TROMBOCYTY V NETRANSFUZNÍCH APLIKACÍCH

Transkript

1 Společnost pro bioimplantologii ČLS JEP, Krajská nemocnice Liberec, a.s., Transfuzní oddělení a Oddělení plastické a estetické chirurgie Fakultní nemocnice Olomouc pořádají PRACOVNÍ DEN TROMBOCYTY V NETRANSFUZNÍCH APLIKACÍCH 3. prosince 2014 Brno, hotel Myslivna PROGRAM / SBORNÍK ABSTRAKT

2

3 PROGRAMOVÝ VÝBOR, HLAVNÍ TÉMATA, ORGANIZACE Programový výbor Předseda programového výboru MUDr. Barbara Kubešová předsedkyně Společnosti pro bioimplantologii ČLS JEP Členové programového výboru MUDr. Ivan Fales Ústav hematologie a krevní transfuze doc. MUDr. Daniel Lysák, Ph.D. Fakultní nemocnice Plzeň, Hematologicko-onkologické oddělení MUDr. Renata Procházková, Ph.D. Krajská nemocnice Liberec, a.s., Transfuzní oddělení MUDr. Zenon Lasota Nemocnice Nový Jičín a.s., Transfuzní oddělení Hlavní témata Trombocyty v chirurgických a interních oborech Trombocyty v laboratorní praxi Trombocyty v estetické medicíně Organizační zajištění SYMMA, spol. s r.o. Aleš Martinek Pompova Brno a.martinek@symma.cz 3

4 PARTNEŘI / VYSTAVOVATELÉ Hlavní partneři a vystavovatelé Sysmex CZ s.r.o., Brno Terumo BCT, Zaventem, Belgie VIVACOM s.r.o., Praha Partner a vystavovatel TRIGON PLUS spol. s r.o., Říčany u Prahy Vystavovatelé APR spol. s r.o., Praha BARIA s.r.o., Praha Octapharma CZ s.r.o., Praha VA-BIOS, s.r.o., Brno Partneři coffee breaku Haemonetics CZ spol. s r.o., Brno World Courier Czech Republic, s.r.o., Praha Partner jmenovek MERCI, s.r.o., Brno 4

5 řešení pro vaši laboratoř obchodní a servisní zastoupení firem THERMO Scientific divize laboratorní techniky BIOQUELL. ERLAB. HMC EUROPE. LANCER. RUSKINN SYNBIOSYS. SYNGENE. LABOGENE. TECNIPLAST Teď už vám špičky padat nebudou... Multifunkční centrifuga MEGAFUGE 8 - maximální výkon: ot./min (3 260 x g) výkyvný rotor ot./min ( x g) úhlový rotor - kapacita: výkyvné rotory až 4 x 145 ml (např. 8x50ml, 24x5/7 ml, 4 x mikrodestička) úhlové rotory 6x50ml, 30x15ml, 24x2 ml, 30x1,5/2 m, 8x8 PCR strip hematokritový rotor BBR - Krevní banka + 4 C - pro skladování transfuzních produktů, vzorků a jiných materiálů - chladicí boxy BBR se vyrábí ve dvou základních provedeních - nerezový interiér a vnější plášť nebo kovový vnitřní i vnější plášť s epoxidovým lakem - kapacita 130 až 2100 l - masivní izolace v plášti i ve dveřích garantuje teplotní stabilitu Elektronické pipety F1-ClipTip - systém 100 % uchycení špičky na pipetě ClipTip zamezí nechtěné ztrátě vzorku - programovatelné, až 20 programů - nastavitelná rozteč mezi dávkovacími kanály - možnost transferu vzorku mezi různými formáty - AUTO LOCK : výměna rotoru během 3 sekund bez použití nástroje - SMARTSpin : optimalizace centrifugace podle typu rotoru a rozdílu ve vyvážení - výkonný chladicí systém zajišťuje stabilní teplotu a malé výkyvy teplot při vyvětrání - náběh teploty na +4 C do 3 hod, přesnost ± 1 C - vynikající přesnost - vynikající reprodukovatelnost dávkování servis validace akreditovaná kalibrační laboratoř

6 ODBORNÝ PROGRAM 3. prosince hod Zahájení konference hod Přednáškový blok I. Předsedající: Turek P., Procházková R. Krev zázračná tekutina? Turek P. Thomayerova nemocnice v Praze, Transfuzní oddělení Trombocyty a jejich potenciál pro netransfuzní použití Procházková R. 1, Jenčová V. 2 Krajská nemocnice Liberec, a.s., Transfuzní oddělení 1 Katedra netkaných textilií, Textilní fakulta, Technická univerzita v Liberci 2 Interakce trombocytů s nanovlákennými materiály Jenčová V. 1, Mikeš P. 1, Pilařová K. 1, Horáková J. 1, Chvojka J. 1, Erben J. 1, Procházková R. 2 Katedra netkaných textilií, Textilní fakulta, Technická univerzita v Liberci 1 Krajská nemocnice Liberec, a.s., Transfuzní oddělení 2 Povrch implantačních materiálů upravený krevními komponentami Himmlová L., Bártová J., Kubies D., Vrbová R., Oganessian E., Podzimek Š. Stomatologická klinika VFN v Praze a 1. LF UK Diskuze hod COFFEE BREAK hod Přednáškový blok II. Předsedající: Lasota Z., Lysák D. Možné technologie přípravy trombocytárních kultivačních půd Lasota Z. Nemocnice Nový Jičín, a.s., Tranfuzní oddělení Testování tromobogenicity mikro-/nanovlákenných povrchů cévních náhrad Horáková J. 1, Pavlíková T. 1, Novák P. 1, Šaman A. 1, Maříková Š. 2, Jiroušová J. 2, Procházková R. 2, Jenčová V. 1 Katedra netkaných textilií, Textilní fakulta, Technická univerzita v Liberci 1 Krajská nemocnice Liberec, a.s., Transfuzní oddělení 2

7 ODBORNÝ PROGRAM 3. prosince 2014 Analýza složení a vývoje hladin cytokinů v destičkovém lyzátu v průběhu skladování Lysák D., Holubová M., Windrichová J., Miklíková M., Jindra P. Fakultní nemocnice Plzeň, Hemato-onkologické oddělení Deriváty lidské krve jako náhrada fetálního telecího séra při kultivaci kmenových buněk Suchánková Kleplová T. Lékařská fakulta UK v Hradci Králové Diskuze hod OBĚD hod Přednáškový blok III. Předsedající: Kubešová B., Jajtner P. Využití plazmy bohaté na destičky ( PRP ) při regeneraci kloubní chrupavky kolene u středně pokročilé femorotibiální chondromalacie - porovnání léčby pomocí PRP a kyseliny hyaluronové Jajtner P., Hart R., Komzák M. Nemocnice Znojmo, p.o. Terapie šlachových lézí dostihových koní nekomerčně připravenou plazmou bohatou na trombocyty Žuffová K., Žert Z. Klinika chorob koní, VFU Brno Trombocytopenie a aplasie radia - tar syndrom z pohledu klinické a molekulární genetiky Kuklík M., Mařík I. Genetické oddělení Praha a Endokrinologický ústav Praha První zkušenosti s aplikací neautologních destičkových faktorů v dermatologii Kubešová B., Klimovič R., Kubeš V. VA-BIOS, s.r.o. Brno Macopharma, příprava destičkového lyzátu Bárta P. VIVACOM s.r.o. Diskuze hod COFFEE BREAK

8 ODBORNÝ PROGRAM 3. prosince hod Přednáškový blok IV. Předsedající: Stehlík D., Bohoněk M. Kryokonzervované trombocyty jako dostupná alternativa nativních trombocytárních přípravků Bohoněk M., Křánová M. Ústřední vojenská nemocnice - Vojenská fakultní nemocnice Praha PRP v korektivní dermatologii (indikace, metody použití) Trojanová P. Lékařské centrum zdraví a estetické péče s.r.o., Brno Vliv růstových faktorů na efektivitu plasticko-chirurgických technik u léčby chronických ran Stehlík D., Menšík I., Zálešák B., Hatalová I. Fakultní nemocnice Olomouc, Oddělení plastické a estetické chirurgie Trombocyty pro netransfuzní aplikaci u dítěte - kazuistika Pacasová R. 1, Tesařová E. 1, Lejdarová H. 1, Adamcová M. 1, Dvořáková J. 1, Štěrba J. 2, Múdry P. 2, Janíček P. 3, Tomáš T. 3 Transfuzní a tkáňové oddělení Fakultní nemocnice Brno 1 Klinika dětské onkologie Fakultní nemocnice Brno, Brno 2 Ortopedická klinika Fakultní nemocnice u sv. Anny, Brno 3 Pokroky v kvantifikaci trombocytů v laboratoři a nadstavbové parametry trombocytů Budín M., Valina O. SYSMEX CZ s.r.o. Diskuze hod Závěr konference hod Závěrečný cocktail POSTEROVÁ SEKCE Trombocyty adherované na nanovlákenné nosiče stimulují viabilitu a proliferaci melanocytů Vocetková K., Rampichová M., Sovková V., Benešová J. 2. Lékařská fakulta UK v Praze Adheze trombocytů na povrch implantačních materiálů Vrbová R., Bártová J., Oganessian E., Kubies D., Himmlová L., Podzimek Š. Stomatologická klinika 1. LF UK a VFN

9 VŠEOBECNÉ INFORMACE Místo konání Hotel Myslivna, Nad Pisárkami 276/1, Brno Registrační poplatky Lékaři do Kč 700,- na místě Kč 900,- NLZP do Kč 400,- na místě Kč 600,- Registrace účastníků 2. prosince hod 3. prosince hod Registrující osoby Vám rádi sdělí Vaše event. dotazy. Konferenční materiály Program konference a jmenovka. Oběd Menu 3. prosince 2014, cena a Kč 130,- Hovězí vývar s játrovou rýží 150g smažený kuřecí řízek Vařené brambory Nealkoholický nápoj nebo malé pivo Audiovizuální technika Dataprojektor PC Bezdrátová myš vč. laserpointu Náhledový monitor INFORMACE PRO PŘEDNÁŠEJÍCÍ Techniku je možné si vyzkoušet před zahájením konference nebo v průběhu přestávek. Prezentace Prezentace, které od Vás převezme technická obsluha v přednáškovém sále, prosíme dodat na USB Flash disku.

10 REJSTŘÍK AUTORŮ Bohoněk Miloš, MUDr., Ph.D. Himmlová Lucie Horáková Jana, Mgr. Jajtner Pavel, MUDr., MBA Jenčová Věra, Ing., Ph.D. Kubešová Barbara, MUDr. Kuklík Miloslav, MUDr., CSc. Lasota Zenon, MUDr. Lysák Daniel, doc. MUDr., Ph.D. Pacasová Rita, RNDr., Ph.D. Procházková Renata, MUDr., Ph.D. Stehlík David, MUDr. Suchánková Kleplová Tereza, MDDr. Trojanová Petra, MUDr., Ph.D. Turek Petr, MUDr., CSc. Vocetková Karolína, MUDr., Ing. Vrbová Radka, Ing., Ph.D. Žuffová Kristína, MVDr., Ph.D

11 SBORNÍK ABSTRAKT PRACOVNÍ DEN TROMBOCYTY V NETRANSFUZNÍCH APLIKACÍCH 3. prosince 2014 Abstrakta neprošla jazykovou úpravou. 11

12 TROMBOCYTY V NETRANSFUZNÍCH APLIKACÍCH Obsah: Trombocyty a jejich potenciál pro netransfuzní použití...13 Interakce trombocytů s vlákennými (mikro/nano) materiály...14 Povrch implantačních materiálů upravený krevními komponentami...15 Možné technologie přípravy trombocytárních kultivačních půd...16 Testování tromobogenicity mikro-/nanovlákenných povrchů cévních náhrad...17 Analýza složení a vývoje hladin cytokinů v destičkovém lyzátu v průběhu skladování...18 Deriváty lidské krve jako náhrada fetálního telecího séra při kultivaci kmenových buněk...19 Využití plazmy bohaté na destičky ( PRP ) při regeneraci kloubní chrupavky kolene u středně pokročilé femorotibiální chondromalacie - porovnání léčby pomocí PRP a kyseliny hyaluronové...20 Terapie šlachových lézí u koní plazmou bohatou na trombocyty...21 Trombocytopenie a aplasie radia tar syndrom z pohledu klinické a molekulární genetiky...22 První zkušenosti s aplikací destičkových faktorů v dermatologii...23 Kryokonzervované trombocyty jako dostupná alternativa nativních trombocytárních přípravků...24 PRP v korektivní dermatologii (indikace, metody použití)...25 Trombocyty pro netransfuzní aplikace u dítěte - kazuistika...26 Posterová sekce Trombocyty adherované na nanovlákenné nosiče stimulují viabilitu a proliferaci melanocytů...27 Adheze trombocytů na povrch implantačních materiálů

13 Trombocyty a jejich potenciál pro netransfuzní použití Procházková R. 1, Jenčová V. 2 Transfuzní oddělení, Krajská nemocnice Liberec, a.s. 1 Katedra netkaných textilií, Textilní fakulta, Technická univerzita v Libererci 2 SBORNÍK ABSTRAKT Vzhledem k obsahu velkého množství řady růstových faktorů (PDGF, TGFB1, PDGFs, IGF1, FGF1, EGF, VEGFs) představují trombocyty významný potenciál pro regenerativní medicínu. Uvolněné růstové faktory podporují v organismu buněčnou diferenciaci, proliferaci, transkripci specifických proteinů, chemotaxi a další procesy nutné pro reparaci a regeneraci tkání. Terapeutické využití trombocytů v praxi ve formě autologní PRP (plazmy bohaté na trombocyty bylo zkoumáno a verifikováno nejprve v oblasti stomatochirurgie, postupně se rozšířilo i do dalších oblastí medicíny (další chirurgické obory, dermatovenerologie, oftalmologie..). Zkoumá se použití nejen PRP, ale i destičkového lyzátu, hledá se optimální koncentrace růstových faktorů, forma použití, otázky sterility přípravků apod. Trombocyty mají potenciál i pro použití v tkáňovém inženýrství, kde se ve formě PRP využívají pro stimulaci buněčné proliferace různých typů tkáňových kultur na nanovlákenných nosičích s cílem vytvořit systém vhodný pro následnou implantaci do organismu, s jejich pomocí se zkoumá trombogenicita cévních náhrad, vyvíjejí se produkty pro podporu hojení ran, apod. Problémem pro praxi je legislativní rámec, kdy i přes existenci základních právních norem, které tuto oblast regulují, se v praxi setkáváme s obtížně řešitelnými otázkami, zejména v oblasti produktů tkáňového inženýrství. 13

14 TROMBOCYTY V NETRANSFUZNÍCH APLIKACÍCH Interakce trombocytů s vlákennými (mikro/nano) materiály Jenčová V., Mikeš P., Pilařová K., Chvojka J., Erben J., Jiroušová J., Maříková Š., Procházková R., Horáková J. Technická Univerzita v Liberci Použití bioaktivních molekul v kombinaci se tkáňovými náhradami má velký potenciál pro regenerativní medicínu a tkáňové inženýrství. Zvláště u scaffoldů určených pro náhradu objemných tkání (kost, chrupavka) je velmi žádoucí podpořit buněčnou proliferaci do vnitřních struktur scaffoldu a tím výrazně urychlit proces hojení. V této práci jsme použili pro funkcionalizaci vlákenných materiálů trombocyty, které podporují buněčnou adhezi a proliferaci. Mikro a nano vlákenné materiály vyrobené z biodegradabilních syntetických a přírodních polymerů byly inkubovány 2h s trombocytárním koncentrátem (PRP? získaná z buffy coatu). Následně byl testován vliv struktury scaffoldu (mikro/nano) na adhezi trombocytů a dále uvolňování růstových faktorů. Byla měřena metabolická aktivita adherovaných trombocytů (MTT test), interakce s materiálem pomocí fluorescenční (anticd41-fitc) a elektronové mikroskopie (SEM) a uvolňování růstových faktorů pomocí SDS-PAGE. První výsledky ukazují, že přítomnost mikrovláken ve struktuře scaffoldu má vliv na aktivaci trombocytů a dochází k pozvolnějšímu uvolňování růstových faktorů. 14

15 SBORNÍK ABSTRAKT Povrch implantačních materiálů upravený krevními komponentami Himmlová L. 1, Bártová J. 1, Kubies D. 2, Vrbová R. 1, Oganessian E. 1, Podzimek Š. 1 Stomatologická klinika VFN v Praze a 1. LF UK 1 Ústav makromolekulární chemie AV ČR 2 Místem prvního kontaktu mezi implantovaným materiálem a živou tkání příjemce je krev. Po kontaktu s krví dochází k výměně iontů a proteinů a povrch implantátu je modifikován aktivitou krevních buněk. V in vitro podmínkách při interakcích mezi povrchem a buňkami vždy předchází adhese proteinů adhezi buněčné. Interakce povrchu materiálu s krví je regulována fyzikálněchemickými vlastnostmi implantátu. Proto je viabilita buněk v nejbližším okolí implantátu v přítomnosti různých krevních komponent důležitým krokem k porozumění procesu vhojování. Pro studium základního celulárního a molekulárního mechanizmu integrace implantátů byl použit modelový in vitro systém, ve kterém bylo sledováno chování lidských osteoblastů inokulovaných přímo na povrch materiálu pokrytý některou z krevních komponent (sérum, aktivovaná plasma a plasma bohatá na destičky). Tento model lépe umožní zjistit, které složky krve stimulují osteoinduktivní procesy, případně evokují zánětlivou reakci při vhojování implantátů do kosti. Studie sledovala vliv fyzikálně-chemických vlastností povrchu implantačních materiálů (Tiplasma-spray, Ti-leptaný, Ti-HA, ZrO 2 keramika, uhlíkový kompozit) bez i s aplikovanými krevními komponentami (sérum, aktivovaná plasma a plasma bohatá na destičky) na časnou odpověď lidských osteoblastů v podmínkách in vitro. Povrchové vlastnosti byly charakterizovány povrchovou drsností, smáčivostí ve vodě a volnou povrchovou energií. Proliferační a syntetická aktivita osteoblastů (BAP, RANKL, IL-8) byla hodnocena jak u implantačních materiálů s komerčně dostupnou úpravou povrchu, tak i u materiálů potažených krevními komponentami. Kontrolním materiálem byl polystyren upravený pro tkáňové kultury (TCPS). Relativně vysoká proliferační aktivita osteoblastů dosahovaná na téměř všech materiálech byla způsobena vysokou drsností povrchů (Ti-PS, Ti-HA), jejich hydrofilním charakterem (Ti-Etch, ZrO 2 ), přítomností funkčních skupin na povrchu (Ti-Etch) i osteokonduktivním chováním sledovaných materiálů (Ti-HA, ZrO 2 ). Vliv povrchové energie na proliferační aktivitu však nebylo možné jednoznačně rozlišit. Na druhé straně nízká proliferace osteoblastů na povrchu C/C kompozitu má pravděpodobně příčinu v téměř nulové hodnotě polární komponenty g P volné povrchové energie podpořené vysokou hydrofobicitou povrchu. Úprava povrchu implantačních materiálů krevními komponentami zlepšuje proliferaci osteoblastů u všech testovaných vzorků, avšak v různém rozsahu. Aplikace aktivované plasmy (fibrinová síť) vedla k unifikaci povrchů se srovnatelně vysokou proliferací. Stimulační efekt potažením sérem nebo plasmou bohatou na destičky nebyl tak zřejmý. Při hodnocení syntetické aktivity byla zjištěna vzrůstající tendence v expresi markeru časné osteoblastické aktivity - kostní kyselé fosfatázy (BAP) a IL-8 v řadě Ti-HA Ti-leptaný Tiplasma-spray ZrO 2 C/C kompozit u všech vzorků. Stejná produkce cytokinů srovnatelná s TCPS kontrolou, ve shodě s proliferací, byla pozorována na površích potažených plasmou, avšak mimo ZrO 2 a C/C kompozitu. Příspěvek vznikl za podpory projektu Interní Grantové Agentury Ministerstva zdravotnictví ČR č. NT a č. NS a za podpory výzkumného programu PRVOUK P28/LF1/6 Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy. 15

16 TROMBOCYTY V NETRANSFUZNÍCH APLIKACÍCH Možné technologie přípravy trombocytárních kultivačních půd Lasota Z. Nemocnice Nový Jičín a.s., Transfuzní oddělení Ve sdělení se snažíme poskytnout zejména ucelený pohled transfuziologa na možné alternativy přípravy trombocytárních in vitro produktů pro použití v půdách pro tkáňový růst. Je zohledněn pohled hematologa a imunologa. Prvořadě je to volba suroviny pro další zpracování. Zda budeme pracovat s aferetickými koncentráty trombocytů, poolovanými koncentráty z buffy coatu nebo s koncentráty separovanými z plazmy bohaté na trombocyty, či dokonce z out dated in vivo trombocytárními koncentráty. Na kvalitu výchozí suroviny může mít vliv i věk dárců a pohlaví. V případě práce s poolovanou surovinou, je otázka stejnoskupinových koncentrátů či nestenoskupinových. Výchozí surovina by měla být s největším zřetelem standardizována. Rozhodli jsme se pro standardizovaný výrobek trombocytů z aferézy deleukotizovaných. Kvalita vstupní suroviny je ověřována fenotypickým stanovením trombocytů. Následuje práce s komerční sestavou, zahrnující šokové zmražení, rozmražení, centrifugaci a filtraci. Je třeba stanovit kvalitativní znaky produktu, supernatantu koloidního roztoku se zbytky partikulí buněčných membrán, po rozmražení a po filtraci. Mezi specifické znaky je třeba zahrnout míru homogenity produktu, velikost partikulí po rozmražení a účinnost centrifugace a filtrace. Dále se ptáme na přítomnost povrchových epitopů destiček a možnou míru imunologické vazby, na hladiny vybraných složek obsahu granulí a na hladinu destičkového růstového faktoru a fibroblasty stimulujícího růstového faktoru. 16

17 SBORNÍK ABSTRAKT Testování tromobogenicity mikro-/nanovlákenných povrchů cévních náhrad Horáková J., Pavlíková T., Novák P., Šaman A., Mikeš P., Maříková Š., Jiroušová J., Procházková R., Jenčová V. Technická univerzita v Liberci Umělé cévní náhrady s malým průměrem (<6 mm) dosud v klinické praxi nenašly své uplatnění díky nesplnění všech požadavků, které tyto materiály musí splňovat. Jedním z nejdůležitějších parametrů je trombogenicita povrchu. Po implantaci do těla pacienta se krevní destičky po styku s cizorodým materiálem aktivují a vznikající tromby pak mohou ucpávat cévní náhradu. Nanovlákenné povrchy urychlují endotelizaci vnitřního lumen cévní náhrady, nicméně mohou vykazovat větší trombogenicitu. Adhezi a aktivaci krevních destiček mohou ovlivňovat nejrůznější látky jako např. S-nitrosothioly uvolňující oxid dusnatý. Vliv mikro-/nanovlákenné struktury a působení oxidu dusnatého na adhezi a aktivaci krevních destiček byl zkoumán pomocí smáčení v roztoku trombocytů a následném měření metabolické aktivity adherovaných trombocytů, fluorescenční mikroskopií a elektronovou mikroskopií. Míra trombogenicity povrchu pomáhá předpovídat chování cévní náhrady po implantaci do organismu před endotelizací vnitřního povrchu, který trvale zajistí průchodnost bypassu. 17

18 TROMBOCYTY V NETRANSFUZNÍCH APLIKACÍCH Analýza složení a vývoje hladin cytokinů v destičkovém lyzátu v průběhu skladování Lysák D., Holubová M., Windrichová J., Miklíková M., Jindra P. Hematologicko-onkologické oddělení Fakultní nemocnice Plzeň Úvod: Trombocyty a jejich deriváty jsou v současné době využívány jako vhodná alternativa xenogenních proteinů v růstových médiích pro přípravu mesenchymálních kmenových buněk (MSC) a své místo nacházejí také v regenerativní medicíně v oblasti hojení ran a chronických defektů. Destičková granula obsahují množství biologicky aktivních substancí, chemokinů, angiogenních proteinů a růstových faktorů podporujících buněčnou proliferaci a tkáňovou regeneraci. Cílem práce bylo analyzovat složení biologicky aktivních látek v destičkovém lyzátu a změny jejich hladin v průběhu skladování lyzátu po dobu 28 dní. Metoda: Bylo vyšetřováno 5 šarží poolovaného destičkového lyzátu (phpl). Každá šarže byla získána od cca 30-ti dárců trombocytů. Lyzát byl vyroben pomocí mechanické disrupce trombocytů opakovaným zamražením a rozmrazením, supernatant obsahující destičkové faktory byl oddělen centrifugací. Následně byl lyzát uchováván při 20 C. Hladiny cytokinů byly vyšetřovány na rozmraženém lyzátu skladovaném v lednici (2? 8 C) po dobu 0 hodin? 24h? 48h? 7 dní? 14d? 21d a 28d. Využita byla multiplexová xmap analýza (Luminex). Zároveň jsme testovali vliv takto uchovávaného lyzátu na proliferaci MSC pomocí platformy xcelligence (Roche). Výsledky: Analyzována byla kinetika hladin celkem 12 cytokinů: PDGF-AA, PDGF-BB, IL-8, PECAM-1, angiopoetin, HGF, GROβ, VEGF, Rantes, scd40l, ENA-78, follistatin. Hladiny většiny cytokinů byly podobné napříč šaržemi (CV 0,04? 0,13) a zůstávaly po celou dobu sledování stabilní nebo mírně klesaly ode dne +14? s mediánem 6 % (3 13%). Mírný vzestup byl zaznamenán pouze u PDGF-AA i -BB, GROβ, VEGF a Rantes (medián 7 %, 2 17%). Změny hladiny pohybující se do 10 % vstupní hodnoty byly zaznamenány u 83 % analytů. V den +28 byl pokles hladiny detekován u většiny cytokinů s mediánem 11 % (3 40%). Změna hladiny do 10 % vstupní hodnoty byla po měsíčním skladování přítomna pouze u 42 % analytů. S ohledem na malý počet testovaných šarží lyzátu je třeba zjištěnou kinetiku interpretovat jako orientační, nicméně i tato omezená data dokládají zachování hladin biologicky aktivních faktorů po dobu několikadenního skladování při teplotě 2? 8 C. Všechny testované lyzáty bez ohledu na dobu skladování efektivně stimulovaly proliferaci mesenchymálních kmenových buněk. Růstové křivky vykazovaly identický tvar až do 96 hodin (buněčný index 1,06? 0,04). Ode dne 120 byl vzestup křivek pro déle uchovávané lyzáty ( 7 dní) pozvolnější (buněčný index v den +144: 1,61? 0,05 vs. 1,30? 0,06; lyzáty skladované < 7 dni a 7 dní). Závěr: Analýza potvrdila přítomnost řady biologicky aktivních faktorů v destičkovém lyzátu. Jejich hladina zůstává stabilní i při několikadenním skladování lyzátu při teplotě 2? 8 C a takto skladovaný lyzát lze využít pro přípravu růstových médií pro kultivace MSC nebo pro přípravu léčivých přípravků pro účely tkáňové regenerace a hojení ran. Práce byla podpořena grantem MZ ČR RVO (Fakultní nemocnice Plzeň FNPl, ) a grantem Nadace pro transplantaci kostní dřeně. 18

19 SBORNÍK ABSTRAKT Deriváty lidské krve jako náhrada fetálního telecího séra při kultivaci kmenových buněk Suchánková Kleplová T. Lékařská fakulta UK v Hradci Králové Cíle: Cílem studie bylo izolovat mezenchymální kmenové buňky ze zubní dřeně (DPSC), kultivovat je v médiích obohacených o deriváty lidské krve, a následně zkoumat jejich základní biologické vlastnosti. Metodika: DPSC byly kultivovány v pěti různých médiích na bázi alfa-mem obohaceném o lidskou plazmu (HP), plasmu bohatou na destičky (PRP), nebo fetální telecí sérum (FCS) v různé koncentraci. Vliv média byl sledován pomocí měření proliferační aktivity, fenotypu a viability DPSC. Výsledky: DPSC v různých kultivačních médiích dosáhly více než 15 populačních zdvojení s výjimkou médiu obohaceném o 10% HP. Naše výsledky ukazují, že DPSC kultivované v médiu doplněném 10% PRP měly nejkratší doubling time (DT) (28,6+/-4,6 hodin), na rozdíl od DPSC kultivovaných v 10% HP, který měl nejdelší DT (156,2+/-17,8 hodin); kultivace buněk v mediu s 10% HP byla ukončena v 6. pasáži. DPSC kultivovány v médiu s 2% FCS (DT 47,3+/-10,4 hodin), 2% PRP (DT40,1+/-5,7 hodiny) a 2% HP (DT 49,0+/-15,2 hodin) vykazovali téměř shodnou proliferační aktivitu. DPSC kultivované v 10% PRP byly diferencovány ve zralé buněčné linie. Závěr: Prokázali jsme, že lidské krevní deriváty jsou možnou náhradou pro FCS v kultivačních médií pro dlouhodobou kultivaci DPSC. The study was supported by the Charles University in Prague, project GA UK No

20 TROMBOCYTY V NETRANSFUZNÍCH APLIKACÍCH Využití plazmy bohaté na destičky ( PRP ) při regeneraci kloubní chrupavky kolene u středně pokročilé femorotibiální chondromalacie - porovnání léčby pomocí PRP a kyseliny hyaluronové Jajtner P. 1, Hart R. 2, Komzák M. 3 Hematologicko-transfúzní oddělení Nemocnice Znojmo, p.o. 1 Ortopedicko-traumatologické oddělení Nemocnice Znojmo, p.o. 2,3 Úvod: Kloubní chrupavka je speciální pojivovou tkaní, která přebírá a rozděluje zatížení a zajišťuje v kloubech pohyb téměř bez tření. Tyto unikátní vlastnosti jsou poskytovány vysoce organizovanou extracelulární matrix, která je složena ze dvou hlavních makromolekul, což je fibrilární kolagen (typ II), který dává tahovou sílu, a velké agregáty vysoce hydratovaných proteogylkanů (PG) a hyaluronové kyseliny (HA), které jsou zachovány uvnitř kolagenní sítě a dodávají chrupavce její deformabilitu a elasticitu. Chondrocyty, které jsou živou hmotou kloubní chrupavky, jsou zodpovědné za udržování mimobuněčné matrix, pro niž musí být zajištěny vyvážené anabolické a katabolické reakce. Homeostáza chrupavky vyžaduje dynamickou rovnováhu mezi všemi těmito faktory. Jakékoliv porušení této rovnováhy může vést ke kvantitativním nebo kvalitativním změnám genové exprese chondrocytů, působícím modifikaci ve složení a struktuře kloubní chrupavky, což může ohrozit její funkci a integritu a vést k vývoji a progresi artrózy. Použití růstových faktorů je považováno za způsob, jak ovlivňovat hojení a usnadnit reparaci a remodelaci hostitelské tkáně. Jednou z možností je použití krevních destiček jako prostředku k dodání růstových faktorů na poškozené místo, což napodobuje fyziologický proces reparace tkáně. Růstové faktory jsou rozpustné bílkoviny, cytokiny. Jsou biologickými mediátory, které regulují klíčové fáze ve tkáňové reparaci: buněčnou proliferaci, chemotaxi (řízená buněčná migrace), diferenciaci buněk a syntézu extracelulární matrix. Krevní destičky obsahují několik signálních proteinů, které hrají velmi důležitou roli v remodelaci a reparaci různých typů pojivových tkání, jako je PDGF (destičkové růstové faktory), TGF β1 (transformovaný růstový faktor), VEGF (vaskulární endotelový růstové faktory), FGF (hlavní fibroblastový faktor) a EGF (epidermální růstový faktor). Nejčastěji používaný způsob jak aplikovat krevními destičkami vylučované růstové faktory je získat plazmu bohatou na destičky (PRP). PRP? plazma se dvou či vícenásobnou koncentrací trombocytů oproti normální plazmě. Cíle studie: Cílem studie bylo prokázat, že PRP má potenciál regenerovat poškozenou tibiofemorální kloubní chrupavku a zlepšit funkci kolenního kloubu. Metody: Čtyřicet pacientů s chondromalácií II. a III. stupně dle Outerbridgeho klasifikace podstoupilo jednoroční léčbu vlastní PRP nebo kyselinou hyaluronovou (HA). Výsledky byly hodnoceny těmito skórovacími systémy: Lysholm, Tegner, IKDC, WOMAC a SF-36. K vyšetření kloubní chrupavky byla použita magnetická rezonance, dále artroskopie s odběrem histologického vzorku. Vyšetření byla provedena před a následně po skončení terapie k objektivnímu hodnocení šíře chrupavky a zhodnocení stupně degenerace před a po skončení terapie. Výsledky: Studie demonstrovala signifikantní zlepšení v Lysholmově, Tegnerově, IKDC, WOMAC a SF-36 skórovacích systémech v obou skupinách. Z hodnocení vzhledu chrupavky nevyplynula makroskopická změna struktury při artroskopii po léčbě ani průkaz zvýšení šíře chrupavky při kontrolním vyšetření MRI. Mikroskopicky bylo prokázáno vyšší zastoupení chondrocytů a proteoglykanů v obou skupinách pacientů po léčbě, ale bez statisticky významného rozdílu mezi oběma skupinami. Závěr: PRP a HA signifikantně redukuje kloubní bolest a zlepšuje kvalitu života pacientů se středním stupněm degenerace kloubní chrupavky. Zastoupení chondrocytů a proteoglykanů v chrupavce bylo vyšší ve skupině pacientů léčených PRP než ve skupině léčených HA, ale bez statisticky významného rozdílu mezi oběma skupinami vzájemně. Studie byla podpořena grantem MZ ČR NT / autora: pavel.jajtner@nemzn.cz 20

21 Terapie šlachových lézí u koní plazmou bohatou na trombocyty Žuffová K., Žert Z. Klinika chorob koní, VFU Brno SBORNÍK ABSTRAKT V prezentaci jsou ukázky především praktického využití plazmy bohaté na trombocyty v léčbě různých šlachových lézí u sportovních a dostihových koní s pozitivním i negativním výsledkem jejího použití na průběh hojení. Přičemž plazma bohatá na trombocyty byla připravovaná buď nekomerční metodou, nebo metodou za použití komerčních setů na přípravu koncentrované plazmy. 21

22 TROMBOCYTY V NETRANSFUZNÍCH APLIKACÍCH Trombocytopenie a aplasie radia tar syndrom z pohledu klinické a molekulární genetiky Kuklík M., Mařík I. Genetické oddělení Praha a Endokrinologický ústav Praha Trombocytopénie a aplázie radia tvoří syndromologickou jednotku, mendelovsky dědičnou autosomálně recesivního charakteru, spojenou se zvýšenou lomivostí chromozomů, aplázií radia a dalšími skeletálními anomáliemi, např. kolenních kloubů. Pro chorobu je typická intermitentní trombocytopénie, poruchy imunitního systému a řada ortopedických komplikací. Onemocnění je prekancerozou, zvýšená dispozice k nádorovým onem oc nění je i u přenašečů tohoto onemocnění, kterými jsou z definice onemocnění rodiče i někteří ze sourozenců. Ve vybraných kazuistických sděleních demonstrujeme v longitudiálním sledování pacientů od dětství do dospělosti klinický a laboratorní obraz (např.manus vara congenita symetrického charakteru, cytogenetické změny u pacientů), diagnostické a terapeutické možnosti. V závěru je věnována pozornost diferenciální diagnostice podobných afekcí jako je např. Fanconiho anemie či syndrom VACTERL. 22

23 První zkušenosti s aplikací destičkových faktorů v dermatologii Kubešová B., Klimovič R., Kubeš V. VA-BIOS SBORNÍK ABSTRAKT Vynikající účinky plazmy s obsahem destičkových faktorů využili autoři při vývoji kosmetického gelu, který slouží pro regeneraci a podporu hojení. Součástí vývoje gelu bylo rovněž dlouhé hledání vhodných konzervačních látek, které zabrání množení mikroorganizmů v gelu, ale současně nepovedou ke snížení jeho biostimulačních vlastností. Ke stanovení dostatečné účinnosti antimikrobiální konzervace byly vzorky gelu naočkovány pěti kmeny mikroorganizmů (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Aspergillus brasiliensis). Každý týden mikrobiolog aseptickým způsobem odebral vzorek kontaminovaného gelu k mikrobiologickému vyšetření. Do 14-ti dnů byly všechny vzorky bez prokázání mikroorganismů a tři původně kontaminované vzorky byly sterilní již po týdnu sledování. Tento výsledek potvrdil správný výběr konzervačních látek z mikrobiologického pohledu. Dále bylo zapotřebí vyšetřit bezpečnost gelu pro lidi a to pomocí odborného a objektivního kožního testování. To proběhlo na akreditovaném dermatologickém pracovišti. Byla provedena studie na vzorku 25 účastníků ve věku od 18 do 63 let. Pro větší objektivnost byly zvoleny dva druhy dermatologických testů - uzavřený náplasťový epikutánní test s okluzí a jednoduchý otevřený epikutánní test. Nebyla zaznamenána žádná objektivní iritativní reakce ani žádné subjektivní negativní pozorování. 23

24 TROMBOCYTY V NETRANSFUZNÍCH APLIKACÍCH Kryokonzervované trombocyty jako dostupná alternativa nativních trombocytárních přípravků Bohoněk M., Křánová M. Ústřední vojenská nemocnice - Vojenská fakultní nemocnice Praha Trombocytární přípravky pro jakékoli použití jsou zatíženy nevýhodou krátké doby použitelnosti, která vylučuje tvorbu větších zásob a ztěžuje logistiku spojenou s jejich přípravou, distribucí a použitím. Jedním z míst, kde je toto omezení zvláště patrné, jsou urgentní příjmy a oddělení, která řeší problematiku masivního krvácení. Moderní masivní transfuzní protokoly jsou založeny na současném podání erytrocytů a plazmy, doplněných transfuzí trombocytů v co nejkratší možné době, zejména z důvodu prevence vzniku koagulopatie. Dostupnost trombocytů k včasné aplikaci masivního transfuzního protokolu během první?zlaté hodiny? po úrazu je ale často problematická a většina nemocnic si je nemůže dovolit mít kvůli krátké expiraci a vysoké ceně trvale na skladě, v případě urgentní potřeby většího množství přípravků, mají problémy s dostupností trombocytů i pracoviště fakultního typu. Vhodnou alternativou jsou proto trombocyty kryokonzervované, zmražené v DMSO při 80 C a skladované při teplotě 65 až 80 C. V takto zamraženém stavu je možné prodloužit expiraci trombocytů až na 2 roky. Postup kryokonzervace trombocytů je poměrně jednoduchý, cena je přijatelná a zařízení nutné ke skladování těchto transfuzních přípravků není nijak náročné. Celý proces rozmražení a rekonstituci kryokonzervovaných trombocytů v rozmražené plazmě trvá pouze 30 min. Takto rozmražené a rekonstituované trombocyty mají expiraci 6 hod a skladují se při C. Ve srovnání s čerstvými trombocytárními přípravky jsou kryokonzervované trombocyty částečně aktivované a i když jsou známy některé defekty trombocytů způsobené procesem zmražení a rozmražení, tyto změny nejsou klinicky významné a kryokonzervované trombocyty jsou efektivní při léčbě krvácení. Kryokonzervace trombocytů může nalézt i uplatnění u dalších aplikací, jako např. při přípravě autologních trombocytů pro transfuzní, ale i netransfuzní použití nebo při přípravě vzácných, či HLA kompatibilních trombocytů. Kryokonzervované trombocyty jsou proto vhodnou alternativou s širším uplatněním, kdy díky prodloužené době expirace lze vytvářet dostatečné zásoby těchto transfuzních přípravků. Krátká doba nutná k rozmražení a rekonstituci navím umožňuje jejich rychlé použití při urgentních stavech, jako je např. masivní krvácení. 24

25 PRP v korektivní dermatologii (indikace, metody použití) Trojanová P. Lékařské centrum zdraví a estetické péče s.r.o SBORNÍK ABSTRAKT PRP v indikacích korektivní dermatologie: rejuvenace kůže, atrofické jizvy, využití v kombinačních technologiích při řešení gravitační ptozy obličeje. Kazuistika-PRP terapie v léčbě iatrogenně vzniklé jizvy postmedikamentozní(depotní aplikace steroidů). 25

26 TROMBOCYTY V NETRANSFUZNÍCH APLIKACÍCH Trombocyty pro netransfuzní aplikace u dítěte - kazuistika Pacasová R. 1, Tesařová E. 1, Lejdarová H. 1, Adamcová M. 1, Dvořáková J. 1, Štěrba J. 2, Múdry P. 2, Janíček P. 3, Tomáš T. 3 Transfuzní a tkáňové oddělení Fakultní nemocnice Brno, Brno, Česká republika 1 Klinika dětské onkologie Fakultní nemocnice Brno, Brno, Česká republika 2 Ortopedická klinika Fakultní nemocnice u sv. Anny, Brno, Česká republika 3 Úvod: Léčba trombocyty představuje ve Fakultní nemocnici Brno (FN Brno) významnou část hemoterapie. V roce 2008 došlo ve FN Brno k výraznému nárůstu spotřeby trombocytů, zejména s ohledem na dlouhodobě úspěšnou léčbu pacientů s onkologickými diagnózami. Výroba trombocytových transfuzních přípravků představuje v Transfuzním a tkáňovém oddělení FN Brno standardizovaný proces při kterém jsou trombocyty získávány buď technikou aferézy nebo z buffy coatu z odběrů plné krve. Oba způsoby vedou ke vzniku cca terapeutických dávek trombocytů ročně; všechny trombocyty jsou deleukotizovány před skladováním a resuspendovány ve směsi plazmy a náhradního roztoku. V roce 2012 byla nabídka Transfuzního a tkáňového oddělení FN Brno rozšířena o trombocyty, ošetřené metodou inaktivace patogenů, provenience CERUS. Dlouhodobé a rozsáhlé zkušenosti s výrobou trombocytových transfuzních přípravků byly v roce 2013 ve FN Brno využity k výrobě trombocytů pro netransfuzní aplikaci, a to k výrobě Autologous Conditioned Plasma (ACP). Produkt byl použit k lokální aplikaci při odstranění pakloubu po transplantaci kostního štěpu před 14 měsíci a k rekonstrukční osteosyntéze ulny u pětiletého chlapce s diagnózou periostálního osteosarkomu středního rizika. Materiál a metodika: Autoři ve svém sdělení popisují validaci a průběh přípravy ACP v souladu s rutinními postupy používanými v zařízení transfuzní služby, jakými jsou odběr plné krve, tzv. měkká centrifugace plné krve pro získání Platelets Rich Plasma (PRP), sterilní napojení satelitních plastových vaků, adjustace vyrobených přípravků, zároveň s dodržením limitu, definovaného ortopedem, který k operaci požadoval ACP s obsahem trombocytů 5 x vyšším než jejich počet v periferní krvi a o objemu ml. Na základě literárních zdrojů byl pro výběr vhodného postupu přípravy zařazen i parametr minimální kontaminace leukocyty dle definice čím méně, tím lépe. Výsledky: Chlapci DV, ve věku 5 let a pět měsíců, s tělesnou hmotností 18 kg, bylo odebráno 143 ml plné krve, ze které byly vyrobeny následující produkty: krev pro autotransfuzi o objemu 110 ml, ochuzená o trombocyty a část objemu plazmy ACP pro lokální autologní netransfuzní aplikaci o objemu 35 ml s počtem trombocytů 35 x 109, tj. 1 x 106/ml, s nežádoucí kontaminací leukocyty v počtu 457/ml. Oba produkty byly aplikovány v průběhu téhož dne a v souladu s jejich předpokládaným použitím; jejich aplikace nebyla provázena výskytem nežádoucí reakce. Jiné transfuzní přípravky nebyly pro léčbu použity, resp. v časovém odstupu 8 dnů byla chlapci podána jedna transfuzní jednotka alogenních erytrocytů. Závěr: Pro výrobu a použití obou produktů byly realizovány postupy v souladu s požadavky Zákona o léčivu č. 378/2007 Sb. a Vyhlášky o lidské krvi č. 143/2008 Sb., obě legislativní normy v platném znění. Dikci Zákona o léčivu bylo vyhověno také při výdeji krve pro autotransfuzi, avšak ACP byla chlapci vydána pro léčbu v rozporu se zněním 5, odst. 6, Zákona o léčivu. Stav pacienta 10 měsíců po rekonstrukční osteosyntéze s použitím ACP, kdy je konstatováno přihojení štěpu, evokuje zahájení diskuze o změně definice pro výdej transfuzních přípravků dle 5, odst. 6, Zákona o léčivu. 26

27 POSTEROVÁ SEKCE Trombocyty adherované na nanovlákenné nosiče stimulují viabilitu a proliferaci melanocytů Vocetková K., Rampichová M., Sovková V., Benešová J. 2. Lékařská fakulta UK v Praze Cíle: Vitiligo je nejčastější depigmentační onemocnění kůže, charakterizované ztrátou funkčních melanocytů. Současné léčebné metody se zaměřují na repigmentaci již vzniklých lézí. Cílem bylo vyvinout polymerní systém pro dodávání bioaktivních látek, který by byl vhodný k autologní transplantaci melanocytů. Metody: Nanovlákna z polykaprolaktonu (PCL) byla připravena elektrostatickým zvlákňováním. Jako zdroj bioaktivních látek byly použity trombocyty. Nosiče byly osazeny melanocyty a byl sledován vliv látek uvolňovaných z trombocytů na melanocyty (jejich viabilitu a proliferaci). Výsledky: PCL nosiče funkcionalizované trombocyty signifikantně zlepšovaly adhezi melanocytů a stimulovaly jejich viabilitu a proliferaci, v porovnaní s PCL kontrolou. Závěr: Uvedené výsledky naznačují, že takto funkcionalizovaný nosič je vhodný pro terapii vitiliga. 27

28 POSTEROVÁ SEKCE Adheze trombocytů na povrch implantačních materiálů Vrbová R., Bártová J., Oganessian E., Kubies D., Himmlová L., Podzimek S. Stomatologická klinika 1. LF UK a VFN Krev hraje významnou roli při prvním kontaktu implantačního materiálu s živou tkání příjemce. Přítomnost krve v chirurgické ráně a adheze proteinů na povrch implantátu je nezbytná pro jeho úspěšné vhojení. Klíčovou roli v těchto procesech mají fyzikálně-chemické vlastnosti povrchu použitých materiálů. Krevní sraženina nejen spojuje vnější okraje rány, ale také vyplňuje prostor mezi stěnou kostního lůžka a implantátem. Tím izoluje tento prostor od vnějšího prostředí a slouží jako bariéra proti případné infekci. Vznikající vlákna fibrinu vytváří časné spojení mezi kostním lůžkem a povrchem implantátu a umožňují migraci buněk od povrchu kosti k implantátu. Proto je rychlá tvorba krevního koagula důležitá zejména pro počáteční fázi hojení, tedy primární fixaci implantátu do kosti. Studie se zabývala porovnáním vlivu různých povrchových úprav komerčně dostupných materiálů pro výrobu implantátů (cp-ti a slitina Ti6Al4V, CrCoMo slitina, ZrO2 keramika, polyethylen a uhlíkový kompozit) na rychlost tvorby krevního koagula. Povrchy testovaných implantačních materiálů byly charakterizovány volnou povrchovou energií, smáčivostí a povrchovou drsností. Kontrolním materiálem byl polystyren upravený pro tkáňové kultury. Jednotlivé sterilní vzorky byly vloženy do jamek kultivačních destiček a poté zaplaveny čerstvě odebranou plnou králičí krví. Tvorba krevního koagula na povrchu vzorků byla hodnocena ve 4 časových intervalech po 60 vteřinách, přičemž první vzorky byly vyjmuty po 2 minutách kontaktu s krví. Po opláchnutí byly vzorky fixovány, vysušeny v lyofilizátoru a pokoveny. Tvorba koagula byla sledována rastrovacím elektronovým mikroskopem a hodnocena kvalitativně ve všech časových intervalech a kvantitativně na vzorcích exponovaných v krvi po dobu 4 minut. Hodnocení bylo prováděno na obou stranách vzorku na 32 polích při 800 násobném zvětšení. V jednotlivých zorných polích byl sledován počet adherujících elementů, počet ložisek s již agregovanými elementy, počet vláken i vytvořená síť. Získané výsledky byly statisticky zhodnoceny Kruskal-Wallis a Mann-Whitney testy. Nejrychleji krev koagulovala na površích s vyšší povrchovou drsností, zatímco na materiálech s hladším povrchem se krev srážela pomaleji. Vliv volné povrchové energie ani smáčivosti povrchu nebyl prokázán. Jako nejvýhodnější se mezi sledovanými materiály ukázal cp-ti s povrchem upraveným leptáním. Fibrinová síť i celé krevní koagulum se na jeho povrchu tvořilo rychleji ve srovnání s ostatními sledovanými materiály. Rovněž počet elementů a vláken byl nejvyšší u tohoto typu materiálu. Studie vznikla za podpory projekty Interní Grantové Agentury Ministerstva zdravotnictví ČR č. NS a č. NT a za podpory výzkumného programu PRVOUK P28/LF1/6 Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy. 28

29 KONFERENCE/KONGRESY/SYMPOZIA VÁŠ OSVĚDČENÝ PARTNER PŘI REALIZACI KONGRESŮ KONFERENCÍ SYMPOZIÍ FIREMNÍCH PREZENTACÍ SPOLEČENSKÝCH AKCÍ DOPROVODNÝCH PROGRAMŮ VZDĚLÁVACÍCH KURZŮ PR SLUŽEB

30 POZNÁMKY: 30

31

32 2013 Terumo BCT, Inc. / PN