Sandwichová metoda. x druhů mikrokuliček rozlišených různou kombinací barev (spektrální kód)

Transkript

1 Jindra Vrzalová

2

3 x druhů mikrokuliček rozlišených různou kombinací barev (spektrální kód) na každém druhu je navázána molekula vázající specificky jeden analyt (protilátka, antigen, DNAsonda,,) Sandwichová metoda Navázání analytu na mikrokuličky Poté navázání reporterové molekuly (např. druhá protilátka s phycoerytrinem)

4 Vyhodnocení pomocí kalibrační křivky pro každý analyt Vzorky mohou být měřeny na přístroji několika typů

5

6 Modifikace průtokové cytometrie Mikrokuličky protékají přístrojem jedna po druhé U každé kuličky jsou změřeny fluorescence vzniklé po excitaci 2 různými lasery: Jeden laser určuje barvu kuličky = druh analytu kvalita Druhý laser stanovuje množství reporterové molekuly = množství analytu kvantita

7

8

9

10 Pro celou analýzu se používají mikrofiltrační 96 jamkové destičky Pro odstranění nenavázaných substancí je používána filtrace přímo na deskách (mikrokuličky s navázanými substancemi zůstávají v desce, vše ostatní je odsáto dnem desky)

11 Nová možnost separace pro multiplex Výhoda jednodušší automatizace, lepší reprodukovatelnost

12 Alzheimer Nádorové markery Kardio markery Buněčná signalizace Cytokiny, Chemokiny, růstové faktory Genová exprese a genotypizace Endokrinologie Epigenetika Isotypizace Metabolické markery Nervový a CNS systém Sepse Kožní markery Transkripční faktory Toxikologie Testování očkovacích látek

13 Analytický přínos Stejná a standardní preanalytika a analytika pro všechny analyty Urychlí a ušetří práci Malé množství materiálu Klinický a výzkumný přínos Získání obrovského množství dat Finanční přínos To se vyplatí!!!

14 Extracelulární proteiny v oběhu Membrána stav receptorů Intracelulární 2. poslové signální kaskády Transkripční faktory DNA SNP, mutace, amplifikace mrna Regulátory translace např. microrna proteiny

15 Sérum Plazma Výpotky Seminální plazma Supernatanty buněčné kultury Mikrodialyzáty Nitrooční tekutina Lidské Myší Krysí (Prasečí)

16 Ideální biomarker 1. specifický pro daný typ choroby 2. nepřítomný u osob bez dané choroby 3. koncentrace by měla korelovat s tíží onemocnění / agresivitou Žádný současný marker to nesplňuje Hledání nových biomarkerů?? Kombinace biomarkerů!!! nový analytický přístup multiplexové technologie

17 Existující panely musí být optimalizovány v souladu s klinickými otázkami Problém: Ověření panelů pro klinické účely vyžaduje studie s velkým počtem pacientů Dosud nelze statimové vyšetření Nedostatečná validace Plné využití je možné pouze ve spojení s multiparametrickým hodnocením výsledků Klinické Technické

18 Proteiny ve velmi nízkých koncentracích v krvi Interleukiny Růstové faktory Chemokiny Proteiny vyžadující ředění Adhezivní molekuly MMP9 Adiponektin PAI-1 Proteiny vyžadující speciální preanalytiku PTH, ACTH 100 (50) analytů v imunoanalýze dnes pouze teorie

19 EDTA plasma Miliony EDTA plasma Serum/EDTA plasma comparison for VCAM 4000 Rozdílné výsledky pro některé analyty: y = 0,8447x + 184,18 R 2 = 0,7883 v séru a v plazmě v EDTA a citrát. plazmě serum VCAM linear trend Typ materiálu má vliv i na úspěšnost detekce proteinu Serum/EDTA plasma comparison for MMP9 Kompromis je nezbytný musí být použit materiál vhodný pro většinu proteinů nebo pro nejdůležitější proteiny ve studii 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 Miliony Serum MMP9

20 ACTH plasma!!! Insulin Leptin OPN Osteopontin Osteokalcin Osteoprotegerin PTH plasma!!!

21 Vypočtená funkce: Logit = -2, ,3156 * MIF - 0,7761 * PRL + 4,1199 * CA125_LU - 1,4290 * OPN + 1,3022 * Leptin + 3,7243 * IGF přiřazuje každému markeru koeficient přírůstku - důležitosti Odds ratio Vypočtené zařazení skupina Odds ratio Vypočtené zařazení skupina 0,09 0, benigni? 0 0,09 0, benigni? 1 0,09 0, benigni? 0 0,09 0, benigni? 1 0,09 0, benigni? 0 53,72 1, maligni? 1 0,09 0, benigni? 0 3,21 1, maligni? 1 0,09 0, benigni? ,28 1, maligni? 1 0,33 0, benigni? 0 200,2 1, maligni? 1 0,32 0, benigni? 0 5,41 1, maligni? 1 0,09 0, benigni? 0 53,72 1, maligni? 1 0,09 0, benigni? 0 736,2 1, maligni? 1 0,09 0, benigni? 0 24,72 1, maligni? 1 0,09 0, benigni? 0 5,41 1, maligni? 1 0,04 0, benigni? 0 197,53 1, maligni? 1 0,09 0, benigni? 0 200,2 1, maligni? 1 0,09 0, benigni? 0 3,64 1, maligni? 1 0,09 0, benigni? 0 3,25 1, maligni? 1

22 Proliferativní typ (PDR) Hlavní důvod slepoty u dospělých v USA ovlivňuje centrální i periferní vidění Následek angiogeneze zvýšená novotvorba nekvalitních cév, které vedou často k hemoragickým projevům Roli hrají: Angiogenní faktory Antiangiogenní faktory Chemokiny, zánětlivé cytokiny Stanovení faktorů v nitrooční tekutině

23 PDR VEGF conc.: 7246 pg/ml Novotvořené cévy

24 Po léčbě (pars plana vitrectomie): Residuální fibrotická tkáň VEGF conc.: 16 pg/ml Patient was not treated by anti-vegf drugs

25 Sensitivity AUC 95% CI b VEGF IL6 IL8 IP10 MCP1 TGFB1 VEGF to IL to IL to IP to MCP to TGFB to Specificity

26 Panel gastrointestinálních patogenů Cystická fibróza - genetika Panel respiratorních virových onemocnění Novorozenecký screening Pharmakogenetika - Cytochrome P450 2D6 genotypizace Detekce a diferenciace HSV 1&2 viru u žen Testování alergií Autoimunitní choroby HLA testování

27

28 Děkuji za pozornost