Kazící mikroflora biogenní aminy. Bakterie a kvasinky

Transkript

1 Kazící mikroflora biogenní aminy Bakterie a kvasinky

2 Mikroflora působící kažení potravin Co to je mikrobiální kažení potravin Faktory ovlivňující kažení potravin Projevy mikrobiálního kažení Přehled kazících mikroorganismů (KM) Potraviny napadané mikroby Bakterie vyvolávající měkkou hnilobu ovoce a zeleniny Monitorování a detekce KM Mikrobiální indikátory kvality potravin Prevence kažení potravin

3 Projevy kažení Zkažená potravina má odlišné sensorické vlastnosti vizuální, čichové, chuťové apod. Kažení se může vyskytovat v kterékoli části potravního řetězce. Kažení může vznikat po mechanickém ataku hmyzu, fyzikálním poškozením, otlak, zmrznutím,vysušením apod. Aktivita enzymů z vlastní potraviny Chemické změny Kažení je komplex biologických, fyzikálních, chemických a biochemických změn.

4 Mikroorganismy působící kažení potravin Gram negativní tyčinky Pseudomonas Alteromonas Potraviny bohaté na bílkoviny při chladicích teplotách Gram negativní tyčinky Gram negativní tyčinky Gram negativní tyčinky Gram pozitivní nesporulující tyčinky Acetobacter, Acetomonas, Gluconobacter Fer.:Enterobacteriaceae: Escherichia coli Nefer.:Acinetobacter, Xanthomonas Koryneformní bakterie Corynebacterium Alkoholické nápoje Limonády Většina potravin. bílkovinných surovin Většina potravin. bílkovinných surovin Nakládané maso a párky, čerstvé maso vakuuově balené,zelenina Gram pozitivní koky Gram pozitivní nesporulující tyčinky Aer.: Micrococcus Fak.aer.: Staphylococcus Homoferm a heteroferm. Lactobacillus sp. Mléčné výrobky, solené maso Mléko, mléčné výrobky, ferment. mléč. výrobky, maso a zelenina balená ve vakuu

5 Nejčastější kazící mikroorganismy Gram pozitivní Gram negativní Sporotvorné nesporulující, BMK Koliformní Pseudomonas Bacillus Micrococcus Lactobacillus Citrobacter Acinetobacter Clostridium Brocotrix Streptococcus Serratia Aeromonas Leuconostoc Proteus Alcaligenes Pediococcus Escherichia Moraxella Enterobacter Altermonas Erwinia Flavobacterium Klebsiella Hafnia

6 Potraviny napadané mikroby Zdroje kazících organismů pocházejí z půdy a vody, rostlin a jejich produktů, prachu, gastrointestinální trakt zvířat a lidí, Zkáze nejrychleji podléhají chlazené čerstvé potraviny bohaté na proteiny (červené maso, drůbež, ryby, mléčné výrobky). Všechny jsou vysoce výživné, mají velký obsah vody a w, relativně neutrální ph. Z dalších čerstvých potravin, které jsou napadané je to ovoce a zelenina

7 Mikroorganismy působící kažení potravin Mesofilní aerobní a fak. anerobní bakterie Kvasinky a plísně Sporotvorné bakterie: - aerobní a fak. anaerobní - mesofilní - termofilní, anaerobní Psychrofilní a psychrotrofní Kyselinotvorné Proteolytické Lipolytické Slizotvorné halofilní, osmolifní, osmotolerantní

8 Přehled kazících mikroorganismů Gram negativní tyčinky: nejčastěji napadají čerstvé chlazené potraviny, min růst T 0-3 o C, při 5-10 o C rostou rychle. Nejvíce se vyskytuje Pseudomonas, Moraxella, Acinetobacter, Aeromonas, Alteromonas, Flavobacterium Koliformní tyčinky: poněkud vyšší T optimum, 8-15 o C Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Proteus. Serratia, Hafnia, Erwinia Gram pozitivní tyčinky: sporulující Bacillus, Clostridium, Alicyclobacillus

9 Přehled kazících mikroorganismů Bakterie mléčného kvašení: fermentují cukry za tvorbu kys. mléčné, výsledkem je pokles ph. Vydrží až ph 3,6. Další Gram pozitivní bakterie: Brocothrix thermosphacta na čerstvém mase, Micrococcus spp. roste i přítomnosti NaCl

10 Kyselinotvorné : Bacillus, Clostridium, Streptococcus, Pediococcus, Leuconostoc, Staphylococcus, Lactobacillus, Propionibacterium, Bifidobacterium, čeleď Enterobacteriaceae, Acetobacter, plísně, kvasinky Lipolytické: Pseudomonas, Rhizopus, Geotrichum, Aspergillus, Penicillium, Debaryomyces, Rhodotorula, Hansenula, Candida, Yarrowia Proteolytické: Bacillus, Clostridium, Proteus, Serratia, Mucor, Thamnidium, Geotrichum, Aspergillus, Penicillium

11 Sporotvorné bakterie Bacillus, Clostridium, Desulfotomaculum Důležité : spory přežívají 100 o C při ph nižším než 4 spory neklíčí Základ stanovení : kultivace po usmrcení vegetativních buněk

12 Aerobní a fakultativně anaerobní termofilní Rod Bacillus Mesofilní: inaktivace 30 min. při 80 0 C Termotolerantní: B.coagulans 8min. při C Inkubace při 30 0 C, ph 4,0-7,0, rozmnož C Termofilní: B. stearotermophilus Inkubace při 55 0 C, ph více než 5,3 Plynuprosté kysání nekyselých konzerv Chladový šok

13 Mesofilní sporotvorné anaeroby Proteolytické druhy rodu Clostridium Cl.sporogenes, Cl. putrefaciens, Cl.bifermentans rozklad bílkovin za tvorby merkaptánů, indolu, skatolu, kadaverinu, putrescinu, CO 2, H 2 = bombáž konzerv

14 Sacharolytické druhy V sýrařství Cl. tyrobutyricum zkvašuje laktát na máselnou kyselinu za silného vývoje plynu, působí nežádoucí duření sýrů Toxinogenní druhy Cl. botulinum, Cl. perfringens Kultivační teploty C, Cl.putrefaciens C

15 Termofilní sporotvorné anaeroby Cl. thermosaccharolyticum působí bombáž kyselých konzerv obsahujících sacharidy a uchovávaných nad teplotu 30 0 C, nemá proteolytické enzymy, netvoří toxiny Opt. ph 6,2-6,7, ale i ph 4,1-4,6, neroste pod 37 0 C Škrob, obiloviny, koření, sušení houby, sušené mléko, konzervovaná zelenina, rajčatové výrobky Důvod rozvoje = pomalé chlazení konzerv

16 Termofilní sporotvorné anaeroby Desulfotomaculum nigricans G- tyčinky, netvoří bombáže, tvoří H 2 S ze síranů a cysteinu Roste při C může se rozmnožovat i při C, opt. tep C, ph 6,2-7,8, ale pomalý růst při ph 5,6 Nekyselé konzervy

17 Alicyclobacillus sp. Termo-acidofilní bakterie, tvoří endospory, aerobní, růst v rozmezí C, ph 3-6, optimum 4 4,5 Některé rody jsou schopny produkovat spory při ph nižším než 3,2 a je schopna produkovat 2,3-dibromfenol a 2,6 dichlorfenol, guajakol A. pomorum, A.acidoterrestris, A. hesperidum, A. cycloheptanicus, A. herbarius, A. sendaiensis

18 Psychrofilní mikroorganismy Psychrofilní C, opt. teplota< 20 0 C Psychrotrofní rostou ještě ve stejném rozmezí teplot, bez ohledu na jejich opt. Teplotu ( může být i 30 0 C) Pseudomonas, Flavobacterium, Alcaligenes některé druhy Bacillus, Clostridium, kvasinka Geotrichum, plísně Sporotrichum, Botrytis, Thamnidium, Mucor Proteolytické, lipolytické vlastnosti V pitné vodě patří mezi stanovené ukazatele, jejichž množství může být ze závažných důvodů překročeno

19 Kyselinotvorné mikroorganismy Kysání potravin Bacillus, Clostridium, Streptococcus, Pediococcus, Leuconostoc, Staphylococcus, Lactobacillus, Propionibacterium, Bifidobacterium, čeleď Enterobacteriaceae, Acetobacter, plísně, kvasinky Méčné bakterie - katalázový test v mlékárenství, v pivovarství

20 Proteolytické mikroorganismy Mikrobiální rozklad bílkovin vznik toxických aminů a zápachu Bacillus, Clostridium, Proteus, Serratia, Mucor, Thamnidium, Geotrichum, Aspergillus, Penicillium Stanovení půda s odstředěným mlékem, kaseinem a CaCl 2, hydrolýza želatiny

21 Slizotvorné mikroorganismy Leuconstoc (melasa, limonády, maso) Bacillus (pečivo, strouhanka), Fusarium Slizotvorná pouzdra na bázi polysacharidů a polypeptidů Stanovení: půda s 20% sacharosy (6-10 kolonií)

22 Slizotvorné mikroorganismy Bacillus subtilis a B. mesentericus jsou termofilní. Spory těchto bakterií přečkávají teplotu pečení, která nepřekročí 100 C uvnitř chleba, za příznivých podmínek klíčí Napadány bývají zejména výrobky vyšší hmotnosti a z pšeničné mouky. Nitkovitost je výsledkem tvorby slizovitých pouzder těchto bakterií společně s enzymovou hydrolýzou lepku a škrobu, který po zcukření podporuje tvorbu pouzder. Střída chleba začne druhý až třetí den po upečení vlhnout, maže se, je lepivá, zbarvuje se dožluta a odporně hnilobně páchne. Při doteku se vytahuje do dlouhých nití, což je patrné zejména při rozlomení bochníku.

23 Lipolytické mikroorganismy Hydrolýza a oxidace tuků Pseudomonas, Rhizopus, Geotrichum, Aspergillus, Penicillium, Debaryomyces, Rhodotorula, Hansenula, Candida, Yarrowia Smetana, máslo, majonézy, sýry, ořechy, čokoláda apod. Základ stanovení půda s tukem a se síranem nilské modři

24 Halofilní bakterie - slabé 2-5% NaCl Pseudomonas, Moraxella, Acinetobacter, Flavobacterium ryby, korýši halotolerantní rostou i bez NaCl, ale pro rozmnožování potřebují více než 5% Microccocacea (Staphylococcus aureus), Některé bacily a klostridia (Cl. botulinum, Cl. perfringens

25 Halofilní bakterie - mírné 5-20% NaCl (Bacillus, Clostridium, Mikrokoky, Vibrio costiola) půda s 10% NaCl lák naloženého uzeného masa, slanečci - extrémní % NaCl - Halobacterium, Haloccocus půda s 25% NaCl - Karotenoidní barviva, proteolytické vlastnosti, aerobní, sliz na mase, rybách

26 Přehled kazících mikromycet a kvasinek Kvasinky: Candida, Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Torulospora, Rhodotorula, Pichia Plísně: Aspergillus, Mucor, Penicillium, Rhizopus, Geotrichum, Botrytis, Cladosporium, Byssochlamys

27 Kvasinky Bakterie mléčného kvašení Octové bakterie Kažení vína Kyselost čím je ph nižší, tím je pro mikrorganismy těžší přežít Alkohol inhibuje většinu mikrobů, včetně kvasinek, hlavně 15 18%. Teplota růst je obvykle nejrychlejší při C a zpomalený při sklepních teplotách (10-15 C) Oxid siřičitý koncentrace od 20 mg/l inhibuje růst mikroorganismů Zbytkový cukr přítomnost zkvasitelných cukrů zvyšuje riziko kažení obzvláště kvasinkami Růstové faktory např. nutrienty jako aminokyseliny a vitaminy Vzduch (kyslík) nezbytný pro růst aerobních octových bakterií Hygiena vinařství

28 Hlavní typy kazících kvasinek Saccharomyces cerevisiae, Debaryomyces hansenii Pichia anomala, Pichia membranifaciens, Pichia fermentans, Pichia burtonii, Candida parapsilosis, Candida zeylanoides subpelliculosa, Candida guilliermondii, Candida albidus, Candida tropicalis, Torulaspora delbrueckii, Issatchenkia orientalis, Zygosaccharomyces bailii, Zygosaccharomyces bisporus, Cryptococcus spp., Zygosaccharomyces rouxii, Hansenula anomala, Kluyveromyces marxianus, Saccharomyces exiguus, Sporobolomyces roseus, Trichosporon pullulans, Trichosporon cutaneum, Hanseniapora uvarum

29 Vinařství Produkce 4-etylfenolu Brettanomyces/Dekkera spp. v červených vínech je pokládaná za kažení pouze v případě, že tento sekundární metabolit je přítomen v množství větším než 620 μg/l. Méně než 400 μg/l, přispívá ke zlepšení komplexity vína neboť podporuje aromatické znaky koření, kůže a další aromata oceňovaná konsumenty. Nad 620 μg/l, vína jsou pro řadu konzumentů podřadná, ale pro mnohé zůstavají příjemná.

30 Otázky spojené s kazícími kvasinkami (i) Co vlastně jsou kazící kvasinky? (ii) Má potravinářský průmysl dostatečné informace aby mohl odpověďně řešit mikrobiologické problémy potravin? (iii) Kde jsou zdroje kazících kvasinek v potravinářském průmyslu? (iv) Má potravinářský průmysl vhodné zymologické indikátory pro určení kvality potravin a pro zavedení testů na kvalitu potravin a uzavírat čestné (fair) obchodní smlouvy mezi maloobchody a velkoobchody?

31 Osmofilní kvasinky Zygosacharomyces rouxii, Z. bailii 60% sacharozy, snáší EtOH a SO 2 (víno), odolná vůči konzervačním prostředkům Wickerhamia fluorescens 50% sacharosy Sirupy, med, čokoládové bonbony s čokoládovou náplní prýštění náplní

32 Osmofilní plísně Aspergillus glaucus, Penicillium Džemy, sušené ovoce a zelenina, obilí, čokoládové bonbony, chléb, pečivo apod. Media s 8 event. 40% sacharozy

33 Faktory ovlivňující kazící mikrofloru 1. Počáteční množství všech mikrobů 2. Typ potraviny/vnitřní vlastnosti - ph - a w - Obsah živin - antimikrobiální látky - Eh Redox potenciál (oxidativně-redukční potenciál) - Biologické struktury

34 Procesní a skladovací podmínky - tepelné zákroky - okyselení (acidifikace) - snížení vodní aktivity - užití konservačních látek - skladování při nízkých teplotách - atmosféra skladování - kombinace shora uvedených

35 Projevy mikrobiálního kažení Viditelný růst, pigmentové kolonie, hlavně plísně Tvorba plynu Sliz Difuze pigmentů a enzymů Zápach (off-odours) Špatná chuť (off-flavors) Produkce metabolitů: alkohol, estery, ketony, sirné sloučeniny fluoreskující pigmenty organické kyseliny, diaminy

36 Projevy mikrobiálního kažení Kysnutí - mléčné výrobky, vakuově balené masné výrobky, pivo, víno, ovocné šťávy Chem. příčina - kys. octová,mléčná, citronová,máselná Organismus bakterie mléčného kvašení, Bacillus sp., Brochothrix thermosphacta, - bakterie máselného kvašení, Acetobacter spp., příslušníci rodu Clostridium, -

37 Projevy mikrobiálního kažení Kvašení ovocné šťávy, majonézy, saláty Chem. příčina etanol Organismus kvasinky Hnojový pach zelenina Chem. příčina p-kresol, indol, skatol Organismus Erwinia sp. Clostridium sp. Sliz maso, cukr,výrobky Chem. příčina tvorba polysacharidů Organismus Pseudomonas fragi, Leuconostoc mesenteroides, Bacillus subtilis

38 Projevy mikrobiálního kažení měknutí/hnití ovoce a zelenina Chem. příčina pektinasy, cellulasy, xylanasy Organismus Erwinia, Clostridium, kvasinky, plísně Tvorba plynu - sýry, tvaroh, olivy, Chem. příčina tvorba oxidu uhličitého Organismus - bakterie mléčného kvašení, kvasinky Tvorba biogenních aminů ryby, sýry

39 Bakterie vyvolávající měkkou hnilobu ovoce a zeleniny Erwinia carotovora subsp. atroseptica (většina ovoce a Erwinia carotovora subsp. carotovora zeleniny) Erwinia chrysanthemi (ananas) Pseudomonas marginalis zelenina Pseudomonas viridiflava Fazole Pseudomonas cichori čekanka, endive, zelí, salát

40 Monitorování a detekce KM Přímé mikrobiologické metody Chemické/ fyzikální/ fyzikálněchemické metody Molekulárně biologické metody - PCR Kriteria přijatelnosti potravin sensorické posouzení barvy, textury, vůně, chuti a celkového vzhledu

41 POTRAVINY A SKUPINY POTRAVIN MIKROBIOLOGICKY NERIZIKOVÉ a) lihoviny (o obsahu etanolu nad 20% objemových) b) ocet c) potravinářská barviva a aromata d) přírodní a náhradní sladidla e) sůl kuchyňská a přípravky na bázi soli f) jedlé oleje g) tuky (s výjimkou směsných emulgovaných tuků) h) chléb a běžné pečivo i) trvanlivé pečivo j) nečokoládové cukrovinky k) káva pražená a kávoviny

42 POTRAVINY A SKUPINY POTRAVIN MIKROBIOLOGICKY NERIZIKOVÉ l) čaj pravý (fermentovaný, polofermentovaný, zelený) m) sušené náhrady mléka a smetany do teplých nápojů n) mouka, luštěniny, rýže a výrobky z nich (v suchém stavu) o) dehydrované sojové výrobky p) škrob, výrobky ze škrobu a výrobky z brambor (v suchém stavu) q) pivo, víno r) nealkoholické nápoje (včetně výrobků v prášku) s) hořčice t) sterilizované potraviny u) pasterované ovoce a zelenina, ovoce naložené v lihu, ovocné pomazánky v) doplňky stravy (bez složek rostlinného nebo živočišného původu

43 Biogenní aminy Biogenní aminy jsou přirozené antinutriční faktory a jsou významné z hygienického hlediska. Bývají spojovány s celou řadou případů otrav z potravin a jsou schopné iniciovat různé farmakologické reakce. Histamin, putrescin, kadaverin, tyramin, tryptamin, β-fenyletylamin, spermin a spermidin jsou považovány za nejvýznamněší biogenní aminy vyskytující se v potravinách.

44 Engogenní a exogenní biogenní aminy Endogenní aminy jsou tvořeny mnoha typy tkání (např.: adrenalin v dřeni nadledvinek, histamin v mastocytech (žírné buňky pojivové tkáně) a játrech. Aminy se šíří místně nebo přes krevní systém. Exogenní aminy se absorbují z jídla v zažívacím traktu. Alkohol může zvýšit absorpční rychlost. Monoaminoxidasa (MAO) rozkládá biogenní aminy a brání přebytečné resorpci. MAO inhibitory (MAOI) se také užívají jako medikace léčby depresí, aby zabránily MAO v rozkladu aminů důležitých pro pozitivní účinky.

45 Biogenní aminy Histamin látka odvozená z aminokyseliny histidinu, působí jako neurotransmiter zprostředkovájící přenos signálu, dále je signálem zánětlivých onemocnění. Histamin je také významným stimulantem sekrece HCl v žaludku, pomocí histamin H2 receptoů. Tyramin - látka nacházená v mnoha běžných potravinách, je spojován se zvýšným krevním tlakem a bolestmi hlavy.

46 histamin Jako mediátor se uplatňuje i v patofyziologických procesech, zejména při alergické reakci 1. typu a zánětlivé reakci. Dále má podíl při některých mechanismech nauzey a zvracení. Při alergických reakcích zastává histamin roli antigenu, který je uvolňován z mastocytů a bazofilních granulocytů. Síťuje molekuly protilátek IgE na povrchu mastocytů, čímž dochází k jeho exocytóze z buněk. Histamin uvolněný do kůže způsobí zvýšení permeability kapilár, zčervenání kůže a přispívá k tvorbě podlitin.

47 Serotonin Serotonin - neurotransmiter centrálního nervového systému, odvozený z aminokyseliny tryptofan účastní se regulace pochodů jako spánek, chuť k jídlu a sexualita. Tryptamin - monoamin alkaloid nalezený ve stopových množstvích v mozku savců, a zdá se, že má roli jako neuromodulátor nebo neurotransmitter.

48 Tři katecholaminové neuropřenašeče: Norepinefrin (noradrenaline) - neurotransmiter regulace spánku, únavy, nespavosti, pozornosti a příjmu potravy, právě tak stresový hormon uvolňovaný nadledvinkami, reguluje nervovou dráhu sympatiku. Epinefrin (adrenaline) - stresový hormon nadledvinek, právě tak neurotransmiter přítomný v nízké koncentraci v mozku. Dopamin - neurotransmiter řídící motivaci, závislosti, posilování chování a koordinaci pohybů těla.

49 Detekce producentů biogenních aminů Detekce BA-produkujících bakterií pomocí kultivačních technik je pomalá a nejistými výsledky. Mnoho studií popsalo ztrátu schopnosti tvorby BA u LAB po delším skladování nebo po kultivaci izolovaných kmenů na syntetických mediích. Metody založené na molekulární biologii jsou rychlé, spolehlivé a nezávislé na kultivaci. Tyto metody dávají informace o potenciálním riziku tvorby těchto látek.

50 Proč jsou nebezpečné Toxicita histaminu se zdá být zesilovaná přítomností ostatních aminů, jako je kadaverin, putrescin a tyramin. Biogenní aminy mohou být také považované za karcinogeny, neboť mají schopnost reagovat s nitrity za tvorby potenciálně karcinogenních nitrosaminů. Obsah biogenních aminů v různých potravinách a krmivech byl sledován a byly nalezeny v sýrech, rybách a masných výrobcích, vejcích a houbách.

51 Vznik biogenních aminů Potraviny připravené fermentačními procesy, nebo ty, které byly vystaveny mikrobiální kontaminaci během vyzrávání a skladování pravděpodobně obsahují aminy. Alkoholické nápoje jako pivo mohou obsahovat biogenní aminy, jako další fermentované potraviny např. kyselé zelí a potraviny ze soji. Aminy jsou také považované za endogenní rostlinné látky, některé druhy ovoce a zeleniny obsahují vysoké koncentrace různých aminů.

52 Limity obsahu biogenních aminů Histamin- rybí výrobky z druhů spojovaných s vysokým obsahem histidinu. To jsou čeledi: Scombridae, Clupeidae, Coryfenidae, Pomatomidae, Scombresosidae Vzorkovací plán : n (9), c(2), m 100mg/kg, M 200mg/kg Dále rybí výrobky které prošly enzymovým zracím ošetřením v nálevu a nejsou vyrobené z druhů spojovaných s vysokým obsahem histidinu. Vzorkovací plán : n (9), c(2), m 200mg/kg, M 400mg/kg Analytická metoda - HPLC