N Laboratoř hydrobiologie a mikrobiologie

Transkript

1 ÚSTAV TECHNOLOGIE VODY A PROSTŘEDÍ N Laboratoř hydrobiologie a mikrobiologie Název úlohy: Kultivační stanovení: Receptář Vypracováno v rámci projektu: Inovace a restrukturalizace předmětu Laboratoř hydrobiologie a mikrobiologie PIGA číslo projektu Řešitel C_VŠCHT_2015_013 ifis číslo projektu doc. RNDr. Jana Říhová Ambrožová, Ph.D Spoluřešitelé Ing. Dana Vejmelková, Ph.D. Ing. Vladimíra Škopová Rok zpracování:

2 Kultivační stanovení: Receptář Kultivační média a roztoky pro mikrobiologická stanovení jsou z důvodu přehlednosti a rychlejší orientace v textu uvedeny v souboru podle daného stanovovaného ukazatele. Ukazatele kvality vody: Kultivovatelné mikroorganismy při 22 C a 36 C Psychrofilní a mezofilní bakterie Mikromycety (plísně, kvasinky) Koliformní bakterie Termotolerantní koliformní bakterie a Escherichia coli Intestinální enterokoky Clostridium perfringens Koagulázopozitivní stafylokoky Pseudomonas aeruginosa Testování citlivosti na antibiotika 2

3 Stanovení kultivovatelných mikroorganismů při 22 C a 36 C s kvasničným extraktem (HiMedia M1272). Tryptone / pepton z kaseinu Dehydratovaný kvasničný extrakt 6 g 3 g 12 g firmy HiMedia (M1272). Výrobcem předepsané množství dehydratovaného média 21,0 g se rozpustí v ml destilované vody, sterilizuje se autoklávováním 15 min při (121 ± 3) C ve skleněných DURAN 45 lahvích. Před použitím se kultivační médium v DURAN 45 lahvi roztopí, nechá se zchladnout případně se pak udržuje na vodní lázni při teplotě (45 ± 3) C. Stanovení psychrofilních a mezofilních bakterií Masopeptonový agar, Nutrient agar 1,5% (HiMedia M087). Masový pepton Hovězí extrakt Chlorid sodný 3 g 8 g 1 firmy HiMedia (087). Výrobcem předepsané množství dehydratovaného média 31,0 g se rozpustí v ml destilované vody, sterilizuje se autoklávováním 15 min při (121 ± 3) C ve skleněných DURAN 45 lahvích. Před použitím se kultivační médium v DURAN 45 lahvi roztopí, nechá se zchladnout případně se pak udržuje na vodní lázni při teplotě (45 ± 3) C. 3

4 Stanovení mikromycet (plísní a kvasinek) Sabouraudův agar s chloramphenicolem (HiMedia M1067). Dichloran glycerol médium pro xerophyta (HiMedia M1129). Laktofenol dle Amanna. Methylenová modř. Sabouraudův agar s chloramphenicolem Kasein enzymatického hydrolyzát Pepton Dextróza Chloramphenicol 40 g 0,0 1 firmy HiMedia (M1067). Výrobcem předepsané množství dehydratovaného média 65,0 se rozpustí v ml destilované vody. Po nabobtnání se sterilizuje autoklávováním 15 min při 121 C. Hotové médium se po ochlazení asi na 50 C vylévá do sterilních Petriho misek. Po ztuhnutí se misky skladují v chladničce ve tmě při teplotě 5 C ± 3 C nejdéle dva týdny. Dichloran glycerol médium pro xerophyta Pepton Dextróza Hydrogenfosforečnan draselný Síran hořečnatý Dichloran 0, 0,002 g 1 firmy HiMedia (M1129). Výrobcem předepsané množství dehydratovaného média 15,8 g se rozpustí v 500 ml destilované vody, přidá se 110 mg glycerolu. Po nabobtnání se sterilizuje autoklávováním 15 min při 121 C. Hotové médium se po ochlazení asi na 50 C vylévá do sterilních Petriho misek. Po ztuhnutí se misky skladují v chladničce ve tmě při teplotě 5 C ± 3 C nejdéle dva týdny. Laktofenol dle Amanna Krystalický fenol Kyselina mléčná o 1,21 sp.hm Glycerol Destilovaná voda 20 g 10 ml V horké destilované vodě se rozpustí fenol a další chemikálie (index lomu je 1,45). Takto připravený laktofenol lze obohatit modří. Do 100 ml laktofenolu se přidá 0, soluble blue 2 R, (cotton blue), čímž se připraví 0,5 % roztok. V některých případech je vhodnější koncentrace 0,05 %, čímž se obarví pouze hyfy, které barvivo přijímají intenzivně a zorné pole je téměř bezbarvé. 4

5 Methylenová modř Methylenová modř 0,3 g 96% ethanol 30 ml Destilovaná voda 100 ml Barvivo se rozpustí v ethanolu, přidá se destilovaná voda a nakonec se zfiltruje. 5

6 Stanovení koliformních bakterií Endo agar (HiMedia M1481 anebo M029). Roztok bazického fuchsinu. Roztok pro cytochromoxidázový test. Endo agar (modifikovaný bez fuchsinu M1481) Masový extrakt Pepton Laktóza Chlorid sodný Siřičitan sodný bezvodý 8,6 g 1,2 g 12 g firmy HiMedia (M1481). Výrobcem předepsané množství dehydratovaného média 46,8 g se rozpustí v 990 ml destilované vody, přidá se 3,4 ml 5% roztoku bazického fuchsinu v ethanolu připraveného z RM112 a nebo se přidá rozpuštěný obsah lahvičky FD059A. Po nabobtnání se sterilizuje autoklávováním 15 min při 121 C. Hotové médium se po ochlazení asi na 50 C vylévá do sterilních Petriho misek. Při rozlévání je velmi důležité půdu průběžně promíchávat. Po ztuhnutí se misky skladují v chladničce ve tmě při teplotě 5 C ± 3 C nejdéle dva týdny. Médium musí být slabě růžové, pokud zčervená, nehodí se již k použití. Roztok bazického fuchsinu K přípravě roztoku bazického fuchsinu se používají komerčně připravené lahvičky s navážkou od firmy HiMedia (FD059A). Navážka v lahvičce se rozpustí v 5 ml ethanolu. Obsah lahvičky odpovídá přípravě ml Endova agaru. Rovněž lze použít 5% roztok bazického fuchsinu od firmy HiMedia (RM112). Bazický fuchsin 1 g 95% ethanol 20 ml Po dokonalém rozpuštění 1 g bazického fuchsinu v ethanolu se roztok v případě potřeby přefiltruje. Skladuje se v chladničce při teplotě 2 C až 8 C. Na připravovaných 1000 ml Endova agaru se přidává 3,4 ml tohoto roztoku. Pozor! Fuchsin je karcinogenní látka, proto je třeba při manipulaci s ním (zejména při navažování) musí být dodržována náležitá bezpečnostní opatření. 6

7 Endo agar (obsahující fuchsin M029) Masový pepton Laktóza Siřičitan sodný Hydrogenfosforečnan (di)draselný Basický fuchsin 2, 3, 0, 12 g firmy HiMedia (M029). Výrobcem předepsané množství dehydratovaného média 41, se rozpustí v ml destilované vody. Po nabobtnání se sterilizuje autoklávováním 15 min při 121 C. Hotové médium se po ochlazení asi na 50 C vylévá do sterilních Petriho misek. Po ztuhnutí se misky skladují v chladničce ve tmě při teplotě 5 C ± 3 C nejdéle dva týdny. Médium musí být slabě růžové, pokud zčervená, nehodí se již k použití. Pozor! Fuchsin je karcinogenní látka, proto je třeba při manipulaci s ním (zejména při navažování) musí být dodržována náležitá bezpečnostní opatření. Roztok pro cytochromoxidázový test Chelaton 3 Thiosíran sodný 0,1 g 0,2 g Tetramethylparafenylendiamindihydrochlorid 1,0 g Destilovaná voda 100 ml Chemikálie v uvedeném pořadí se rozpustí v destilované vodě a doplní se do 100 ml. Roztok nesmí přijít do styku s železem a musí se chránit před světlem. Uchovává se v chladničce při teplotě (5 ± 3) C maximálně týden (pokud zmodrá dříve, likviduje se ihned). 7

8 Stanovení termotolerantních koliformních bakterií a Escherichia coli m-fc agar (HiMedia M1122). Alkalický roztok kyseliny rosolové (HiMedia FD058 a 10 ml 0,2N NaOH). Činidlo MUG (HiMedia M1046I). m-fc agar Tryptose Proteose pepton Kvasničný extrakt Chlorid sodný Laktóza Zlučové sole Anilinová modř 3 g 12, 1, 0,1 g 12 g firmy HiMedia (M1122). Výrobcem předepsané množství dehydratovaného média 52,1 g se rozpustí v 990 ml demineralizované vody, která již obsahuje 10 ml alkalického roztoku kyseliny rosolové (FD058). Potom se médium zahřeje těsně pod bod varu (nesterilizuje se!), ihned se ochladí na teplotu 45 C až 50 C a rozlévá se do sterilních Petriho misek. Při rozlévání je důležité průběžně médium promíchávat. Po ztuhnutí se misky skladují v chladničce při teplotě 5 C ± 3 C nejdéle dva týdny. Alkalický roztok kyseliny rosolové Hydroxid sodný o koncentraci 0,2 mol/l Kyselina rosolová 10 ml 0,1 g K přípravě roztoku se používá kyselina rosolová od firmy HiMedia (FD058), jejíž hmotnost v jednotlivých lahvičkách odpovídá 1 litru připravovaného m-fc média. Při přípravě se dodržuje návod výrobce, to znamená, že kyselina v lahvičce se rozpustí v roztoku hydroxidu. Činidlo MUG (Lauryl sulfát) Enzymatický hydrolyzát kaseinu Laktóza Hydrogenfosforečnan (di)draselný Dihydrogenfosforečnan draselný Chlorid sodný Laurylsíran sodný 4-methyl-umbelliferyl-β-D-glukuronid (MUG) Tryptofan 20 g 2,7 2,7 0,1 g 0,1 g 1 g K přípravě roztoku se používá kyselina rosolová od firmy HiMedia (M1046I). Výrobcem předepsané množství dehydratovaného média 36,7 g se rozpustí v ml demineralizované vody. Po rozpuštění jednotlivých komponent, se sterilizuje autoklávováním 15 min při 121 C. Skladuje v chladničce při teplotě 5 C ± 3 C nejdéle dva týdny. 8

9 Stanovení intestinálních enterokoků Médium dle Slanetz Bartley (m-enterokokový agar, HiMedia M612I) Žluč-aeskulin-azidový agar (HiMedia M493I). Médium dle Slanetz Bartley (m-enterokokový agar) Tryptose-pepton Kvasničný extrakt Glukosa Hydrogenfosforečnan draselný 2,3,5-trifenyltetrazoliumchlorid 20 g 2 g 4 g 0,1 g 12 g firmy HiMedia (M612I). Výrobcem předepsané množství dehydratovaného média 46, se rozpustí v ml demineralizované vody. Na vodní lázni se zahřívá za stálého míchání až do úplného rozpuštění agarové složky. Při zahřívání se nesmí agar vařit ani měnit barvu na oranžovou (popřípadě červenou), pokud by k tomuto mělo docházet, je nutné agar urychleně ochladit. Pokud je agar oranžový až červený není použitelný. Médium se neautoklávuje! Hotové médium se po okamžitém ochlazení asi na 50 C vylévá do sterilních Petriho misek a po ztuhnutí se skladuje v chladničce ve tmě při teplotě 5 C ± 3 C maximálně týden. Žluč-aeskulin-azidový agar Trypton Pepton Kvasničný extrakt Volská žluč dehydratovaná Chlorid sodný Aeskulin Citran železitoamonný Azid sodný 17 g 3 g 1 g 0, 0,1 1 firmy HiMedia (M493). Výrobcem předepsané množství dehydratovaného média 56,6 se rozpustí v ml demineralizované vody a sterilizuje se v autoklávu 20 minut při teplotě 121 C ± 3 C. Hotové médium se po ochlazení asi na 50 C vylévá do sterilních Petriho misek a po ztuhnutí se skladuje v chladničce ve tmě při teplotě 5 C ± 3 C maximálně týden. Pozor! Azid sodný je to látka vysoce toxická a mutagenní. Musí být proto dodržována opatření, aby se zbránilo kontaktu s ní, především inhalaci aerosolu během přípravy. Kultivační média obsahující azid sodný nesmí být směšována se silnými anorganickými kyselinami, protože může být produkován silně toxický azoimid (HN 3 ). Roztoky obsahující azid sodný mohou také tvořit explozivní sloučeniny ve styku s kovovým potrubím. Azid může být bezpečně rozložen přídavkem nadbytku nasyceného roztoku dusitanu. 9

10 Stanovení Clostridium perfringens m CP agar (HiMedia M1354). m CP Selective Supplement I. (FD153). m CP Selective Supplement II. (FD154A). Amoniak, vodný roztok, koncentrovaný 24 % - 28 %. m CP agar Tryptosa Kvasničný extrakt Sacharosa L-cystein hydrochlorid Síran hořečnatý heptahydrát Bromkresolová červeň Chlorid železitý hexahydrát Indoxyl-β-D-glucosid 30 g 20 g 1,0 g 0,1 g 0,04 g 0,09 g 0,06 g 1 firmy Himedia (M1354). Výrobcem předepsané množství 35,60 g dehydratovaného média se rozpustí v 485 ml demineralizované vody. Zahřívá se za stálého míchání až do úplného rozpuštění agarové složky. Hotové médium se sterilizuje v autoklávu při (121 ± 3) C po dobu (15 ± 1) min. Po ochlazení asi na 50 C se přidá obsah lahvičky m-cp Selective Supplement I. a obsah lahvičky m-cp Selective Supplement II. Médium se dobře promíchá a rozlévá do sterilních Petriho misek. V průběhu nalévání je nutné agar průběžně promíchávat. Po ztuhnutí se skladuje v chladničce ve tmě při teplotě 4 C ± 2 C maximálně dva týdny. m CP Selective Supplement I D-cykloserin Polymyxin B sulfát 200 mg 12, K přípravě se používá komerčně vyráběné dehydratované médium od firmy HiMedia (FD153). Obsah lahvičky se rozpustí přidáním 5 ml sterilní demineralizované vody. Po rozpuštění se dobře promíchá a přidá se asepticky k 485 ml m-cp agaru, který je ochlazený na teplotu cca 50 C. m CP Selective Supplement II Fenolftalein difosfát 0,0 K přípravě se používá komerčně vyráběný roztok od firmy HiMedia (FD154). Obsah lahvičky se vytemperuje na laboratorní teplotu, přidá se 10 ml demineralizované vody. Obsah lahvičky se přidá asepticky k 485 ml m-cp agaru, který je ochlazený na teplotu cca 50 C. Amoniak, vodný roztok Amoniak vodný roztok, koncentrovaný 24 % - 28 %. 10

11 Stanovení koagulázopozitivních stafylokoků ová půda podle Baird-Parkera s přídavkem sulfamezathinu (HiMedia M1140). Žloutková emulze s teluričitanem draselným (HiMedia FD046). ová půda podle Baird-Parkera s přídavkem sulfamezathinu Enzymatický hydrolyzát kaseinu Hovězí extrakt Kvasničný extrakt Glycin Pyrohroznan sodný Chlorid lithný Sulfamezathin 1 g 12 g 0,0 20 g firmy HiMedia (M1140) Výrobcem předepsané množství 63,0 g dehydratovaného média se rozpustí v 950 ml demineralizované vody. Zahřívá se za stálého míchání až do úplného rozpuštění agarové složky. Hotové médium se sterilizuje v autoklávu při (121 ± 3) C po dobu (15 ± 1) min. Po ochlazení asi na 50 C se přidá 50 ml žloutkové emulze s 3,5% teluričitanem draselným (FD046). Alternativně lze použít FD045 žloutkovou emulzi o objemu 50 ml a k ní přidat 3 ml sterilního 3,5% teluričitanu draselného (FD047). Médium se dobře promíchá a rozlévá do sterilních Petriho misek. Po ztuhnutí se skladuje v chladničce ve tmě při teplotě 4 C ± 2 C maximálně dva týdny. Žloutková emulze s teluričitanem draselným Žloutková emulze Sterilní solný roztok Sterilní teluričitan draselný 30 ml 64 ml 6 ml K přípravě se používá komerčně vyráběný roztok od firmy HiMedia (FD046). 50 ml emulze se aplikuje k vysterilizované a na 50 C ochlazenému Baird-Parker agarovému médiu. 11

12 Stanovení Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas agar base/cn (HiMedia M085). Cetrinix Supplement (HiMedia FD029). Kingovo médium B (HiMedia M120I). Acetamidové tekuté kultivační médium (HiMedia M148I). Pseudomonas agar base/cn Pepton Enzymatický hydrolyzát kaseinu Síran draselný Chlorid hořečnatý 16 g 1,4 g 11 g firmy HiMedia (M085). Výrobcem předepsané množství 24,2 g dehydratovaného média se rozpustí v 500 ml demineralizované vody obsahující 5 ml glycerolu. Zahřívá se za stálého míchání až do úplného rozpuštění agarové složky. Hotové médium se sterilizuje v autoklávu při (121 ± 3) C po dobu (15 ± 1) min. Po ochlazení asi na 50 C se přidá CN Cetrinix Supplement (FD029) rehydrovaný ve 2 ml sterilní destilované vody. Médium se dobře promíchá a rozlévá do sterilních Petriho misek. Po ztuhnutí se skladuje v chladničce ve tmě při teplotě 4 C ± 2 C maximálně dva týdny. Cetrinix supplement CN Cetrimid Kyselina nalidixová 100 mg 7,5 mg K přípravě se používá komerčně vyráběné dehydratované médium od firmy HiMedia (FD029). Obsah lahvičky se rozpustí přidáním 2 ml sterilní demineralizované vody. Po rozpuštění se dobře promíchá a přidá se asepticky k 500 ml vysterilizovaného Pseudomonas agaru (M085), který je ochlazený na teplotu cca 50 C. Kingovo médium B Pepton Hydrogenfosforečnan draselný Heptahydrát síranu hořečnatého 20 g 1, 1, 1 K přípravě se používá komerčně vyráběný roztok od firmy HiMedia (M120I). Výrobcem předepsané množství 37,23 g dehydratovaného média se rozpustí v ml demineralizované vody a přidá se 10 ml glycerolu. Zahřívá se za stálého míchání až do úplného rozpuštění agarové složky. Hotové médium se sterilizuje v autoklávu při (121 ± 3) C po dobu (15 ± 1) min. Médium se dobře promíchá a rozlévá do sterilních Petriho misek. Po ztuhnutí se skladuje v chladničce ve tmě při teplotě 4 C ± 2 C maximálně dva týdny. 12

13 Acetamidové tekuté kultivační médium Část A Acetamid 2 g Část B Chlorid sodný Dihydrogenfosforečnan draselný Síran hořečnatý Heptahydrát síranu železnatého Dihydrát molybdenanu sodného 0,2 g 1 g 0,2 g 0,000 0,00 K přípravě tekutého kultivačního média se používá komerčně vyráběné dehydratované médium od firmy HiMedia (M148I). Výrobcem předepsané množství 1,4 g dehydratovaného média části B se rozpustí v ml demineralizované vody a přidá se 2,0 g části A. Zahřívá se za stálého míchání až do úplného rozpuštění. Hotové médium se sterilizuje v autoklávu při (121 ± 3) C po dobu (15 ± 1) min ve skleněných DURAN 45 lahvích (alternativně lze použít skleněné zkumavky, do kterých se médium před autoklávováním rozplní). Po zchladnutí se tekutina skladuje v chladničce ve tmě při teplotě 4 C ± 2 C maximálně dva týdny. Pozor! Acetamid je karcinogenní a dráždivá látka, proto je třeba při manipulaci s ním (zejména při navažování) musí být dodržována náležitá bezpečnostní opatření. Roztok pro oxidázový test Tetramethylparafenylendiamindihydrochlorid 0,1 g Destilovaná voda 10 ml Chemikálie se rozpustí v destilované vodě a doplní se do 10 ml. Roztok musí se chránit před světlem. Uchovává se v chladničce při teplotě (5 ± 3) C maximálně týden, činidlo není stálé. Je možné namísto něho použít i roztok pro cytochromoxidázový test (viz stanovení koliformních bakterií). Nesslerovo činidlo Chlorid rtuťnatý Jodid draselný Hydroxid sodný Destilovaná voda bez amoniaku 7 g 16 g 100 ml Používá se komerčně dostupné činidlo firmy HiMedia (R010). Uchovává se v lahvičce z borosilikátového skla uzavřené pryžovou zátkou, chráněné před slunečním zářením nejdéle 1 rok. Pozor! Chlorid rtuťnatý je toxický. Je nutné zabránit jeho požití. Po použití se roztok nevylévá do odpadu, ale kvůli rtuti se speciálně likviduje (sběrná láhev). 13

14 Testování citlivosti na antibiotika Müller-Hintonův agar (HiMedia M173). Müller-Hintonův agar Hovězí výtažek Hydrolyzát kaseinu Škrob 300 g 17, 1, 17,0 g firmy HiMedia (M173). Výrobcem předepsané množství dehydratovaného média 38,0 g se rozpustí v ml destilované vody, sterilizuje se autoklávováním 15 min při (121 ± 3) C ve skleněných DURAN 45 lahvích. Před použitím se kultivační médium v DURAN 45 lahvi roztopí, nechá se zchladnout případně se pak udržuje na vodní lázni při teplotě (45 ± 3) C. Hotové médium se po ochlazení asi na 50 C vylévá do sterilních Petriho misek. Po ztuhnutí se misky skladují v chladničce ve tmě. Médium lze uchovávat i v DURAN 45 lahvích (opětovné rozehřívání média nevadí). Pro potřeby zvýraznění inhibiční zóny (MIC) lze použít 0,5% TTC (trifenyl tetrazolium chlorid). K ml připravené půdy se přidá 1 ml 0,5% vodného roztoku TTC. Po jeho přidání do agaru se růst projevuje červeným zabarvením. Poznámka: médium je možné použít i pro kultivaci druhů Neisseria. 14