdůšek, 2003). Maximální doba skladování chlazeného mléka před zpracováním záleţí na počáteční kontaminaci a typu psychrotrofních mikroorganismů a na teplotě skladování. Při 10 C dochází ke značnému pomnoţení mikroorganismů, takţe mléko se dá uchovat bez sníţení kvality jeden den. Má-li se skladovat 2-3 dny, musí být vychlazeno na teplotu 4 C (Grieger, Holec, 1990). Uvádí se, ţe technologické problémy mohou nastat jiţ při počtech psychrotrofních mikroorganismů 10 5 aţ 10 6 KTJ/ml. V čerstvě nadojeném mléce je podíl psychrotrofních mikroorganismů odhadován na % celkové mikroflóry a tento podíl můţe vzrůst během skladování a dopravy mléka za jeden den aţ na %. Psychrotrofní mikroorganismy se sice pasterací převáţně inaktivují, ale jejich enzymy jsou termorezistentní a mohou proto vyvolávat řadu vad. Mléko jimi pozměněné nebo narušené má celkem jinou příchuť jak normální nebo nakyslé mléko. Rostou při 4 C asi za 48 aţ 72 hodin po nadojení, pokud nebylo mléko vychlazeno i dříve. Začátek růstové fáze je dřívější, kdyţ se mléko skladuje při teplotě 8-10 C. (Gajdůšek, 2003). 3.8 Mikrobiální rozklad mléka Působením mikroorganismů a činností jejich enzymů vznikají různě intenzivní smyslové odchylky mléka. Bakteriálnímu rozkladu nejsnadněji podléhá mléčný cukr, mléčné bílkoviny a mléčný tuk (Grieger, Holec, 1990). Mikrobiální enzymy štěpí základní sloţky mléka, čímţ ho znehodnocují. Některé z těchto enzymů jsou termorezistentní, a proto způsobují neţádoucí změny mléka 31

32 i po jeho tepelném ošetření pasterací. Nejdůleţitější enzymy, které sniţují kvalitu mléka a mléčných výrobků jsou mikrobiální lipázy a proteázy (Vlková et al., 2009) Rozklad tuku Prvním stádiem rozkladu tuku je rozpad mléčného tuku na mastné kyseliny a glycerol. Volné mastné kyseliny jsou pak oxidovány a dochází ke vzniku kyseliny octové a mastné kyseliny kratší o dva atomy uhlíku. Rozkladné mikrobiální činnosti podléhají i fosfatidy (vyznačují se zápachem po rybách) (Grieger, Holec, 1990) Mikrobiální lipázy Mikrobiální lipázy představují nejdůleţitější enzymy, které sniţují kvalitu mléka a mléčných výrobků. Silnou lipolýzu v potravinách způsobují mikroorganismy rodů Pseudomonas, Achromobacter, Proteus, Bacillus, Micrococcus, Staphylococcus, Clostridium, plísně a kvasinky (Grieger, Holec, 1990). Mikrobiální lipázy štěpí tuky na diacylglyceroly, monoacylglyceroly a volné mastné kyseliny. Smyslové vady mléka způsobují zejména volné mastné kyseliny s počtem uhlíků C 4 aţ C 12, mezi nimiţ má největší chuťový potenciál kyselina máslová. Pro chuťový vjem vyprodukuje dostatečné mnoţství volných mastných kyselin asi 10 6 KTJ/ml (Görner, Valík, 2004; Vlková et al., 2009). Negativní vliv lipáz se projevuje při nešetrném zacházení s mlékem ještě před jeho pasterací. Lipázy mohou napadat poškozené tukové kuličky, ty jsou na povrchu obaleny lipoproteinovou membránou, která chrání triacylglyceroly před účinkem lipáz. Poškození membrány mechanickými vlivy (turbulence v potrubí, intenzivní míchání atd.), opakovanými náhlými změnami teplot nebo činností proteolytických enzymů urychluje lipolýzu tuku. Rovněţ disperze a velikost tukových kuliček ovlivňují lipolýzu. Čím jemněji jsou kuličky rozptýleny a čím jsou menší, tím větší je lipolýza. Stejné je to pak u homogenizace, po které by měla ihned následovat pasterace mléka, aby byla nativní lipáza inaktivována co nejdříve (Buchvaldková et al., 2006; Grieger, Holec, 1990). Mikrobiální lipázy jsou na rozdíl od mléčných lipáz termorezistentní, zachovávají si aktivitu i po pasteraci. Termorezistence lipáz se liší podle druhu lipolytických mikroorganismů (Grieger, Holec, 1990). Při dlouhodobé pasteraci (63 C za 30 min) 32

33 některé lipázy ztrácejí 15 aţ 60 % svojí aktivity, při šetrné pasteraci (72 C za 17 s) ztrácejí 2 aţ 40 % aktivity a při záhřevu 130 C trvajícím 5 aţ 10 min se jejich aktivita sníţí na minimální hodnoty. Na rezistenci mikrobiálních lipáz v mléku má vliv i skutečnost, ţe jsou chráněné méně tepelně vodivým tukem. (Görner, Valík, 2004). Bylo prokázáno, ţe lipázy Pseudomonas fluorescens jsou odolné nejen vůči teplu, ale i vůči chemickým denaturačním prostředkům. Po ošetření UHT (138 C ± 2 C), bylo z původní činnosti aktivních 50 % lipáz a po 22 dnech skladování při 8 C byla aktivita enzymu o 40 % niţší neţ počáteční hodnota (Burdová et al., 2002). Optimální teplota produkce lipáz je niţší jak optimální teplota růstu příslušných mikroorganismů. U psychrotrofů je asi při 20 C, u mezofilů a termofilů mezi 30 a 40 C. Lipázy jsou ale aktivní i při niţších teplotách. Pro většinu mikrobiálních lipáz leţí optimum jejich účinnosti při neutrální aţ mírně alkalické reakci (Görner, Valík, 2004). Činnost mikrobiálních lipáz v mléce a mléčných výrobcích Čerstvě nadojené mléko obsahuje průměrně 4-6 mmol/kg volných mastných kyselin, při svozu do mlékárny 7-9 mmol/kg. Tyto kyseliny se uvolňují v mléce činností mléčné lipázy. Mikrobiální lipázy se uplatňují v syrovém mléce při nedodrţování hygieny získávání mléka, kdy je dána moţnost pomnoţení lipolytických mikroorganismů. V pasterovaném mléce jsou účinné především mikrobiální lipázy, které mají původ v syrovém mléce nebo jsou produkovány dodatečně kontaminujícími mikroorganismy. Senzorická závada bývá označována jako cizí, krmivová, kovová apod. (Grieger, Holec, 1990). Negativní vliv lipáz se projevuje i u UHT nebo sušeného mléka. Na rozdíl od svých původců můţe termorezistentní mikrobiální lipáza přeţívat UHT záhřev či sprejové sušení a způsobovat tak vznik ţluklé chuti i po dlouhé době bez zjevné mikrobiální kontaminace (Buchvaldková et al., 2006) Rozklad bílkovin Mléčné bílkoviny jsou degradovány četnými mikroorganismy. Šíře a hloubka rozkladu jsou ovlivněny podmínkami při proteolýze. Kasein je rozkládán 33

34 aţ na aminokyseliny, které dále mohou být rozloţeny na amoniak, těkavé kyseliny a sirovodík, a to vţdy kaţdý stupeň příslušnými enzymy (Grieger, Holec, 1990) Mikrobiální proteázy Většina psychrotrofních mikroorganismů produkuje v mléce vedle lipáz také proteolytické enzymy. Mezi nejsilnější producenty patří rody Pseudomonas, Flavobacterium, Proteus, Bacillus, Alcaligenes a některé kvasinky a plísně (Grieger, Holec, 1990). Proteolytické enzymy psychrotrofních bakterií mají podle druhu odlišný charakter. Některé štěpí celou molekulu bílkovin (Bacillus, Pseudomonas, Serratia), jiné aţ niţší štěpné produkty bílkovin (Escherichia, Proteus), proto rozeznáváme dva stupně odbourávání bílkovin: štěpení bílkovin na peptidy, které jsou dále metabolizovány za vzniku amoniaku, sirovodíku, indolu a skatolu. Z kaseinových frakcí nejrychleji štěpí κ-kasein. β-kasein je téţ rychle rozkládaný, naproti tomu α 1 -kasein a syrovátkové bílkoviny neatakují. Rozštěpení κ-kaseinu má za následek koagulaci kaseinů ve formě vápenatých solí (Görner, Valík, 2004; Vlková et al., 2009). Mikrobiální proteázy štěpí všechny mléčné bílkoviny s různou intenzitou. Optimální teplota produkce proteáz je 20 C. Avšak % psychrotrofních kmenů, kdyţ je na to dostatečný čas (více dní skladované mléko), produkuje účinné mnoţství proteáz i při 4 C. Proteázy jsou aktivní v rozsahu ph 4,5-11, maximum aktivity většiny mikrobiálních proteáz je v neutrální oblasti (ph 6,6 aţ 7,0). Proteázy se v mléku hromadí aţ při konci logaritmické fáze jejich růstu. Měřitelná proteolýza bývá aţ při počtech psychrotrofních bakterií 10 6 KTJ/ml. Mikrobiální proteázy jsou stejně jako lipázy termorezistentní. Ztrátu aktivity aţ 90 % způsobují především teploty kolem 55 C (Grieger, Holec, 1990; Görner, Valík, 2004). Mikrobiální proteázy mohou ve významné míře ovlivnit skladovatelnost trvanlivého mléka. I malá reziduální mnoţství, která odolala tepelnému namáhání při výrobě trvanlivého mléka, mohou za delší čas jeho skladování (týdny aţ měsíce) štěpit κ-kasein s následkem vzniku koagulátu kaseinů. Mechanizmus je tu podobný jako při sráţení kaseinů proteolytickými enzymy syřidla. Jeden nanogram extracelulárních enzymů Pseudomonas fluorescens způsobil ve sterilním mléku za tři měsíce degradaci kaseinu (Görner, Valík 2004). 34

35 Činnost mikrobiálních proteáz v mléce a mléčných výrobcích. Při nízkém počtu psychrotrofních mikroorganismů v syrovém mléce nemá proteolýza praktický význam. Psychrotrofní bakterie produkují ve zbytcích mléka na nedostatečně čištěných a dekontaminových plochách dojících strojů štěpné produkty bílkovin (peptidy a volné aminokyseliny), které potom mohou být vyplachované do nadojeného mléka. Jestliţe je mléko kontaminováno plně rostoucími bakteriemi, které mají moţnost se dále rozmnoţovat, způsobuje proteolýza neţádoucí změny, které se následně projeví u mléčných výrobků (Grieger, Holec, 1990; Görner, Valík, 2004). Produkcí proteolytických termorezistentních enzymů způsobují psychrotrofní mikroorganismy ireverzibilní změny v kvalitě mléka a mléčných výrobcích. Většina běţných vad chuti v mléku a v mléčných výrobcích, které souvisí s vysokým počtem psychrotrofních mikroorganismů a jejich enzymy jsou: ovocná a zatuchlá chuť, pozorovaly se i hnilobná, syrová, hořká, nečistá, mýdlová, kvasinková, nebo chuť po rybách (Ducková, Čanigová, 2004). V pasterovaném mléce a ve smetaně stimulují rozmnoţování kontaminujících bakterií, jehoţ výsledkem je zhoršená trvanlivost pasterizovaného mléka a sníţená šlehatelnost smetany (Görner, Valík, 2004). U pasterovaného mléka dochází ke koagulaci bílkovin, které se usazují v láhvi ve formě sedimentu. V dalších stádiích dochází k vytvoření hnilobného zápachu, způsobeného rozkladem bílkovinných sloţek aţ na amoniak, indol aj. Mikrobiální proteázy se výrazně podílejí na hlenovatění trvanlivého mléka. Před vlastním hlenovatěním dochází k fyzikálně chemickým a organoleptickým změnám. Samotné hlenovatění je způsobeno rychlým štěpením κ-kaseinu a β-kaseinu (Grieger, Holec, 1990). Ducková et Čanigová (2004) uvádí, ţe s aktivitou extracelulárních proteáz v pasterovaném a UHT mléce jsou spjaté vady, jako např. sladké sráţení, gelovatění, táhlá - viskózní konzistence, ztekucení, vady barvy - šedá, vznik různých cizích chutí a vůní (např. hořká, nečistá, hnilobná, zkyslá). Dále uvádí, ţe UHT mléko je citlivější na působení proteáz, neţ mléko syrové. Zdůvodňují to tím, ţe syrové mléko obsahuje nativní termorezistentní inhibitory proteáz, které mohou být důvodem větší rezistence bílkovin syrového mléka vůči proteázám psychrotrofních mikroorganismů oproti bílkovinám UHT mléka. Při výrobě kysaných mléčných výrobků a sýrů mají proteázy kontaminujících mikroorganismů stimulační účinek na rychlost produkce kyseliny mléčné mléčnými 35

36 bakteriemi. Tyto nespecifické proteázy vytvářejí příznivé prostředí štěpením kaseinu na peptidy a volné aminokyseliny, které jsou pak zdrojem dusíku, nezbytného pro metabolismus mléčných bakterií (Grieger, Holec, 1990). Peptidy a volné aminokyseliny podporují rychlý růst, coţ významně urychlí kysnutí mléka i zrání sýrů. Nevítaným následkem u sýrů můţe být ztráta celkových bílkovin, vyšší obsah amoniaku a někdy i hořká chuť způsobená vznikem tzv. hořkých peptidů (Görner, Valík, 2004). Těchto poznatků bylo experimentálně vyuţito při výrobě sýrů přidáním izolovaných a vyčištěných proteáz Bacillus subtilis, B. pumilus, B. licheniformis nebo Aspergillus oryzae do mléka. Doba sýření se zkrátila aţ o 60 min, avšak smyslové hodnocení některých výrobků nebylo jednoznačně příznivé (Grieger, Holec, 1990) Význam v mlékařství Z hlediska jakosti mléčných produktů se obyčejně projevuje společný účinek mikrobiálních lipáz jako i proteáz. Sušené mléko vyrobené z mléka déle skladovaného při nízkých teplotách můţe i v inertní atmosféře vykazovat oxidační a lipolytické změny. V másle mohou vzniknout vady způsobené jak proteolytickou, tak i lipolytickou aktivitou psychrotrofních bakterií. Mléčný tuk je proti bakteriím odolnější jak zbytky bílkovin v másle. Proto senzorické vady másla je třeba nejprve připočítat aktivitě proteolytických enzymů. Některé kmeny rodu Pseudomonas rozkládají i aromatické látky másla, redukují diacetyl na nearomatický 2,3 - etylenglykol (Görner, Valík, 2004). V sýrařství se chuťové vady skladovaného mléka snadno přenášejí na sýry. Takto mohou vzniknout v sýrech ţluklost, hnilobná a ovocná příchuť anebo i změny zbarvení těsta a struktury (ţelatinové zrno, slizovitost kůry). Zvýšený obsah psychrotrofních bakterií z rodů Pseudomonas a Flavobacterium a jejich proteáz má vliv na zkrácení doby sýření mléka syřidlem, ovlivnit tuhost sraţeniny, kvalitu sýřeniny, pokles výtěţnosti při výrobě sýrů a chuť sýrů. K sníţení výtěţnosti při výrobě sýrů dochází z důvodu štěpení kaseinu na jednodušší štěpné produkty, které jsou rozpustné ve vodě. Tyto štěpné produkty potom přechází do syrovátky, takţe se v syrovátce zvyšuje obsah rozpustného dusíku a jeho podíl v sýřenině klesá. Tuk v těchto sýrech můţe obsahovat zvýšené mnoţství volných mastných kyselin, coţ se projevuje i vznikem mýdlové chuti (Ducková, Čanigová, 2004; Görner, Valík, 2004). 36

37 V důsledku činnosti proteáz se můţe v některých případech objevit u sýrů hořká chuť jako důsledek přítomnosti tzv. hořkých peptidů. Vady chuti sýrů vyvolané proteázami psychrotrofních bakterií jsou méně časté jako vady způsobené lipázami. Souvisí to s tím, ţe proteázy mají tendenci přecházet do syrovátky, zatímco lipázy jsou zachycené v sýřenině. Co se týká fermentovaných mléčných výrobků, vliv psychrotrofní mikroflóry na růst a aktivitu čistých mlékárenských kultur není jednoznačný. Bylo zjištěno, ţe počty psychrotrofních mikroorganismů převyšující KTJ/g a jejich termorezistentní proteázy mohou vést k fyzikálním a chemickým změnám, ale i k chybám funkčních vlastností a vadám chuti sušeného mléka (Ducková, Čanigová, 2004). Ducková et Čanigová (2004) uvádí, ţe mezi negativní účinky vyplývající z vysokých počtů psychrotrofních mikroorganismů v syrovém mléku a z produkce jejich extracelulárních enzymů bylo zařazeno: ztráty tuku během výroby smetany, sníţení pěnění mléka v automatech na kapučíno, prodluţování doby stloukání másla, neúspěch při výrobě jogurtů a sýrů a celkové zhoršení kvality mléčných výrobků Prevence rozkladu mléka K zamezení ekonomických ztrát, které vznikají činností mikrobiálních proteáz a lipáz v mléce a mléčných výrobcích je potřeba: zabránit pomnoţení psychrotrofních mikroorganismů v syrovém mléce rychlým a účinným zchlazením nadojeného mléka, provádět účinné čištění a dezinfekci zařízení, zabránit dekontaminaci pasterovaného mléka (Grieger, Holec, 1990). 3.9 Psychrotrofní mikroorganismy Pod pojmem psychrotrofní mikroorganismy se podle definice Mezinárodní mlékárenské federace rozumí ty, které rostou při teplotě 7 C a niţší bez ohledu na jejich optimální růstovou teplotu. Tato skupina mikroorganismů vstoupila do pozornosti potravinářských mikrobiologických technologií se vznikem potřeby více jak jednodenního chladírenského skladování rychle se kazících potravin (syrové a pasterizované mléko, 37

38 chlazená drůbeţ a jiné). Takto uloţené potraviny se za několik dní zjevně anebo diskrétně kazily (Görner, Valík, 2004). Tato skupina mikroorganismů je neţádoucí především z důvodů produkce extracelulárních, značně termorezistentních enzymů, schopných rozkládat základní sloţky mléka, zejména mléčné bílkoviny a tuk (Ducková, Čanigová, 2004). Zahrnují morfologické a taxonomické typy, podobné mezofilním bakteriím. Mohou to být krátké i dlouhé tyčinky, koky, grampozitivní nebo gramnegativní, sporulující nebo nesporolující, aerobní i anaerobní. Psychrotrofní mikroorganismy jsou v přírodě velmi rozšířené, vyskytují se ve vodě, v půdě, prachu, na rostlinách, v krmivu, ve výkalech zvířat (Grieger, Holec, 1990). Dobrá pitná voda nemá obsahovat více jak 100 KTJ psychrotrofních bakterií v 1 ml, znečištěná obsahuje 10 3 aţ 10 4 KTJ psychrotrofů v 1 ml. Při oplachování nářadí a zařízení při získávání, opracování a zpracování potravin se jimi kontaminují i potraviny a takto se dostávají do koloběhu (Görner, Valík, 2004). Do syrového mléka se dostávají jednak z výše uvedených zdrojů, jednak z dojícího zařízení. Především mléčné potrubí, ventily a gumové nástavce jsou hlavní zdroje kontaminace. Výplachy z mléčného potrubí mohou obsahovat aţ 10 5 ml -1 mikroorganismů. Vysoké počty mohou obsahovat výtěry z ventilů a výpustných kohoutů (Grieger, Holec, 1990). Proporcionální podíl psychrotrofů v celkovém počtu mikroorganismů v syrovém mléce značně kolísá, a to v závislosti na míře a druhu kontaminace, teplotě a době skladování mléka (Görner, Valík, 2004). Ani vliv ročního období na počet psychrotrofních mikroorganismů není zanedbatelný. Nejvyšší počty těchto bakterií byly zjištěny v měsících červenec, září, říjen a nejmenší hodnoty byly zaznamenány v měsících únor, duben a červen. Je tedy zřejmé, ţe i kalendářní měsíc je statisticky významným faktorem (Ducková, Čanigová, 2004). Počet psychrotrofů do 10 % se vyskytuje v syrovém mléce, získaném za přísných hygienických podmínek, více neţ 75 % se vyskytuje v mléce získaném za špatných hygienických podmínek. Kultury psychrotrofních bakterií z rodu Pseudomonas mají v mléku při 5 C (modelové pokusy) generační dobu 3,6 aţ 9,5 h. Významný vliv má i rychlost ochlazení mléka po nadojení. V důsledku jejich enzymatické činnosti mohou v mléku a v mléčných produktech vyvolat neţádoucí změny. Chuťové změny se obyčejně projevují aţ při jejich obsahu vyšším jak 10 6 KTJ/ml. Tato hranice je však velmi závislá od převládajícího druhu psychrotrofa a od jeho biochemické aktivity (Görner, Valík, 2004). 38

39 Psychrotrofní mikroorganismy obsahují v cytoplazmatické membráně více nenasycených mastných kyselin, coţ jim umoţňuje mít aktivní metabolismus i při nízkých teplotách (Grieger, Holec, 1990). Psychrotrofní mikroorganismy produkují enzymy, které procházejí pasterací v aktivní formě. Degradací sloţek mléka způsobují senzorické vady a technologické škody tím, ţe zhoršují jeho sýrařské vlastnosti a znemoţňují jeho další zpracování. Lipolýza má za následek mýdlovitou vůni a hořkou chuť, proteolýza způsobuje šedou barvu a hořkou chuť kontaminovaného mléka. Neţádoucí vliv na kyselost, alkoholovou stabilitu, sýřitelnost mléka a hydrolýzu mléčného tuku vede ke sniţování výtěţnosti výroby sýrů a k poškození výţivové kvality mléčných potravin (Kirchnerová, 2004). Převáţná většina psychrotrofních bakterií nacházejících se ve vychlazeném mléce jsou gramnegativní, nesporolující tyčinky, zahrnující rody Pseudomonas, Flavobacterium, Alcaligenes, Xantomonas, Achromobacter, Acinetobacter a méně z čeledi Enterobacteriaceae, rody Escherichia, Enterobacter, Citrobacter, Yersinia, Aeromonas, Proteus. Z chlazeného mléka se také izolovaly psychrotrofní kmeny grampozitivních rodů, např. sporotvorného druhu Bacillus (zejména z potravin tepelně upravených), Clostridium, Microbacterium, Streptococcus, Micrococcus,, Corynebacterium. Psychrotrofní jsou i některé plísně a kvasinky (Ducková, Čanigová, 2004; Görner, Valík, 2004). Nejčastěji se vyskytujícím psychrotrofním rodem ve vychlazeném mléku, je rod Pseudomonas (Grieger, Holec, 1990). Většina psychrotrofních mikroorganismů, které jsou přítomné v mléku, nepředstavují pro člověka zdravotní riziko. Existuje však několik výjimek, které mohou způsobovat infekce trávicího traktu a alimentární otravy, např. Bacillus cereus (Ducková, Čanigová, 2004) Psychrotrofní mikroorganismy v pasterovaném mléce Pasterační teploty spolehlivě ničí psychrotrofní mikroorganismy. Jiţ teplota 63 C za 10 s je dostačující k devitalizaci gramnegativních bakterií. Je-li zabráněno rekontaminaci, mléko můţe být skladováno bezpečně při 6-8 C po 48 h. Mléko odebrané ihned za pasterem neobsahuje ţádné psychrotrofní mikroorganismy. K sekundární kontaminaci dochází v mléčném potrubí, v zásobních tancích. Příčiny kontaminace jsou stejné jako u syrového mléka. Jsou to zbytky výplachové vody, nedostatečné čištění a dezinfekce, nízká hygiena prostředí. 39

40 Význam psychrotrofních mikroorganismů spočívá v tom, ţe produkují enzymy, které štěpí základní sloţky mléka. Některé z nich jsou termorezistentní a uchovávají si aktivitu i po pasteraci, takţe způsobují neţádoucí změny v mléčných výrobcích a sniţují tak jejich kvalitu (Grieger, Holec, 1990). Mikrobiologická kvalita pasterovaného mléka je dána zejména výší kontaminace a druhovým zastoupením v rámci skupiny psychrotrofů. Při důkladném chlazení se uplatňují zejména pseudomonády a další bakterie, které nevykazují významnou rezistenci k teplotě (do mléka se mohou dostat jako popasterační kontaminace), při teplotách nad 10 C mohou navíc (i kdyţ pomaleji neţ pseudomonády) také psychrotrofní bacily, které ve formě spor přeţily pasterační záhřev (Němečková et al., 2009). V současnosti je snaha prodluţovat trvanlivost pasterovaného mléka z původních 3 dnů na 5 aţ 10 dní. V této souvislosti se staly aktuálními psychrotrofní kmeny aerobního sporotvorného mikroorganismu Bacillus cereus a potenciální toxinogennost některých kmenů tohoto druhu. Nejnověji byl popsaný psychrotrofní druh této skupiny, který byl identifikovaný jako nový taxon a nazvaný Bacillus weihenstephanensis (Görner, Valík, 2004). V pasterovaném mléce psychrotrofní Bacillus cereus způsobuje defekt sladkého sráţení, a v zahušťovaném mléce růst Bacillus subtilis a Bacillus coagulans způsobuje neţádoucí koagulaci bílkovin. Jsou to indikátory mikrobiologické kvality balených výrobků s dlouhou dobou trvanlivostí. Spory přeţívající pasteraci omezují dobu moţného skladování a zkracují lhůty spotřeby mléčných potravin (Kirchnerová, 2007) Psychrotrofní mikroorganismy v trvanlivém mléce I přes termolabilnost velké většiny psychrotrofních bakterií, způsobují tyto bakterie, i kdyţ nepřímo, problémy i v trvanlivém mléce, které se při jeho výrobě zahřívá na 140 C po dobu 3 aţ 4 s. Důvodem je skutečnost, ţe psychrotrofní bakterie produkují extracelulárně proteolytické a lipolytické enzymy, ze kterých jsou některé velmi termorezistentní. Mezi nejaktivnější producenty se řadí rody Pseudomonas, Flavobacterium, Proteus, Bacillus, Alcaligenes (Görner, Valík, 2004). 40

41 3.9.3 Vliv psychrotrofní mikroflóry na jakost sýrů Sýry patří k nevýznamnějším skupinám fermentovaných potravin. Jsou to, jak uvádí Görner et Valík (2004), více nebo méně koncentrované bílkovinné a tukové produkty vzniklé sráţením kaseinu, který obaluje mléčný tuk a část syrovátky, s přidanou solí, fermentované sacharolyticky, proteolyticky a lipolyticky působením mléčných, mikrobiálních a syřidlových enzymů. Vlastní výroba sýrů je sloţitý proces, ve kterém jsou kladeny vysoké technologické i hygienické nároky nejen na mléko ale i na jednotlivé fáze výroby. Mléko nesmí obsahovat patogenní mikroorganismy, nevhodné je však i mléko, které je kontaminováno velkým mnoţstvím psychrotrofních mikroorganismů, koliformních bakterií a bakterií máselného kvašení. Buňková et al. (2010) uvádí, ţe pokud je dodrţen správný výrobní postup tavených sýrů, lze mezi nejvýznamnější kontaminanty zařadit především psychrotrofní mikroorganismy nebo mikroorganismy schopné růst v prostředí s nízkým obsahem kyslíku. Černý et al. (1999) shrnuje vliv psychrotrofní mikroflóry reprezentované kmenem Pseudomonas fluorescens v kombinaci s vlivem kyselosti sýrů dosaţené před jejich vkládáním do solné lázně na průběh zrání ementálských sýrů a na výslednou jakost zralých sýrů tohoto typu. Výsledky udávají, ţe vyšší počet zárodků kmene Pseudomonas fluorescens v mléce na výrobu sýrů významně mění charakter zrání sýrů. Výsledky senzorického hodnocení, sledování proteolýzy bílkovin i další rozbory prokázaly jednoznačně negativní působení psychrotrofní mikroflóry na průběh proteolýzy bílkovin, změny dalších sledovaných analytů a v celém komplexu působení zejména na výslednou jakost všech sledovaných skupin sýrů. Negativní vliv psychrotrofní mikroflóry, reprezentované pouţitým kmenem Pseudomonas fluorescens, na výslednou jakost zralých sýrů byl prokázán i na obdobných souborech kontrolních a pokusných sýrů eidamského typu a sýrů s plísní na povrchu (Černý et al., 1999) Indikátorový význam psychrotrofních bakterií Indikátorový význam psychrotrofních bakterií ukazuje na primární nebo sekundární kontaminaci potravin z hlediska jejich chladírenského skladování. Jsou ukazatelem dodrţování předepsaných chladících teplot v zemědělské prvovýrobě, hygieně práce 41

42 a sanitaci. V mlékárenské výrobě je třeba dodrţovat podmínky chlazení mezi technologickými operacemi a dbát na úroveň sanitace (Dragounová, 2003). Stanovení psychrotrofních bakterií se oficiálně uskutečňuje kultivací při 6 ± 1 C za 10 dní (na polotuhých mediích tvoří kolonie a v kapalném médiu zákal). Dlouhý čas kultivace významně zvyšuje nároky na prostor termostatů, ale má významnou informační hodnotu. Při této metodě od odběru vzorku po získání výsledků uběhne dlouhý čas. Proto se na provozní stanovení vyvinula skupina metod s kratším kultivačním časem. Mezinárodní mlékařská federace doporučila v r alternativní metodu na stanovení za 25 hodin při kultivační teplotě 21 C (Görner, Valík, 2004) Eliminace rozvoje psychrotrofní mikroflóry Nepříznivý vliv psychrotrofní mikroflóry na kvalitu mléka a mléčných výrobků je moţné prakticky eliminovat především vysoce aseptickým získáváním mléka, jeho ošetřením a uchováváním bez další kontaminace, vychlazením na 4 C a skladováním při této teplotě, zároveň zkracováním doby od získání mléka po jeho zpracování v mlékárně. Další přístup potlačení růstu psychrotrofních mikroorganismů v mléku zahrnuje naočkování syrového mléka bakteriemi mléčného kysnutí. Přídavek čistých mlékárenských kultur, které produkují kyselinu mléčnou, H 2 O 2, antimikrobiální látky, inhibuje sice růst psychrotrofních bakterií v mléku během jeho skladování v chladu, avšak pokles ph naočkovaného mléka můţe vést k vysráţení mléka během následné pasterace (Ducková, Čanigová, 2004) Zástupci psychrotrofních mikroorganismů Rod Pseudomonas (řád Pseudomonadales, čeleď Pseudomonadaceae) Do tohoto rodu se zařazují gramnegativní rovné nebo mírně zakřivené bakterie tyčinkovitého tvaru, které se pohybují pomocí polárně umístěných bičíků, pouze zřídka jsou nepohyblivé. Aerobní se striktně respiratorním typem metabolizmu. Produkce nazelenalých, modrozelených aţ hnědých pigmentů rozpustných ve vodě (fluorescein, pyocyanin), fluoreskující v ultrafialovém záření, je diagnosticky významná jen jako pozitivní znak, neboť mnohé druhy Pseudomonas, které jsou z hlediska ostatních 42

43 rozlišovacích znaků přímo typickými představiteli pseudomonád, neprodukují pigmenty, případně ztratili tuto schopnost během subkultivace (Arpai, Bartl, 1997; Sedláček, 2007). Druhy: Pseudomonas aeruginosa P. aeruginosa je v přírodě značně rozšířený. Zařazuje se, tak jako všechny pseudomonády, mezi psychrotrofní bakterie. Vyskytuje se v půdě, povrchových vodách, na rostlinách a ovoci. Způsobuje pomalé sráţení mléka, které peptonizuje a alkalizuje (Gajdůšek, Klíčník, 1993; Görner, Valík 2004). P. aeruginosa, podobně jako i jiné pseudomonády, je velmi rezistentní vůči nepříznivým vlivům prostředí a můţe se rozmnoţovat i při nízké teplotě a při minimálním obsahu ţivin, umývadlové mísy, spáry v dlaţbě, klimatizační zařízení, zvlhčovač vzduchu, voda v květinových vázách, stroje na umývání kuchyňského a jídelního nádobí, nedostatečně čištěné a dekontaminované plochy, hlavně v prvovýrobě mléka a mléko, které s těmito plochami přišlo do styku. Pro jeho rezistenci odolává i účinkům některých dekontaminačních činidel, a proto se z prostředí těţko eliminuje. P. aeruginosa můţe vyvolat akutní gastroenteritidu nebo enterokolitidu hlavně u telat a u osob oslabených jiným vyčerpávajícím onemocněním. Enteropatogenní kmeny produkují termolabilní enterotoxin proteinové povahy. Enterotoxické vlastnosti se zjistili i u P. putrefaciens a několika dalších druhů rodu Pseudomonas (Görner, Valík 2004). Pseudomonas fluorescens liquefaciens Je tyčinkový mikrob, škodlivý zejména v mléce delší dobu skladovaném při nízkých teplotách pod 10 C, neboť jeho optimum růstu je 5 aţ 10 C. Kromě rozkladu bílkovin vyvolává téţ ţluknutí mléčného tuku. Pseudommonas syncyanea Je příčinou barevných vad mléka - vytváří šedomodré skvrny na povrchu mléka. Pseudomonas putrefaciens Rozkládá bílkoviny a do mléka se dostává převáţně s krmivy (Gajdůšek, Klíčník, 1993). 43

44 Rod Bacillus Bacillus cereus se nachází v syrovém mléce zpravidla v malém mnoţství, v jednotkách KTJ/ml. Nebezpečná je jeho vlastnost, ţe jako sporotvorný mikrob přeţívá pasteraci, kterou je současně zbaven přirozených antagonistů v mléce, bakterií mléčného kvašení. V chlazeném pasterizovaném mléku se můţe po dobu jeho vícedenního chladírenského skladování (8 C a niţší) rozmnoţovat. Jím vytvořené toxiny mohou způsobit u konzumentů alimentární otravu (Jičínská, Havlová, 1995). Technologický a hygienický význam Patogeneze Bacillus cereus je nepochybně technologicky nejdůleţitější a současně i hygienicky rizikový bakteriální kontaminant mléka. Rychlost znehodnocování mléka a mnoha mléčných produktů po výrobě, v garanční době, je v současných podmínkách chlazení mléka určována kontaminací B. cereus. Se zlepšujícími se hygienickými podmínkami a systematickým vyuţíváním chlazení ve všech fázích produkce a zpracování mléka určují uchovatelnost výrobku mikroorganismy, které přeţívají pasteraci a rychle se rozmnoţují i při nízké teplotě. B. cereus, který je psychrotrofní a tvoří termorezistentní spory, tyto technologicky neţádoucí vlastnosti má (Jičínská, Havlová, 1995). Avšak B. cereus nejenţe je determinujícím faktorem znehodnocování mléka, je navíc i etiologickým agens jedné z alimentárních intoxikací způsobovaných mléčnými výrobky. B. cereus způsobuje řadu vad nebo méně prudkých infekčních onemocnění a otrav z potravin, které jsou zapříčiněné tvorbou emetického nebo diarhogenního toxinu. Produkují i další virulenční faktory - fosfolipáza, hemolyzin aj. - které zvyšují jeho patogenní potenci. Oba typy onemocnění jsou bez specifických komplikací a obvykle trvají méně neţ 24 hodin. Příleţitostně však můţe otrava způsobená B. cereus vést aţ k úmrtí pacienta. Riziko představuje i B. licheniformis - některé kmeny tohoto druhu jsou toxinogenní a mohou způsobovat otravy z potravin (Němečková et al., 2006; Jičínská, Havlová, 1995). Bacillus cereus a Bacillus licheniformis jsou mikroorganismy s velkým významem pro mlékárenské výrobky, a to jak z hlediska zdravotní nezávadnosti, tak z hlediska senzorické kvality a trvanlivosti finálních výrobků. 44

45 Mezi nejvýznamnější vady vyvolané působením enzymů patří změny konzistence - sladké sráţení mléka, gelovatění nebo tvorba sedimentu, a senzorické vady jako je hořknutí či zatuchlá chuť (Němečková et al., 2006). Psychrotrofní kmeny bacilů jsou příčinou organolepticky nepříjemných vlastností mnohých mléčných výrobků (mléko, smetana, sýr), jako je např. hořká, zatuchlá, ţluklá, shnilá, trpká nebo ovocná příchuť. Za tyto organoleptické defekty zodpovídají zejména B. sphaericus, B. subtilis, B. cereus, Brevibacillus laterosporus, Paenibacillus macerans, P. polymyxa. Tyto mikroorganismy jsou schopné růst při 1-4 C a byly izolovány také z pasterovaného mléka a smetany. Některé psychrotrofní bacily, jako jsou např. B. cereus a B. cereus var. mycoides produkují enzymy lecitinázu či fosfolipázu. Činností těchto enzymů mohou vzniknout další vady mléčných výrobků, např. sladké sráţení mléka (Buňková et al., 2010). Zdroje kontaminace Ke kontaminaci syrového mléka dochází nejčastěji při dojení ze znečištěných vemen řetězcem postupných kontaminací: půda krmivo zaţívací trakt dojnice hnůj vemeno dojení mléko. Postpasterační kontaminace je dvojí: spory ze syrového mléka, které prošly pasterací, z prostředí závodu - stykem s nedostatečně očištěnými povrchy zařízení, z vnějšího prostředí - z obalů, z balicího materiálu, z ovzduší - v důsledku netěsnosti uzávěrů nebo švů obalů (Jičínská, Havlová, 1995). Taxonomie Buňky B. cereus jsou gram-pozitivní, pohyblivé, jednotlivé, ve dvojicích nebo řetízcích. Spory jsou eliptické, umístěné centrálně, nenadouvají sporangia. B. cereus je fakultativně anaerobní, biochemicky aktivní. Minimální teplota růstu psychrotrofních kmenů adaptovaných na mléko a mlékárenské prostředí je 6 aţ 10 C. Optimální ph pro růst je 7,0 aţ 7,4. Vegetativní buňky nepřeţívají pasterační záhřev 72 C (16-17 s), ale spory mohou být tímto záhřevem aktivovány. Spory jsou termorezistentní a nejsou poškozovány obvyklým pasteračním záhřevem. Nepřeţívají sterilizaci mléka v autoklávu při 110 C a UHT proces při 134 C (Jičínská, Havlová, 1995). 45

46 Bacillus subtilis, zvaný téţ senný bacil, tvoří dlouhé tyčinky. Je to aerob a ztekucuje ţelatinu. Mléko sráţí a zvolna peptonizuje. Vyskytuje se v půdě a suché píci, odkud se dostává do mléka (Gajdůšek, Klíčník, 1993). Prevence Zcela nezbytné je dodrţování dobrého sanitačního reţimu v prvovýrobě i ve zpracovatelských závodech. Mytí a dezinfekce vemen sniţuje obsah spor B. cereus v čerstvě nadojeném mléce aţ 10krát. V ţádném případě nesmí být zařízení, které přišlo do styku s mlékem v mlékárnách nebo v prvovýrobě, ponecháno nevyčištěné nebo jen propláchnuté vodou. Film zředěného vysychajícího mléka, který se vytvoří na povrchu výrobního zařízení nebo uvnitř prázdného potrubí, poskytuje ideální podmínky pro indukci sporulace B. cereus a další rozšíření spor v prostředí. Při výrobě ve zpracovatelských závodech, během dopravy, v trţní síti, v kuchyních společného stravování i v domácnostech nesmí být výrobky, polotovary, hotové nebo rekonstituované pokrmy ponechány delší dobu (několik hodin) při pokojové teplotě, aby se předešlo pomnoţení B. cereus. Aţ do pouţití musí být uchovávány při teplotě do +5 C (Jičínská, Havlová, 1995) Rod Flavobacterium Gramnegativní tyčky se zakulacenými konci převáţně nepohyblivé, jen velmi zřídka i peritrichní tyčinky. Nesporolující, proteolytické, aerobní aţ fakultativně anaerobní. Kataláza, oxidáza a fosfatáza pozitvní. Tvoří podle sloţení ţivného média ţluté, oranţové, červené nebo ţlutohnědé pigmenty. Glukosu spotřebovávají oxidačně. Z glycidů tvoří kyseliny, netvoří plyn. Vyskytují se v půdě, ve vodě a potravinách (Arpai, Bartl, 1997; Sedláček, 2007). Flavobacterium aquatile Flavobacterium fucatum Flavobacterium lutescens (Arpai, Bartl, 1997) Rod Alcaligenes Gramnegativní tyčky, kokotyčky nebo koky, uspořádané většinou jednotlivě. Nesporolující, pohyblivé peritrichálními bičíky, obligátně aerobní. Nepigmentující, 46

47 oxidáza a kataláza pozitivní, indol negativní. Vyskytují se především ve vodě a v půdě, příleţitostně způsobují oportunní infekce člověka. Alcaligenes faecalis subsp. faecalis Alcaligenes faecalis subsp parafaecalis (Sedláček, 2007) Rod Micrococcus Zahrnuje přísně aerobní druhy, všechny jsou schopny růstu v přítomnosti 5 % NaCl. Vyskytují se hlavně na solených potravinách, kde mohou tvořit ţluté, oranţové aţ intenzivně růţové kolonie. Toto zabarvení je způsobeno nerozpustnými karotenoidními barvivy, která chrání buňky před letálními účinky ultrafialové sloţky slunečního světla, a proto se uvedené bakterie vyskytují jako častá vzdušná kontaminace (Šilhánková, 2002) Čištění a dezinfekce v mlékárenském průmyslu Zpracování mléka jako téměř ideálního substrátu pro široké spektrum mikroorganismů klade velké nároky na proces čištění a sanitace výrobního zařízení. Lze říci, ţe takřka třetina provozního času v mlékárně se věnuje čištění. Správné a bezchybné čištění se stává prostředkem ke zvýšení trvanlivosti mléka a mléčných výrobků a součástí péče o zdravotní nezávadnost těchto výrobků (Lukášová, 2001). Sanitace (čištění a dezinfekce) je poslední fází prvovýroby mléka. V systému řízení jakosti, hygienické a zdravotní nezávadnosti potravin (HACCP Hazard Analysis Critical Kontrol Point) představuje velmi kritickou (rizikovou etapu) (Zadraţil, 2002). Nečistoty ulpělé na zařízení můţeme rozdělit podle moţnosti jejich odstranění: nečistoty rozpustné ve vlaţné vodě bez pouţití čisticích prostředků jedná se především o jednoduché soli a mléčný cukr, nečistoty rozpustné v roztoku čisticího prostředku v důsledku chemických reakcí: o nečistoty rozpustné v kyselinách (minerální látky), o nečistoty rozpustné v alkáliích (tuky, mastné kyseliny, bílkoviny a ostatní organické nečistoty), 47

48 nečistoty nerozpustné v čisticích prostředcích (v prvovýrobě mléka se vyskytují velmi málo). Vlastní proces čištění probíhá v podstatě ve třech fázích: 1) Oddělení nečistot z čištěného povrchu mechanickým působením, chemickým působením (alkálie nebo kyselina). 2) Dispergace rozpuštění nečistoty v čistícím roztoku omýváním čištěného místa přívodem nového roztoku. 3) Zabránění zpětnému usazení dispergovaných částic na vyčištěný povrch. Účinnost sanitačních prostředků je závislá na: 1) Koncentraci prostředku zvyšující se koncentrace urychluje usmrcování mikroorganismů, negativně však můţe zvýšená koncentrace působit na čištěné materiály (guma, plastické hmoty). 2) Teplotě s růstem teploty do určité míry příznivě stoupá baktericidní účinek, závisí však na druhu pouţitého prostředku. 3) Době působení potřebná doba je závislá na citlivosti mikroorganismů vůči prostředku (Zadraţil, 2002) Druhy čištění Z hlediska charakteru čistícího postupu lze rozeznat následující druhy čištění: fyzikální čištění - odstranění všech viditelných nečistot z čištěného povrchu, chemické čištění - odstranění nejen viditelných ale všech mikroskopických, zbytků nečistot, které mohou způsobit závady v chuti a vůni vyráběných výrobků, bakteriologické čištění - pouţití dezinfekce, sterilizace - destrukce všech mikroorganismů. V mlékárenských čistících postupech se sleduje dosaţení chemické a bakteriologické čistoty současně. Povrch zařízení přicházející do styku s produktem se proto nejprve čistí chemicky a potom dezinfikuje. 48

49 Chemické čištění V mlékárnách se zásadně pouţívá kombinace alkalických a kyselých čisticích prostředků, coţ je dáno povahou usazenin na vnitřním povrchu technologického zařízení (Lukášová, 2001). Dezinfekce Správně provedené alkalické a kyselé čištění nemá za následek pouze čistou fyzikální a chemickou, ale také bakteriologickou. Bakteriologický efekt můţe být dále zesílen desinfekcí, která odstraní mikroorganismy na zařízení. U výroby trvanlivých výrobků je nezbytné sterilizovat zařízení úplným odstraněním bakterií z povrchu. Desinfekce se můţe provádět ráno, bezprostředně před započetím výroby, nebo po skončení pracovního dne (Lukášová, 2001). Dezinfekce je soubor opatření, která likvidují choroboplodné zárodky a přerušují cestu přenosu infekce od zdroje k vnímavému jedinci. Dezinfekce je také součástí opatření ke zdolání nákaz a prevence jejich vzniku. Podle pouţitých prostředků a způsobu provedení se rozeznávají různé druhy dezinfekce (mechanická, fyzikální, chemická, biologická a kombinovaná). Při desinfekci dojících a chladících zařízení se vyuţívá zejména kombinovaných účinků chemických látek spolu s fyzikálními a mechanickými prostředky. Mikrobiologická čistota všech mléčných dopravních a kontaktních cest je důleţitým momentem pro dosaţení poţadované mikrobiologické kvality mléka (Seydlová, 2003). Personální hygiena Důleţitou součástí provozního čištění a sanitace je personální hygiena pracovníků přicházejících do styku se surovinami, obaly a hotovými výrobky. Zahrnuje systém výměny a praní pracovních oděvů, čištění pracovní obuvi a mytí a desinfekci rukou pracovníků. Součástí systému je zamezení nebezpečí přenosu infekčního onemocnění z pracovníka do výrobku a také způsob provádění pravidelného školení pracovníků (Lukášová, 2001). 49

50 4 MATERIÁL A METODIKA V rámci praktické části bakalářské práce byly mikrobiologicky analyzovány vzorky kozího mléka a kozích sýrů. 4.1 Mikrobiologický rozbor vzorků mléka a sýrů Analyzovaný materiál K mikrobiologickému rozboru byly pouţity vzorky a) kozí mléko b) kozí sýry V analyzovaném materiálu byl stanoven celkový počet mikroorganismů (CPM), a psychrotrofní bakterie (PSM) Příprava laboratorních pomůcek Laboratorní sklo bylo umyto v teplé vodě s přídavkem mycího prostředku, opláchnuto ve studené a nakonec v destilované vodě. Poté bylo vloţeno do sušárny a vysušeno při 100 C. Laboratorní sklo pouţité při mikrobiologickém rozboru bylo sterilizováno v horkovzdušném sterilizátoru 165 C 1 hodinu. Pipety s ústním zazátkovým kouskem vaty byly vysterilizovány v hliníkové fólii. Ehrlenmayerovy baňky byly sterilizovány uzavřené hliníkovou fólií. Zkumavky s destilovanou vodou a Ehrlenmayerovy baňky s ţivnými půdami byly sterilizovány v parním sterilizátoru 20 minut při 121 C. Při rozboru byly pouţity jednorázové Petriho misky Příprava kultivačních půd Typy pouţitých půd pro jednotlivé mikroorganismy GTK (PCA) pro stanovení CPM - kultivace při 30 C, 72 hodin, PCA agar pro stanovení psychrotrofních bakterií - kultivace při 6,5 C, 10 dní. 50

51 Ředící roztok Jako ředící roztok byl pouţit fyziologický roztok Sloţení: chlorid sodný destilovaná voda 8,5 g/l 1000 ml GTK agar (Milom a.s.) Tato půda byla pouţita pro stanovení celkového počtu mikroorganismů a k rozlišení acidogenní a alkaligenní mikroflóry. Sloţení: trypton 5,0 g/l kvasničný extrakt sušený 2,5 g/l glukosa 1,0 g/l čínská modř 0,3 g/l agar (dle ztuţovací schopnosti) 10,0-18,0 g/l Konečné ph 7,0 ± 0,2 při 25 C. Ţivná půda, připravená v lahvičkách jiţ od výrobce, byla v den potřeby rozvařena a zchlazena na teplotu 45 ± 1 C. PCA agar se sušeným odstředěným mlékem (Biokar Diagnostics, Francie) Sloţení: trypton 5,00 g/l kvasničný extrakt sušený 2,50 g/l glukosa 1,00 g/l sušené odstředěné mléko 1,0 g/l bakteriolog. agar 12,0 g/l Příprava: Naváţka 21,5 g sušené půdy se rozpustí v 1 litru destilované vody a zahřívá se do úplného rozpuštění. Sterilizuje se v autoklávu 15 minut při 121 C. Konečné ph při 25 C je 7,0 ± 0, Zpracování vzorků Ze sýrů se na digitálních vahách odváţí vzorky o hmotnosti 10 g do sterilního plastikového sáčku a přidá se 90 ml fyziologického roztoku. Sáček se uzavře svorkou a vloţí se na 1 minutu do homogenizátoru typu STOMACHER, čímţ se obsah sáčku důkladně promíchá. Takto získáme ředění

52 Po homogenizaci se ze sáčku se vzorkem odebere pipetou 1 ml a převede se do zkumavky s 9 ml fyziologického roztoku, čímţ se získá ředění U vzorků mléka se odebírá 1 ml přímo z láhve s mlékem po jejím promíchání. Z tohoto ředění se pipetou opět odebere 1 ml do další zkumavky s 9 ml fyziologického roztoku a takto se pokračuje aţ do ředění 10-7, kdy předpokládáme nejvyšší moţnou kontaminaci. Metoda desetinného ředění se provede u všech vzorků. Z kaţdé takto připravené zkumavky se po důkladném promíchání jejího obsahu odebere pipetou 1 ml na předem připravenou Petriho misku. Pro kaţdé jednotlivé ředění jsou nachystány 2 Petriho misky. Misky s napipetovaným inokulem se zalijí odpovídající půdou (zchlazenou na 45 C) a krouţivými pohyby se promíchá inokulum s agarem. Po ztuhnutí agaru se misky obrátí dnem vzhůru, aby nedocházelo ke kontaminaci kondenzující vodou, a vloţí se do termostatu nebo do chladničky podle poţadavků zkoumaných mikroorganismů. Během celého průběhu zpracování vzorků musí být kladen důraz na maximální sterilitu, aby nedošlo ke kontaminaci mikroflórou z vnějšího prostředí Způsob vyhodnocování výsledků Po ukončení doby inkubace byly misky vyndány z chladničky a termostatu a spočítány jednotlivé kolonie mikroorganismů. Psychrotrofní mikroorganismy vytvářely bělavě zbarvené kolonie. Pro výpočet se podle odpovídajících norem mají pouţít misky obsahující kolonií v případě celkového počtu mikroorganismů a u psychrotrofních mikroorganismů kolonií. Počet mikroorganismů na 1 ml mléka se vypočetl dle rovnice: ( a b c d) V ( n 0,1 n ) d 1 2 kde: ΣC V n 1 n 2 d je součet kolonií spočítaných na Petriho miskách, objem inokula, počet ploten vybraných k počítání z prvního ředění, počet ploten vybraných k počítání z druhého ředění, první z obou vybraných ředění. 52

53 Výsledné počty mikroorganismů se vyjádřily jako počet kolonií jednotlivých mikroorganismů, zkratka KTJ (kolonie tvořící jednotky) na 1 mililitr mléka/1 gram sýru. Při provádění mikrobiologického rozboru vzorků mléka se vycházelo z metod uvedených v těchto normách: ČSN ISO 6610 Stanovení počtu jednotek mikroorganismů tvořících kolonie (stanovení alkaligenních a acidogenních mikroorganismů). ČSN ISO 6730 Stanovení počtu jednotek tvořících kolonie psychrotrofních mikroorganismů (PSM). Obr. 3 Psychrotrofní mikroorganismy na živné půdě PCA 53