SBORNÍK REFERÁTU Z ICHTYOLOGICKÉ KONFERENCE

Transkript

1

2 SBORNÍK REFERÁTU Z ICHTYOLOGICKÉ KONFERENCE (Vodňany května 1994 ) Editoři: Jindřiška Mikešová Zdeněk Adámek Výzkumný ústav rybářský a hydrobiologický Vodňany Česká republika

3 Použité materiály a označení v této publikaci jsou původní a jejich význam nebyl upravován ISBN: Tisk: Výzkumný ústav rybářský a hydrobiologický, Vodňany Distribuce: Výzkumný ústav rybářský a hydrobiologický, Vodňany Česká republika

4

5

6 DÉLKO-HMOTNOSTNÍ VZTAH U LAREV A JUVENILŮ JELCE TLOUŠTĚ (LEUCISCUS CEPHALUS) M. PROKEŠ Úvod Ř e š e n á p r o b l e m a t i k a v ý z k u m u p a r a m e t rů délkohmotnostního vztahu u larev a juvenilnich jedinců jelce tlouště (Leuciscus cephalus), navazuje na výzkum reprodukce, rané ontogeneze a sezónního růstu tohoto druhu v p ř i - rozeném prostředí řeky Rokytné, který byl proveden v letech (Prokeš 1977, 1978, 1981; Prokeš a Peňáz 1980; Prokeš a kol. 1977, 1978) a na výzkum produkční b i o l o g i e plůdku ryb, který byl proveden v roce 1992 (Prokeš 1994, Prokeš a kol. 1993). Získané výsledky jsou srovnány s parametry, které b y l y získány stejnou metodou u kapra obecného a okouna ř íčního (Szlamiňská a kol. 1989, Prokeš 1992, 1993), s cílem zjistit, zda rozdílný průběh délko-hmotnostního vztahu během larvální periody vývoje může být z hlediska ontogenetického specifický pro vyšší systematické taxony (řády, čeledě). Metodika a materiál Materiál byl získán elektrolovem v řece Rokytné v letním a podzimním období roku Po odlovu byl veškerý plůdek fixován ve 4% roztoku formaldehydu a laboratorně zpracován později. U každého jedince bylo provedeno jeho zařazeni do vývojové etapy, zjištěny tři základni délky (TL,FL,SL v mm) a hmotnost (w v g). Celkem bylo tímto způsobem zpracováno 160 jedinců 0+ a 299 jedinců 1+ (viz tab. 1). K vyjádření délko-hmotnostního vztahu bylo použito exponenciální, prediktivní regrese (y=ax b ) a k proložení hodnot regresního koeficientu b bylo použito polynomické regrese (y = a + bx + cx 2 + dx 3 ). Označení sledovaných lokalit je následující: Bu1 Budkovice, úsek pod panelovým brodem toku řeky, Bu2- Budkovice, regulovaný úsek nad panelovým brodem, Vel Vémyslice, regulovaný úsek nad panelovým prahem toku řeky v místě silničního mostu z Vémyslic do Tulešic, Vé2- Vémyslice, úsek toku řeky pod panelovým prahem, Ta- Tavíkovice, Km-Kašparův mlýn, Př- Příštpo, Ja1 Jaroměřice nad Rokytnou, úsek toku nad splavem, Ja2- Jaroměřice nad Rokytnou, úsek toku pod splavem (podrobněji - viz Prokeš 1994). Výsledky Průběh délko-hmotnostního vztahu se výrazně měnil během larvální periody vývoje a poměrně malá proměnlivost byla zjištěna v průběhu juvenilní periody vývoje. Nejnižší hodnota regresního koeficientu b (0,932), vyjadřujícího strmost nárůstu hmotnosti se zvyšující se délkou zkoumaných jedinců byla zjištěna během první larvální etapy ontogenetického vývoje. Nejvyšší hodnota tohoto koeficientu (4,892) byla zjištěna během páté larvální etapy vývoje. Od Šesté larvální etapy vývoje se zjištěná hodnota regresního koeficientu b pohybovala v poměrně úzkém rozmezí hodnot (2,664-3,339). Během juvenilní periody vývoje nebyly zjištěny mezi hodnota- 5

7 Diskuze Získané výsledky plně potvrdily správnost závěrů Szlamiňské a kol. (1989), která zjistila u larev kapra obecného maximální hodnotu regresního koeficientu b v průběhu 4 a 5 larvální etapy ontogeneze a v dalším období vývoje výrazný pokles tohoto koeficientu až k hodnotě 3. Prokeš (1993) zjistil u larev a juvenilních jedinců okouna říčního m a x i- mální hodnotu b koeficientu až na začátku druhé juvenilní etapy vývoje, tj. až po ukončení všech základních vývojových změn, charakteristických pro larvální periodu vývoje a pro první juvenilní etapu ontogenetického vývoje. Zjištěný rozdíl zřejmě souvisí s vývojem plynového měchýře, který se během 4a 5 larvální etapy z větší části dokončuje (Prokeš 1978, Prokeš a Peňáz 1980),a s rozdílnou ekologicko - etologickou charakteristikou cyprinidů a percidů, známou pro larvální periodu vývoje. Cyprinidi jsou při příjmu potravy závislí na funkci plynového měchýře, u percidů funkci plynového měchýře do doby jeho plného vývinu nahrazují tukové kapky, které umožňují jedincům tohoto druhu udržet se ve vrstvách vody, které jsou z hlediska nabídky dostupné potravy (planktónu) nejpříhodnější (proto tzv. název ichtyoplankton). Nejnižší hodnota b koeficientu, zjištěná u jelce tlouště během první larvální etapy vývoje opět dokumentuje skutečnost, že období zahájení příjmu exogénni výživy je u ryb velmi kritickým obdobím rané ontogeneze (Peňáz 1992). Lineární charakter vztahu délky a hmotnosti se během první larvální etapy vývoje v případě vhodného prostředí a dostatečného množství dostupné potravy velmi rychle mění v exponenciální (Prokeš a Perez 1991). Při nevhodných, nebo ne plně dostatečných podmínkách prostředí však může b koeficient kdykoliv během larvální periody vývoje opět klesnout na hodnotu blízkou 1, což determinuje výrazně kri tický stav organizmu larev (Prokeš a Peňáz 1992, Máchová a kol.1992). Vzhledem ke skutečnosti, že v období larválního vývoje jsou organizmy nejcitlivější k faktorům vnějšího prostředí a diference parametrů, charakterizujících stav organizmu jednotlivých jedinců je největší (Prokeš 1993) a naopak metody, kterými se provádí zjištění fyziologických hodnot jsou velmi omezené vzhledem k malé velikosti larev, je parametr délko-hmotnostního vztahu velmi významným kritériem pro determinaci hmotnostní kondice larev a nepřímo, vhodným k r i t é- riem pro determinaci kvality životního prostředí larev i juvenilních jedinců. 6

8 Tab.l. Celková délka (TL v mm) a hmotnost (w v g) larev a juvenilů jelce tlouště, Leuciscus cephalus, zjištěná na zkoumaných lokalitách řeky Rokytné v roce

9 Tab.2. Hodnoty regresních a korelačních koeficientů exponenciální, prediktiní regrese (y=ax b ) délko-hmotnostní ho vztahu larev a juvenilů jelce tiouště (Leuciscus cep-halus) na zkoumaných lokalitách reky Rokytné v roce 1992 Obr. 1. Variabilita regresního koeficientu b u vývojových etap larev a juvenilů jelce tlouště (Leuciscus cephalus)

10 Literatura Máchová, J., Svobodová, Z., Vykusová, B., Prokeš, M., Peňáz,M., 1992: Vývoj a růst eleuterembryí a larev kapra obecného, Cyprinus carpio, při omezeném krmení živým zooplaanktonem. In: Adámek,Z. a Flajšhans,M. (eds) : Sb. Reprodukce ryb '92, VÚRH Vodňany, ČSFR 1992, s Peňáz,M., 1992: Raná ontogeneze ryb fauny ČSFR. Doktorská disert. práce, ÚSEB ČSAV, Brno 1992: 102 s. + přílohy 16 publikací. Prokeš,M., 1977: Raný vývoj a růst jelce louště, Leuciscus cephalus (Linnaeus, 1758) v říčce Rokytné. Vertebrat. zprávy 1977: Prokeš,M., 1978: Produkční biologie a bionomie hlavních druhů ryb řeky Rokytné. Kand. dis. práce, ÚVO ČSAV, Brno 1978: 371 s. Prokeš,ML, 1981: Seasonal growth of chub Leuciscus cephalus, in the Rokytná Stream. Folia Zool., 30(4): Prokeš,M., 1992: Studie o vztahu mezi délkou a hmotností u plůdku okouna říčního, Perca fluviatilis. In: Adámek,Z. a Flajšhans,M. (eds.): Sb. Reprodukce ryb '92, VÚRH Vodňany, ČSFR 1992, s Prokeš,M., 1993: Length-weight relationship of perch (Perca fluviatilis) larvae and juveniles in the Mostiště Reservoir. Folia Zool., 42(2): Prokeš,M., 1994: Diversita, abundance a biomasa plůdku ryb řeky Rokytné. In: Sb. Ichtyol. konf., Vodňany 1994: v tisku Prokeš,M. a Peňáz,M., 1980: Early development of the chub, Leuciscus cephalus. Acta Sc. Nat. Brno, 14(7): Prokeš,M. a Peňáz,M., 1992: Mortalitní,ontogenetická a somatická charakteristika eleuterembryi a larev kapra obecného, Cyprinus carpio, chovaných v laboratorních podmínkách při částečné a plné absenci krmení živým zooplanktonem. Zpráva ÚSEB ČSAV, Brno 1992: 35 s. Prokeš,M. a Peréz Martinez, A., 1991: Growth of Cichlasoma tetracanthum 0+. Folia Zool., 40(1): Prokeš,M., Libosvárský,J., Baruš,V., 1977: Scale growth in juvenile chub, Leuciscus cephalus, from the Rokytná Stream. Folia Zool., 26(3): Prokeš,M., Libosvárský,J., Baruš,V., 1978: Computed growth of juvenile chub, Leuciscus cephalus, from the Rokytná Stream. Folia Zool., 27(1): Prokeš,M., Baruš,V., Halačka,K., Hlavová,V., Lusk,S., Peňáz,M.,1993: F 5 Společenstva ryb ve vodách oblasti energetické soustavy Dukovany-Dalešice. Zpráva ÚEK AV ČR, Brno 1993: 26 s. Szlamiňská,M., Kamler,R., Bergot,P., Barska,B.,Jakubas,M., Kuczyňski,M., Raciborski,K., 1989: The course of the relationship between body weight and length during development of carp (Cyprinus carpio L.) larvae. Pol. Arch. Hydrobiol., 36(1): Adresa autora: M. Prokeš, Ústav ekologie krajiny AV ČR Květná 8, Brno 9

11 STRUKTURA EPIDERMIS ŠTIKY OBECNÉ (Esox lucius) K. HALAČKA Souhrn Pokožka štiky obecné (Esox lucius) obsahuje velmi hojné sekreční buňky dvou typů - pohárkové (v sekretu převažuji kyselé sialinizové glykoproteiny) a váčkovité (sekret tvoří pouze glykoproteiny neutrální) - lišící se svoji ultrastrukturou. Buňky pigmentové nebyly v pokožce nalezeny. Tloušťka pokožky je průměrně 127 µm, sekreční buňky jsou 25x18 µm velké (4210 µm3) a tvoří 29,5% objemu epidermis. Pokožka samců je silnější a má více sekrečních buněk než u samic. V době tření dochází u obou pohlaví k zesílení epidermis a zvýšení počtu i celkového objemu sekrečních buněk. Úvod Kůže ryb, přizpůsobená vodnímu prostředí, má řadu funkcí, často velmi specifických: podílí se na osmoregulaci a výměně plynů, produkuje množství různých sekretů, jsou v ní uloženy smyslové, elektrické a bioluminiscentní orgány. Vzhledem k dlouhodobé evoluci této třídy obratlovců existují značné rozdíly v charakteru pokožky u jednotlivých druhů ryb. Popsány jsou však i rozdíly v závislosti zejména na pohlaví či pohlavní aktivitě (Knoz a kol. 1990, Halačka a kol.1991).z toho důvodu jsou znalosti stále nedostačující a navíc jsou neustále rozšiřovány aplikace nových histochemických a ultramikroskopických metod výzkumu, které umožňují stále hlubší řešení dané problematiky. Materiál a metodika Sledováno bylo 30 jedinců štiky obecné (Esox lucius): 5 samců a 5 samic o průměrné velikosti (délka těla) 44 cm v době tření (březen), 9 samců (40 cm) a 11 samic (43 cm) v době mimo tření (duben až listopad). Vzorky kůže byly odebírány z dorzální části hlavy, fixovány v Bouinu, zality do parafinu a krájeny na řezy kolmé k povrchu pokožky. Pro základní orientaci bylo použito barvení hematoxylineosinem a dle Malloryho. Ke stanovení chemické povahy glykoproteinového obsahu sekrečních buněk byly použity histochemické metody PAS, AB při ph 2,5 a 1,0, slabá a silná metylace a slabá hydrolýza. Pro TEM byly vzorky (1 samice, období mimo tření) fixovány v glutaraldehydu a dále zpracovány běžnými metodami. Ryby byly rozděleny podle pohlaví a pohlavní aktivity do čtyř skupin: I - samci v době tření, II - samci mimo tření, III - samice v době tření, IV - samice mimo tření. Tyto pak byly vzájemně srovnávány. Na řezech pokožkou byla prováděna následující měření: 10

12

13 F. Počet sekrečních buněk /ks/ I II III IV I-IV 1,13 0,99 0,83 0,73 0,89 Samci mají v průběhu celého roku více sekrečních buněk než samice. U obou pohlaví se v době tření tyto buňky stávají hojnějšími. Ultrastruktura epiteliálních buněk Epiteliální buňky bazálni a střední vrstvy pokožky mají centrálně uložené jádro laločnatého tvaru. V cytoplasmě se vyskytují oválné váčky se slabě elektrondenzním či elektronlucentním agranulárním obsahem. Cytoplazmatická membrána má četné kořenovitě větvené cytoplazmatické výběžky. Mezi buněčné prostory jsou místy velmi prostorné bez zjevného obsahu. Epiteliální buňky povrchové vrstvy mají zploštělý tvar a obsahují velké množství elektronlucentních váčků. Cytoplazmatická membrána apikální strany buněk ležících zcela na povrchu pokožky je zvrásnená množsvím hřebenů. Pohárkové buňky mají relativně velké sekreční globuly, většinou miskovitého průřezu, vyplněné slabě elektrondenzním, jemně granulárním obsahem. Mezi skupinami globulů jsou místy velké shluky silně elektrondenzního materiálu. Častý je rozpad biomembrán i jednotlivých globulů, a to i u buněk, které ještě nemají vytvořeno vyústění na povrch těla. U váčkovitých buněk vytvářejí granule sekretu, zejména u zralých buněk, nepravidelná nahromadění. Centrálně umístěná sekreční vakuola je obklopena vrstvou elektrondenzni granulární cytoplazmy. Jádro je, stejně jako u buněk pohárkových, zatlačeno k bazálni periferii buňky. Diskuze Zjištěná skladba pokožky, tj. výskyt sekrečních buněk pohárkových a váčkovitých a absence kyj ovi tých, je dalším potvrzením předpokládaného obecného schématu pro Clupeiformes (Whitear 1986). Silnější pokožku a menší objemový podíl sekrečních buněk (187 jim, 15%) naměřil u štiky Macků (1988). Jednalo se vsaj jen o 3 jedince bez určení pohlaví a počítány byly pouze buňky alciánofilní, tj. pohárkové. Histochemické složení sekretu pohárkových buněk, tj, vysoký podíl glykoproteinů sialinizovaných je poměrně častým jevem, zajímavá je však barvi tel nost sekretu váčkovitých buněk metodou PAS, neboť u většiny našich druhů ryb, u nichž se tyto buňky vyskytují (pstruh obecný, okoun říční, candát obecný, vranka obecná) v této a ani v dalších metodách používaných ke zjištění glykoproteinů, barvitelné nejsou (Halačka 1989). Stejně jako i u jiných druhů ryb vykazovala pokožka štiky změny v závislosti na pohlaví i pohlavní aktivitě. Jde zejména o silnější pokožku u samců a zesílení epidermis u obou pohlaví v době tření (Smith 1976), jenž závisí na hladině androgenních steroidů (Pickering 1986). Shodný 12

14 nost glykoproteinů v nich potvrdila i histochemická pozorování v této práci. Merrilees (1974) nalezl u Esox americanus kromě pohárkových buněk jejichž popis odpovídal zde uváděnému, ještě jejich další typ, obsahující zrna mukózního sekretu, jenž jsem ve své práci u štiky obecné nezjistil. Ultastruktůra váčkovitých buněk odpovídá obecné charakteristice uváděné autory u jiných druhů ryb (Whitear 1986). Lireratura Halačka,K.,1989.Histologie,histochemie a ultrastruktura pokožky sladkovodních ryb. Disertační práce,127 s. Halačka,K.,Brabec,H.,Vyhnalíková,D.,1991. Morphometry of the epidermis of the Grayling (Thymallus thymallus) in the spawning season. Folia zool. Brno,40(2): Knoz,J.,Halačka,K.,Brabec,H.1990.Morphometry of the epidermis of the brown trout {Salmo trutta m. fario).folia zool.brno, 39(3): Macků, P.,1988.Využití morfometrických metod ve studiu sekrečních buněk epidermis některých druhů sladkovodních ryb. Diplomová práce,74 s. Merrilees,M.J.,1974.Epidermal fine structure of the teleost Esox americanus (Esocidae, Salmoniformes). J. ultrastruc. Res. 47: Pickering,A.D.,1986.Changes in blood cell composition of the browm trout,salmo trutta L.,during the spawning season. J. Fish Biol.,29: Smith,R.J.F.,1976.Season loss of alarm substance cells in North American cyprinoid fishes and relation to abrasive spawning behaviour. Can.J.Zool.,54: Whitear,M.,1986.The skin of fishes including eye 1ostomes. In: Bereiter-Hahn,J., Matoltsy, A.G.,Richards, K.S.(Eds)., Biology of the integument. 2. Vertebrates. Heidelberg. Springer Verlag. s

15 HORMONÁLNÍ INDUKCE OVULACE JIKERNAČEK LÍNA OBECNÉHO (TINCA TINCA) POMOCÍ PREPARÁTŮ OVAPRIM A KOBARELÍN A KAPŘÍ HYPOFÝZY J. KOUŘIL, J. HAMÁČKOVÁ, T. BARTH Souhrn Jikernačky l í n a obecného z rybničního chovu ve stavu optimální předvýterové připravenosti o průměrné kusové hmotnosti 0,5 kg b y l y převezeny na l í h eň a náhodně rozděleny do 3 skupin. Jikernačky 1. skupiny byly injikovány odvodněnou kapří hypofýzou, ve 2. skupině preparátem Kobarelin obsahujícím analog savčího GnRH a ve 3. skupině preparátem Ovaprim, obsahující analog lososího GnRH a betadopaminergní i n- hibitor. U j ikernaček injikovaných kapři hypofýzou bylo dosaženo ovulace u 75 % jedinců, při použití přípravku Kobarel i n 92 % jedinců a při podání přípravku Ovaprim pouze 8 %. Ukazatele dosažené pracovní plodnosti byly výrazně nejlepší u jikernaček injikovaných přípravkem Kobarelin. Úvod Hormonálně indukovaný umělý výtěr 1 í na s pomocí injikace kapří hypofýzy zavedl Pokorný (1974). Kouřil (1987) porovnal efekt použití hypofýzy v jedné a ve dvou d í l č í c h dávkách a optimalizoval výši dávky hypofýzy. Byl zjišťován i účinek stáří kapří hypofýzy na jej i účinnost u lína (Kouřil a Hamáčková, 1988). Významným zjištěním bylo ověření možnosti použití savčího GnRH k indukci ovulace lína (Kouřil a Barth, 1981; Kouřil a kol., 1981). Při těchto pokusech byl zjištěn nejen vliv podáni GnRH na vyšší počet vytřených j i - kernaček, ale i na zvýšení jejich pracovní plodnosti. Později byly, převážně úspěšně, testovány různé analogy savčího GnRH, vyznačující se nižší prahovou hodnotou pro vyvolání ovulace jikernaček lína (Kouřil a kol., 1983, 1986a, 1986b, 1986c,e; Kouřil a Mrkvan, 1986). V těchto a zejména v pozdějších pokusech byl i u analogů savčího GnRH potvrzen ú č i - nek jejich podání na dosažení vyššího počtu ovulujícich j i - kernaček i vyšší pracovní plodnosti, přičemž m í r a tohoto v l i v u j e u j e d n o t l i v ý c h a n a l o gů G n R H r o z d í l n á ( K o uřil a kol., 1991). Při ošetření dvou skupin jikernaček l í n ů rozdílné výtěrové kondice, jednak analogem savčího GnRH, jednak kapří hypofýzou, byl zjištěn výrazně vyšší účinek analogu GnRH, jak na počet vytřených jikernaček, tak na jejich pracovní plodnost (Vachta a kol., 1992). Byl vyhodnocen i v l i v různého místa aplikace analogů GnRH do rybího těla (Kouřil a kol., 1986d, 1990b) a testována účinnost i lososího GnRH (Kouřil a kol., 1990) a jeho analogů (Kouřil a k o l., 1987d, 1989) na indukci ovulace u jikernaček lína. Metodika a materiál Pokus byl proveden ve VÚRH Vodňany ve dnech června 1993 u jikernaček původem z rybničního chovu ústavu, na rybách i n d i v i d u á l ně označených na podzim 1992 kryogenickou metodou. Jikernačky lína obecného ve stavu o p t i m á l n í předvýtěrové připravenosti o průměrné kusové hmotnosti 502 g ( g) byly převezeny na l í h eň a náhodně rozděleny do tří skupin po jedincích. Po i n d i v i d u á l n í m zjištění hmotnosti byly ryby umístěny do průtočných nádrží o obje- 14

16 mu Jikernačky v 1. skupině byly injikovány odvodněnou kapří hypofýzou (v dávce 2 mg.kg" ), ve 2. skupině preparátem K o b a r e l i n o b s a h u j í c í a n a l o g s a včího G n R H /(D- Ala 6 )GnRHProNHEt/ v dávce 10 [µg.kg- 1 ) a ve 3. skupině preparátem Ovaprim (Syndel Laboratories Ltd., Canada) v dávce 0>5 ml. Kg-1. Přípravek obsahuje analog lososího GnRH /(D- Arg 6 )GnRHProNHEt/ s přídavkem betadopaminergního inhibitoru (domperidon). Injikace ryb v jednotlivých skupinách byla provedena jednorázově intramuskulárně, u skupin 1. a 2. s použitím fyziologického roztoku (při dávce 1 ml.kg-1 ), u skupiny 3. s použitím originálního roztoku (tab. 1). Teplota vody v průběhu pokusu byla C, obsah ye vodě rozpuštěného kyslíku se pohyboval v rozpětí 6-7 mg.1 1 Výsledky Jak je patrné z tab. 1, bylo u j ikernaček injikovaných kapří hypofýzou dosaženo ovulace u 75 % jedinců, při použití přípravku Kobarelin 92 % jedinců (neovulovala pouze 1 jikernačka) a při podání přípravku O v aprim pouze 8 %. Ukazatele dosažené pracovní plodnosti byly výrazně nejlepší u jikernaček injikovaných přípravkem Kobarelin. U jikernaček injikovaných kapří hypofýzou bylo po přepočtu na 1 k g hmotnosti jikernaček vytřeno 51,1 tis. ks jiker. U jikernaček injikovaných přípravkem Kobarelin bylo vytřeno 94,9 t i s. k s.kg-1 ( c o ž představuje z v ý š e n í 1, 8 6 x ) a při a p l i k a c i O v a p r i n u p o u z e 1 4, 7 t i s. k s. k g ( t j. 0, 2 9 x m é ně), v e s r o v n á n í s použitím hypofýzy. Vytřené j ikry od všech skupin jikernaček byly op Lozeny a po vykulení získán normální plůdek. Tab. 1 Hmotnost jikernaček, počty injikovaných a vytřených jikernaček lína a jejich pracovní plodnost při indukci ovulace třemi různými preparáty Použitý preparát (výše dávky) Hypofýza (2 mg.kg-1 1 ) Hmotnost jikernaček g x±s (variační rozpětí) 515±158 ( ) Počet jikernaček injik. vytřených Rel. hmot. vytř.jiker % x ± s (variační rozpětí) ks k s % ,25±2,70 (0,90-9,04) Pracovní plodnost absolutní lo 3.ks -11 prům. relativní lo3ks.kg-1 prům. (var.rozp.) ,l±58,0 (14,3-180,9) Délka časového int. od inj.do výtěru h 17,9±4,0 (15-23) Kobarelin (10 (µg.kg- 1 ) 503±137 ( ) ,80±3,41 (1,05-13,50) ,8±72,6 (8,2-270,0) 31,7±1,6 (31-35) Ovaprira (0,5 ml.kg-1 1 ) 487±153 ( ) , ,3 33,0 15

17 Diskuse Byl potvrzen vyšší účinek Kobarelinu než kapří hypofýzy na podíl vytřených jikernaček z počtu injikovaných a na výši pracovní plodnosti (Kouřil a kol., 1983; Kouřil a kol., 1986a, 1986b, 1986c; Kouřil a Mrkvan, 1986). Naopak selhalo vyvolání ovulace pomocí přípravku Ovaprim, který byl úspěšně odzkoušen a je výrobcem doporučován k indukci ovulace při umělém výtěru u řady asijských kaprovitých ryb, lososů aj. Účinek podání donperidonu či jiného betadopaminergního inhibitoru samostatně nebo v kombinaci s analogem lososího GnRH /(D-Arg )GnRHProNHEt/, ani samostatné použití tohoto analogu není při indukci ovulace jikernaček lína v literatuře doposud uváděn. Literatura Kouřil, J., Induced ovulation of the female tench (Tinca tinca L.): Effect of the number and levels of pituitry injections on the results of stripping. Práce VURH Vodňany, 16: Kouřil, J., Barth, T., Docílení ovulace jiker pomocí LH-RH při umělém výtěru lína obecného (Tinca tinca L.). Bul. VÚRH Vodňany, 17, 1: Kouřil, J., Hamáčková, J., The effect of the storage of acetone-dehydrated carp pituitaries on their action in induced spawning of tench (Tinca tinca L.). Práce VÚRH Vodňany, 17: Kouřil, J., Mrkvan, L., Provozní ověření účinku analogu LH-RH k dosažení indukovaného umělého výtěru jikernaček lína na rybí líhni Státního rybářství, o. z. Přerov v Hodoníně. Čs. Rybnikářství, 3: Kouřil, J., Barth, T., Hamáčková, J., Výsledky pokusů s aplikací arginin-vasotocinu a LH-RH k dosažení ovulace jiker při umělém výtěru lína obecného (Tinca tinca L.). Ve: Proč. Reprodukce, genetika a hybridizace ryb, Slovenská zool. spol. - ichtyologická sekce, Vodňany, s Kouřil, J., Barth, T., Hamáčková, J., Slaninová, J., Servítová, L., Macháček, J., Flegel, M., Pokusy s použitím LH-RH a jeho syntetického analogu k dosažení ovulace jikernaček lína, amura, kapra a sumce. Bul. VÚRH Vodňany, 19, 2:3-16. Kouřil, J., Barth, T., Hamáčková, J., 1986a.Výtěr jikernaček lína pomocí analogů LH-RH. Edice Metodik, č. 20, 4 s. Kouřil, J., Barth, T., Hamáčková, J., Flegel, Induced ovulation in tench (Tinca tinca LH-RH synthetic analogues: effect of site of administration and temperature. Aquaculture, 54, 5/6: Kouřil, J., Barth, T., Hamáčková, J., Flegel, ML, Krchňák, V., Pospíšek, J., 1986c. Testování účinek některých analogů LH-RH na vyvolání ovulace jikernaček lína obecného (Tinca tinca L.). Bul. VÚRH Vodňany, 22, 3:3-12 Kouřil, J., Barth, T., Hamáčková, J., Flegel, M., Přikryl, I., 1986d. Indukovaný výtěr jikernaček lína obecného (Tinca tinca L.) při injekčním podání hypofýzy a analogu LH-RH na různá místa rybího těla. Bul. VÚRH Vodňany, 22, 2:

18 Kouřil,J., Barth,T., Hamáčková, J.,Macháček, J.,F1ege1,M e. Výsledky pokusů s indukovanou ovulací pomocí LH-RH a jeho syntetického analogu u některých druhů ryb. Ve: Proč. Reprodukce a genetika ryb, Vodňany, Slov. zool. spol. - ichtyol. sekce, s Kouřil J., Barth, T., Hamáčková, J., Pospíšek, J., Krchňák, V., Flegel, M., Indukovaný výtěr jikernaček l í n a obecného (Tinea tinca) pomocí syntetického analogu lososího Gn-RH. Živočiš. Výroba, 32, 10: Kouřil, J., Mikodina, Je. V., Glubokov, A. I., Hamáčková, J., Barth, T., Flegel, M., Charvátová, J., Využití [D-Glu(NH-Ad) 6,Trp 7,Leu 8 ]Gn-RH k indukci ovulace jikernaček lina obecného (Tinca tinca L.). Bul. VÚRH Vodňany.25, 1:8-13 Kouřil, J., Mikodina, Je. V., Navolockij, V. I., Hamáčková, J., Vachta, R., Velek, J., Bláha, I., Barth, T., 1990a. Účinek lososího Gn-RH na vyvolání ovulace jikernaček l í n a obecného (Tinca tinca L.). Bul. VÚRH Vodňany, 26, 3:7-10. Kouřil, J., Vachta, R., Hamáčková, J., 1990b. V l i v intramus-kulární, intraperitoneálni a dorsální injekční aplikace analogu savčího Gn-RH na výsledky umělého výtčru jikernaček lína obecného (Tinca tinca L.). Bul. VÚRH Vodňany, 26, 3: Kouřil, J., Barth, T., Hamáčková, J., Mikodina, Je. V., Glubokov, A. I., Flegel, M., The comparison of effecte hormonal induction of ovulation in tench (Tinca tinca L.) in artificial propagation. Ve: Proc. International Symposium on Reproductive Biology in Aquaculture; Taipei (Taiwan), s. 54. Pokorný, J Výtěr lína a odchov plůdku. Rybářství 12: Vachta, R., Hamáčková, J., Kouřil, J., Vliv rozdílných podmínek prostředí v odchovu jikernaček lina (Tinca tinca) v předvýtěrovém období na kondiční ukazatele a výsledky indukovaného výtěru pomocí kapři hypofýzy a syntetického analogu GnRH. Ve: Sb. Reprodukce ryb '92; Vodňany, VÚRH, s Adresy autorů: J. Kouřil, J. Hamáčková, Výzkumný ústav rybářský a hydrobiologický, Vodňany; T. Barth, Ústav organické chemie a biochemie AV CR, F l e m i n - govo nám. 2, Praha 10 -Dejvice 17

19 ISOLACE KAPŘÍHO GONADOTROPINU (GtH) I.HŮLOVÁ, J.BARTHOVÁ, G.ENTLICHER, L.MALETÍNSKÁ, T.BARTH, P.HRBAS, J.HAMÁČKOVÁ. J.KOUŘI L Úvod Vodný extrakt dehydratovaných kapřích hypofys indukuje ovulaci u různých druhů sladkovodních ryb. Účinnou složkou extraktu jsou hormony gonadotropiny (GtH), což jsou chemicky glykoproteiny. Kapří GtH se skládá ze dvou podjednotek, jejich primárni struktura je známa, byla odvozena z cdna knihovny (Chang et al. 1988). Poznatky základního výzkumu nebyly zatím v podstatě využity v praxi. Pokud jde napr. o využiti čistých Látek nebo diagnostiku hladiny GtH v krvi. Naším dlouhodobým záměrem je vypracovat technologii isolace čistého GtH a využít jej pro indukci ovulace u různých rybích druhů. Alternativní cesta je využití analogů GnRH v kombinaci s dopaminergními inhibitory. Také bychom chtěli vytvořit materiální základ pro vyvinutí diagnostiky GtH metodami RIA nebo ELISA. Zatím jsme kombinovali několik isolačních postupů několika autorů (Burzawa-Gerard 1971, Idler et al. 1975, Swanson et al. 1991, Tanaka et al. 1993) a isolovali různé GtH.i Materiál a methody Acetonem odtučněné kapří hypofysy byly získány z Rybářství Nemanice. Před použitím byly skladovány při -18 C. Hypofysy byly homogenisovány buď rychlootáčkovým nožovým mixerem (10 mg hypofys v 0,5 ml vody, 5000 ot/min) nebo v třecí misce. Homogenát byl centrifugován ( ot/min, 15 min), sediment byl ještě jednou extrahován stejným způsobem a supernatanty byly spojeny. K roztoku byl za chlazení přidán NaCl do koncentrace 2% a ethanol do koncentrace 20%. Po 30 minutách stání byla sraženina odcentrifugována a v supernatantu byla koncentrace ethanolu zvýšena na konečných 80%. Po 10 hodinách stání byla sraženina oddělena centri fugací, rozpuštěna v malém množství vody a dialysována intensivně proti vodě. Roztok zbavený ethanolu byl lyofilizován a skladován při -18 C. "Fast protein liqiud chromatography" (FPLC) hypofysárních proteinů byla prováděna na sloupci SepPak 15 HR DEAE AR-1. Sloupec byl ekvilibrován s 20 mm Tris-HCl pufrem ph 8,5. Na sloupec bylo aplikováno 1 až 40 mg proteinu. Sloupec byl eluován roztokem NaCl ve zmíněném pufru. Koncentrace NaCl se lineárně zvyšovala od 0 do 0,5 M, průtoková rychlost byla 1,5 ml/min, separace trvala max. 60 minut. Koncentrace proteinů byla monitorována měřením absorbance při 280 nm. Pro afinitní chromatografii byl používán Konkanavalin A vázaný na Sepharosu 4B. Na 15 ml afinitního nosiče bylo aplikováno 2-5 mg proteinu, balastní proteiny byly vymývány 0, 5 M NaCl ve vodě, vázané proteiny byly eluovány 0,2M roztokem mannosy v pufru. SDS polyakrylamidová e lek troforesa byla prováděna podle Laemliho (1970) v 17,5% gelu. Obsah neutrálních cukrů ve frakcích proteinů byl stanoven methodou Duboise et al. (1956). 18

20 K biologickému hodnoceni frakci bylo využito kapřích jikernaček. Rybám byl injikován vzorek a byl sledován průběh ovulace. Vzorek byl aplikován ve dvou dávkách, první byla 50 µg na 1 kg váhy, druhá následovala 16 hodin po první v množství 450 µg/kg. Výsledky FPLC analysa rozpustných hypofysárních proteinů je uvedena na obr.l. Biologická aktivita byla lokalisována ve frakci 1H. Distribuce proteinů je zřejmá z elektroforeogramu, který je součástí obrázku. Pro všechny další analysy byl používán méně strmý gradient koncentrace NaCl. Obsah cukrů v jednotlivých frakcích FPLC chromátografické analysy je uveden na obr.2. Frakce 1A-4A jsou biologicky aktivní. Také účinnost ethanolové frakcionace a afinitní chromatografie proteinů z hypofysy byla vyhodnocena pomocí FPLC analysy. Takto bylo zjištěno, že hormonálně aktivní proteiny precipitují mezi 20% až 80% ethanolu (Obr.3). Obr.4 ukazuje rozdělení proteinů během afinitní chromatografie. Hlavní podíl hormonálně aktivních proteinů se vázal na Konkanavalin-Sepharosu a uvolňoval se 0,2 M mannosou. Konečně účinnost isolace zahrnující ethanolovou frakcionaci i afinitní chromatografii ilustruje Obr.5. Mezi proteiny biologicky aktivními byly SDS elektroforesou nalezeny proteiny o relativní molekulové váze , a Diskuse Methoda FPLC chromatografie představuje moderní a efektivní separační techniky, kterou lze využít jak analyticky tak preparativně. V kombinaci s klasickými methodami lze tak získat vysoce purifikované proteiny. SDS elektroforesa takto získaných proteinů indikuje přítomnost jak podjednotek, tak nativní molekuly o molekulové hmotnosti chemické povaze tohoto proteinů lze jen říci, že se jedná o glykoprotein.

21

22 Literatura Burzawa-Gerard E., Purification d'zone hormone gonadotrope hypophysaire de poisson teleosteen la carpe (Cyprinus carpio L.). Biochemie 53: Chang Y.S., C.J.Huang, F.L.Huang, T.B.Lo, Primary structure of carp gonadotrophin subunits deduced from cdna nucleotide sequences. Int.J.Peptide Protein Res. 32: Dubois M., K.A.Gilles, J.K.Hamilton, P.A.Rebers, F.Smith, Colorimetric method for determination of sugar and related substances. Anal.Chem. 28: Idler D.R., L.S.Bazar, S.J.Hwan,1975. Fish gonadotrophin(s). II. Isolation of gonadotrophin(s) from chum salmon pituitary glands using affinity chromatography. Endocrine Res.Commun.159: Swanson P., K.Suzuki, H.Kawauchi, V.V.Dickhoff, Isolation and characterization of two Coho salmon gonadotrophins, GTH I and GTH II. Biology and Reproduction 10: Tanaka H., H.Kagawa, K.Okuzawa, K.Hirose, Purification of gonadotrophins (PmGTH I and II) from read seabream (Pagrus major) and development of a homologous radioimmunoassay for PmGTH II.Fish Physiology and Biochemistry 10: Trinh K.-Y., N.C.Vang, C.L.Hew, L.V.Crim, Molecular cloning and sequencing of salmon gonadotrophin beta subunit. Eur.J.Biochem. 159: Adresy autorů: I. Hůlová, J.Barthová, G.Entlicher, Katedra biochemie přírodovědecké fakulty KU, Praha 2 T.Barth, L.Maletínská, P. Hrbas, Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, Praha 6 J. Hamáčková, J. Kouřil, Výzkumný ústav rybářský a hydrobiologický, Vodňany 21