DISTRIBUCE GENŮ REZISTENCE NA ČOV

Transkript

1 VODA 2017, Poděbrady, DISTRIBUCE GENŮ REZISTENCE NA ČOV Eva Proksová Karol Król Kristýna Časarová Jana Říhová Ambrožová Dana Vejmelková

2 PROBLEMATIKA REZISTENCE NA ANTIBIOTIKA MOŽNOSTI DETEKCE ÚVOD

3 ANTIBIOTIKA látky, které usmrcují mikroorganismy nebo inhibují jejich růst a množení působí především proti bakteriím (dále někt. houbám, parazitickým prvokům) známo více než 9000 látek s ATB účinkem, z toho několik desítek: humánní a veterinární medicína k léčbě infekčních stavů, někdy též preventivně (tzv. ATB profylaxe) problém chybné použití (nevhodné ATB, nevhodné dávkování, nedodržení léčby, atd.) rozvoj rezistence zvýšená nemocnost, úmrtnost a náklady na terapie = jeden z hlavních

4 Fuchsová et al VYBRANÉ TŘÍDY ANTIBIOTIK Třída antibiotik ß-laktamy Aminoglykosi dy Chinolony Sulfonamidy Zástupci Peniciliny (ampicilin), Peniciliny rezistentní k penicilinase (methicilin), Cefalosporiny (cefamycin), Karbapenemy (meropenem), Monobaktamy (aztreonam) streptomycin, gentamycin, amikacin, netilmicin, isepamycin, tobramycin, spektinomycin ciprofloxacin, norfloxacin, ofloxacin, levofloxacin, pefloxacin, moxifloxacin, prulifloxacin sulfamethoxazol, sulfasalazin, sulfathiazol, sulfisoxazol, sulfadiazin Cílové místo působení Biosyntéza peptidoglykanu buněčné stěny Inhibice syntézy bílkovin, translace vazba na 30S podjednotku ribozómu Inhibice syntézy nukleových kyselin DNA replikace Inhibice syntézy nukleových kyselin inhibice kyseliny

5 Fuchsová et al VYBRANÉ TŘÍDY ANTIBIOTIK Třída antibiotik Glykopeptidy Amfenikoly Makrolidy Tetracykliny Ansamyciny a mnoho dalších.. Zástupci vankomycin, teikoplanin chloramfenikol erytromycin, spiramycin, roxitromycin, klaritromycin Azalidy (azitromycin) tetracyklin, doxycyklin rifampicin, rifabutin, rifaximin Cílové místo působení Biosyntéza buněčné stěny blokáda esenciálního substrátu Inhibice syntézy bílkovin, translace vazba na 50S podjednotku ribozómu Inhibice syntézy bílkovin, translace vazba na 50S podjednotku ribozomu Inhibice syntézy bílkovin, translace vazba na 30S podjednotku ribozómu Inhibice syntézy nukleových kyselin, transkripce inhibice DNA dependentní RNA polymerasy Inhibice syntézy nukleových kyselin

6 Upraveno dle Stalder et al ŠÍŘENÍ REZISTENCE ČLOVĚK vs. PROSTŘEDÍ DomácnostiNemocnice Průmysl Výroba Jatka Hospodářská antibiotik zvířata ČOV Zemědělství Rybí farmy Půda Pitná voda Řeka

7 ŠÍŘENÍ REZISTENCE rezistence k antibiotikům kódována specifickými geny (R-geny) neseny na bakteriálním chromozomu nebo na malých extrachromozomálních částicích (př. plazmidy, ) mobilní genetické elementy - oproti chromozomu menší molekulární hmotnost, jednodušší struktura flexibilnější horizontální přenos genů (nezávislý na příbuznosti/podobnosti) bakteriální DNA plazmidy chromozom plazmid

8 HNACÍ SÍLY ATB REZISTENCE 1. antimikrobiální látky (př. antibiotika, antivirotika) 2. těžké kovy 3. biocidy (př. desinfekční čin., povrchově aktivní látky) některé mechanismy rezistence společné pro biocidy/ těžké kovy a antibiotika umožnění koselekce R-genů př.: efluxní pumpa (kovy: Cu, Co, Zn, Cd, Ni, As; ATB: tetracyklin, chloramfenikol, ß-laktamy) snížení permeability membrány (kovy: As, Cu, Zn, Mn, Co, Ag; ATB: ciprofloxacin, tetracyklin, chloramfenikol, ß-laktamy)

9 CO SE DĚJE NA ČOV? hotspot rezistentních bakterií a R-genů vhodné prostředí pro šíření rezistence přítomnost antimikrobiálních látek, (těžkých) kovů, biocidů doba kontaktu vysoká koncentrace MO množení R-genů/R-bakterií korezistence př. odolnost vůči desinfekčním činidlům Domácnosti NemocnicePrůmyslVýroba antibiotik Pitná voda Rybí farmy ČOV Řeka Půda Jatka Hospodářská zvířata Zemědělství

10 METODY DETEKCE FENOTYPOVÉ (KULTIVAČNÍ) DIFÚZNÍ A DILUČNÍ TESTY 1. Disková difúzní metoda (kvalitativní) Mueller-Hinton agar přeočkování předem vykultivované kolonie nanesení antibiotických disků inkubace (16-20 h) ATB se postupně uvolňuje do agaru a inhibuje růst citlivých bakterií vytvoření inhibičních zón změření, interpretace výsledků: rezistentní / intermediárně rezistentní / citlivý

11 METODY DETEKCE FENOTYPOVÉ (KULTIVAČNÍ) 2. Gradientová difúzní metoda (E-test) (kvantitativní) přeočkování na agar stejný postup nanesení proužku - logaritmicky klesající gradient antibiotika inkubace kapkovitá inhibiční zóna místo, kde okraj zóny protne okraj proužku minimální inhibiční koncentrace (MIC) nevýhoda: vyšší cena

12 METODY DETEKCE FENOTYPOVÉ (KULTIVAČNÍ) 3. Diluční metoda (kvantitativní) diluční mikrometoda v mikrodestičce odstupňované koncentrace ATB (ředěné geometrickou řadou) smíchání s bujónem, naočkování inkubace (24 h) růst buněk se projevuje zákalem zjištění MIC: nejnižší koncentrace, která již zabraňuje růstu

13 METODY DETEKCE GENOTYPOVÉ (DNA) DETEKCE R-GENŮ 1. Sekvenování nové generace vyšší cena znalost bioinformatiky interpretace dat 2. DNA mikročipy princip hybridizace vyšší cena 3. Polymerázová řetězová reakce (PCR) specifické primery pro detekci jednotlivých R-genů, avšak 1 ATB více R- genů! (multiplex) qpcr - možnost kvantifikace monitoring, porovnávání

14 POROVNAT VÝSKYT R-GENŮ V RŮZNÝCH ČÁSTECH ČOV/POLOPROVOZNÍ AnMBR JEDNOTKY CÍL PRÁCE

15 schema koloběhu? VZORKOVÁNÍ KULTIVAČNÍ METODY, DNA ANALÝZA - PCR METODIK A

16 VZORKOVÁNÍ: ČOV + PILOTNÍ JEDNOTKA AnMBR AnMBR (6 odběrů) přítok kal odtok mikrofiltrace odtok ultrafiltrace ČOV (2 odběry) odtok z usazovací nádrže aktivovaný kal (Aer - nitrifikace, An anaerobní) odtok z ČOV

17 KULTIVACE dle norem: Escherichia coli (TNV ), Enterococcus spp. (ČSN EN ISO ), Clostridium perfringens (Vyhl. MZ ČR č. 252/2004 Sb.) kultivace 1 2 dny, potvrzení potvrzené kolonie přeočkovány na Mueller-Hinton agar

18 DISKOVÁ DIFÚZNÍ METODA dle EUCAST (dostupné i v češtině web SZU) ATB disky: Ampicilin (AMP 10 µg), Ciprofloxacin (CIP 5 µg), Sulfamethoxazole (50 µg), Streptomycin (10 µg, 300 µg), Sulfonamid (300 µg) inkubace 20 h

19 POLYMERÁZOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE (PCR) zakoncentrování vzorku (filtrace/centrifugace) izolace DNA (PowerSoil kit) PCR se specifickými primery detekce bakterií: E. coli, enterokoky, C. perfringens detekce genů rezistence: ß-laktamy (bla-shv, TEM, CTX-M), sulfonamidy (sul1, sul2, sul3)

20 VÝSLEDK Y

21 VÝSLEDKY - KULTIVACE AnMBR (6 odběrů) ČOV (2 odběry) Vzorek E. coli enterokoky C. perfringens přítok + + +/- (3/2) kal + + +/- (3/2) odtok M +/- (3/3) +/- (2/4) - odtok U +/- (4/2) +/- (3/3) +/- (1/4) odtok UN An AK Aer AK odtok ČOV + + +/- (1/1)

22 VÝSLEDKY DISKOVÁ DIFÚZNÍ METODA AnMBR Vzorek E. coli enterokoky AMP* CIP AMP CIP přítok R/R/R R/R/R C/C/C R/R/C kal R/R/R R/R/IR C/C/C R/C/C odtok M R/R/R R/R/R nd/c/c nd/r/c odtok U R/R/R R/IR/IR nd/c/c nd/r/c * E. coli přirozeně rezistentní k AMP R = rezistentní, IR = intermediárně rezistentní, C = citlivý

23 VÝSLEDKY DISKOVÁ DIFÚZNÍ METODA ČOV Vzorek E. coli enterokoky AMP* CIP AMP CIP odtok UN nd/r nd/r nd/c nd/r An AK R/R R/R R/C C/C Aer AK nd/c nd/r nd/c nd/r odtok ČOV R/R R/R C/C C/R R = rezistentní, C = citlivý

24 VÝSLEDKY PCR Vzorek E. coli enteroko ky C. perfringen s ß-laktamové R-geny Sulfonamid. R- geny bla-shv TEM CTX-M Sul1 Sul2 přítok kal /- (4/2) odtok M - +/- (3/3) - - odtok U - +/- (3/3) /- (5/1) +/- (3/3) +/- (4/2) odtok UN An AK

25 VÝSLEDKY KULTIVACE vs. PCR AnMBR Vzorek E. coli enterokoky C. perfringens Kultivace PCR Kultivace PCR přítok kal odtok M odtok U +/- (3/3) +/- (4/2) - - +/- (2/4) +/- (3/3) +/- (3/3) +/- (3/3) Kultivac e +/- (2/2) +/- (3/2) PCR /- (1/4) odtok UN

26 SHRNUTÍ PLÁNY DO BUDOUCNA ZÁVĚR

27 SHRNUTÍ neshodné výsledky kultivací a PCR, nejcitlivěji se jeví detekce enterokoků potřeba optimalizace geny rezistence k sulfonamidům detekovány ve všech vzorcích ß-laktamové R-geny detekovány ve většině vzorků membrány U/M mají v daném uspořádání potenciál redukovat šíření bakterií a ß-laktamových R-genů neexistuje ideální metoda detekce bakterií rezistentních na antibiotika a R-genů potřeba kombinace metod

28 PLÁNY DO BUDOUCNA určení falešně pozitivních/ falešně negativních výsledků MALDI-TOF MS identifikace vykultivovaných kolonií optimalizace PCR: použití jiných primerů pro detekci C. perfringens detekovat více R-genů pomocí PCR přejít na qpcr možnost kvantifikace a porovnávání monitoring ČOV s různým uspořádáním

29 SPECIÁLNÍ PODĚKOVÁNÍ: Dr. Josef Máca, Ing. Petr Dolejš, Ing. Jakub Hejnic, Ing. Vojtěch Kouba, Doc. Jan Bartáček DĚKUJI ZA POZORNOST