ELISA-VIDITEST anti-vzv IgG (CSF)

Transkript

1 ELISA-VIDITEST anti-vzv IgG (CSF) OD-087 / 5ST Návod k použití soupravy VÝROBCE: VIDIA spol. s r.o., Nad Safinou II č. 365, Vestec, Jesenice, tel.: , 1. NÁZEV SOUPRAVY : ELISA-VIDITEST anti-vzv IgG (CSF): souprava pro semikvantitativní a kvantitativní detekci protilátek třídy IgG proti viru varicella zoster (VZV) v séru a pro stanovení intrathekální syntézy. 2. POUŽITÍ : Souprava je určena pro diagnostiku chorob vyvolaných nebo spojených s VZV, např. planých neštovic a pásového oparu, včetně infekcí provázených neurologickými komplikacemi (encefalitis, meningitis, cerebellitis, vaskulitis, myelitis a zánětlivé neuropatie). Soupravu lze též využít pro diferenciální diagnostiku neuroinfekcí, očních infekcí a kožních exanthematických onemocnění. Doplňkovými testy pro sérologické vyšetření VZV jsou detekce IgM, či IgA protilátek a stanovení avidity IgG protilátek proti VZV (ELISA-VIDITEST anti-vzv IgM, ELISA-VIDITEST anti-vzv IgA, ELISA-VIDITEST anti-vzv IgG a avidita IgG). 3. PRINCIP TESTU : ELISA-VIDITEST anti-vzv IgG (CSF) je imunoanalytický test na pevné fázi. Na povrch jamek je navázán nativní antigen VZV. Jsou-li v testovaných sérech přítomny příslušné protilátky, navážou se na imobilizované antigeny. Navázané protilátky pak v dalším kroku reagují s protilátkami proti lidskému IgG značenými křenovou peroxidázou. Množství navázaných značených protilátek se stanoví barevnou enzymatickou reakcí. Intenzita zabarvení substrátu odpovídá množství protilátek v testovaném vzorku. Negativní séra nereagují, mírná změna v zabarvení jamek je pozadím reakce. Vyšetření intrathekálních protilátek udává informaci o protilátkové odpovědi proti VZV v centrálním nervovém systému. Pro toto stanovení je nezbytné kvantifikovat VZV-specifcké IgG protilátky v párových vzorcích séra a mozkomíšního moku, odebraných od pacienta ve stejnou dobu. Přesnou kvantifikaci protilátek lze provést pouze podle lineární části kalibrační křivky. Proto se doporučuje vyšetřit sérum ve dvou ředěních (viz kap. 6, příprava reagencií). Pro stanovení je nutno znát celkovou koncentraci IgG a albuminu v obou vzorcích. Výpočet intrathekální syntézy specifických protilátek se provádí pomocí Reiberovy rovnice (viz kap Výpočet intrathekální syntézy protilátek). 4. OBSAH SOUPRAVY : ELISA odlamovací stripy v manipulačním rámečku potažené antigenem STRIPS Ag 1 x 12 ks 1,3 ml Standardu A=negativní kontrolní sérum, r.t.u. 1), 2) ST A/CTRL- 1 lahvička 1,3 ml Standardu B, r.t.u. ST B 1 lahvička 1,3 ml Standardu C, r.t.u. ST C 1 lahvička 1,3 ml Standardu D=Standard 1(kalibrátor), r.t.u. ST D/ST 1 1 lahvička 1,3 ml Standardu E=Standard 2 (pozitivní kontrolní sérum), r.t.u. ST E/ST 2 1 lahvička 13 ml protilátek proti lidskému IgG značených peroxidázou (konjugát anti-igg Px) r.t.u. CONJ 1 lahvička 55 ml promývacího roztoku 10x konc. WASH 10x 1 lahvička 60 ml ředicího roztoku r.t.u. DIL 1 lahvička 13 ml chromogensubstrátového roztoku TMB r.t.u. TMB 1 lahvička 13 ml stop roztoku r.t.u. STOP 1 lahvička 1

2 Sáček se zipem Návod k použití soupravy Certifikát kontroly kvality 1) r.t.u., ready to use (v pracovní koncentraci) 2) koncentrace standardů jsou uvedeny v přiloženém certifikátu pro danou šarži soupravy (miu/ml - mezinárodní jednotky WHO (mili-iu)) Chromogensubstrátový roztok TMB r.t.u. je zaměnitelný pouze mezi soupravami ELISA-VIDITEST, které obsahují TMB, a NENÍ VZÁJEMNĚ ZAMĚNITELNÝ s ostatními roztoky TMB použitými v jiných soupravách ELISA-VIDITEST TMB-O, TMB-BF. 5. POTŘEBNÝ MATERIÁL NEDODÁVANÝ SE SOUPRAVOU : Destilovaná/deionizovaná voda pro ředění promývacího roztoku, pipetovací zařízení, zařízení pro rozplňování roztoků a promývání stripů, spektrofotometr/kolorimetr pro měření absorbance mikrotitrační destičky při 450nm. 6. PŘÍPRAVA REAGENCIÍ : a. Vytemperujte všechny složky soupravy na laboratorní teplotu. b. Těsně před vyšetřením důkladně zamíchejte vzorky vyšetřovaných sér, likvorů a standardy. Testovaná séra řeďte ředicím roztokem 101x (5 L séra L ředicího roztoku). Pro stanovení intrathekálních protilátek doporučujeme vyšetřovat séra ve dvou ředěních: 101x a 404x Ředění séra 404x proveďte čtyřnásobným naředěním séra, ředěného 101x, (např. 150 μl ředícího roztoku + 50 μl séra, naředěného 101x). Likvory řeďte ředícím roztokem 2x (např. 100 μl mozkomíšního moku μl ředícího roztoku). Kontrolní séra (standardy) neřeďte, jsou v pracovní koncentraci (r.t.u., ready to use). c. Připravte pracovní koncentraci promývacího roztoku jeho naředěním 10x ve vhodném objemu destilované/deionizované vody (např. 50 ml promývacího roztoku ml H 2O). Pokud jsou v koncentrovaném roztoku krystaly soli, zahřejte ho na vodní lázni při +32 až +37 o C a před naředěním dobře promíchejte. Nespotřebovaný promývací roztok v pracovní koncentraci lze skladovat 1 týden při teplotě +2 až +10 o C. d. Konjugát anti-igg Px, chromogensubstrátový roztok TMB a stop roztok neřeďte, jsou v pracovní koncentraci (r.t.u.). 7. PRACOVNÍ POSTUP a. Stripy, vakuově zatavené s desikantem, nechte před otevřením sáčku vytemperovat na laboratorní teplotu, aby nedošlo k orosení destičky. Připravte si potřebný počet stripů pro reakci. Nepoužité stripy společně s desikantem dobře uzavřete do sáčku se zipem nebo vakuově zatavte. b. Zvolte způsob, který chcete použít pro hodnocení testu (viz kap. 8) a podle něj aplikujte vzorky na destičku. Naplňte jamky po 100 L jednotlivých standardů a ředěných testovaných vzorků takto: První jamku naplňte samotným ředicím roztokem DIL pro stanovení pozadí reakce. Pro kvalitativní a semikvantitativní hodnocení naplňte dvě jamky Standardem D ST D/ST 1, který slouží jako kalibrátor. Další jamku pozitivním kontrolním sérem ST E/ST 2 a další negativním kontrolním sérem ST A/CTRL- (viz Tab. 1). Pro kvantitativní hodnocení naplňte vždy po jedné jamce Standardy A E (STA/CTRL-, ST B, ST C, ST D/ST 1, ST E/ST 2). Zbývající jamky naplňte ředěnými testovanými vzorky (S1 ), (viz Tab. 2) Každý vzorek stačí aplikovat na jednu jamku (S1, S2, S3, ), případně mozkomíšními moky (M1, M2, M3, ). Pokud chcete vyloučit případnou laboratorní chybu, vyšetřované vzorky a standardy aplikujte po dvou jamkách (viz Tab. 3), v případě kvalitativního a semikvantitativního hodnocení aplikujte ST D/ST 1 na tři jamky. Pro ověření správnosti kalibrace, návaznosti a variability testu doporučujeme zahrnout vzorek pozitivního referenčního séra (vaši vnitřní kontrolu) do každého běhu. Inkubujte 60 minut (+/- 5 min.) při laboratorní teplotě. c. Odsajte obsah jamek do pojistné sběrné láhve obsahující vhodný dezinfekční prostředek (viz Bezpečnostní předpisy). Jamky poté 4x promyjte 250 L promývacího roztoku. Vyvarujte se přetékání roztoku ven z jamek. Obsah jamek odsajte a destičku vyklepněte na přířez buničité vaty. 2

3 d. Důkladně promíchejte lahvičku s konjugátem anti-igg Px r.t.u. CONJ a napipetujte do jamek po 100 L konjugátu anti-igg Px r.t.u.. Inkubujte 60 minut ( 5 min.) při laboratorní teplotě. e. Tekutinu z jamek odsajte a promyjte je 4x 250 L promývacího roztoku (viz bod c.). Odsajte a vyklepněte. f. Napipetujte do jamek po 100 L chromogensubstrátového roztoku TMB. Inkubujte 10 minut ( 30 sec.) v temnu při laboratorní teplotě. Dobu inkubace začněte měřit po napipetování 1. stripu destičky. Dodržujte toto pravidlo, vyvarujete se tak nedodržení časového intervalu. Pipetujte rychle v pravidelném rytmu, případně použijte vhodný dispenzor. Překryjte stripy neprůhledným víčkem, nebo je po dobu reakce uložte na temné místo. g. Zastavte reakci přidáním 100 L stop roztoku STOP. Pipetujte ve stejném rytmu jako při rozplňování chromogensubstrátového roztoku TMB, aby enzymatická reakce probíhala ve všech jamkách po stejnou dobu. Zkontrolujte, zda nejsou v jamkách bubliny, pokud ano, jemným poklepem na rámeček destičky je odstraňte. h. Intenzitu barevné reakce změřte na spektrofotometru/kolorimetru při 450 nm nejpozději do 10 minut po zastavení reakce. Doporučujeme použít referenční filtr nm. a Tab. 1: Schéma aplikace vzorků pro kvalitativní a semikvantitativní hodnocení DIL b ST D/ST 1 c ST D/ST 1 d ST E/ST 2 e f g h ST A/CTRL- S1 S2 S Tab. 2: Schéma aplikace vzorků pro kvantitativní hodnocení, příp. pro stanovení intrathekální syntézy po jedné jamce a DIL S3 b ST A/CTRL- S c ST B M1 d ST C M2 e ST D/ST 1 M3 f ST E/ST 2 M g h S1 S2 3

4 Tab. 3: Schéma aplikace vzorků pro kvantitativní hodnocení, příp. pro stanovení intrathekální syntézy po dvou jamkách a DIL S2 M b ST A/CTRL- S2 M c ST B S d ST C S e ST D/ST 1 M1 f ST E/ST 2 M1 g S1 M2 h S1 M2 8. HODNOCENÍ TESTU : Nejdříve odečtěte absorbanci jamky se samotným ředicím roztokem (DIL = pozadí reakce) od hodnot Standardů a testovaných vzorků Kvalitativní orientační hodnocení 1. Spočítejte průměrnou hodnotu OD Standardu D ST D/ST 1. Pokud aplikujete tři jamky Standardu D a některá z těchto hodnot se liší o více než 20% od průměru, nepoužívejte ji k výpočtu a spočítejte průměr ze zbývajících dvou hodnot. 2. Stanovte cut-off hodnotu. Cut-off hodnotu stanovíte tak, že průměrnou hodnotu Standardu D ST D/ST 1 vynásobíte korekčním faktorem. Hodnota korekčního faktoru Standardu D se určuje pro každou šarži soupravy a je uvedena v Certifikátu kontroly kvality dané šarže. 3. Séra s hodnotou OD < 90% cut-off jsou negativní a séra s hodnotou OD > 110% cut-off jsou považována za pozitivní Semikvantitativní hodnocení Stanovte hodnotu indexu pro jednotlivé vzorky sér: 1. Nejdříve stanovte cut-off hodnotu jako v předešlém způsobu hodnocení (kap. 8.1., bod 2). 2. Stanovte hodnotu indexu pro jednotlivé vzorky tak, že vydělíte OD testovaného vzorku cut-off hodnotou. 3. Odečtěte v tabulce (viz HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ) odpovídající stupeň reaktivity vzorku. HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ: Hodnota indexu Vyhodnocení < 0,90 Negativní 0,90-1,10 +/- 1,11-2,50 + 2,51-5, ,01-8, > 8, Příklad: Získaná OD Standardu D = 1,807; 1,704; 1,750 Průměrná hodnota OD = 1,754 Korekční faktor = 0,15 Cut-off hodnota = 1,754 x 0,15 = 0,263 OD vzorku séra = 0,800 Hodnota indexu = 0,800 / 0,263 = 3,04 4

5 Pozn.: Hodnocení +/- znamená, že sérum leží v rozmezí šedé zóny. V případě tohoto výsledku test opakujte. Leží-li sérum po opakovaném testování opět v rozmezí šedé zóny, opakujte testování alternativní metodou nebo použijte sérum odebrané od téhož jedince o 1-2 týdny později Stanovení koncentrace protilátek ve vyšetřovaném séru (miu/ml) Stanovte množství mezinárodních jednotek (miu/ml) v jednotlivých vzorcích: 1. Sestrojte kalibrační křivku tak, že na osu x vynesete jednotky Standardů (uvedeny v přiloženém certifikátu kvality pro danou šarži soupravy). Na osu y vyneste jejich absorbance. Doporučujeme použít logaritmickou osu x. 2. Na kalibrační křivce vyhledejte místo, kde absorbance testovaných sér protíná kalibrační křivku a spusťte kolmici na osu x. Zde odečtěte koncentraci protilátek testovaných sér v miu/ml. Pro vyhodnocení lze využít různé softwarové programy, např. KimQ, Winliana aj. V tom případě je nejpřesnější hodnocení pomocí polynomické (čtyř-parametrové) funkce Hodnocení koncentrace protilátek v séru (ředění 101x) Koncentrace (miu/ml) Vyhodnocení < 150 Negativní /- > 200 Pozitivní Pozn. 1: jednotek odpovídá šedé zóně. V případě tohoto výsledku test opakujte. Leží-li sérum po opakovaném testování opět v rozmezí šedé zóny, opakujte testování alternativní metodou, nebo použijte sérum odebrané od téhož jedince o 1-2 týdny později. Pozn. 2: Kvantifikace je přesná pouze v lineární části kalibrační křivky. Pokud naměřené OD vzorku přesahuje interval linearity (OD 0,200-2,000) je nutno pro přesnou kvantifikaci opakovat testování vzorku při vyšším ředění. 9. PRŮKAZ INTRATHEKÁLNÍ SYNTÉZY SPECIFICKÝCH PROTILÁTEK IgG: 9.1. Průkaz protilátek proti VZV v séru IgG protilátky proti VZV mají anamnestický charakter. Po prodělané primární infekci přetrvávají v séru pacienta po celý život. Signifikantní vzestup IgG protilátek může být důsledkem reaktivace infekce. Detekce IgG protilátek v ELISA není zárukou protektivní imunity. Sérologický nález je možno interpretovat pouze v kontextu s výsledky ostatních laboratorních testů a s klinickým obrazem pacienta. 9.2 VÝPOČET PROTILÁTKOVÉHO INDEXU (AI) (dle Reibera) Stanovení koncentrace IgG proti VZV v mozkomíšním moku lze interpretovat pouze na základě výpočtu intrathekální syntézy protilátek Výpočet poměru mezi koncentracemi celkového IgG (Q total IgG) a celkového albuminu (Q total alb) v mozkomíšním moku a séru. Spočítejte Q total IgG a Q total alb podle vzorce: Q total IgG = totaligg v MM totaligg v séru Q total alb = totalalb v MM totalalb v séru Výpočet limitního koeficientu Q limigg tj. množství IgG v mozkomíšním moku, které může za daného stavu bariéry pocházet ze systémové cirkulace (Reiberova hyperbolická funkce). Spočítejte Q limigg podle vzorce: 5

6 Q limigg = 0,93 x (Q totalalb ) 6 x ,7 x Výpočet koeficientu pathogen-specifických protilátek IgG Q path.-spec.igg, který udává poměr mezi koncentrací specifických IgG v mozkomíšním moku a séru. Spočítejte Q path.-spec.igg podle vzorce: Q path.-spec.igg = c spec.igg MM x ředění c spec.igg sérumx ředění kde c spec.igg MM / sérum je stanovená koncentrace specifických protilátek v miu/ml v mozkomíšním moku/ séru násobená ředěním vzorku (viz kap. 6) Příklad: c spec.igg MM = 38 miu/ml, vzorek ředěn 2x v ředicím roztoku c spec.igg sérum = 10 miu/ml, vzorek ředěn 101x v ředicím roztoku Q path.-spec.igg = 38 x 2 10 x 101 = 75,2 x Výpočet protilátkového indexu AI a) Pokud platí: Q total IgG < Q limigg, spočítejte AI podle vzorce: AI = Q path. -spec.igg Q totaligg b) Pokud platí: Q total IgG > Q limigg, spočítejte AI podle vzorce: AI = Q path. -spec.igg Q limigg Pro automatický výpočet k soupravám dodáváme software VIDITAB. 9.3 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ: Hodnocení výsledku stanovení intrathekálních protilátek AI < 1,5 intrathekální syntéza specifických protilátek neprokázána AI 1,5-2,0 suspektní intrathekální syntéza specifických protilátek AI > 2,0 prokázána intrathekální syntéza specifických protilátek Průkaz specifických intrathekálních protilátek je znakem přítomnosti virových antigenů v centrálním nervovém systému (CNS). Nízké hladiny těchto protilátek se mohou tvořit v důsledku polyklonální aktivace i při jiných zánětlivých onemocněních CNS, např. při roztroušené skleroze. 10. CHARAKTERISTIKY TESTU : Platnost testu Hodnota absorbance samotného ředicího roztoku (DIL = pozadí reakce) by měla být < 0,100. Hodnoty OD standardů/ kontrolních sér a poměr hodnot OD standardů ST E/ST 2 / ST D/ST 1 by měly být v rozmezích uvedených v Certifikátu kontroly kvality dané šarže Přesnost testu Pro stanovení variability mezi jednotlivými testy - reprodukovatelnost (interassay) a během testu - opakovatelnost (intraassay) bylo provedeno srovnání vzorků s různými hodnotami OD Opakovatelnost (intraassay) Variační koeficient opakovatelnosti je maximálně 5%. Je měřen pro každou šarži minimálně na 12 paralelních jamkách téže destičky. 6

7 Příklad: (n = počet paralelních jamek na téže destičce) n A CV opak. 16 1,335 0,050 3,8 % 16 0,614 0,023 3,7 % Reprodukovatelnost (interassay) Variační koeficient reprodukovatelnosti je maximálně 15%. Je měřen pro každou šarži porovnáním jamek téhož séra v několika po sobě jdoucích testech. Příklad: (n = počet testů určitého vzorku) n A min max CVrepro 18 1,369 0,064 1,223-1,476 4,7% 18 0,463 0,060 0,337-0,569 12,9% Recovery test Naměřené hodnoty recovery se pohybují pro každou šarži v rozmezí 80 až 120% očekávané hodnoty Diagnostická citlivost a specifita testu Stanovení diagnostické citlivosti a specifity testu bylo provedeno pomocí porovnání výsledků vyšetření vzorků soupravou Viditest s výsledky vyšetření dvěma srovnávacími komerčními ELISA testy a testem nepřímé imunofluorescence. panel sér celk. poč pozitivní hraniční negativní hodnocení pozitivní citlivost: 96,9% negativní specifita: 96,6% Hraniční výsledky nebyly brány při hodnocení v potaz Interference Hemolytické a lipemické vzorky nevykazují žádný vliv na výsledek testu minimálně do 50 mg/ml pro hemoglobin, 5 mg/ml pro bilirubin a 50 mg/ml pro triglyceridy Mez stanovitelnosti Mez stanovitelnosti je definována jako nejnižší měřitelná koncentrace, která může být s 95% jistotou odlišena od nuly. Tato hodnota činí 10 miu/ml. 11. BEZPEČNOSTNÍ PŘEDPISY : Všechny složky soupravy jsou určeny pouze pro laboratorní účely. Lidská séra použitá v soupravě byla testována na nepřítomnost HBsAg, HCV a protilátek anti-hiv-1,2. Přesto s nimi nakládejte jako s infekčním materiálem a předměty, které s nimi přišly do styku, autoklávujte 1 hodinu při 121 C nebo dezinfikujte minimálně 30 minut 3% roztokem chloraminu. Tekuté odpady obsahující stop roztok (roztok kyseliny sírové) před likvidací neutralizujte 4% roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Odpad vzniklý při promývání stripů dezinfikujte v odpadní nádobě pomocí vhodného dezinfekčního roztoku (např. Incidur, Incidin, chloramin,...) v koncentraci doporučené výrobcem. Se stop roztokem pracujte opatrně, aby nedošlo k potřísnění kůže nebo sliznice. Stane-li se tak, omyjte postižené místo větším množstvím tekoucí vody. Při práci nejezte, nepijte a nekuřte. Nepipetujte ústy, ale vhodnými pipetovacími zařízeními. Používejte ochranné rukavice a po práci si důkladně umyjte ruce. Dbejte, aby nedošlo k rozlití vzorků a k tvorbě aerosolu. 7

8 12. UPOZORNĚNÍ : a. Výrobce zaručuje použitelnost soupravy jako celku. b. Promývací roztok, chromogensubstrátový roztok TMB r.t.u., stop roztok r.t.u. a ředicí roztok r.t.u. jsou vzájemně zaměnitelné mezi jednotlivými soupravami ELISA-VIDITEST, pokud není v návodu k použití soupravy uvedeno jinak. c. Pracujte asepticky, aby nedošlo k mikrobiální kontaminaci sér a reagencií. d. Při odebírání, ředění a skladování reagencií postupujte tak, aby nedošlo k jejich vzájemné kontaminaci či kontaminaci látkami inhibujícími enzymatickou aktivitu. e. Kontrolní séra (standardy), ředicí roztok, chromogensubstrát. roztok TMB a konjugát anti-igg Px jsou konzervovány ProClinem 300. f. Chromogensubstrátový roztok nesmí přijít do styku s oxidačními látkami a kovovými povrchy. g. Dodržujte přesně pokyny uvedené v návodu. Nereprodukovatelné výsledky mohou vzniknout zejména: * nedostatečným promícháním reagencií a vzorků před použitím * nepřesným pipetováním a nedodržováním času inkubací uvedených v bodě 7. * špatnou technikou promývání a potřísněním okrajů jamek vzorky nebo konjugátem * použitím stejné špičky při pipetování různých roztoků nebo záměnou uzávěrů 13. SKLADOVÁNÍ A EXPIRACE : a. Soupravu a její složky skladujte v suchu a temnu při teplotě +2 až +10 C. Za těchto podmínek je exspirační doba celé soupravy uvedena na centrálním štítku na obalu soupravy, exspirace jednotlivých složek je uvedena na jejich obalu. b. Nespotřebované stripy vložte zpět do obalu a zatavte, nebo dobře uzavřete do sáčku se zipem společně s desikantem. Soupravy se přepravují v termotaškách s ledem, doba přepravy do 72 hodin nemá na exspiraci vliv. Jestliže po obdržení soupravy zjistíte vážné poškození obalu jakékoliv složky soupravy, ihned informujte výrobce. c. Nespotřebovaná testovaná séra uchovávejte v neředěném stavu rozplněná na alikvoty a zmrazená při teplotě -18 až -28 C. Časté zmrazování a rozmrazování se nedoporučuje. Pokud skladujete séra při teplotě +2 až +10 C, pak je spotřebujte do jednoho týdne. d. Roztoky testovaných sér a konjugátu anti-igg Px v pracovní koncentraci nelze skladovat. Připravujte je vždy čerstvé. 14. DOPORUČENÁ LITERATURA: Schultze D,Weder B,Cassinotti P,Vitek L, et al. Diagnostic significance of intrathecally produced herpes simplex and varicella-zoster virus-specific antibodies in central nervous systém infections. Swiss med wkly 2004;134: ( Provost PJ, Krah DL, Kuter BJ, Morton DH et al. Antibody assays suitable for assesing immune response to live varicella vaccine. Vaccine 1991; 9: 111 Gilden DH, Bennett JL, Kleinschmid-DeMasters BK, Song DD et al. The value of cerebrospinal fluid antibody in the diagnosis on neurologic disease produced by varicella zoster virus. J Neurol Sci 1998; 159: Leung J, Harpaz R, Baughman AL, Heath K et al. Evaluation of laboratory methods for diagnosis of varicella. Clin Infect Dis 2010; 51: Reiber H.: The hyperbolic function: a mathematical solution of the protein influx/csf flow model for blood-csf barier function. J Neurol Sci 1994; 126: Reiber H, Lange P.: Quantification of Virus-Specific Antibodies in Cerebrospinal Fluid and Serum: Sensitive and Specific Detection of Antibody Synthesis in Brain Clin. Chem 1991;.37/7:

9 15. TESTOVACÍ SCHÉMA: Krok 1. Krok 2. Krok 3. Krok 4. Připravte reagencie, testovaná séra a likvory v pracovním ředění Aplikujte 100 L/ jamku Standardů a testovaných sér (likvorů) Inkubujte 60 minut při laboratorní teplotě 4x promyjte (250 L/ jamku), vyklepněte Aplikujte 100 L/ jamku konjugátu anti-igg Px r.t.u. Inkubujte 60 minut při laboratorní teplotě 4x promyjte (250 L/ jamku), vyklepněte Aplikujte 100 L/ jamku chromogensubstrátového roztoku TMB Inkubujte 10 minut v temnu při laboratorní teplotě Krok 5. Krok 6. Aplikujte 100 L/ jamku stop roztoku Změřte absorbanci při 450/ nm do 10 minut Souprava byla vyvinuta za finanční podpory ze státních prostředků poskytnutých prostřednictvím Grantové agentury Akademie věd ČR. Datum poslední verze tohoto návodu: 09/2015 9

10 10