SBORNÍK PŘEDNÁŠEK květen 2013

Transkript

1 SBORNÍK PŘEDNÁŠEK květen

2 2

3 Best servis Ústí nad Labem Ústav fyzikální chemie J. Heyrovského AV ČR, v. v. i., Praha Biofyzikální ústav AV ČR, v. v. i., Brno UNESCO laboratoř elektrochemie životního prostředí na Přírodovědecké fakultě Univerzity Karlovy v Praze Sborník přednášek mezinárodní odborné konference XXXIII. Moderní Elektrochemické Metody Jetřichovice května 2013 Uspořádali: Navrátil Tomáš, Fojta Miroslav a Karolina Pecková ISBN

4 Tato publikace je určena pro účastníky konference a členy pořádajících organizací. Za obsah veškerých textů nesou plnou zodpovědnost autoři. Publikace neprošla odbornou ani jazykovou úpravou. Zveřejněné informace mohou být dále použity za předpokladu úplného citování původního zdroje. Přetiskování, kopírování či převádění této publikace do jakékoliv tištěné či elektronické formy a její prodej je možný pouze na základě písemného souhlasu vydavatele. (Bona fide vědečtí pracovníci si mohou pořídit jednotlivé kopie pro vlastní potřebu). Název: Vydal: Autor: Počet stran: 256 Náklad: 80 Vydání 1. Formát: A5 XXXIII. Moderní Elektrochemické Metody Srsenová Lenka - Best servis Ústí nad Labem kolektiv autorů ISBN:

5 Best servis Ústí nad Labem J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of the AS CR, v.v.i., Prague Institute of Biophysics of the AS CR, v.v.i., Brno UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Prague Collection of Conference Proceedings International Conference Modern Electrochemical Methods XXXIII Jetřichovice, Czech Republic May 20 th - May 24 th, 2013 Editors: Navrátil Tomáš, Fojta Miroslav, and Karolina Pecková ISBN

6 4

7 Obsah Lenka Bandžuchová, Renáta Šelešovská, Jaromíra Chýlková, and Tomáš Navrátil Voltammetric Determination of Herbicide Triasulfuron using Mercury Meniscus Modified Silver Solid Amalgam Electrode Lenka Bandžuchová, Renáta Šelešovská, Tomáš Navrátil, and Jaromíra Chýlková Voltammetric Behavior of Folates and Related Substances Using Silver Solid Amalgam Electrode Martin Bartošík, Mojmír Trefulka, and Emil Paleček Novel Electrochemical Assay for MicroRNA Detection Using Electroactive Complex of Six-Valent Osmium and Magnetic Beads Lenka Benešová, Jan Klouda, Adéla Patáková, Kateřina Pišnová, Karel Nesměrák, Jiří Barek, and Karolina Pecková Electrochemistry of Selected Bile Acids and Phytosterols at Bare Electrodes Jana Bulíčková and Romana Sokolová Adsorption of 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine on Au(111) and HOPG Ales Danhel, Hana Pivonkova, Veronika Raindlova, Michal Hocek, and Miroslav Fojta Nitro-Hydrazine DNA Redox Labels in Electroanalysis of Nucleic Acids at m-agsae Hana Dejmkova, Barbora Fahnrichova, Jiri Barek, and Jiri Zima Utilization of Carbon Paste Electrodes for Amperometric Detection in HPLC with Gradient Elution Vlastimil Dorčák, Veronika Ostatná, and Emil Paleček Roles of Amino Acid Residues in Peptide-Catalysed Hydrogen Evolution Jan Fischer, Mariya Kyrylenko, Anastasios Economou, and Jiří Barek Voltammetric Determination of Pesticide Paraquat on Meniscus Modified Silver Solid Amalgam Electrode Lukáš Fojt and Thomas Doneux Adsorption and Two Dimensional Condensation of Cytosine Derivatives at Mercury and Gold Single Crystal Electrode Miroslav Gál, Lucia Hrnčiariková, Kamil Kerekeš, and Ján Híveš Electrochemical Synthesis of Ferrates(VI) in Molten NaOH Vladimir Halouzka, Petr Jakubec, Jan Hrbáč, and Libuše Trnková Carbon Fiber Microelectrodes Modified by Silver for Determination of Hydrogen Peroxide Luděk Havran, Pavlína Vidláková, Hana Pivoňková, Iva Kejnovská Electroanalytical Methods Sensitive Tools for DNA Structure Transitions Analysis Šárka Honsová and Tomáš Navrátil Continuous Glucose Monitoring by Real Time Sensor in Interstitial Fluid Eva Horáková, Vlastimil Vyskočil, and Jiří Barek Voltammetric Determination of 4-Nitrobiphenyl at a Mercury Meniscus Modified Silver Solid Amalgam Electrode Jan Hrbac, Vladimir Halouzka, Petr Jakubec, Libor Kvitek, Vlassis Likodimos, Athanassios G. Kontos, Kyriakos Papadopoulos, Polycarpos Falaras Nanostructured Ag films on Silicon Wafers for Electrochemical and SERS Sensing Deposited by Electrochemical/Electrophoretic Method Str

8 Jana Jaklová Dytrtová, Tomáš Navrátil, Michal Jakl, and Kateřina Nováková Detection of Thiram Pesticide Using Copper Affinity Electrochemical Separation Electrospray Ionization Mass Spectrometry Bohdan Josypčuk, Jiří Barek, and Oksana Josypčuk Flow Electrochemical Biosensors for Measurements at High Negative Potentials Oksana Josypčuk, Jiří Barek, and Bohdan Josypčuk Construction and Application of Tubular Detector and Porous Flow-through Detector/Reactor of Silver Solid Amalgam for Electrochemical Measurements in Flow Systems Tereza Kadlecová, František Opekar, and Petr Tůma Simplified Pressure-Controlled Sample Introduction into Separation Capillary in Laboratory-Made Electrophoretic Apparatus Mahmoud Khodari, Ekram Rabie, and Omina Fahmy Voltammetric Quantification of the Pollutants Nitro Compounds using Glassy Carbon Electrode Tomáš Křížek, Romana Velvarská, Veronika Doubnerová, Helena Ryšlavá, and Pavel Coufal Applications of Capillary Electrophoresis in Enzyme Assays Štěpánka Lachmanová, Magdaléna Hromadová, Lubomír Pospíšil, and Philippe P. Lainé Electrochemical Properties of Branched Pyridinium Cations Jana Matějčková, Eva Samcová, and Petr Tůma Malondialdehyde as a Biomarker of Oxidative Damage Jan Mika, Jiří Barek, Jiří Zima, and Hana Dejmková Determination of Thymol Using Flow Injection Analysis on New Coulometric Detector with Renewable Working Material Based on Glassy Carbon Microparticles Tomáš Mikysek, Robert Jirásko, Michal Holčapek and Karel Vytřas Electrochemical Generation of Drug Metabolites Rudolf Navrátil, František Jelen, and Libuše Trnková Pencil Graphite Electrodes as a Tool for Analysis of Xanthine and 8-Methylxanthine Tomáš Navrátil, Sergey Zakharov, Daniela Pelclová, and Karolina Mrazová Short Information on Methanol Outbreak in the Czech Republic in the year 2012 Kateřina Nováková, Tomáš Navrátil, and Jaromíra Chýlková Characterization of Electrochemical Behavior of Lecithin-Cholesterol Mixture in Formation of Model Phospholipid Membranes Jakub Opršal, Renáta Petráňková, Ladislav Novotný, and Miloslav Pouzar Impact of the Silver Nanoparticles on Carpio Embryos, evaluation of their gradual agglomeration Petr Orság, Hana Pivoňková, Luděk Havran, Petra Horáková, Eva Šimková, Miloslava Fojtová, Hana Macíčková-Cahová, Michal Hocek, and Miroslav Fojta Monitoring of Activities of DNA-Processing Enzymes by Electrochemical Methods Martina Parisová, Tomáš Navrátil, Ivana Šestáková, and Jiří Barek Characterization of Liposomes Used as Model System of Biological Membranes by Glassy Carbon Electrode

9 Václav Pavlíček and Petr Tůma Very Fast Electrophoretic Determination of Creatinine and Uric Acid in Human Urine using a Combination of Two Capillaries with Different Inner Diameters Iveta Pilařová, Zdeňka Balcarová, and Libuše Trnková Adsorptive Transfer Stripping Voltammetry in DNA and RNA Oligomer Research Medard Plucnara, Petra Ménová, Jana Balintová, Hana Macíčková-Cahová, Luděk Havran, Michal Hocek, and Miroslav Fojta Preparation of DNA Probes for Electrochemical Bioassays by Sequence-Specific Incorporation of a Single or More Redox Labels into a DNA-Strand Petr Pořický Evaluation of Measured Data Validation of a New Analytical Method Šárka Ramešová, Romana Sokolová, and Ilaria Degano Electrochemical Study of Rhamnazin Zdeněk Samec, Jan Langmaier, Eva Samcová, and Petr Tůma Effect of tetraalkylammonium cations on amperometric detection of heparin at a polarized water/ionic liquid membrane interface Ernst Dietmar Schachinger, Roland Braidt, and Achim Walter Hassel Blister Formation on Polymer Coated Galvanised Steel during Immersion in Oxidizing Alkaline Solutions Barry R. Silver, Karel Holub, and Vladimir Mareček Ion current enhancement at glass microcapillaries Jozef Sochr, Ľubomír Švorc, Miroslav Rievaj, Dušan Bustin, and Ján Labuda Electrochemical Determination of Adrenaline in Human Urine by Boron-doped Diamond Film Electrode Romana Sokolová, Jana Bulíčková, Martina Parisová, Tomáš Navrátil, and Miroslav Gál The Adsorption of Phospholipids at the Interface Hanna Sopha, Samo B. Hočevar, and Ivan Švancara Applicability of Novel Antimony- and Bismuth-Based Electrodes in Advanced Electroanalysis Matěj Stočes, Iveta Ksandrová, and Ivan Švancara Determination of Nicotine at a Carbon Paste Electrode Using Square-Wave Voltammetry Jana Svítková, Ľubomír Švorc, Miroslav Rievaj, Dušan Bustin, and Ján Labuda Use of New Electrode Materials for Tasks of Food, Clinical and Environmental Analyzes Ivana Šestáková, Martina Parisová, Kateřina, Nováková, and Tomáš Navrátil The Influence of Labile Complexes on Cadmium Transport across Artificial Phospholipid Membrane Jan Špaček, Ece Eksin, Gulsah Congur, Luděk Havran, Petra Horáková, Arzum Erdem, and Miroslav Fojta Enzyme-linked Electrochemical Detection of DNA Hybridization at the Surface of Pencil Graphite Electrode

10 Ľubomír Švorc, Miroslav Rievaj, and Dušan Bustin Sensitive electrochemical determination of selected opiates using a boron-doped diamond film electrode Markéta Tomášková, Jaromíra Chýlková, Vladimír Jehlička, Tomáš Navrátil, and Renáta Šelešovská Direct Voltammetric Determination of Antioxidant Butylated Hydroxyanisol in Biodiesel Libuše Trnková, Nuria Serrano, and Iveta Pilařová A New Method of Apparent Protonation Constant Evaluation from Voltammetric Data Petr Tůma, Václav Pavlíček, Klára Málková, and Eva Samcová The Use of Large Volume Sample Stacking with Acetonitrile for Determination of Neurotransmitters by Capillary Electrophoresis with Contactless Conductivity Detection Veronika Vargová, Marko Zivanović,Vlastimil Dorčák, Veronika Ostatná, and Emil Paleček Electrocatalysis in Proteins and Polyamino Acids Radim Vespalec Novel Analytical Subject Matter: Cluster Compounds of Boron Pavlína Vidláková, Jana Balintová, Petra Ménová, Luděk Havran, Michal Hocek, and Miroslav Fojta Voltammetric Analysis of DNA Multiply Labeled with Anthraquinone and Nitro Tags Lada Vítová and Radim Vespalec Electrophoretic Separation of Short Oligonucleotides from their Complexed Osmates Ryan M. West, Mira Josowicz, and Jiří Janata Deterministic and Stochastic Analysis of Organic Semiconductor Doping Brigita Zámečníková, Hana Vodičková, Daniela Miholová, Zorka Kotíková, and Jaromír Lachman The Use of the Conductometric Method for Indication of Damage Plant Tissues by Cadmium

11 Voltammetric Determination of Herbicide Triasulfuron using Mercury Meniscus Modified Silver Solid Amalgam Electrode (Voltametrické stanovení herbicidu triasulfuronu s využitím rtuťovým meniskem modifikované stříbrné pevné amalgámové elektrody) Lenka Bandžuchová a, Renáta Šelešovská a, Jaromíra Chýlková a, and Tomáš Navrátil b a University of Pardubice, Faculty of Chemical Technology, Institute of Environmental and Chemical Engineering, Studentská 537, CZ Pardubice, Czech Republic, lenka.bandzuchova@upce.cz b J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of ASCR, v.v.i., Dolejškova 3, Prague 8, Czech Republic, navratil@jh-inst.cas.cz Abstract Voltammetric behavior of triasulfuron (TS), which belongs to sulfonylurea herbicide family, was studied using two working electrodes: mercury meniscus modified silver solid amalgam electrode (m-agsae) and hanging mercury drop electrode (HMDE) for comparison. It was found that TS provided one reduction peak on both used working electrodes. The highest response was observed in the environment of Britton-Robinson buffer (BR) of ph 3 (m-agsae) and 2.5 (HMDE), respectively. Working parameters of differential-pulse voltammetry (DPV) were optimized and this method was applied in analysis of agricultural formula and river water. Key words: Triasulfuron, Mercury meniscus modified silver solid amalgam electrode, Voltammetry, Determination, Hanging mercury drop electrode. Introduction Triasulfuron (TS, Fig 1.) belongs to the group of sulfonyluera herbicides. These herbicides are wide-spread used in all over the world in more than 40 countries 1. The main reasons for their rapid acceptance are very low acute and chronic mammalian toxicity but extremely high phytotoxicity against weeds, low application rate and broad-spectrum weed control 2, 3. This type of herbicides acts through an inhibition of the enzyme acetolactate synthase (EC ), which is a key enzyme in the biosynthesis of branched-chain amino acids (valine, leucin, isoleucine). The inhibition leads to rapid break cell division and growth 2-4. TS is commonly used in commercial preparations for protection of barley, oat, wheat or rye 5. TS degradation in the environment, especially in the soils, was studied in many papers, e.g 6-8. The papers especially dealt with the influence of types of soil, ph and a depth of soils, a presence of microorganisms, an application rate of the herbicide or rainfalls 6-8. It was found that degradation time of TS was longer under laboratory conditions (e.g days for removing of 50 % TS) than under field conditions (e.g days for degradation of 50 % of TS) 7 but it is obvious, that TS could stay many days after its application in the environment and its determination in environment samples is important. Fig. 1. The chemical structure of triasulfuron. Voltammetry presents cheap, time saving and sensitive method for determination of various compounds. Voltammetric methods in connection with solid amalgam made from silver or another metal have been already successfully utilized in analysis and determination of various 9

12 bioactive or environmentally important substances 9-12 including various types of pesticides (e.g. in 13, 14 ). The voltammetric behavior of herbicide triasulfuron has been examined using m-agsae in the present paper. Various voltammetric techniques were applied for voltammetric determination of this herbicide. All results were compared with them obtained on HMDE. Experimental All chemicals used for preparation of supporting electrolytes, standard solutions and other solutions were of p.a. purity. All solutions were prepared in distilled water. The Britton- Robinson buffers (BR) of ph values from 1.8 to 9 were prepared by mixing of the alkaline component consisting of 0.2 mol L -1 NaOH (Lachema, Brno, Czech Republic) with the acidic component which consisted of 0.04 mol L -1 H 3 PO 4, 0.04 mol L -1 H 3 BO 3 and 0.04 mol L -1 CH 3 COOH (all p.a., Lachema, Brno, Czech Republic) mol L -1 H 2 SO 4 (ph 1.3) was prepared by dissolution of an appropriate amount of 96 % H 2 SO 4 (Penta, Czech Republic) with distilled water. Triasulfuron (Sigma-Aldrich) was dissolved in 50 % acetonitrile (Lachnner, Czech Republic). The solution of 2 mol L -1 KCl was prepared by dissolution of the appropriate amount of KCl (Lachema, Brno, Czech Republic). Herbicide formula Logran 20WG with content of TS 200 g/kg was provided by Syngenta (Syngenta Crop Protection AG, Basel, Swiss). The river water was sampled from the river Elbe in Pardubice, Czech Republic. All voltammetric measurements were carried out with the computer controlled Eco-Tribo Polarograph PC-ETP (Eco Trend Plus, Prague, Czech Republic) which was equipped by software POLAR.PRO (version 5.1) for Windows XP. All measurements were provided in a 3-electrodes set up, where m-agsae or HMDE (both Eco Trend Plus, Prague, Czech Republic) served as the working electrode, silver/silver chloride/saturated KCl (Ag/AgCl/KCl (sat.)) as the reference and platinum wire as the auxiliary electrode (both Monokrystaly, Turnov, Czech Republic). Air oxygen was removed by bubbling with nitrogen (purity class 4.0; Linde, Prague, Czech Republic) for 5 minutes before every analysis. The ph values were measured by ph-meter Hanna 221 (Hanna Instruments, Inc., USA). Solution of Logran 20 WG was prepared using ultrasonic bath Bandelin Sonorex (Schalltec GmbH, Germany). All the measurements were carried out at laboratory temperature. The working surface of the AgSAE, which was used for preparation of m-agsae, was first abraded with a soft emery paper and then polished using a polishing kit (Electrochemical Detectors, Turnov, Czech Republic) which consisted of a polishing polyurethane pad, Al 2 O 3 suspension (particle size 1.1 µm) and Al 2 O 3 powder (particle size 0.3 µm). The mercury meniscus covering the electrode surface was prepared by immersion of the prepared AgSAE into the pot with liquid mercury. Before the first measurement of the day as well as after every pause longer than one hour, the electrode surface was electrochemically activated in the solution of 0.2 mol L -1 KCl by application of the potential mv for 300 s while stirring. The parameters of the electrochemical regeneration of the amalgam electrode surface before each measurement were incorporated directly into the controlling software. Optimum conditions found for the surface regeneration of m-agsae in BR buffer (ph 3) were 30 regeneration cycles between 0 and mv in cycles (the limiting potentials were kept constant for 0.3 s in each cycle). CV (cyclic voltammetry) was used for investigation of dependence between voltammetric response of TS and ph of supporting electrolyte. DCV (direct current voltammetry) was utilized for studying the effect of scan rate on voltammetric behavior of TS. DPV (differential pulse voltammetry) with pulse height of -50 mv, pulse width 80 ms, scan rate (v) 20 mv s -1, 10

13 initial potential (E in ) 0 mv and final potential (E fin ) mv was used for the rest of analysis. Other parameters depended on the used working electrode. The potential of accumulation (E acc ) 0 mv was found to be optimal for m-agsae and -400 mv for HMDE. The applied time of accumulation (t acc ) depended on the TS concentration in the analyzed medium. Baseline correction method was applied for simplification of the evaluation of TS peak recorded on m-agsae. The studied compound provided one reduction signal at potential about mv (vs. Ag/AgCl in BR of ph 3). The peak shape was affected by partly overlapping signal of the supporting electrolyte decomposition. The limits of decision (CC), detection (LD) and quantification (LQ) were calculated as described in 11 and the parameters of calibration curves (e.g., slope, intercept) were calculated using software Excel 2010 (Microsoft, USA). Results and discussion The relation between ph of supporting electrolyte and response of TS was examined on both used working electrodes using CV. It was found that TS ( mol L -1 (m-agsae) and mol L -1 TS (HMDE), respectively) provided only one reduction signal in medium of ph from 1.3 to 6 on m-agsae and on HMDE as well. These results coincided with results presented by Sarigul and Inam in the paper 12, where the voltammetric behavior of TS on SMDE was studied. The highest current response of TS was registered in BR buffer of ph 3 (m-agsae) and 2.5 (HMDE), respectively. The potential of the followed peak shifted linearly to negative values with increasing value of ph on both used working electrodes. The effect of scan rate (from 10 to 500 mv s -1 ) was investigated applying DCV. Different relations between current response and scan rate, which depended on used working electrode, were observed. While the I p of mol L -1 increased linearly with increasing v on HMDE, which suggests the adsorption controlled process, I p of mol L -1 increased linearly with v 1/2 on m-agsae (Fig. 2.), which corresponds to diffusion controlled process. Fig. 2 Voltammetric response of TS depending on scan rate recorded on m-agsae. Method: DCV; parameters: E in = 0 Vm, E fin = mv, v = mv s -1, E reg = mv, t reg = 30 s; supporting electrolyte: BR of ph 3; c(ts) = mol L -1. Inset: Dependence of height of TS peak (I p ) on square root of scan rate (v 1/2 ). DPV, as a sensitive voltammetric method, was chosen for analysis and determination of TS. Therefore, the working parameters of this method were optimized. On the beginning, parameters of electrochemical regeneration of working surface of m-agsae were 11

14 investigated because the working surface of m-agsae could not be regularly renewed after every analysis as a working surface of HMDE. It was found that the regeneration in cycles with limiting potentials 0 and mv provided the best results for the regeneration of the working surface and showed good repeatability of measurements. Obtained relative standard deviation of 11 repeated measurements (RSD M (11) = 0.5 %) is fully comparable with this calculated for repeated measurements on HMDE (RSD M (11) = 0.4 %). The potential of accumulation (E acc ) 0 mv (m-agsae) and -400 mv (HMDE), respectively, found to be optimal. The applied time of accumulation (t acc ) depended on the TS concentration in the analyzed medium. DPV with found working parameters was applied for repeated determinations of TS in model solutions. Relative standard deviations of 5 repeated determinations (RSD D (5)) were equal or lower than 4 % for both used working electrodes, which show high reproducibility of reached results. Limit of decision (CC(m-AgSAE) = 32 nmol L -1 ; CC(HMDE) = 1.4 nmol L -1 ), limit of detection (LD(m-AgSAE) = 64 nmol L -1 ; LD(HMDE) = 2.7 nmol L -1 ) and limit of quantification (LQ(m-AgSAE) = 97 nmol L -1 ; LQ(HMDE) = 4.1 nmol L -1 ) were calculated using K*Sigma method 15. The applicability of proposed method was verified by analysis of two types of real samples: agricultural formula LOGRAN 20 WG and fortified river water. A content of TS in the agricultural formula was declared by producer as 200 g TS in 1 kg of the preparation. The content of the herbicide was determined using standard addition method and the determination was 5 times repeated. Results are summarized in the Table I. River water was only fortified with particular volume of the standard solution of TS, mixed with BR and analyzed. The amount of TS was also determined using standard addition method and every determination was 5 times repeated. Obtained results are shown in the Table I. Table I. Results of determination of TS in herbicide preparation LOGRAN 20 WG and in spiked river water using m-agsae and HMDE. m-agsae HMDE Declared [g/kg] Found * [g/kg] RSD D (5) [%] Declared [g/kg] Found * [g/kg] RSD D (5) [%] LOGRAN ± ± Added [mol L -1 ] Found * [mol L -1 ] RSD D (5) [%] Added [mol L -1 ] Found * [mol L -1 ] RSD D (5) [%] River water (1.02±0.02) (1.99±0.06) * average of 5 times repeated determinations Conclusion Voltammetric behavior of triasulfuron, wide-spread used herbicide from sulfonylurea family, has been examined using m-agsae and HMDE in present paper. It was found that TS provided one reduction signal on both used working electrodes. Working parameters of DPV were found for both working electrodes and our proposed method was used for analysis of model solutions. Both used electrodes showed high sensitivity for determination of TS and 12

15 they were applied in analysis of two types of real samples with very good results. It can be concluded, that voltammetric method for determination of TS introduced in this paper can be considered as effective tool in analysis of triasulfuron. Acknowledgement Financial support was provided by The Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic (project No. CZ.1.07/2.3.00/ Strengthening of Research and Development Teams at the University of Pardubice and project No. CZ.1.07/2.2.00/ ) and by the GA CR (project No. P208/12/1645). References 1. Downloaded 14th February Brown H. M.: Pestic. Sci. 29, 263 (1990). 3. Pusino A., Braschi I., Gessa C.: Caly. Clay Miner. 48, 19 (2000). 4. Fahl G. M., Kreft L., Altenburger R., Faust M., Boedecker W., Grimme L. H.: Aquat. Toxicol. 31, 175 (1995). 5. Biljon J. J. van, Hugo K. J., Iwanzik W.: Appl. Pl. Sci. 2, 49 (1988). 6. Sarmah A. K., Kookana R. S., Alston A. M.: Weed Res. 39, 83 (1999). 7. James T. K., Holland P. T., Rahman A., Lu Y. R. Weed Res. 39, 137 (1999). 8. Sarmah A. K., Kookana R. S., Alston A. M.: Aust. J. Soil Res. 38(3), 617 (2000). 9. Bandžuchová L., Šelešovská R., Navrátil T., Chýlková J.: Electrochim. Acta 56, 2411 (2011). 10. Bandžuchová L., Šelešovská R., Navrátil T., Chýlková J.: Electroanalysis 25, 213 (2013). 11. Jiránek I., Pecková K., Králová Z., Moreira J. C., Barek J.: Electrochim. Acta 54, 1939 (2009). 12. Šelešovská-Fadrná R., Fojta M., Navrátil T., Chýlková J.: Anal. Chim. Acta 582, 344 (2007). 13. Barek J., Fischer J., Navrátil T., Pecková K., Yosypchuk B., Zima J.: Electroanalysis 19, 2003 (2007). 14. Yosypchuk B., Barek J.: Cr. Rev. Anal. Chem. 39, 189 (2009). 15. Miller J. N., Miller J. C.: Statistics and Chemometrics for Analytical Chemistry. Person Education. Harlow Sarigul T., Inam R.: Bioelectrochemistry 75, 55 (2009). 13

16 Voltammetric Behavior of Folates and Related Substances Using Silver Solid Amalgam Electrode (Voltametrické chování folátů a látek souvisejících s využitím stříbrné pevné amalgámové elektrody) Lenka Bandžuchová a, Renáta Šelešovská a, Tomáš Navrátil b, and Jaromíra Chýlková b a Institute of Environmental and Chemical Engineering, University of Pardubice, Studentská 573, Pardubice, Czech Republic, renata.selesovska@upce.cz b J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of ASCR, v.v.i., Dolejškova 3, Prague 8, Czech Republic, navratil@jh-inst.cas.cz Abstract The possibility of application of silver solid amalgam electrode in voltammetric analysis of compounds with folate structure (folic acid, methotrexate, leucovorin) and substances, which play an important role in its metabolism (riboflavin, hydroxocobalamin) has been investigated. Cyclic voltammetry, DC voltammetry and Elimination voltammetry with linear scan has been used for study of voltammetric behavior of mentioned substances and for elucidation of electrochemical reactions. Differential pulse voltammetry has been applied for development of sensitive methods of determination for investigated electroactive compounds. The proposed methods were successfully applied for real samples analysis. Obtained results have been compared with those achieved using HMDE. Key words: Silver solid amalgam electrode, Folic acid, methotrexate, Leucovorin, Riboflavin, Hydroxocobalamin Úvod Foláty jsou biologicky aktivní látky odvozené od kyseliny listové (FA). Jejich strukturním základem je 6-methylpterin navázaný přes 4-aminobenzoovou kyselinu na několik zbytků glutamové kyseliny γ-peptidovou vazbou. FA patří do skupiny ve vodě rozpustných vitamínů B (B 9 ). Struktura nejjednodušší formy kyseliny listové je uvedena na Obr. 1. Nejčastěji obsahuje 2-7 zbytků kyseliny glutamové. FA, resp. foláty jsou v organismu enzymaticky transformovány na tetrahydrofoláty (THF), které patří mezi přenašeče jednouhlíkových (C1) zbytků. THF jsou schopny přenášet uhlík v různých oxidačních stupních a proto jsou na rozdíl od jiných přenašečů považovány za univerzální 1. FA a foláty hrají klíčovou roli v metabolismu aminokyselin, při syntéze nukleových kyselin (NK), při dělení a syntéze buněk a při tvorbě červených krvinek. Hlavním projevem nedostatku FA je megaloblastická anémie, při které je narušena produkce červených krvinek a objevuje se nadbytek megaloblastů 2. Obr. 1. Struktura kyseliny listové. Leukovorin (LV) patří do skupiny redukovaných metabolitů kyseliny listové THF. Má široké uplatnění v současné medicíně. Může být aplikován samostatně při léčbě megaloblastické anemie s prokázaným deficitem FA nebo v kombinaci s protinádorovými léčivy, jejichž cytostatický účinek buď zvyšuje (5-fluorouracil) nebo naopak působí jako jejich antidotum (metotrexát) 3. Metotrexát (MTX) je vzhledem ke svým účinkům 14

17 v organismu řazen do skupiny látek označovaných jako antifoláty. Od kyseliny listové se liší pouze v methylové skupině navázané na aminoskupinu 4-aminobenzoové kyseliny (N(10)) a nahrazením hydroxyskupiny aminoskupinou na C(4) pyridinového kruhu. Vzhledem k obdobné struktuře je MTX schopen inhibovat celý metabolismus FA. Tento mechanismus je využíván při léčbě psoriázy, revmatoidní artritidy, Crohnovy choroby, zhoubných nádorů buněk imunitního systému, nádorů vznikající v děloze v příčinné souvislosti s těhotenstvím nebo maligních kostních nádorů 3,4. MTX je ve srovnání s ostatními antitumorózními léčivy méně toxický. Navíc je to jediné cytostatikum, které má antagonistu LV. Kobalaminy jsou komplexní sloučeniny se 4 pyrolovými jádry, které svírají jeden atom kobaltu. Stejně jako foláty patří do skupiny ve vodě rozpustných vitamínů B (B 12 ). Jako hlavní funkce tohoto vitamínu je uváděn jeho antiperniciózní účinek (tzn. předcházení vzniku megaloblastické anémie), je kofaktorem syntézy NK, podílí se na krvetvorbě, na syntéze myelinu a nukleoproteinů. Při porovnání účinků kobalaminů a folátů na lidský organismus je zřejmé, že reakce poskytované těmito látkami spolu souvisí a ovlivňují se. Dietou jsou přijímány především hydroxokobalamin (OH-B 12 ) a kyanokobalamin (CN-B 12 ). V posledních letech je OH-B 12 využíváno jako antidota při otravách kyanidy 5,6. Riboflavin (RF) patří stejně jako foláty a kobalaminy mezi ve vodě rozpustné vitamíny B (B 2 ). Základem RF je heterocyklické isoalloxazinové jádro, na které je připojen alkohol ribitol. Většina RF je v organismu ve formě FAD (flavinadenindinukletid), v menší míře jako FMN (flavinmononukletid). Základními funkcemi RF jsou transport aktivovaných vodíků v citrátovém cyklu, účast na metabolismu aminokyselin, sacharidů a purinů, integrita buněčné membrány a erytrocytů nebo působení v antioxidační ochraně organismu. Zmíněné kofaktory se podílejí i na enzymaticky katalyzovaná reakci 5,10-methylen THF na 5-methyl THF. Mezi projevy deficitu RF patří: záněty spojivek, sklon k zánětům epitelu na přechodu kůže do sliznice a nervové poruchy. Ve vyspělých zemích je nedostatek RF velmi vzácný. Vzhledem ke své biologické aktivitě a hojnému využití v lékařství je problematika stanovení FA, LV, MTX, RF a OH-B 12 velmi důležitá. Tato práce je zaměřena na studium voltametrického chování těchto látek a návrh vhodných voltametrických metod stanovení s využitím rtuťovým meniskem modifikované (m-agsae) a leštěné stříbrné pevné amalgámové elektrody (p-agsae). Amalgámové elektrody kombinují výhody rtuťových a pevných pracovních elektrod. Jejich velkou výhodou je vysoké vodíkové přepětí srovnatelné s HMDE, vysoká citlivost pro stanovení redukovatelných látek, možnost elektrochemické regenerace povrchu elektrody, jednoduchá příprava před měřením a v neposlední řadě i netoxický elektrodový materiál, neomezená doba životnosti nebo dobrá mechanická odolnost apod. V minulosti již byly tyto elektrody s různě modifikovaným povrchem použity pro stanovení řady anorganických 7,8 i organických látek 9,10, v analýze peptidů 11 nebo DNA Experimentální část Pro voltametrická měření byl požit Eco-Tribo Polarograf PC ETP (EcoTrend Plus, Praha, ČR) se software Polar 5.1. Analýzy probíhaly v tříelektrodovém zapojení při teplotě 23±2 C. Jako měrné elektrody sloužily HMDE s povrchem kapky 0,73 mm 2, m-agsae s pracovním povrchem 0,39 mm 2 a p-agsae s pracovní plochou 0,28 mm 2 (všechny od EcoTrend Plus s.r.o., Praha, ČR). Jako referentní sloužila nasycená argentchloridová elektroda (Ag/AgCl/KCl(satur.)) a jako pomocná platinový drátek (obě od firmy Monokrystaly s.r.o., Turnov, ČR). Kritická úroveň (LC), limit detekce (LD) a mez stanovitelnosti (LQ) byly počítány metodou 3*Sigma (ACS) 15 pomocí software QC Expert v. 2.5 (Trilobyte, ČR). Parametry kalibračních přímek byly získány pomocí MS Excel 2010 (Microsoft, USA). 15

18 Všechny chemikálie použité pro přípravu standardních roztoků a základních elektrolytů byly čistoty p.a. (Lachema, Brno, ČR). Jako základní elektrolyt byly používány roztoky 0,05M acetátového pufru o ph 5 nebo roztoky Britton-Robinsonova (B-R) pufru o různém ph. Přehled základních elektrolytů vhodných pro stanovení jednotlivých látek je uveden v tabulce I. Roztoky LV, OH-B 12 a RF (Sigma Aldrich) byly připravovány rozpuštěním v destilované vodě. Vzhledem k lepší rozpustnosti v alkalickém prostředí byly roztoky FA (Sigma Aldrich) a MTX (Sigma Aldrich) připravovány rozpuštěním v 0,01M NaOH (Lachema, Brno, ČR). Pro studium závislosti proudové odezvy na ph byla využita CV (počáteční potenciál E in = 200 mv, potenciál obratu E fin = mv, rychlost polarizace v = 100 mv s -1 ) V případě LV byl nejprve proveden záznam ve směru anodickém a poté byla sledována zpětná redukce. Pro studium závislosti voltametrické odezvy na rychlosti polarizace byla použita DCV. Pro objasnění řídících dějů jednotlivých elektrodových reakcí byla využita EVLS. Pro stanovení daných látek byla optimalizována DPV (v = 20 mv s -1, výška pulzu: -50 mv a šířka pulzu: 80 ms.), která byla kombinována s AdSV. Nalezené optimální E in a E acc pro stanovení jednotlivých látek jsou pro všechny tři pracovní elektrody shrnuty v tabulce II. Optimální parametry regenerace pracovního povrchu amalgámových elektrod byly rovněž zjištěny experimentálně a jsou uvedeny v tabulce III. Tabulka I. Složení základních elektrolytů pro voltametrické stanovení jednotlivých látek. p-agsae m-agsae HMDE FA acetátový pufr (ph 5) acetátový pufr (ph 5) B-R pufr (ph 8) + methanol (9:1) LV acetátový pufr (ph 5) B-R pufr (ph 4) acetátový pufr (ph 5) MTX acetátový pufr (ph 5) B-R pufr (ph 5) B-R pufr (ph 8) OH-B 12 B-R pufr (ph 6) acetátový pufr (ph 5) B-R pufr (ph 6) RF B-R pufr (ph 3) acetátový pufr (ph 5) acetátový pufr (ph 5) Tabulka II. Optimální hodnoty E in a E acc pro jednotlivé látky a použité pracovní elektrody. E in [mv] E acc [mv] p-agsae m-agsae HMDE p-agsae m-agsae HMDE FA LV MTX OH-B RF Tabulka III. Parametry regenerace povrchu p-agsae a m-agsae pro jednotlivé analyty. p-agsae m-agsae cykly t reg1 t reg2 E reg1 E reg2 cykly t reg1 t reg2 E reg1 E reg2 FA 30 0,3 0, ,3 0, LV 30 0,3 0, MTX 30 0,3 0, OH-B ,3 0, RF ,3 0, Výsledky a diskuse 16

19 Voltametrické chování zmíněných látek bylo studováno s využitím p-agsae, m-agsae a HMDE. Nejprve byl testován vliv ph prostředí na proudové odezvy jednotlivých látek metodou CV. Bylo zjištěno, že FA a strukturně obdobný MTX poskytují v kyselém prostředí na HMDE a m-agsae 3 katodické a 1 anodický signál. Na p-agsae byly pouze 2 katodické a 1 anodická odezva. V alkalickém prostředí byl naměřen pouze 1 katodický a 1 anodický pík na všech pracovních elektrodách. Pro další analýzy byl pro obě varianty AgSAE vybrán redukční pík 1 poskytovaný FA i MTX (E p = -400 mv) a prostředí o ph 5. Pro rtuťovou pracovní elektrodu byl zvolen roztok B-R pufr o ph 8. V případě LV byly zaznamenány na obou modifikacích AgSAE 2 redukční signály po předcházející oxidaci. Pro stanovení byl zvolen acetátový pufr o ph 5 (p-agsae, HMDE) resp. B-R pufru o ph 4 (m-agsae), ve kterém byl redukční pík 1 oxidovaného LV největší. Kyselé prostředí bylo vhodné i pro analýzy OH-B 12 a RF, kde byl zaznamenán nejvyšší katodický pík. Obě látky poskytovaly pouze 1 katodický. RF navíc poskytoval i jeden oxidační pík. Dalším sledovaným parametrem byla rychlost polarizace s využitím DCV. Ze získaných výsledků byly určeny řídící děje probíhajících elektrodových reakcí. Získaná data byla porovnána s výstupy z EVLS. Pro nejednoznačnost výsledků byla pro LV a RF vyhodnocena i závislost log(i p ) na log(v). Výsledkem bylo, že všechny sledované redukční reakce probíhaly úplně nebo částečně v adsorbovaném stavu, takže bylo možné zvýšit citlivost stanovení všech zmíněných látek zařazením akumulačního kroku (tab. II). Navržené metody pro stanovení jednotlivých látek byly ověřovány na modelových roztocích. Získané výsledky se vždy velice dobře shodovaly s přidaným množstvím analyzovaných látek. Z 5-ti opakovaných stanovení jednotlivých látek při různých koncentracích byly spočítány relativní směrodatné odchylky, které se pohybovaly pod 5% hranicí pro všechny použité pracovní elektrody. Pro všechny látky byly také vypočteny některé chemometrické parametry, z nichž lze usuzovat na citlivost optimalizovaných metod (tabulka IV). Získané LD pro amalgámové elektrody jsou i přes menší pracovní povrch srovnatelné (MTX a OH- B12) a v případě LV dokonce nižší než LD dosažené s využitím HMDE. Pouze pro stanovení kyseliny listové a riboflavinu byla použitá rtuťová elektroda výrazně citlivější než m-agsae a p-agsae. Tabulka IV. Statistické parametry pro navržené metody stanovení jednotlivých látek p-agsae m-agsae HMDE LC LD LQ LC LD LQ LC LD LQ nmol/l nmol/l nmol/l nmol/l nmol/l nmol/l nmol/l nmol/l nmol/l FA 0,29 0,57 0,86 0,10 0,27 0,78 0,019 0,036 0,054 LV 25,00 50,00 75,00 11,00 22,00 33,00 409,00 980, ,0 MTX 0,04 0,08 0,11 0,12 0,25 0,37 0,23 0,44 0,64 OH-B 12 1,10 3,30 6,5 0,70 1,50 2,20 1,20 2,40 3,6 RF 1,20 1,30 3,60 0,52 0,76 0,93 0,15 0,31 0,46 Možnosti aplikace navržených metod byly ověřeny na reálných vzorcích. FA, RF a OH-B 12 byly stanoveny s velmi dobrými výsledky ve vitamínových preparátech. Obsah FA byl navíc stanoven i v multivitamínových džusech. Z analýzy multivitamínového přípravku s obsahem FA i RF je zřejmé, že po vhodné úpravě vzorku je možné správně stanovit oba přítomné vitamíny a jejich stanovení není navzájem ovlivněno. LV a MTX byly úspěšně stanoveny v léčivech. 17

20 Závěr Vzhledem k obsahu kapalné rtuti a vzniku odpadů s tímto toxickým kovem při práci s HMDE je důležité stále hledat nové elektrodové materiály, které nebudou nadále rizikem pro životní prostředí. Z dosažených výsledků je zřejmé, že testované pracovní elektrody z netoxického stříbrného amalgámu mohou konkurovat nebo úplně nahradit rtuťové elektrody v analýze vybraných bioaktivních molekul. Poděkování Tato práce vznikla s podporou Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy prostřednictvím projektů č. CZ.1.07/2.3.00/ a č. CZ.1.07/2.2.00/ a Grantové agentury ČR (projekt GAČR P208/12/1645). Literatura 1. Voet D., Voetová J. G.: Biochemie. Victoria Publishing, Praha Vávrová J., Pechová A., Wilhelm Z., Kazda A., Friedecký B., Jabor A.: Vitamíny a stopové prvky 2007, Česká společnost klinické biochemie ČLS JEP, Pardubice Martínková J., Chládak J., Mičuda S., Chládková J.: Farmakologie Pro studenty zdravotnických oborů. Grada Publishing, Praha Downloaded 27 th December Hall A. H., Dart R., Bogdan G.: Ann. Emerg. Med. 49, 806 (2007). 6. Borron S. W., Baud F. J., Mégarbane B., Bismuth C.: Am. J. Emerg. Med. 25, 551 (2007). 7. Yosypchuk B., Novotný L.: Chem. Listy 96, 756, Fadrná R.: Anal. Lett. 37, 3251 (2005). 9. Barek J., Fischer J., Navrátil T., Pecková K., Yosypchuk B.: Sensors 6, 445 (2006). 10. Šelešovská-Fadrná R., Navrátil T., Vlček M.: Chem. Anal. (Warsaw) 52, 911 (2007). 11. Šelešovská-Fadrná R., Fojta M., Navrátil T., Chýlková J.: Anal. Chim. Acta 582, 344 (2007). 12. Fadrná R., Yosypchuk B., Fojta M., Navrátil T., Novotný L.: Anal. Lett. 37, 65 (2004). 13. Fadrná R. Cahová-Kuchaříková K., Havran L., Yosypchuk B., Fojta M.: Electroanalysis 17, 452 (2005). 14. Yosypchuk B., Fojta M., Havran L., Heyrovský M., Paleček E.: Electroanalysis 18, 186 (2006). 15. Bandžuchová L., Šelešovská R., Navrátil T., Chýlková J.: Electrochimica Acta 56, 2411 (2011). 16. Bandžuchová L., Šelešovská R.: Acta Chim. Slov. 58, 776 (2011). 17. Šelešovská R., Bandžuchová L., Navrátil T.: Electroanalysis 23, 177 (2011). 18. Šelešovská R., Bandžuchová L., Navrátil T., Chýlková J.: Electrochimica Acta 60, 375 (2012). 19. Bandžuchová L., Šelešovská R., Navrátil T., Chýlková J., Novotný L.: Electrochimica Acta 75, 316 (2012). 20. Bandžuchová L., Šelešovská R., Navrátil T., Chýlková J.: Electroanalysis 25, 213 (2013). 18

21 Novel Electrochemical Assay for MicroRNA Detection Using Electroactive Complex of Six-Valent Osmium and Magnetic Beads Martin Bartošík a,b, Mojmír Trefulka a, and Emil Paleček a,b a Institute of Biophysics, AS CR, v.v.i., Královopolská 135, Brno, Czech Republic b Masaryk Memorial Cancer Institute, Žlutý kopec 7, Brno, Czech Republic, martinb@ibp.cz, martin.bartosik@mou.cz Abstract micrornas (mirnas) are short non-coding RNAs capable of regulating gene expression by binding to mrnas. It was shown that altered expression levels of specific micrornas (mirnas) were observed in certain cancer cells, and thus their detection is of great importance. Here we present simple and specific assay for electrochemical detection of mirna by using electroactive complex composed of osmium(vi) and nitrogenous ligand, such as bipyridine, which specifically binds to the 3 -end of the RNA. By combining labeling step with a magnetic beads-based hybridization procedure, we were able to specifically determine microrna at subnanomolar concentrations. Key words: microrna, Hybridization, Electrochemical detection, Mercury and solid amalgam electrodes, Regulation of gene expression, Electroactive labeling, Osmium, Bipyridine. Introduction One of the main goals of current research in cancer diagnostics is to develop sensitive, fast and inexpensive methods for biomarkers detection. One of these biomarkers could be micrornas (mirnas), i.e. short noncoding RNA molecules (20 25 nucleotides) regulating gene expression by binding to mrna and thus blocking protein synthesis 1. Cancer cells often exhibit altered expression levels of various mirnas lower levels may lead to overexpression of oncogenes, while higher levels block synthesis of tumor suppressors 2. These findings had a great impact on quick development of different techniques for detection of specific mirna sequences, relying in most cases on hybridization between the mirna and a complementary DNA oligonucleotide (codn), followed by an end-point (usually optical) detection of the created duplex. In the early days, mirnas were mostly analyzed using Northern blotting, and later with microarrays with optical detection. These are standard robust methods, however they are still rather laborious and/or expensive 3, 4. Fast, inexpensive and relatively simple bioassays for mirna detection might be attainable using electrochemical (EC) end-point detection. The method is also amenable for microarray construction because electrodes are easily miniaturized. It was therefore only a matter of time before first papers started to appear 5-7. Here we report a sensitive assay for EC detection of specific mirna. For this purpose, we utilized an electroactive six-valent osmium in complex with nitrogenous ligand, 2,2 -bipyridine (bipy), shortly Os(VI)bipy, which specifically binds to diol groups, including 3 -end of a ribose in RNA. The specificity of the assay was achieved by hybridizing the target mirna with the codn attached to the magnetic beads. We also show that mirna can be determined down to picomolar concentrations due to an electrocatalytic nature of a resulting EC signal at hanging mercury drop electrode (HMDE). Besides HMDE, solid amalgam electrodes (SAEs) can also be applied as detection platforms, making this assay attractive for point-of-care applications. 19

22 Experimental Used material: potassium osmate dihydrate, pyridine (py) and 2,2 -bipyridine (bipy) from Sigma (USA). Oligodeoxynucleotides (ODNs) and mirna-2115 (5 - AGC UUC CAU GAC UCC UGA UGG A -3 ) synthesized in VBC Biotech GmbH (Austria). Centrifugal filters for purification (Millipore, USA), magnet and magnetic beads (MB) covered with oligo(dt) 25 for hybridization procedure (Life Technologies, USA); other chemicals of analytical grade, all aqueous solutions prepared from deionized water. Modification of mirna with electroactive complex Os(VI)bipy was performed via ligand exchange: incubation of mirna with 1 mm Os(VI)py for 10 min at 20 C, followed by addition of 2 mm bipy and further incubation for 10 min at 20 C. Adducts were purified by centrifugation through membrane to remove free Os(VI)bipy. During a hybridization procedure, magnetic beads covered with oligo(dt) 25 were hybridized with adenine tail at the end of a capture probe, creating a duplex. Then the labeled mirna was added, hybridizing with a complementary part of the capture probe, forming a sandwich with the mirna being the third, outer component. After both hybridizations, thorough washing was necessary to remove any unbound Os(VI)bipy which would otherwise contribute to the resulting signal. The mirna and the capture probe were finally released from the magnetic beads by short heating and transferred into the background electrolyte for EC measurement. Measurements were carried out with Autolab with VA-Stand 663 (both Metrohm Autolab, Switzerland). HMDE, mercury meniscus-modified solid amalgam electrode (m-sae) and pyrolytic graphite electrode (PGE) were working electrodes, Ag/AgCl/3M KCl was reference electrode and platinum wire was an auxiliary electrode. Differential pulse voltammetry (DPV) was applied at HMDE and square wave voltammetry (SWV) at PGE. Background electrolyte was degassed before each measurement by a stream of argon. Results and discussion We have previously shown that Os(VI)bipy is specific towards oligodeoxynucleotide containing a ribose residue at the 3 -end of the molecule, demonstrated by well-developed voltammetric peaks at PGE and HMDE 8. This contrasted with a negligible response from the oligodeoxynucleotide having no ribose residue. Based on these findings, we applied Os(VI)bipy also to modify actual mirna and reached similar results. At PGE, oxidation peaks of mirna-os(vi)bipy adduct (peaks α and β) were obtained, with peak potentials (E P ) of ~ 0.1 V and ~ 0.5 V for α and β, respectively (Fig. 1C). When the same Os(VI)bipymodified mirna was adsorbed at the HMDE, we observed single, well-resolved peak at ~ 1.2 V (Fig. 1B), which increased with decreasing ph, suggesting that it could be due to a catalytic hydrogen evolution reaction. As a negative control we also used an oligodeoxynucleotide having the same length and sequence as mirna-2115 (except that it contained deoxyribose and thymine), and in agreement with the reaction scheme shown in Fig. 1A, modification of deoxyribose at the 3 -end of the oligonucleotide did not proceed as indicated by the absence of oxidation peaks at the PGE and electrocatalytic peak at the HMDE (Fig. 1B-C). To ensure that the resulting signal did not arise from unreacted Os(VI)bipy reagent, it was necessary to remove it after a modification step by centrifuging the sample solution through a membrane with a proper cutoff limit (3 kda). Measurement with only a free Os(VI)bipy (i.e. no mirna) after the purification step did not lead to any peak, suggesting its sufficient removal. 20

23 Fig. 1. (A) Simplified scheme of 3 -end modification of RNA with an electroactive Os(VI)L complex. (B-C) Voltammograms of (a) Os(VI)bipy-modified mirna-2115, (b) Os(VI)bipymodified ODN, (c) unmodified mirna-2115 and (d) free Os(VI)bipy. All samples were purified by centrifuging through proper-sized membrane. (B) HMDE. Concentration of mirna-2115 and ODN was 10 nm. Background electrolyte: Britton-Robinson buffer, ph 4.5. AdS DPV: accumulation time, t A 60 s (with stirring), accumulation potential, E A 0.7 V. (C) PGE. Concentration of mirna and ODN was 2 µm. 0.2 M acetate buffer, ph 5.0. SWV: t A 60 s, E A OCP, frequency 500 Hz, baseline corrected. Due to the catalytic nature of a voltammetric peak at the HMDE, depicted concentration of Os(VI)bipy-modified mirna-2115 (10 nm; Fig. 1B) could be substantially lowered. Concentrations of 500 pm and 250 pm were still easily distinguishable from the background, without a need for baseline correction. The concentration range span three orders of magnitude, from about 80 nm down to 150 pm (Fig. 2). At about 20 nm concentration, no more increase in peak height was observed with increasing concentration, perhaps due to a saturation of the electrode surface. Besides conventional adsorptive stripping voltammetry used above, we have also applied adsorptive transfer stripping (AdTS) technique 9 (ex situ) from 5 µl drop and in that way detected 2.5 nm modified mirna-2115; this concentration corresponds to only 12.5 fmol of mirna. AdTS voltammetric peaks (as compared to AdS) are generally lower because the sample is adsorbed from a quiescent solution (unstirred drop), and so the mass transfer equation does not include a contribution from the convection part (i.e. forced convection). This can be usually adjusted by increasing accumulation time. 21

24 Fig. 2. (A) Dependence of peak current on concentration of Os(VI)bipy-modified mirna at HMDE. Measurement was performed in situ. Other conditions as in Fig. 1B. Inset: Peaks of (a) 500 pm Os(VI)bipy-modified mirna-2115 (thin solid) with the error bar showing the RSD from four independent measurements (~ 7 %) and (b) 2.5 nm Os(VI)bipymodified mirna-2115 (bold solid) after the adsorption from 5 µl drop and transfer into a blank electrolyte. No baseline correction needed. Britton-Robinson buffer, ph 4.5 (dashed). Next logical step in our work was to capture mirna with a desired sequence, otherwise the protocol would not be very useful. For this purpose, we employed (i) codn specifically designed to hybridize with the mirna-2115 and (ii) magnetic beads for removal of interfering species (see Experimental for details). Fig. 3 shows the electrocatalytic peak of Os(VI)bipy-labeled mirna-2115 when the complementary capture probe was used (curve a), while no peak was obtained when using noncomplementary capture probe (curve b), suggesting that the hybridization did not occur under these conditions; if any nonspecifically bound molecules were attached to the magnetic beads, they were removed during the washing step. When working with magnetic beads, we have used unpurified samples (no membranebased purification required), which saves time. However, we had to perform another control experiment containing only free Os(VI)bipy (i.e. no mirna) to make sure that washing step after hybridization is sufficient for its removal (curve c). Indeed, free Os(VI)bipy yielded only negligible response in this case. Our results indicate that the HMDE is well-suited for a highly sensitive determination of Os(VI)bipy-labeled mirnas. Despite the advantages of liquid mercury electrodes (e.g. excellent reproducibility, atomically smooth surface or highly cathodic potential window), their possible use in sensors is rather inconvenient. We have thus carried out our EC assay also in combination with m-sae (Fig. 3, inset), which possesses similar properties like HMDE but is more suitable for sensor applications. Our results obtained with m-sae are similar as with HMDE in Fig. 3, although higher concentrations of mirnas were necessary for analysis due to a lower sensitivity of the m-sae surface. Nevertheless, we were still able to easily distinguish nm concentrations of complementary and noncomplementary target mirnas using the hybridization protocol. 22

25 Fig. 3. Detection of mirna-2115 using magnetic beads-based protocol and DPV at HMDE and m-sae. mirna-2115 hybridized with (a) complementary codn and (b) noncomplementary ODN; (c) negative control without any mirna-2115 (only free Os(VI)bipy reagent); concentrations at HMDE: 100 nm, m-sae: 200 nm. Conclusion In this work we show that 3'-end of mirna is labeled with electroactive Os(VI)bipy and that this adduct produces peaks at HMDE, m-sae as well as PGE. When the labeling step is combined with hybridization protocol and magnetic beads, mirna with specific sequence (complementary to the codn) can be detected. Further experiments will be focused on optimization of the protocol for its application to detection of real mirna isolated from human cancer cells. Acknowledgment This work was supported by a grant from RECAMO CZ.1.05/2.1.00/ , GACR P301/11/2055 and by institutional research plan AV0Z Literature 1. Bartel D. P.: Cell 136, 215 (2009). 2. Iorio M. V., Croce C. M.: Carcinogenesis 33, 1126 (2012). 3. Cissell K. A., Deo S. K.: Anal. Bioanal. Chem. 394, 1109 (2009). 4. Hunt E. A., Goulding A. M., Deo S. K.: Anal. Biochem. 387, 1 (2009). 5. Gao Z. Q., Yu Y. H.: Biosens. Bioelectron. 22, 933 (2007). 6. Kilic T., Topkaya S. N., Ariksoysal D. O., Ozsoz M., Ballar P., Erac Y., Gozen O.: Biosens. Bioelectron. 38, 195 (2012). 7. Pohlmann C., Sprinzl M.: Anal. Chem. 82, 4434 (2010). 8. Trefulka M., Bartosik M., Palecek E.: Electrochem. Commun. 12, 1760 (2010). 9. Palecek E., Bartosik M.: Chem. Rev. 112, 3427 (2012). 23

26 Electrochemistry of Selected Bile Acids and Phytosterols at Bare Electrodes Lenka Benešová a, Jan Klouda a, Adéla Patáková a, Kateřina Pišnová a, Karel Nesměrák a, Jiří Barek a,b, and Karolina Pecková a,b a Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry, UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Albertov 6, , Prague 2 b Charles University in Prague, Faculty of Science, University Research Centre "Supramolecular Chemistry", Department of Analytical Chemistry, Albertov 6, , Prague 2, Czech Republic, kpeckova@natur.cuni.cz Abstract In electrochemistry-related research bile acids and phytosterols do not belong among frequently studied compounds, because they are inactive under variety of conditions and electrode materials. In this contribution, several examples of their redox activity including electrochemical reduction of bile acids at mercury and silver solid amalgam electrodes and electrochemical oxidation of phytosterols and bile acids at platinum, glassy carbon and borondoped diamond electrodes in non-aqueous media are presented. Key words: Bile Acids, Boron doped diamond electrode, Mercury electrodes, Phytosterols, Silver solid amalgam electrode, Supramolecular assemblies. Introduction The bile acids occurring in humans are mostly hydroxylated derivatives of the steroid-5 cholan-24-oic acids. In the form of their conjugates they are amphipathic end products of cholesterol metabolism with multiple physiological functions, mainly in digestion and absorption of fats. Cholesterol is a C 27 sterol with a double bond at C 5 and an isooctane C 8 side chain. Bile acids possess the C 3 hydroxy group of cholesterol and a C 7 hydroxy or oxo group, because the rate limiting step in their biosynthesis from cholesterol is cholesterol 7 hydroxylase 1. The last hydroxyl functionality may appear at C 12. Chemical structures of cholesterol and common bile acids are shown in Fig. 1. The most abundant bile acids in human bile are chenodeoxycholic acid (45%) and cholic acid (31%). Bile acid anions are surface-active molecules due to their amphipathic character they have a hydrophobic side (the face of the bile acid molecule) containing no substituents and a hydrophilic side (the face) containing the hydroxy groups. Bile acid anions self-associate over a fairly narrow concentration range to form micelles. The critical micellization concentration (CMC) in aqueous media of C 24 bile acids has been intensively studied 2. The values range from 9 mmol L 1 (chenodeoxycholic acid) to 60 mmol L 1 (ursocholic acid) in water at 25 C. Depending on their structure and ph values, the bile acids and their conjugates are in ionic/protonized form. Bile acid dissociation constants are independent of the substituents in the steroid nucleus, since inductive effects of the hydroxyl groups on the steroid nucleus are too distant from the acidic group at the end of the side chain to influence its ionization, nevertheless, they are influenced by derivatization of the carboxyl group at the C 24. While for unconjugated bile acids the pk a values are 5.0±0.1, the amidation of bile acids with glycine lowers the pka value to 3.9±0.1 because of the proximity of the amide bond to the terminal carboxyl group 3. The conjugation with taurine leads to substantial incerase in acidity, e.g. the sulfo group of TUDCA has the pka value of 1.5, and it is negatively charged in wide range ph values under physiological conditions. The other important class of compounds derived from cholesterol includes the plant sterols phytosterols. Their chemical structure differs from that of cholesterol by the presence of modified side chains at carbon C 24 and they are metabolized differently, so that mammals are 24

27 not capable of their synthesizing. Phytosterols and their esters are used clinically to reduce low density lipoprotein cholesterol and atherosclerotic risk 4. The complex composition of naturally occuring steroid compounds and the small structural differences between individual components demand a fit for purpose analytical technique. The common techniques for the assay of these compounds in biological and physiological matrices include mainly chromatographic procedures, but also electrophoretic, enzymatic, and immunological methods as summarized in several reviews 5-7. The arched skeleton of bile acids with about ten chiral carbons and multiple hydrogen-bonding groups makes these compounds ideal for intermediate assemblies which relate to supramolecular properties, such as hostguest, inclusion, reaction, chirality, recognition, dynamics, information, and so on 8, 9. (A) (B) Bile acid A ring B ring C ring D ring 17C(CH 3 ) CH 2 CH 2 COR Cholic 3 OH 7 H 12 OH R=OH Chenodeoxycholic 3 OH 7 H R=OH Deoxycholic 3 OH 12 OH R=OH Ursodeoxycholic 3 OH 7 H R=OH Ursocholic 3 OH 7 H 12 OH R=OH Lithocholic 3 OH R=OH Glycocholic 3 OH 7 H 12 OH R= NHCH 2 COOH Tauroursodeoxycholic 3 OH 7 H 12 OH R=NHCH 2 CH 2 SO 3 H Fig. 1. Chemical structure of steroid skeleton (A) and selected bile acids (in the table), and cholesterol (B). The redox activity of bile acids and phytosterols is rather limited. For oxidation it relies on the oxidation of the hydroxyl groups at the bile acid / phytosterol skeleton. Approaches, based on their indirect electrochemical oxidation using PbO 2, platinum and carbon anodes producing various keto derivatives, were described 10. Further, sterols can be directly electrochemically oxidized at the glassy carbon electrode using high anodic potential in non-aqueous solvents 11, 12 presumably with the hydroxyl group at the 3 -position of cholesterol as a target of electrochemical oxidation. This has been utilized in a number of analytical methods aiming on 13, 14 the determination of cholesterol and its steroidal metabolites and precursors and phytosterols 15 using direct electrochemical detection in HPLC. Moreover, direct electrooxidation of cholesterol succeeded also at the boron-doped diamond (BDD) electrode 16. Electrochemical reduction of bile acids is enabled by the presence of the carboxyl group at C 24 or C 27 and was investigated at dropping mercury electrode 17. It is known that aliphatic and aromatic carboxyl acids which are not strongly activated by electron- 25

28 withdrawing groups and do not contain more easily reducible groups give a well-developed polarographic wave in aqueous 18 or nonaqueous 19, 20 solvents, but this is usually due to reduction of protons to hydrogen. In this contribution we focused on the characterization of electrochemical behaviour of selected bile acids and phytosterols. Several examples of their redox activity including electrochemical reduction of bile acids at mercury and meniscus-modified silver solid amalgam electrodes (m-agsae) and electrochemical oxidation of phytosterols and bile acids at platinum, glassy carbon and BDD electrodes in non-aqueous media are presented and discussed with respect to their potential use for characterization of supramolecular systems based on these compounds and their utilization for electroanalytical purposes. Experimental The following stock solutions were prepared: mol L 1 of tauroursodeoxycholic acid (TUDCA) in deionized water (Milli-Q plus system, Millipore, USA); mol L 1 cholic acid, deoxycholic acid, chenodeoxycholic acid, dehydrocholic acid, ursodeoxycholic acid (UDCA), lithocholic acid, and stigmasterol in methanol and acetonitrile. All the solutions were stored in the dark. Britton-Robinson buffers were prepared in a usual way, i.e. by mixing a solution of 0.04 mol L 1 in phosphoric acid, 0.04 mol L 1 in acetic acid and 0.04 mol L 1 in boric acid with the appropriate amount of 0.2 mol L 1 sodium hydroxide solution. For measurements in non-aqueous media acetonitrile Chromasolv (Sigma Aldrich) with water content below vol.% (determined by gas chromatography) was used. Sodium perchlorate purity for HPLC (Fluka) served as a basic electrolyte. All other chemicals were of gradient grade purity (Lach-Ner, Neratovice, CZ). Measurements were carried out using a computer driven Eco-Tribo Polarograph with PolarPro software, version 5.0 (both Polaro-Sensors, Prague). For experiments in aqueous or mixed media the following conditions were used: Three electrode arrangement with classical dropping mercury electrode (DME), hanging mercury drop electrode (HMDE) UM E (Polaro-Sensors, Prague), m-agsae, or BDD electrode (3 mm diameter, Windsor Scientific, UK) as indicator electrodes and platinum wire auxiliary electrode and silver / silver chloride (3M KCl) reference electrode. In differential pulse techniques, the pulse amplitude of ±50 mv and the pulse width of 100 ms were used. The indicator electrodes were activated as follows: BDD was activated at the beginning of each working day in 0.1 mol L 1 H 2 SO 4 by applying the potential of +2.4 V for 60 s. Before starting the work, as well as after every pause longer than one hour, the electrochemical activation of m-agsae was carried out in 0.2 mol L 1 KCl at 2500 mv under stirring of the solution for 300 s. For measurements in non-aqueous media the working electrode was a platinum rotating disk electrode (active surface area 6.2 mm 2 ) or a glassy carbon rotating disk electrode (active surface area 9.4 mm 2 ); constant rotation speed was kept at 1226 rpm. The reference electrode was a silver plate immersed in a solution of 0.01 M AgNO 3 in 1 mol L 1 NaClO 4 in acetonitrile and separated from measured solution by a salt bridge filled with 0.5 mol L 1 NaClO 4 in acetonitrile. The platinum rod served as a counter electrode. For DC voltammetry the scan rate of 10 mv s 1 was used. ph was measured using Conductivity & ph meter Jenway 4330 (Jenway, England). Results and Discussion We tested the possibility of reduction of selected bile acids using DME, HMDE and m- AgSAE in ph range 2-12 in aqueous or mixed methanol-aqueous media. Previously the only bare electrode material succeeding has been the classical dropping mercury electrode (DME) it was used for differential pulse polarographic determination of cholic, deoxycholic, ursodeoxycholic, chenodeoxycholic and lithocholic acid in human bile or pharmaceutical products 17. Figure 2A presents DP voltammograms of TUDCA at HMDE and 26

29 chenodeoxycholic acid at m-agsae. On this example the ph-independence of the reduction process can be demonstrated. Tested bile acids are reduced at far negative potential at ca 1200 mv and the reduction potential shifts with increasing concentration to more negative values, presumably due to the adsorption of the bile acids at the electrode surface. At m- AgSAE, slightly more negative potentials were observed. At both electrodes, for investigation of their electrochemical behavior weakly acidic to basic media are suitable because of the possible interference of the signal of bile acids and the onset of the voltammetric curve due to the hydrogen evolution. The electrochemical oxidation of bile acids represents an unexploited field, attention was paid more frequently to cholesterol and related compounds 11, 13, 14, 16, 21 and phytosterols 15. It was proved for cholesterol that in nonaqueous media the hydroxyl group at the 3 -position is the target of electrochemical oxidation and its oxidation in acetonitrile at carbon electrode proceeds via a four-electron, four-proton transfer to cholesta-4,6-dien-3-one 12. The hydroxyl group at the 3 -position is characteristic for all sterols, therefore related compounds as fytosterols and bile acids exhibit similar behavior. In our experiments cholic acid, ursodeoxycholic acid, dehydrocholic acid, tauroursodeoxycholic acid, deoxycholic acid, chenodeoxycholic acid, and lithocholic acid yield a single, very drawn-out anodic wave in 0.1 mol L 1 NaClO 4 in acetonitrile at rotating platinum and glassy carbon electrode. The halfwave potentials on the platinum electrode were in the range of mv to mv, dependent on the structure of the compound. The half-wave potentials on the glassy-carbon electrode were ca. +50 mv more positive. Further, BDD electrode was tested for oxidation of stigmasterol and its intensive oxidation recognizable as steep onset of the voltammetric curve at about mv, i.e. 300 mv more positive than the onset of supporting electrolyte was observable (Fig. 2B). Conclusions Obviously, the possibilities of electrochemistry for characterization and detection of cholesterols, phytosterols, bile acids and related compounds are rather limited. Nevertheless, utilization of electrochemical methods for characterization of the newly prepared supramolecular systems based on steroid subunits and for investigation of interactions involved in the self-assembling process can broaden the knowledge about their stability and monitored interactions. Further, for analytical chemists the redox activity of sterols in anodic region provides basis for development of methods based on their direct detection in liquidflow techniques. Acknowledgements The research was financially supported by Grant Agency of the Czech Republic (project P206/12/G151). KP thanks to the company LʼOreal Czech Republic for the Stipendium LʼOreal For Women in Science 2012 supporting this research. 27

30 I, na -200 A 2 1 I, na 2000 B E, mv E, mv Fig. 2. (A) Selected DP voltammograms of TUDCA (c = mol L 1 ) at HMDE electrode in Britton-Robinson buffer ph 5.0 (1); 9.0 (2); 12.0 (3) and DP voltammogram of chenodeoxycholic acid (c = mol L 1 ) in the mixture BR buffer ph 9.0 methanol (4); (B) Cyclic voltammograms of stigmasterol at BDD electrode in the mixture methanolacetonitrile-phosphate buffer ph 3.0 (50:49:1); c = 0 mol L 1 (1) and c = mol L 1 (2). References 1. Hofmann A. F., Hagey L. R.: Cell. Mol. Life Sci. 65, 2461 (2008). 2. Hofmann A. F., Roda A.: J. Lipid Res. 25, 1477 (1984). 3. Fini A., Roda A.: J. Lipid Res. 28, 755 (1987). 4. Patel M. D., Thompson P. D.: Atherosclerosis 186, 12 (2006). 5. Scalia S.: J. Chromatogr. B-Biomed. Appl. 671, 299 (1995). 6. Griffiths W. J., Sjovall J.: J. Lipid Res. 51, 23 (2010). 7. Griffiths W. J., Sjovall J.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 396, 80 (2010). 8. Miyata M., Tohnai N., Hisaki I.: Molecules 12, 1973 (2007). 9. Mukhopadhyay S., Maitra U.: Current Science 87, 1666 (2004). 10. Medici A., Pedrini P., De Battisti A., Fantin G., Fogagnolo M., Guerrini A.: Steroids 66, 63 (2001). 11. Hojo K., Hakamata H., Kotani A. I. A., Furukawa C., Hosokawa Y. Y., Kusu F.: J. Chromatogr. A 1166, 135 (2007). 12. Hosokawa Y. Y., Hakamata H., Murakami T., Aoyagi S., Kuroda M., Mimaki Y., Ito A., Morosawa S., Kusu F.: Electrochim. Acta 54, 6412 (2009). 13. Hojo K., Hakamata H., Takahashi A., Hosokawa Y. Y., Kusu F.: Biomed. Chromatogr. 24, 600 (2010). 14. Hojo K., Hakamata H., Kusu F.: J. Chromatogr. B 879, 751 (2011). 15. Ito N., Hakamata H., Kusu F.: Anal. Methods 2, 174 (2010). 16. Kotani A., Hakamata H., Nakayama N., Kusu F.: Electroanalysis 23, 2709 (2011). 17. Ferri T., Campanella L., Deangelis G.: Analyst 109, 923 (1984). 18. Korshunov I. A., Kuznetsova Z. B., Shchennikova M. K.: Zhurnal Fiz. Khimii 23, 1292 (1949). 19. Coetzee J. F., Kolthoff I. M.: J. Am. Chem. Soc. 79, 6110 (1957). 20. Lund H.: Acta Chem. Scand. 17, 972 (1963). 21. Luo H. X., Shi Z. J., Li N. Q., Gu Z. N., Zhuang Q. K.: Anal. Chem. 73, 915 (2001). 28

31 Adsorption of 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine on Au(111) and HOPG (Adsorpce 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfocholin na Au(111) a HOPG) Jana Bulíčková a, Romana Sokolová a a J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of the AS CR, v.v.i., Dolejškova 3, Prague 8, Czech Republic, jana.bulickova@jh-inst.cas.cz Abstract Atomic force microscopy (AFM) was used to study the formation of layers of 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) on Au(111) and highly oriented pyrolytic graphite (HOPG) in microscopic level. Both substrates were found to support the DPPC layers. The nanoshaving technique was applied to determine the layer thickness. In addition, the influence of deionized water on the DPPC ordering at the substrates was studied by ex-situ and in-situ AFM intermittent contact mode measurements. Key words: Phospholipid, Adsorption, Atomic force microscopy, Surface topography. Úvod Molekula 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfocholin (DPPC) (Obr. 1.) 1 patří mezi fosfolipidy (zwitterion fosfoglycerid), které jsou používané pro přípravu liposomálních monovrstev. Obr. 1. Strukturní vzorec 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfocholinu (C 40 H 80 NO 8 P, DPPC). V literatuře se stále setkáváme se snahou vytvořit modelové membrány buněk, tak abychom byli schopni pochopit jejich mechanismus a kinetiku vzniku a následně je mohli využit v biotechnologických aplikacích 2,3. Mezi oblíbené techniky studia adsorpce fosfolipidů, na různých substrátech (slída, vysoce orientovaný pyrolytický uhlík (HOPG) a monokrystalické zlato), patří i mikroskopie atomárních sil (AFM) 4,5,6,7. AFM poskytuje detailní strukturní informace s nanometrovým rozlišením. Na rozdíl od rastrovací tunelové mikroskopie (STM) mohou být vzorky nevodivé a díky potlačení laterálních sil v magneticky řízeném přerušovaně kontaktním režimu AFM (TM AFM) nedochází ani k porušení měkkých biologických vzorků. Oproti tomu v kontaktním režimu AFM (CM AFM) lze molekuly (vrstvy), při působení určité přítlačné síly na hrot, posouvat. Experimentální část Jako substrát slouží vyžíhané monokrystalické zlato Au(111) na slídě dodávané od firmy Agilent Technologies (USA) nebo adhezivní páskou čistě očištěný vysoce orientovaný pyrolytický uhlík (HOPG, Structure Probe Inc., USA). Destilovaná voda byla získána z Milli-Q RG systému (18 MΩ.cm, Millipore Co., USA). 29

32 Látka 1,2 dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfocholin (DPPC) byla zakoupena od firmy Avanti Polar Lipids (Alabaster, USA). Jako rozpouštědlo byl použit roztok absolutního ethanolu (AppliChem, Germany 99,8 %, GC dodavatel Chemos, Cítov, ČR) a n-heptanu (p.a., Penta Švec, Pentachemicals, Praha, ČR), v poměru 1:10 (v/v). Depozice 10mM roztoku DPPC na Au(111) na slídě probíhala za tepla ve vodní lázni, při působení roztoku po dobu 6 minut. Po té byl substrát omyt teplým roztokem samotných rozpouštědel a vysušen pod proudem argonu. Depozice 10mM roztoku DPPC na HOPG probíhala pokrytím celého povrchu teplým roztokem po dobu 6 minut. Po té byl substrát omyt teplým roztokem samotných rozpouštědel, dále omyt absolutním ethanolem a vysušen pod proudem argonu. Všechna měření technikou mikroskopie atomárních sil (AFM) byla provedena na přístroji Agilent 5500 SPM (Agilent Technologies, USA). Jako sonda sloužil hrot typu Type II MAC lever (Agilent Technologies, USA) s nominální resonanční frekvencí f N = 75 khz a hodnotou nominální silové konstanty kn = 2,8 N/m. Nosič Type II MAC lever je vhodný pro zobrazovaní povrchu pomocí tapping módu (TM AFM), tedy zobrazení plochy v magneticky řízeném přerušovaně kontaktním režimu. U vzorku naneseném na Au(111) byl také použit hrot typu Point Probe Plus Non-Contact long (PPP-NCL, Agilent Technologies, USA) s nominální resonanční frekvencí f N = 190 khz a hodnotou nominální silové konstanty kn = 48 N/m, který je vhodný pro zobrazení topografie pomocí řídícího mechanismu AAC. Vzorky byly měřeny jak ex-situ, tak in-situ pod deionizovanou vodou. Získaná data byla zpracována v programu Gwyddion (Český metrologický institute, ČR) a Origin 7,5 (OriginLab Corporation, USA). Výsledky a diskuze Experimentem bylo zjišťováno, jak se DPPC adsorbuje na různé povrchy, tedy hydrofobní HOPG a hydrofilní Au(111). Vzniklé adsorbované vrstvy DPPC byly měřeny ex-situ technikou TM AFM. Zároveň bylo pozorováno, jak se mění uspořádání povrchových struktur při působení deionizované vody, pomocí in-situ TM AFM. Pro získání informace o výšce vrstvy na povrchu jednotlivých substrátů byla využita technika nanoshaving 8 v kontaktním módu AFM (NS-CM AFM). Nejprve je nutné zobrazit danou vhodnou oblast v magneticky řízeném přerušovaně kontaktním režimu (TM AFM). Poté je část vrstvy na povrchu substrátu přemístěna hrotem se zadanou přítlačnou silou v módu CM AFM. Nakonec je stejná oblast zobrazena znovu technikou TM AFM. S analýzy profilů povrchu před a po přemístění pomocí NS-CM AFM lze odečíst výšku vrstvy. Analýza výšky povrchových struktur topografie vzorku DPPC na HOPG (histogram neukazován) ukázala, že jsou struktury vysoké cca 3,5 nm. Jak je patrné na první pohled z topografie (Obr. 2), povrchové struktury netvoří souvislou vrstvu. Patrná změna nastane u vzorku DPPC na HOPG pokud je vzorek vystaven působení vody po několik dnů. U vrstvy DPPC došlo k přeorganizování, je kompaktnější, i když jsou stále patrná nepokrytá místa oválného tvaru (možnost nanobublin 9 ). Výška vrstvy z analýzy povrchu vychází přibližně 3 nm. 30

33 y / nm Obr. 2. Topografie DPPC na HOPG měřená ex-situ technikou TM AFM, velikost zobrazení 1x1 μm, z = 6,8 nm; na pravé straně je ukázán profil linie 1 z levého obrázku. Při adsorpci DPPC na zlatý povrch hraje roli nejen samotný povrch Au(111), ale i koncentrace roztoku, teplota nanášeného roztoku a doba adsorpce (s tím souvisí doba působení roztoku na substrát). Při krátké depozici (po dobu několika sekund) DPPC na Au(111) byla z histogramu distribuce výšky povrchových struktur odečtena výška 2,8 nm, která odpovídá monovrstvě. Oproti tomu při 6 minutové depozici byla vrstva vysoká 5,8 nm. Tato výška odpovídá fosfolipidové dvojvrstvě nanesené na povrchu, tj. vytvořily se tzv. panely. Závěr Oba substráty (Au(111) a HOPG) podporují adsorpci a tvorbu vrstvy DPPC. Z analýzy profilů po NS-CM AFM vznikl histogram distribuce výšky povrchových struktur. U vzorku DPPC na HOPG byla odečtena jako nejvíce se vyskytující hodnota 3,5 nm. Po působení vody na vzorek vyšla hodnota kolem 3 nm. U vzorku DPPC na Au(111) se při kratší depozici vytvořila monovrstva o výšce 2,8 nm. Při šesti minutové depozici DPPC vytvořil panely vysoké 5,8 nm, které odpovídají povrchem podporované dvojvrstvě. Acknowledgement This work was supported by the the Academy of Sciences of the Czech Republic (M ). Literatura 1. Downloaded 26 th March Giocondi M.-C., Yamamoto D., Lesniewska E., Milhiet P.-E., Ando T., Le Grimellec C.: Biochim. et Biophys. Acta 1798, 703 (2010). 3. Richter R. P., Brisson A. R.: Biophys. J. 88, 3422 (2005). 4. Richter R. P., Brisson A. R.: Langmuir 19, 1632 (2003). 5. Hui S. W., Viswanathan R., Zasadzinski J. A., Israelachvili J. N.: Biophys. J. 68, 171 (1995). 6. Spangenberg T., de Mello N. F., Creczynski-Pasa T. B., Pasa A. A., Niehus H.: Phys. Stat. Sol. 201, 857 (2004). 7. Diculescu V. C., Chiorcea-Paquima A.-M., Tugulea L., Vivan M., Oliveira-Brett A.-M.: Bioelectrochem. 74, 278 (2009). 8. Kolivoška V., Gál M., Lachmanová Š., Janda P., Sokolová R., Hromadová M.: Collect. Czech. Chem. Commun. 76, 1075 (2011). 9. Kolivoška V., Gál M., Hromadová M., Lachmanová Š., Pospíšil L.: Biointerphases 6, 164 (2011). x / m 31

34 Nitro-Hydrazine DNA Redox Labels in Electroanalysis of Nucleic Acids at m-agsae Ales Danhel a, Hana Pivonkova a, Veronika Raindlova b, Michal Hocek b, and Miroslav Fojta a a Institute of Biophysics, AS CR, v.v.i., Kralovopolska 135, Brno, Czech Republic, danhel@ibp.cz b Institute of Organic Chemistry and Biochemistry, AS CR, v.v.i., Flemingovo nam. 2, Prague 6, Czech Republic Abstract Electrochemical behaviour of the model single stranded (ss) and double stranded (ds) DNA, prepared by primer extension procedure using enzymatic incorporation of the deoxycytidinetriphosphate (dctp) conjugates with novel redox DNA labels: 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNPH) and N-methyl-4-hydrazino-7-nitrobenzofurazane (NBF), into the selected template (oligonucleotide consisted of 31nt) and primer (15nt) is discussed in this work. Yielding ssdna-dnph and dsdna-nbf, respectively, were studied using cyclic voltammetry, adsorptive stripping voltammetry and transfer stripping voltammetry at mercury meniscus modified silver solid amalgam electrode. Together with the labeled DNAs, electrochemical properties of the involved compounds, such as DNPH, NBF, dc DNPH MP, and dc NBF MP were also studied and advantageous utilization of the silver solid amalgam electrode was confirmed. Key words: DNA, Nitrobenzofurazan, Nitrophenylhydrazine, Primer extension, Redox labels, Silver solid amalgam and voltammetry. Introduction Nucleic acids (NAs) are apparently the most studied but still quite unexplored biopolymers and together with proteins essential for all known living forms of life securing encoding, transmitting and expressing of the genetic information 1. Next to this natural necessity, NAs have found many application utilities in booming field of bio-sensing 2 taking advantages in novel methods and approaches 3. Increase of sensitivity, selectivity and signal response diversity in electrochemical assays may be, among the others, raised by utilization of various redox labels 4. Next to the increase of specificity of the recently designed NA redox labels, they allow utilization of novel electrode materials, which do not offer such wide cathodic potential windows like the mercury electrodes, in development of various novel bio-sensors and bio-assays. The short potential window is not the case of mercury meniscus modified silver solid amalgam electrode (m-agsae) offering comparable potential window with mercury electrodes, advantageous mechanical stability and sufficient sensitivity 5,6. And just the mechanical stability and its simplicity allow utilization of this solid electrode in application for development of novel sensors and detection systems with potential use in biological, toxicological and/or medicinal bio-assays. An enzymatic incorporation of the deoxyribonucleotidtriphospahtes (dntps) bearing the redox labels amino-/nitro-phenyl 7 or mediators for post synthetic modification, such as formylthiophene and ethynyl, directly bounded to the nucleobases is one of the promising approaches in NA redox labeling. Incorporation of the bulky redox labels, such as antraquinon 8, ferocene or osmiumtetraoxide complexes 9, may be proceeded when the bulky label is attached to the nucleobases via a proper linker (e.g. ethynyl, m-/p-phenylene, formylthiophene) 4. According to requirements of the proposed methods, such as polymerase chain reaction (PCR), primer extension (PEX) or tail labeling, proper enzymes, e.g. DNA polymerases and/or terminal transferase 8, used to be applied, respectively. One of the recently designed labeling systems is base on PCR/PEX incorporation of formylthiophene labeled dctp (dc FT TP) into the DNA, which can be easily further modified by Hydrazon formations reaction utilizing carbonyl specific dyes: 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNPH) and 32

35 N-methyl-4-hydrazino-7-nitrobenzofurazane (NBF), or enzymatic incorporation of such a labeled dntps (e.g. dc DNPH TP, dc NBF TP, Fig. 1) into the DNA using PEX reaction 10,11. Systematic study of the electrochemical behaviour of the individual compounds: DNPH, NBF, dc DNPH MP, dc NBF MP and short model ssdna-dnph and dsdna-nbf is the topic of this work. For this purpose, cyclic voltammetry (CV), adsorptive stripping voltammetry (AdS-CV) and open circuit transfer stripping voltammetry (TS-CV) at m-agsae were used. OH O P O - O - O P O O O P O O - O O N NH 2 N S N NH NO 2 NO 2 OH O P O - O - O (A) OH (B) OH Fig. 1. Structure formulae of via formylthiophene DNPH and NBF labeled dctp: A) dc DNPH TP, B) dc NBF TP. Experimental The enzymatic incorporation of the labeled dctp (dc DNPH TP and dc NBF TP) into the DNA respectively was carried out by PEX following procedure published by V. Raindlova et al. 10,11, in 2 ml Eppendorf tubes using thermomixer Comfort (Eppendorf, USA). The PEX reaction mixture was composed of: natural/labeled dntps: dctp/dc DNPH TP/dC NBF TP, datp, dgtp and dttp (>97%, Sigma-Aldrich, Germany), Termopol buffer (#B9004), biotinilated template (31nt) 4BAS II Bio or 4BAS II (when dc DNPH TP or dc NBF TP was used, respectively), primer no-a (15nt), DNA polymerase Vent(exo-) (all BioLabs, New England), and deionized water (Milli-Q plus, Millipore, USA). After an incubation during 45 min at 60 C without stirring in thermomixer, prepared ssdna-dnph and/or dsdna-nbf were further purified using magneto-separation by Streptavidine modified magnetic beads (DBStv, Dynabeads, Invitrogen, USA) and magnetoseparator (Dynal, Norway) or QIAquick Nucleotide Removal Kit (QIAGEN, Germany) following original Quick-Start protocol using centrifuge (minispin plus, Eppendorf, USA), respectively. Prepared labeled DNAs were eluted by 30 μl of water, stored in 2 ml Eppendorf tubes and kept on ice during the measurements to prevent their decomposition, otherwise stored at 5 C in a lab refrigerator. Next to the prepared ssdna-dnph and dsdna-nbf in aqueous solutions, single DNPH and NBF (p.a. Sigma-Aldrich, Germany) dissolved in DMSO and such a labeled dcmps (dc DNPH MP and dc NBF MP) dissolved in water were used as stock solutions for next electrochemical studies carried out by electrochemical workstation CHI440 (CH Instruments, USA) utilizing a three electrode system consisted of platinum wire auxiliary electrode, silver chloride reference electrode (Ag AgCl 3M KCl, both Monokrystaly, Czech Republic) and m- AgSAE in aqueous buffer. All the voltammetric measurements were carried out in a supporting electrolyte, 0.3M ammonium formate/phosphate buffer (AFP buffer) ph 6.95 (prepared from ACS grade chemicals, Sigma-Aldrich, Germany). Observed solutions were 5 min deaerated by Argon ( %, Air Products, Czech Republic) to remove the oxygen prior each measurements. The m-agsae was electrochemically treated by procedure proposed by B. Yosypchuk between individual voltammetric measurements of observed analytes. Application of constant potential 2.0 V during 120 s in 0.2 mol l 1 KCl solution preserves repeatable analysis with relative standard deviation (RSD) up to 10 % 6,12. The CV, AdS-CV and TS-CV methods were used at scan rates within V s 1 using different potential windows. P O 33 O O P O O - O O N NH 2 N S N N O N N NO 2 CH 3

36 Results and discussion Cyclic voltammetry Selected DNA redox labels, DNPH and NBF, and via formylthiophene linker DNPH and NBF labeled dcmps were individually studied by CV at m-agsae within properly delimited potential windows in 0.3M AFP buffer ph Due to small sample volume and concentration, ssdna-dnph and dsdna-nbf were studied only by open circuit TS-CV. All the following CVs were measured using scan rates: 0.1, 1.0, 5.0, 10, 50, and 100 V s 1. Measured voltammograms starts at potential +0.1 V and negative vertex potential was placed just behind the observed signals to observed possible reversible or quasi reversible addition signals in backward anodic and consequent cathodic scans. According to this results and previous studies of analogous compounds, mechanism of their electrochemical reduction/oxidation could be proposed. Thanks to the presence of nitro- groups and/or benzofurazan heterocycle, more positive signals, than simple DNA may offer by CV at mercury based electrodes, were observed. These signals correspond to four or six electron electron reduction, respectively. While benzofurazan is irreversibly reduced to its diaminobenzene derivative, nitro- groups of DNPH and also NBF are quasireversibly reduced to hydroxylamines-, which offer reversible anodic and consequent cathodic signals by its changeover to nitroso- groups and back to hydroxylamines in shortened potential windows. However these additional signals may be well observed using high scan rates over 10 V s 1. Next to the signals mention above, the dc DNPH MP and dc NBF MP provide four electron cathodic signals corresponding to reduction of hydrazon group, yielding appropriate amines. DNPH, NBF, dc DNPH MP and dc NBF MP may be determined with limits of detection (LOD, S/N = 3) 5, 3, 2, and 2 μmol l 1, respectively, using the CV with scan rate 100 V s 1 at m- AgSAE in 0.3M AFP buffer ph Adsorptive stripping voltammetry To evaluate a process of the electrochemical reduction of the studied compounds, the influences of the peak heights on scan rate were observed by CV. Thanks to the obtained linear dependences, it was possible to conclude, that the electrode processes are directed by adsorption. Therefore the AdS-CV could be advantageously applied for determination of lower concentrations of the studied compounds. Accumulation potential (E acc ) and time (t acc ) were separately optimized for the studied compounds mentioned above, starting with 60 s t acc and changing E acc and then changing t acc with optimal E acc using concentration 30 or 40 μmol l 1 in 0.3M AFP buffer ph However, t acc have been further optimized using even lower concentration of the analytes during measurements of concentration dependences. Optimal accumulation parameters for sensitive determination of DNPH, NBF, dc DNPH MP and dc NBF MP were found as follows (E acc /t acc ): 0.1 V/30 s, 0.1 V/30 s, 0.1 V/30 s, and 0.1 V/60 s, respectively. DNPH, NBF, dc DNPH MP and dc NBF MP may be determined with LOD 0.1, 0.02, 0.02, and 0.03 μmol l 1, respectively, using the AdS-CV including above mention E acc and 300s t acc, scan rate 100 V s 1 at m-agsae in 0.3M AFP buffer ph Transfer stripping voltammetry The open circuit TS-CV method could be used due to adsorption affinity of the studied compounds to the mercury meniscus of the m-agsae. Thanks to the mechanical stability of the m-agsae, it can be easily immersed to the sample and sample consumption do not exceed 0.5 μl (only remaining sample on the electrode) or, in case of small sample volume about 2 μl, it may be transferred on the electrode surface by automatic pipette and for repeatable measurements carefully sack out back by the pipette after appropriate t acc. In comparison with HMDE where 3 μl of the sample volume is real lower limit for single adsorption, the m-agsae has a big advantage in this case. Sample adsorptions were carried out from their aqueous solution at appropriate concentration containing 0.2M NaCl increasing 34

37 I, A ionic strength and the affinity of the analytes to mercury meniscus, by immersion of the m- AgSAE into the small Eppendorf tubes. Concentration dependences were measured using t acc 60 s, during this time, the electrode surface became almost saturated by the analytes at the highest observed concentrations, and when obtained signals reached LODs, the t acc was proportionally increased. At the lowest concentration ranges even 10 min t acc did not have a positive effect in some cases, so finally LODs for DNPH, NBF, dc DNPH MP, dc NBF MP, ssdna-dnph and dsdna-nbf were determined as follows (t acc ): 10 (30 s), 0.03 (300 s), 0.04 (60 s), 0.04 (300 s), 0.3 (300 s), and 0.5 μmol l 1 (300 s), respectively, using the TS-CV with scan rate 100 V s 1 at m-agsae in 0.3M AFP buffer ph A comparison of the obtained voltammograms of the prepared ssdna-dnph and dsdna-nbf with unmodified ssdna is depicted on Figure c F+H CA dsdna-nbf G ssdna-dnph G ssdna G c p-no 2 c o-no 2 c p-no E,V Fig. 2. Cyclic voltammograms of: 5 μm ssdna (blue), 0.26 μm ssdna-dnph (red) and 0.63 μm dsdna-nbf (green) at m-agsae in 0.3M AFP buffer ph 6.95, scan rate 100 mv s 1 (c o-no2 reduction peak of nitro-group in (o-) position, c p-no2 reduction peak of nitro-group in (p-) position, c H reduction peak of hydrazon group, c F+H coincide reduction peak of furazan heterocycle and hydrazon group, CA coincide reduction peaks of cytosine and adenine, G oxidation peak of previously reduced guanine to 7,8-dihydroguanine). Even though the incorporation of the redox labels influences their electrochemical properties and the labels do not offer additive anodic signals what quite decrease their potential signal response diversity, it is evident that labeled DNA offers advantageous more positive cathodic signals than unlabeled DNA. This difference could be further used for identification of such a labeled from unlabeled DNA samples in a simple diagnostic tools utilizing also modern biochemical techniques such as, PCR, PEX and magnetic beads. Conclusion DNA redox labels based on DNPH and NBF were found to be convenient alternatives to previously studied labels (nitro-/amino-phenyl, anthraquinone etc.) and may be enzymatically incorporated to the DNA structure by PEX using proper DNA polymerase. In combination with very sufficient electrochemical detection at m-agsae, their application in development c H CA CA 35

38 of novel sensors and detectors was confirmed. Even if the PEX preparation of the labeled DNA is not sufficient enough to incorporate adequate number of the labeled dntps to exceed signals of the unlabeled DNA, they sufficiently indicate the presence of the studied oligonucleotide. However, there is still the post synthetic modification of the DNA, prepared by PCR using formylthiophene labeled dntps and further labeled by DNPH or NBF, what seems to be much promising approach with obvious usage in various biological, toxicological or medicinal applications. Acknowledgment Financial support from project OPVK CZ.1.07/2.3.00/ , The Czech Science Foundation GACR (project P206/12/G151), and GA ASCR (IAA ) is gratefully acknowledged. References 1. Palecek E., Bartosik M.: Chem. Rev. 112, 3427 (2012). 2. Palecek E.: Electroanalysis 21, 239 (2009). 3. Labuda J., Brett A. M. O., Evtugyn G., Fojta M., Mascini M., Ozsoz M., Palchetti I., Palecek E., Wang J.: Pure Appl. Chem. 82, 1161 (2010). 4. Fojta M., Havran L., Pivonkova H., Horakova P., Hocek M.: Curr. Org. Chem. 15, 2936 (2011). 5. Yosypchuk B., Barek J.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 189 (2009). 6. Yosypchuk B., Heyrovsky M., Palecek E., Novotny L.: Electroanalysis 14, 1488 (2002). 7. Cahova H., Havran L., Brazdilova P., Pivonkova H., Pohl R., Fojta M., Hocek M.: Angew. Chem.-Int. Edit. 47, 2059 (2008). 8. Horakova P., Macickova-Cahova H., Pivonkova H., Spacek J., Havran L., Hocek M., Fojta M.: Org. Biomol. Chem. 9, 1366 (2011). 9. Fojta M., Kostecka P., Pivonkova H., Horakova P., Havran L.: Curr. Anal. Chem. 7, 35 (2011). 10. Raindlova V., Pohl R., Klepetarova B., Havran L., Simkova E., Horakova P., Pivonkova H., Fojta M., Hocek M.: ChemPlusChem 77, 652 (2012). 11. Raindlova V., Pohl R., Sanda M., Hocek M.: Angew. Chem.-Int. Edit. 49, 1064 (2010). 12. Fadrna R., Cahova-Kucharikova K., Havran L., Yosypchuk B., Fojta M.: Electroanalysis 17, 452 (2005). 36

39 Utilization of Carbon Paste Electrodes for Amperometric Detection in HPLC with Gradient Elution Hana Dejmkova, Barbora Fahnrichova, Jiri Barek, and Jiri Zima Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry, UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Albertov 6, CZ Prague 2, Czech Republic, Abstract Method for the determination of benzophenone-1 and benzophenone-3 was developed, using HPLC with amperometric detection on glassy carbon paste electrode. Due to the utilization of gradient elution including high content of methanol, attention was paid to the stability of the electrode material and to the influence of these conditions on the determination parameters. Key words: Glassy carbon paste electrode, Benzophenone, HPLC, Gradient elution. Introduction Benzophenones belong to the family of compounds used as additives and preservatives of various products, particularly cosmetics their structure enables them to block UV light and thus protect the materials sensitive to such an influence 1. On the other hand, these compounds are in the same time endocrine disruptors, compounds which interact adversely with endocrine system of organisms, damaging their hormonal balance 2. For that reason, it brings these compounds to the center of attention concerning their occurrence and connected determination method for their monitoring. Electrochemistry provides interesting possibilities in such monitoring due to its sensitivity, relative selectivity, and low instrumental demands 3. Among various electrode materials, carbon paste is advantageous in some electrochemical parameters (potential window, background current) and in variability and versatility 4 ; on the other hand, due to its structure it is also vulnerable towards some influences, particularly towards presence of organic solvents 5. Utilization of glassy carbon microparticles as the carbonaceous component of the paste provides some resistance to it 6. This paper deals with the development of the determination method of benzophenone-1 (BP- 1) and benzophenone-3 (BP-3) using HPLC with amperometric detection. High retention of these compounds offers an interesting possibility to observe the behavior of the glassy carbon paste electrode (GCPE) in extreme conditions combining the high content of methanol and flow technique. Experimental Stock solutions of 100 mol L -1 benzophenone-1 (BP-1, CAS No , Sigma-Aldrich) and benzophenone-3 (BP-3, CAS No , Sigma-Aldrich) in methanol were prepared. HPLC measurements were performed using high pressure pump Beta 10, injector valve with 20 L loop, UV/VIS detector Sapphire 800 (all Ecom, Czech Republic) and amperometric detector ADLC 2 (Laboratorní přístroje, Czech Republic) connected in series. Kromasil μm, 150 4,6 mm, RP-18 column (Merck) was used for the separation. Mobile phase consisted of methanol and phosphate-acetate buffer. All chemicals used for buffer preparation were of analytical grade purity and obtained from Lachema Brno, Czech Republic. Detection wavelength of 288 nm and flow rate of 1.0 ml min -1 was set. The working carbon paste electrode was prepared from mineral oil (Fluka) and spherical microparticles of glassy carbon with a diameter from 0.4 to 12 m (Alfa Aesar, Germany). It was adjusted against the outlet capillary in wall-jet arrangement and immersed in the 37

40 overflow vessel together with a platinum wire auxiliary electrode and an Ag/AgCl (3 M KCl) reference electrode RAE 113 (Monokrystaly Turnov, Czech Republic). All measurements were made in triplicate. Analyte concentration of 100 mol L 1 was used during optimization measurements, unless stated otherwise. Calibration dependences were evaluated by least squares linear regression method. The quantification limits were calculated as the concentration of the analyte which gave a signal ten times the standard deviation of the lowest evaluable concentration. Results and Discussion Firstly, behavior of BP-1 and BP-3 was observed under the isocratic conditions in order to find a suitable ph of the mobile phase; ph 6 was selected as optimal, but in the same time, high retention and resolution of the compounds showed the necessity to use gradient elution. Steep gradient was selected, starting on 30 % of methanol and reaching 91 % of methanol in 5 min. Under these conditions, a reasonable peak distribution was obtained, ensuring appropriate separation of the analytes from the system peak, which can be expected in the real samples, and in the same time minimizing the resolution of the peaks. Nevertheless, the stability of the GCPE might be questionable under such conditions. Therefore, three carbon paste electrodes varying in the content of pasting liquid were prepared and the repeatability of the electrode response during repetitive injections was observed. Two gradient programs were employed: steeper, described in the previous paragraph, and slower, ending in fifth minute on methanol concentration of 85 %. Such a decrease prolonges the separation, but it prevents GCPE from the contact with the highly methanolic mobile phase. Table 1 shows the resulting relative difference in the peak height of the first and tenth measurement. It can be clearly seen that the increasing proportion of pasting liquid protects the electrode from the deterioration. On the other hand, hydrodynamic voltammograms of BP-3 (Fig. 1) in the same time show the shift of the electrode response to higher potentials with increasing proportion of pasting liquid; preparation of unnecessarily thin carbon paste is not recommendable. Table I. Relative difference in the peak height of the first and tenth measurement obtained using various gradient programs and electrode composition. Electrode composition 250 mg carbon: 50 μl oil 250 mg carbon: 90 μl oil 250 mg carbon: 120 μl oil Gradient program Relative increase of peak BP-1 BP-3 BP-1 BP-3 BP-1 BP-3 From 30 % to 91 % of methanol in 5 min % 11.6% 2.9% -4.0% From 30 % to 85 % of methanol in 5 min -14.8% -13.7% 1.7% -2.7% -4.7% -4.4% 38

41 h P, na I, na E, V 0 Fig. 1. Hydrodynamic voltammograms of BP-3 obtained on the electrodes with proportion of carbon to mineral oil 250 mg : 50 μl ( ), 250 mg : 90 μl ( ), and 250 mg : 120 μl ( ) and the background currents of these electrodes(corresponding empty symbols). HPLC-ED on CPE, Kromasil μm, 150 4,6 mm, RP-18 column, mobile phase of methanol and phosphate-acetate buffer ph 6, proportion of methanol increasing from 30 % to 85 % in 5 min. Conclusions The performed measurements confirmed the importance of the relative amount of the pasting liquid for the stability of GCPE. This influence further supports the idea that one of the important reasons of GCPE stability is low porosity of carbonaceous particles and therefore the relative abundance of the pasting liquid on the electrode surface. Acknowledgement This work was performed in the framework of Specific university research (SVV ). Financial support from the Grant Agency of Charles University (project no ) is gratefully acknowledged. References 1. Janjua N. R., Kongshoj B., Andersson A. M., Wulf H. C.: J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. 22, 456 (2008). 2. Study on enhancing the Endocrine. Disrupter priority list with a focus on low production volume chemicals. Downloaded 30 th March Zima J.; Svancara I.; Peckova K.; Barek J.: Carbone paste electrodes for the determination of detrimental substances in drinking water. In Progress on Drinking Water Research (Lefebvre M. H.; Roux M. M., eds.), Nova Science Publishers, New York, Zima J., Svancara I., Barek J., Vytras K.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 204 (2009). 5. Svancara I., Vytras K., Renger F., Smyth M. R.: Electrochim. Acta 37, 1355 (1992). 6. Dejmkova H., Mika J., Barek J., Zima J.: Electroanalysis 24, 1766 (2012). 39

42 Roles of Amino Acid Residues in Peptide-Catalysed Hydrogen Evolution Vlastimil Dorčák a, Veronika Ostatná a, and Emil Paleček a,b a Institute of Biophysics, AS CR, v.v.i., Kralovopolska 135, Brno, Czech Republic b Masaryk Memorial Cancer Institute, Zluty kopec 7, Brno, Czech Republic Abstract We analysed several peptides, differing in amino acid composition and chain length, as a model system at hanging mercury drop electrode to explore the participation of their amino acid residues in the catalysis of hydrogen evolution pronounced by chronopotentiometric stripping peak H in weakly alkaline, neutral, and weakly acidic media. The active roles of cysteine thiol, lysine -ammonium, and arginine guanidinium groups were confirmed while the contribution of histidine imidazolium group was very weak under the given conditions. In addition, possible involvement of hydroxyl groups at side chains of tyrosine and serine residues is suggested. Key words: Constant-current chronopotentiometric stripping, Peptides, Catalytic hydrogen evolution, Mercury electrode. Introduction Chronopotentiometric stripping (CPS) peak H, due to the peptide/protein-catalysed hydrogen evolution at Hg-based electrodes, is known since Mostly proteins were analysed and a number of research papers (reviewed in ref. 2) illustrates its versatility in solving of various specific tasks important in biochemistry and medicine offering thus a novel powerful versatile label-free electroanalytical method. In comparison to other methods (commonly used in analysis of peptides/proteins), determinations based on the measurement of CPS peak H provides lower detection limits (allowing convenient analysis of peptides/proteins at submicromolar concentrations) 1, 3-13 and remarkable sensitivity to local and global changes in protein structures (native, denatured, aggregated, reduced, and oxidized) 6-8, 10-16, and specific binding of protein to DNA 7, low molecular-weight compounds 11, 17 and metal 13. Despite this broad range of practical applications only a little is known about the contribution of individual amino acid (aa) residues in the resulting catalytic process. Their identification is thus of a high importance for further advances in this method not only at the fundamental level, but it will be also useful in investigations of specific binding properties of peptides and proteins. The phenomenon of catalytic hydrogen evolution is known since the times very close to those of the invention of the polarography 18. It consists of a set of reactions during which the peptide/protein molecule in adsorbed state via functional groups (capable of proton exchange reaction) mediates the transfer of protons from the solution onto negatively charged electrode surface where they subsequently combine in more stable molecules, the gaseous hydrogen H 2 (reviewed in ref. 19). Several bioactive as well as synthetic peptides were studied mostly as a protein-like model to better understand the catalytic behaviour of much larger and complex protein molecules and to identify which aa residues are responsible for the appearance of CPS peak H. Up to date, only cysteine (Cys) thiol 9, 11, lysine (Lys) -ammonium 20, arginine (Arg) guanidinium 20, 21, and histidine (His) imidazolium 21 groups had been unambiguously confirmed. Herein, we present the results of the CPS study of the catalytic ability of several peptides (Table I) at a hanging mercury drop electrode (HMDE) in weakly alkaline, neutral, and weakly acidic media. In addition to the above functional groups, possible involvement of hydroxyls at side chains of tyrosine (Tyr) and serine (Ser) residues is discussed. 40

43 Table I. List of investigated peptides with their abbreviations and sequences in 3-letter aa code. Bold aa residues indicate those with functional groups bearing at ph 6 exchangeable protons. Experimental details Reagents Peptides were purchased from Bachem and Sigma-Aldrich. Other chemicals and water were ACS reagents from Sigma-Aldrich and Merck. Apparatus Chronopotentiometric measurements were carried out with an Autolab analyser (Eco Chemie) in connection with VA-stand 663 (Metrohm). The three-electrode system consisted of an HMDE (area of 0.4 mm 2 ) as a working electrode, Ag AgCl 3 M KCl as a reference electrode, and Pt wire as a counter electrode. Procedures All measurements were carried out at room temperature. Peptides were adsorbed on the electrode from unstirred solutions exposed to air for a 60 s accumulation time at open circuit potential (ocp). Then a stripping current (I str ) was applied to record chronopotentiograms from +0.1 V. Results and discussion Earlier, we showed that in some peptides/proteins predominantly free SH-groups of Cys residues are responsible for the appearance of CPS peak H in weakly alkaline media 9, 11. In the case of those with S S-bond/s, they are generated from the cleavage of S S-bonds during the cathodic stripping. Figure 1A shows well-developed CPS peak H of 1 M nonapeptide VP at ph 9.3 while its structural analogue OT (with exchanged two aa residues, Table I) behaves as catalytically inactive under the same conditions. But at neutral ph (Fig. 1B) both peptides produced peak H at the same potential (-1.73 V) and a new one appeared by about 10 mv negatively in the case of VP. On the other hand, responses of one aa residue longer SS38 (differing greatly from the aa composition of VT and OT, Table I) were very similar to those of VP at both ph s (Fig. 1A&B). 41

44 Fig. 1. CPS responses of 1 M VP, OT, and SS38 in weakly alkaline (A: 50 mm sodium borate, ph 9.3) and neutral (B: ¼ McIlvaine buffer, ph 7) media (solid lines); blank electrolyte (dotted lines). For aa composition of indicated peptides see Table I. I str = -25 A, more details are in section Procedures. 20, 21 with Our recent findings some peptides lacking Cys residues (under the similar conditions as shown in Figure 1B) suggest that Lys and Arg residues might be involved in the catalytic process pronounced by the second peak of VP and SS38, respectively (Fig. 1B). Examples of the catalytic activity of the peptides with Lys or Arg residues at ph 6 shown in Figure 2 support this finding. Removing of Arg residue from the ATIII (Table I) molecule resulted in cancelling the catalytic activity (ATIV in Fig. 2A) while its exchange by Lys residue in the peptide BB (Table I) has only small effect (K3BB in Fig. 2B), and the replacement of the dipeptidic moiety Leu-Arg in hlhrh by Trp-Leu (Table I) caused considerably decrease of peak H and its shift towards more negative potentials (slhrh in Fig. 2C). Fig. 2. CPS responses of 500 nm peptides in ½ McIlvaine buffer, ph 6 (solid lines); blank electrolyte (dotted lines). For aa composition of indicated peptides see Table I. I str = -20 A, more details are in section Procedures. There is no doubt about the catalytic activity of His residues as we shown on the example of hexahis at ph But we did not notice their contribution in other His-containing peptides even at ph 6 where the amount of the catalytically active imidazolium group is considerably increased due to its low pk A ~ 6. All the peptides shown in Figure 2 are containing His residues (Table I) but only slhrh (Fig. 2C) could indicate their involvement in the catalysis. However, except of His residue, there are further two with hydroxyl groups at side chains of 42

45 Tyr and Ser residues in the slhrh molecule (Table I) that might also act as a proton donor in the catalysis of hydrogen evolution. Replacement of leucine (Leu) in BB molecule by Tyr (Table I) caused significant increase of peak H and its shift towards less negative values indicating enhancement of the catalytic process (Y4BB in Fig. 2B). Conclusion The active roles of Cys, Lys, and Arg residues in the catalytic hydrogen evolution pronounced by CPS peak H at HMDE were confirmed in weakly alkaline, neutral and weakly acidic media. However, it appears that solving the problem of participation of His, Tyr, and Ser residues will require more work. Acknowledgements This work was supported by grants from GACR P301/11/2055 and RECAMO CZ.1.05/2.1.00/ References 1. Tomschik M., Havran L., Fojta M., Palecek E.: Electroanalysis 10, 403 (1998). 2. Palecek E., Ostatna V.: Electroanalysis 19, 2383 (2007). 3. Tomschik M., Havran L., Palecek E., Heyrovsky M.: Electroanalysis 12, 274 (2000). 4. Kizek R., Trnkova L., Palecek E.: Anal. Chem. 73, 4801 (2001). 5. Trnkova L., Kizek R., Vacek J.: Bioelectrochemistry 56, 57 (2002). 6. Masarik M., Stobiecka A., Kizek R., Jelen F., Pechan Z., Hoyer W., Jovin T.M., Subramaniam V., Palecek E.: Electroanalysis 16, 1172 (2004). 7. Palecek E., Masarik M., Kizek R., Kuhlmeier D., Hassmann J., Schulein J.: Anal. Chem. 76, 5930 (2004). 8. Ostatna V., Uslu B., Dogan B., Ozkan S., Palecek E.: J. Electroanal. Chem. 593, 172 (2006). 9. Dorcak V., Palecek E.: Electroanalysis 19, 2405 (2007). 10. Palecek E., Ostatna V., Masarik M., Bertoncini C.W., Jovin T.M.: Analyst 133, 76 (2008). 11. Dorcak V., Palecek E.: Anal. Chem. 81, 1543 (2009). 12. Ostatna V., Cernocka H., Palecek E.: J. Am. Chem. Soc. 132, 9408 (2010). 13. Palecek E., Ostatna V., Cernocka H., Joerger A.C., Fersh A.R.: J. Am. Chem. Soc. 133, 7190 (2011). 14. Ostatna V., Kuralay F., Trnkova L., Palecek E.: Electroanalysis 20, 1406 (2008). 15. Ostatna V., Palecek E.: Electrochim. Acta 53, 4014 (2008). 16. Palecek E., Ostatna V.: Chem. Commun (2009). 17. Havran L., Billova S., Palecek E.: Electroanalysis 16, 1139 (2004) 18. Heyrovsky J., Babicka J.: Coll. Czech. Chem. Commun. 2, 370 (1930). 19. Heyrovsky M.: In Electrochemistry of Nucleic Acids and Proteins; Palecek E., Scheller F., Wang J., Eds.; Elsevier: Amsterdam, 2005; Vol. 1, pp Zivanovic M., Aleksic M., Doneux T., Palecek E.: Electroanalysis 22, 2064 (2010). 21. Dorcak V., Ostatna V., Palecek E.: Electrochem. Commun. (2013), doi: /j.elecom

46 Voltammetric Determination of Pesticide Paraquat on Meniscus Modified Silver Solid Amalgam Electrode Jan Fischer a, Mariya Kyrylenko b, Anastasios Economou b, and Jiří Barek a a Charles University in Prague, Faculty of Science, University Research Centre UNCE "Supramolecular Chemistry", Department of Analytical Chemistry, UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Albertov 6, Prague 2, Czech Republic, jan.fischer@natur.cuni.cz b Laboratory of Analytical Chemistry, Department of Chemistry, University of Athens, Athens 15771, Greece, aeconomo@chem.uoa.gr Abstract New electroanalytical methods for voltammetric determination of paraquat were developed using DC voltammetry (DCV) and differential pulse voltammetry (DPV) at a meniscus modified silver solid amalgam electrode (m-agsae). Optimal conditions were found in Britton-Robinson (BR) buffer ph 11 without regeneration of working electrode within the concentration range mol.l -1. Key words: Paraquat, DC voltammetry, Differential pulse voltammetry, Meniscus modified silver solid amalgam electrode Introduction Pesticides are widely used in agricultural treatments to boost productivity. Bipyridylium herbicides, mainly represented by paraquat, are commonly employed for use in nonselective weed control. Paraquat is one of the most widely used herbicides of toxicological class I in about 130 countries and also frequently used as an efficient electron transfer-reagent 1. Unfortunately, Paraquat is pesticide hazardous for human health 2. Chronic exposure to agricultural chemicals such as this pesticide has been shown to induce neurotoxic effects or to result in accumulation of various toxic metabolic products. Currently, it has been well established that in case of this pesticide chronic exposure may result in nigrostriatal neuronal damage and parkinsonian-like symptoms 3. The main objective of this work was the development of the electroanalytical procedure for the determination of paraquat using DPV on silver amalgam electrode. Heterocyclic moiety in paraquat structure is easy to reduce on surface of modern electrodes and different electrochemical methods for determination of paraquat have been proposed 4. Therefore, it is beneficial to use for determination of this substance modern nontoxic amalgam electrode, which could replace common mercury electrodes 5. Experimental A stock solutions of mol.l -1 paraquat dichloride was prepared by dissolving g of the substance (C. A. S. Registry Number: [ ]; grade PESTANAL analytical standard, Sigma-Aldrich, Czech Republic) in 50 ml of deionized water. Britton Robinson buffer was used as a supporting electrolyte. Deionized water was produced by a Milli-Q plus system. Other chemicals were obtained from Lachema Brno (Czech Republic) in p.a. purity. All the chemicals were used without any further purification. Voltammetric experiments were performed using computer controlled Eco-Tribo Polarograph. The working electrode was meniscus modified silver solid amalgam electrode (m-agsae) 5. The polished silver solid amalgam electrode was immersed into a small volume of liquid mercury and agitated for 15 seconds to form m-agsae. This process, denoted as amalgamation, was repeated every week. Before starting the experiment for each new surface of m-agsae the electrochemical activation was carried out in 0.2 mol.l -1 KCl at 2200 mv 44

47 under stirring of the solution for 300 s followed by rinsing with distilled water. Work with m- AgSAE was carried out at a scan rate of 20 mv.s -1, pulse amplitude of 50 mv, pulse duration of 100 ms, sampling time of 20 ms beginning 80 ms after the onset of the pulse and interval between pulses of 100 ms. Results and discussion The selection of suitable medium plays important rule in sensitivity and selectivity of developed voltammetric methods. Therefore, as the first step the effect of ph in range 2 12 of Britton-Robinson buffer on the voltammetric signal of paraquat was investigated. For further measurements ph 11 was used, where the substance gave two well-developed waves/peaks for both voltammetric techniques, DCV and DPV. Passivation of the working electrode surface is common problem of solid electrodes. Therefore, repeatability of measurements at m-agsae was checked. For DCV the repeatability was on acceptable level, but for DPV at ph 11 the signal of second peak was not stable for repeated measurements after the activation of the electrode (see Fig. 1). For this reason just the signal of the first peak was used for analytical application. The found optimal conditions were used for measuring of calibration dependences in the concentration range from to mol.l -1 with DCV and from to mol.l -1 with DPV. According to the obtained results, DPV seems to be more sensitive and gives more linear calibration curves then DCV, as can be seen in Table I. -90 I p, na Fig. 1. Dependence of the first (1) and the second (2) peak current of paraquat (c = 10-4 mol.l - 1 ) on serial number of repetitive measurements (N) using DPV at m-agsae in Britton- Robinson buffer ph N 45

48 Table I. Comparison of developed methods for the determination of paraquat in Britton-Robinson buffer ph 11 on m-agsae. Method Calibration range, mol.l -1 LOD, mol.l -1 DCV DPV Conclusions These newly developed methods could be applied for the determination of paraquat in simple environmental matrix such as drinking and river water. The m-agsae showed for this substance good response and acceptable reproducibility without any surface regeneration. This indicates, that m-agsae is a suitable sensor for the determination of this substance. The limit of determination was on submicromolar level for both used voltammetric techniques; sensitivity of these methods could be further increased by a preconstruction step. 3 Acknowledgements Financial support from Technology Agency of the Czech Republic (project TA ) is gratefully acknowledged. References 1. Mai N. N., Liu X. Y., Wei W. Z., Luo S. L., Liu W.: Microchim. Acta 174, 89 (2011). 2. de Souza D., Machado S. A. S., Pires R. C.: Talanta 69, 1200 (2006). 3. Karuppagounder S. S., Ahuja M., Buabeid M., Parameshwaran K., Abdel-Rehman E., Suppiramaniam V., Dhanasekaran M.: Neurochem. Res. 37, 1102 (2012). 4. Fischer J., Barek J., Dejmkova H.: Curr. Org. Chem. 15, 2923 (2011). 5. Barek J., Cabalkova D., Fischer J., Navratil T., Peckova K., Yosypchuk B.: Environ. Chem. Lett. 9, 83 (2011). 46

49 Adsorption and Two Dimensional Condensation of Cytosine Derivatives at Mercury and Gold Single Crystal Electrode Lukáš Fojt a and Thomas Doneux b a Institute of Biophysics, AS CR, v.v.i., Královopolská 135, Brno, Czech Republic, fojt@ibp.cz b Chimie Analytique et Chimie des Interfaces, Faculté des Sciences, Université Libre de Bruxelles, Boulevard du Triomphe, 2, CP 255, B-1050 Bruxelles, Belgium Abstract Nucleic acids bases are well known for their extraordinary high ability of self-association at electrodes surfaces. Formation of self assembled monolayers with specific molecular orientation two dimensional (2D) condensations is allowed by this ability. The 2D condensation of different substituents of cytosine, namely 5-fluorocytosine, 5-bromocytosine and 5-iodocytosine, was studied using hanging mercury drop and gold single crystal electrode. We have found, that all of these derivatives form 2D capacitance pits for different ph`s. Keywords: 2D Condensation, Capacitance pit, Hanging mercury drop electrode, Cytosine derivatives, Self-assembly, Gold single crystal electrode. Introduction It was found that purine and pyrimidine derivatives currently occurring in nucleic acids posses an extraordinary high ability of self-association at the electrode surface and can form there by a two-dimensional (2D) condensation a monomolecular layer 1. This property was probably significant for the origin of life at the earth 2. 2D condensation, initially observed at dropping mercury electrode 3 has been studied at different electrode surfaces, such as hanging mercury drop electrode 4, mercury film electrodes 5, or gold 6,7 and silver single crystal 8 electrodes. At mercury based interfaces, 2D condensed films are mainly studied using measurement of the differential capacitance (C d ) of the electrode double layer. When a compact film of molecules is formed, all solvent molecules are replaced from the electrode surface by the condensed molecules and the differential capacitance C d of the electrode double layer is depressed considerably, giving rise to characteristic pit in the capacitance potential curves. In the case of single crystal electrodes, the presence of 2D layer is associated with the presence of sharp spikes in the cyclic voltammograms. The formation of 2D condensed monolayers, which exhibit supramolecular organizations, is a complex mechanism driven by a long-range ordering underlain by different intermolecular interactions. These stabilization forces are mainly driven by hydrogen bonding between flat-lying adsorbates, stacking between vertically oriented molecules, dispersion and electrostatic interactions. Dipole orientation in the external electric field can lead to the reorientation of the adsorbed molecules at the electrode surface, which may lead to the formation of different 2D condensed layers depending on the electrode potential 9,10. Therefore, in our present study, the effects of different electrode surfaces, ph values and substituents on the 2D condensation of cytosine were studied. For our experiments, we used three halogen derivatives of cytosine: 5-fluorocytosine (5FC), 5-bromocytosine (5BC) and 5-iodocytosine (5IC). Experimental Electrochemical measurements were done using a conventional three electrode system with a platinum wire (diameter 1 mm) as the counter electrode and a Ag AgCl 3 M KCl reference electrode, controlled by an AUTOLAB electrochemical system PGSTAT 302 (EcoChemie, Utrecht, Netherlands) equipped with a frequency response analyzer module (FRA2). The 47

50 specific area capacitance (C d ) electrode potential (E) curves were measured (if not stated otherwise) at a scan rate of 5 mv.s 1, the frequency 37 Hz and amplitude of the sinusoidal perturbation 10 mv. A hanging mercury drop electrode (HMDE) system (Metrohm VA stand 663, Switzerland) with drop surface area of 0.4 mm 2 was used for the experiments conducted at the hanging mercury drop electrode. The gold single crystal electrode in (111) orientation (Au(111)) was grown, oriented, cut and polished using the procedure developed by Hamelin 11. Before each experiment, it was flame annealed during a few seconds and allowed to cool down just above the surface of ultrapure water. Temperature was controlled using Huber CC2 K6 thermostat. Britton Robinson buffer with 0.5 M NaCl and tri distilled water was used with the mercury working electrode, 0.1 M potassium perchlorate salt was the electrolyte used with the Au(111) working electrode. All chemicals were of the highest available purity (Sigma Aldrich, USA). Results and discussion The adsorption behavior of cytosine and some its derivatives was previously studied 4 on mercury based electrodes. These studies revealed a complex adsorption behavior at this interface, each investigated compound producing various adlayers depending on the electrode potential, ph or the concentration. Therefore, we chose all available halogen derivates of cytosine at 5 positions for our present study. Fig 1 displays all used derivates, 5-fluorocytosine, 5-bromocytosine and 5-iodocytosine at two different phs. Fig. 1A shows situation for low ph (ph = 3) and Fig. 1B for neutral ph. Concentrations of all derivatives were close to their saturation concentrations. All the derivates are able to condensate at low ph, whereas the condensation ability of 5FC at neutral ph was not observed. In acidic medium, the three derivatives form a condensed adlayer at potentials slightly more negative than the point of zero charge of the mercury electrode ( 0.45 V). This fact suggests that the pit is stabilized at slightly negatively charged electrode by positively charged adsorbates. Only 5FC is able to form a second adlayer more negatively (around E = -1.2 V to -1.4 V). This 2D condensed pit is observable only at high ac perturbation frequencies around 10 khz where the faradaic signal from 5FC reduction is minimized. Interestingly, this pit is very probably formed due to dipole orientation at very negative potentials. All other observed 2D pits seem to be stabilized by dispersion forces and hydrogen bonding should be considered, as well as electrostatic interactions. The relative amplitude of each contribution strongly depends on the ph. 2D condensation could be observed at single crystal electrodes. In our case, we used Au(111) single crystal electrode. Fig. 2 shows the behavior of the three cytosine derivatives at this surface using cyclic voltammetry. Unfortunately, due to the huge reduction peak of 5IC (blue curve on Fig. 2), we were not able to detect any sign of 2D condensation on Au(111). For the other compounds, some region of interest on the cyclic voltammograms could be recognized according to the literature 8. Region I was assigned to a disordered, gaslike adsorption of the molecule. Charge transfer takes place in the electrode potential Region III, corresponding to the transition from a physisorbed layer to a chemisorbed layer. In Region IV is this layer compact. Sharp spikes corresponding to formation of adsorbed layer could be observed on of the negative-going sweep for 5BC (E = -0.4 V), and in both scanning directions around E = -0.6 V in the case of 5FC. These spikes are of particular interest since their presence reflects a phase transition between the dilute adlayer in Region I and a 2D condensed layer in Region II. 48

51 Fig. 1. Differential capacitance - potential curves of 5-cytosine derivatives at different ph s and close to their saturation concentrations, hanging mercury drop electrode, T = 278 K. Grey chain line electrolyte (BR buffer with 0.5 M NaCl addition); red dashed line 45 mm 5- fluorocytosine, ac frequency 9943 Hz; blue dotted line 3 mm 5-iodocytosine; green solid line 10 mm 5-bromocytosine. Fig. 1A displays situation at ph = 3, Fig. 1B. ph = j / A.cm I II III IV ,7-0,3 0,1 0,4 E (vs. Ag AgCl) / V Fig. 2. The plot of current density, j, as a function of electrode potential, E, for Au(111) in the presence of 10 at 298 K in an electrolyte (0.1 M KClO 4 grey chain line). Red dashed line 10 mm 5-fluorocytosine; blue dotted line 3 mm 5-iodocytosine; green solid line 10 mm 5-bromocytosine. Scan rate υ = 20 mv s 1. For different region descriptions see the text. 49

52 Conclusion We found that all used halogen derivatives of cytosine are able to undergo 2D condensation on hanging mercury drop and gold single crystal electrode. We found interesting effect of ac perturbation frequency on measurement of 5FC, where the 2D condensed layer is while measured at lower frequencies hidden under faradaic signal of 5FC reduction. Acknowledgement This work was supported by Czech Science Foundation (Grant P205/10/2378, P206/12/G151 and P206/12/2378). References 1. Vetterl V.: Collect. Czech. Chem. Commun. 31, 2105 (1966). 2. Sowerby S.J., Cohn C.A., Heckl W.M., Holm N.G.: Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98, 820 (2001). 3. Buess-Herman, C.: Prog. Surf. Sci. 46, 335 (1994). 4. Fojt L., Vetterl V., Doneux T.: Collect. Czech. Chem. Commun. 74, 1611 (2009). 5. Hasoň S., Simonaho S. P., Silvennoinen R., Vetterl V.: Electrochim. Acta 48, 651 (2003). 6. Scharfe M., Hamelin A., Buess-Herman C.: Electrochim. Acta 40, 61 (1995). 7. Doneux T., Fojt L.: ChemPhysChem 10, 1649 (2009). 8. Hö1zle M. H., Krznaric D., Kolb D. M.: J. Electroanal. Chem. 386, 235 (1995). 9. Fojt L., Vetterl V., Doneux T.: Bioelectrochemistry 75, 89 (2009). 10. Fojt L., Doneux T., Vetterl V.: Electrochimica Acta 73, 141 (2012). 11. Hamelin A.: Modern Aspects of Electrochemistry, vol.16, pp Plenum Press. New York

53 Electrochemical Synthesis of Ferrates(VI) in Molten NaOH Miroslav Gál, Lucia Hrnčiariková, Kamil Kerekeš, and Ján Híveš Department of Inorganic Technology, Faculty of Chemical and Food Technology, Slovak University of Technology in Bratislava, Radlinského 9, Bratislava, Slovakia, Abstract Cyclic voltammetry and electrochemical impedance spectroscopy were used to study ferrate(vi) synthesis in the molten sodium hydroxide at pure iron (Fe), silicon-rich steel (FeSi) and white cast iron (FeC) electrodes. Transpassive iron dissolution, including ferrate(vi) production together with massive oxygen evolution occurs after passivity region. Impedance data confirm model of the polarized interphase based on the concept of two macro-homogeneous sublayers. Parameters of equivalent circuit confirm that layers are getting thinner or more disintegrated by strong anodic dissolution and/or massive oxygen evolution. The number of exchanged electrons during ferrate(vi) formation reaction was z = 3 for all electrode materials used. Key words: Ferrate(VI), Impedance spectroscopy, Sodium Hydroxide melt, Anodic dissolution, Electrochemical synthesis. Introduction Electrochemical DC (direct current) and AC (alternating current) techniques are suitable for interfacial and metal dissolution studies in both aqueous and molten solutions Iron is typically found as ferrous(ii) and ferric(iii) ions. However, other not very stable states have been also observed, e.g. ferrate(vi) 17. Stahl prepared K 2 FeO 4 by oxidation of iron filings in molten KNO 3 in Fremy assumed that the violet color of this product was caused by the presence of Fe VI O 3 -II 17. Poggendorf in , 18 electrochemically prepared ferrates(vi) by anodic oxidation of iron in alkaline electrolyte. High oxidation potential of ferrates(vi) allows the decomposition even very stable chemical and biological contaminants. Moreover, Fe(OH) 3, product of ferrate(vi) reduction does not burden the environment, is non-toxic and is excellent coagulant and flocculant. In most cases, ferrates(vi) provides a complete degradation of the pollutant without harmless by-products 19. Therefore, it can be nominated as a green environmental friendly oxidant 20. Another utilization of ferrates(vi) is in organic synthesis, especially for the selective oxidation of primary and secondary alcohols to aldehydes and ketones 21. In the field of the corrosion protection, ferrates(vi) are used for passivation of aluminum, zinc and iron products, or to dissolve resistant layer of deposits 17. Three methods of ferrates(vi) synthesis are listed in literature 17 : dry oxidation, wet oxidation and electrochemical preparation. During dry oxidation iron or iron oxide is heated to a high temperature in the melt of alkali metal compounds. A principle of wet oxidation is absorption of chlorine in solution of concentrated sodium hydroxide and subsequent reaction of the resulting hypochlorite ferric ion to form ferrates(vi). Electrochemical method is based on anodic oxidation (dissolution) of iron or cast iron in concentrated hydroxide solutions or melts. In the case of a melt suitable temperature for ferrates(vi) synthesis is up to 200 ºC. In water solutions the typical temperature range is from 20 to 70 C 17. Electrochemical method produces high purity ferrates(vi). Stability of ferrate(vi) in the presence of water remains the weak point of electrochemical approach. Even a small amount of water decomposes ferrate(vi) within hours. An 51

54 electrochemical treatment of iron in low-temperature binary hydroxide melt, e.g. KOH-LiOH, NaOH-KOH, CsOH-LiOH, KOH-RbOH has been proposed for ferrates(vi) preparation to increase their stability 22. Additionally, reaction rate can be easily and continuously controlled by adjusting temperature in order to achieve the optimum anodic dissolution conditions. Híveš et al. 22 reported the minimal thermal decomposition of ferrates(vi) during their electrochemical preparation. Ferrates(VI) formation can be detected easily by observing color change of the electrolyte. Titration, chemical precipitation, spectral and electrochemical methods can be used for the quantitative determination of ferrates(vi) concentration 21. This contribution describe the preparation of ferrates(vi) by transpassive dissolution of pure iron (Fe), silicon-rich steel (FeSi) and white cast iron (FeC) electrodes in the molten sodium hydroxide. Experimental An oil thermostat with calibrated sensor, stainless steel box and PTFE crucible with sodium hydroxide (p.a., Mikrochem Ltd. Pezinok, Slovakia) was used for our experiments. Reference connection of thermocouple was immersed in a Dewar flask with ice-water. Electrochemical measurements were performed using a three-electrode electrochemical system and PGSTAT 20 with FRA2 module (ECO Chemie, The Netherlands). Working electrodes (WE) were made from: pure iron (Fe) (99.95 wt.% Fe, wt.% C, wt.% Ni and wt.% Mn), silicon steel (FeSi) (3.17 wt. % Si, 0.47 wt.% Cu, 0, 23 wt.% Mn, 0.03 wt.% Ni), and white cast iron (FeC) (3.17 wt.% C in the form of Fe 3 C, 0.44 wt.% Mn and wt.% Ni). The geometric area of the working electrodes varied from 0.2 to 0.7 cm 2. The same material served as the reference electrode (RE). Counter electrode (CE) was made from mild steel (steel class 11). The temperature was varied in the range 70 ºC to 160 ºC. The lower temperature was limited temperature of eutectic NaOH-NaOH.H 2 O which is 62.5 C at the composition of 74 wt. %. Impedance measurements were carried out in the same systems immediately after CV measurements. Frequency range used for the impedance measurements was from 10 Hz to 100 khz. Perturbation signal had a sinusoidal shape with amplitude of 5 mv. Results and discussion In Fig. 1 cyclic voltammograms of Fe, FeSi and FeC electrodes in the molten NaOH at 80 C are plotted. All curves are characterized by the presence of several anodic and cathodic current peaks. On the anodic part of the cyclic voltammograms two, well separated, current peaks A(I) and A(II) are observed. Peak A(I) corresponds to the Fe(II) formation according to equation: Fe 2OH - Fe(OH) 2 2e - (1) Further oxidation process (A(II) peak) can be described as follows: Fe(OH) 2 OH - Fe(OH) 3 e - (2) Fe(OH) 2 OH - FeOOH H 2 O e - (3) 2Fe(OH) 2 2OH - Fe 2 O 3 3H 2 O 2e - (4) 52

55 40 A(I) j / ma cm C(II) A(II) A(IIa) C(III) 250 A(IIb) -20 j / ma cm A(III) -40 C(I) E / V E / V Fig. 1. Cyclic voltammograms of pure iron (solid line), FeSi (dashed line), and FeC (dotted line) WE at t = 80 C; v = 400 mv s -1 ; arrows indicate the potential sweep direction. Nonstochiometric species similar to the magnetite with good protecting properties are probably also formed. Due to its specific insulating properties and some kinetic limitation of such process current peak A(II) is less pronounced than A(I) one 4. The higher is the temperature the higher current densities are observed. At 120 C A(I) and A(II) peaks are not well separated and at 160 C they form single doubled-peak. In the passivity region at about 850 mv vs. RE broad, not perfectly visible current peak A(IIb) is observed. This peak, together with peak A(IIa), is assigned to the restructuring, formation and/or transformation of an anodic solid surface layer. After passivity region a transpassive iron dissolution, together with ferrate(vi) formation (current peak/shoulder A(III)) and oxygen evolution occurs. A hysteresis in the course of voltammetric curve in the transpassive potential region was observed. It is probably connected with either diminution of an inhibition of electrode surface toward dissolution at high potentials or massive oxygen evolution causing the mechanical disruption of the anode surface. In the cathodic direction a peak corresponding to ferrates(vi) reduction (peak C(III)) occurs. Compare to all faradaic anodic peaks, this one is badly pronounced. Other cathodic peaks (C(II) and C(I)) are assigned to the reduction of Fe(III) to Fe(II) and Fe(II) to Fe(0), respectively. Linear dependences of current density on square root of scan rate were found indicating that the electrode reaction kinetic is controlled by mass transport under the semi-infinitive linear diffusion conditions. In the case of FeC electrode, current density at high temperature after reaching a certain maximum at about mv s -1 decreases with increasing polarization rate. It seems, that a chemical step become rate determining when scan rate reach ca. 400 mv s -1. Our observation is in agreement with previous results in the hydroxide melts 22 and strong alkaline aqueous solutions In order to deeply characterize ferrate(vi) electrochemical synthesis EIS was used. An example of impedance spectra obtained for pure iron (Fe) electrode at several potentials is shown in Fig

56 -Z" / Ohm -Z" / Ohm Z' / Ohm Z' / Ohm Fig. 2. Nyquist plots of impedance spectra for pure iron (Fe) electrode at t = 150 C and at chosen potentials vs. RE: 1.4 V; 1.5 V; 1.6 V. Two time constants are recognized. The electrochemical behavior of electrodes in molten NaOH was modeled according proposed equivalent circuit. The physical model based on the concept of two macrohomogeneous surface layers was used to find the best equivalent circuit representation of our results. Two parallel R-Q (constant phase element) impedance elements characterizing individual layers (inner, outer) connected in series together with one resistant (R S ) and one inductance (L) element compose the simplest equivalent circuits that fit our experimental data with acceptably low χ 2. Constant phase element (Q) was used instead of pure capacitance element (C) to underline the nonlinearity of the dissolution process. Resistances of both inner and outer layer decrease with increasing applied potential, therefore either both layers are getting thinner with increasing potential or disintegrate by strong anodic potential and/or an oxygen evolution. Resistance of outer layer is lower than resistance of inner one. The capacitances of inner and outer layer increase with increasing potential. Capacity of inner layer is slightly lower than capacity of outer one. This is in agreement with resistances measurements meaning that inner layer is either thicker and/or more compact than outer one. Additional information can be gained from n parameter of constant phase element. In the case of outer layer n decreases almost ideal behavior to imperfect one with increasing applied potential. This means the quality of the outer layer is changing and the specific surface is increasing and is getting more porous. Bearing in mind the previous conclusions about R out and Q out, one should think about the disintegration of the outer layer rather than reduction in its thickness. n inn is almost unchanged for all potential applied. Therefore, the conclusions made for R inn and Q inn are connected to the reduction in thickness of the inner layer rather than its disintegration. The number of electrons was calculated from the slope of the dependence of the current densities on potentials in ferrate(vi) formation region (static polarization curve). This analysis gave number of electrons z 3 for all electrodes. Acknowledgements The authors gratefully acknowledge the financial support for this research by the Ministry of Education, Science, Research and Sport of the Slovak Republic within project 54

57 VEGA 1/0985/12 and by the Research & Development Operational Program funded by the ERDF within project ITMS References 1. Bouzek K., Flower L., Roušar I. and Wragg A. A.: J. Appl. Electrochem. 29, 569 (1999). 2. Bouzek K. and Roušar I.: J. Appl. Electrochem. 23, 1317 (1993). 3. Dytrtova J. J., Jakl M., Schroder D. and Navratil T.: Curr. Org. Chem. 15, 2970 (2011). 4. Hives J., Benova M., Bouzek K., Sitek J. and Sharma V. K.: Electrochim. Acta 54, 203 (2008). 5. Naumowicz M., Petelska A. D. and Figaszewski Z. A.: Electrochim. Acta 54, 1089 (2009). 6. Naumowicz M., Petelska A. D. and Figaszewski Z. A.: Cell Biochemistry and Biophysics 61, 145 (2011). 7. Naumowicz M., Petelska A. D. and Figaszewski Z. A.: Steroids 76, 967 (2011). 8. Novotny L., Navratil T., Sander S. and Basova P.: Electroanalysis 14, 1105 (2002). 9. Novotny L., Navratil T., Sander S. and Basova P.: Electroanalysis 15, 1687 (2003). 10. Petelska A. D., Naumowicz M. and Figaszewski Z. A.: Langmuir 28, (2012). 11. Sestakova I. and Navratil T.: Bioinorganic Chemistry and Applications 3, 43 (2005). 12. Huskova R., Matisova E., Svorc L., Mocak J. and Kirchner M.: J. Chromatogr. A 1216, 4927 (2009). 13. Mackulak T., Olejnikova P., Prousek J. and Svorc L.: Chemical Papers 65, 835 (2011). 14. Svorc L., Sochr J., Svitkova J., Rievaj M. and Bustin D.: Electrochim. Acta 87, 503 (2013). 15. Svorc L., Sochr J., Tomcik P., Rievaj M. and Bustin D.: Electrochim. Acta 68, 227 (2012). 16. Svorc L., Tomcik P., Svitkova J., Rievaj M. and Bustin D.: Food Chem. 135, 1198 (2012). 17. Macova Z., Bouzek K., Hives J., Sharma V. K., Terryn R. J. and Baum J. C.: Electrochim. Acta 54, 2673 (2009). 18. Poggendorf J. C.: Pogg. Ann. 54, (1841). 19. Licht S., Yang L. and Wang B. H.: Electrochem. Commun. 7, 931 (2005). 20. Sharma V. K.: Advances in Environmental Research 6, 143 (2002). 21. Delaude L. and Laszlo P.: J. Org. Chem. 61, 6360 (1996). 22. Hives J., Benova M., Bouzek K. and Sharma V. K.: Electrochem. Commun. 8, 1737 (2006). 23. Macova Z. and Bouzek K.: J. Appl. Electrochem. 41, 1125 (2011). 24. Macova Z. and Bouzek K.: J. Appl. Electrochem. 42, 615 (2012). 25. Macova Z., Bouzek K. and Sharma V. K.: J. Appl. Electrochem. 40, 1019 (2010). 55

58 Carbon Fiber Microelectrodes Modified by Silver for Determination of Hydrogen Peroxide Vladimir Halouzka a,b, Petr Jakubec a, Jan Hrbáč a, and Libuše Trnková b a Department of Physical Chemistry, Palacký University, tr. 17. listopadu 12, Olomouc, Czech Republic, vladimir.halouzka@upol.cz b Department of Chemistry, Masaryk University, Kamenice 5, Brno, Czech Republic Abstract Carbon fiber microelectrodes coated with a silver and Nafion layers constitute sensitive H 2 O 2 sensors. The silver at the electrode is composed of porous, partially aggregated and crystalline deposits of silver nanoparticles. A wide concentration range (from 1x10 5 up to 0.1 M H 2 O 2 ) is achieved when using amperometry in stirred solution at 0 mv (vs. Ag/AgCl). Key words: Carbon fiber microelectrode, Silver, Sensor. Introduction Electrodes containing silver nanoparticles as an active material have recently gained a great deal of interest as sensors for H 2 O 2 amperometric determination in the cathodic region of potentials (e.g. 1, 2 ). A one approach to achieve nanostructuring of the electrode surface is the electrodeposition from the mixture of target metal salt and a suitable structure directing agent. This technique was first described by Evans et al. 3 who prepared platinized platinum electrode from the aqueous solution containing K 2 PtCl 6 and octaethyleneglycol monohexadecyl ether. In this contribution we have found that Pluronic F127 is an effective structure directing agent for coating carbon fiber microelectrode with silver. The properties of the electrode prepared this way are presented. Experimental Microelectrode fabrication Carbon fiber (diameter 7 μm, Ten Cate Advanced Composites, Amsterdam, The Netherlands) is glued using conductive silver epoxy (Epotek H20E, Polytec, Germany) onto copper wire, the junction is then cured at 170 C for 10 min. The fiber with copper contact attached is fitted into the glass capillary, about 5 mm of the fiber is left protruding from its contracted end. Both sides of the capillary (fiber and wire) are glued using epoxy resin (CHS Epoxy 1200, Sindat Pilsen, Czech Republic). Prior to use, the protruding fiber is cut to the length of approx. 1 mm by lancet, the fiber end of the electrode is briefly sonicated in dichloromethane in order to remove grease. Microelectrode coating and sensor testing For electrochemical measurements the CH Instruments 660C workstation with Pt wire as an auxilliary, Ag/AgCl as a reference and microelectrode sensor as a working electrode. Amperometry in stirred solution was used to test the microelectrode sensors. H 2 O 2 aliquots were introduced into the cell using an autosampler. For testing the selectivities of the sensor, aliquots of selected interference compounds were introduced into the cell using Hamilton microsyringes. Results and Discussion In our efforts to find optimum coating method, we tested a range of surfactants including Pluronic F127, which proved itself to be an optimum structure tuning agent. The electrodeposition of silver onto carbon fiber was therefore performed from 0.08 M silver nitrate solution containing 25 % of Pluronic F127 at 300 mv vs. Ag / AgCl for 60 sec in quiescent solution, amperogram recorded during electrodeposition processes is shown in Fig. 1. The electrodes were then covered with Nafion using a dip dry (1h at 80 C) method. 56

59 I ( A) I ( A) Amperometric curves for H 2 O 2 reduction are shown in Fig. 2 for two operational potentials, calibration curve for H 2 O 2 determination on silver coated carbon fiber electrode using constant potential amperometry in stirred solution at 0 mv vs. Ag/AgCl is shown in Fig. 3. When the electrode is biased at 0 mv, a broad usable concentration range is achieved, at the expense of some current sensitivity. Fig. 1. Amperogram recorded during electrodeposition processes of silver, deposition from AgNO 3 (0.08 M) in the presence of Pluronic F127 (25 % (w/w)) Time (s) Fig. 2. Amperometric response curves of carbon fiber microelectrodes covered with silver and Nafion at 400 mv (left axis) and 0 mv (right axis) in stirred BR buffer (PH=7), each addition corresponded to 1 mm H 2 O 2. 57

60 I ( A) I ( A) 4 3 r 2 = 0, r 2 = 0, c H 2 O 2 (mm) Fig. 3. Calibration curve for H 2 O 2 determination on silver coated carbon fiber electrode using constant potential amperometry in stirred solution at 0 mv vs. Ag/AgCl. As the potential employed (0 mv) is less cathodic than 400 mv used by most of the authors working in the field could make the measurement susceptible to interferences by easily oxidizable compounds, we tested representative species for interferences. We have found that ascorbic acid, uric acid and acetaminophen do not produce significant response, shown in Fig hydrogen peroxide 0.20 buffer uric acid 0.15 ascorbate acetaminophen Time (s) Fig. 4. Amperometric measurement performed at ph 7 in stirred solution with silver coated carbon fiber electrode biased at 0 mv vs. Ag/AgCl. Ascorbate, uric acid, acetaminophen and hydrogen peroxide. 58

61 Conclusion We have shown that carbon fiber coated with a silver layer electrodeposited from silver nitrate / Pluronic F127 solution and subsequently stabilized by Nafion layer can be used as sensor for hydrogen peroxide amperometric monitoring. Acknowledgement Financial support from the "Postdoc I", reg. No. CZ.1.07/2.3.00/ (The project is cofinanced by the European Social Fund and the state budget of Czech Republic) is gratefully acknowledged. References 1. Guascito M. R., Filippo E., Malitesta C., Manno D., Serra A., Turco A.: Biosens. Bioelectron. 4, 24 (2008). 2. Welch C. M., Banks C. E., Simm A. O., Compton R. G.: Anal. Bioanal. Chem. 1, 382 (2005). 3. Evans S. A. G., Elliott J. M., Andrews L. M., Bartlett P. N., Doyle P. J., Denuault G.: Anal. Chem. 6, 74(2002). 59

62 Electroanalytical Methods Sensitive Tools for DNA Structure Transitions Analysis (Elektroanalytické metody citlivé nástroje pro analýzu strukturních přechodů DNA) Luděk Havran a, Pavlína Vidláková a, Hana Pivoňková a, Iva Kejnovská a, Michaela Vorlíčková a, Libuše Trnková b, and Miroslav Fojta a a Institute of Biophysics, AS CR, v.v.i., Královopolská 135, Brno, Czech Republic, raven@ibp.cz b Department of Chemistry, Faculty of Science, Masaryk University, Kamenice 5, Brno, Czech Republic Abstract The nucleic acids, depending on their nucleotide sequences, can exhibit a variety of conformational transitions and adopt different secondary structures such as hairpins, triplexes, left-handed Z-DNA or quadruplexes. Nucleic acids are electroactive species producing set of intrinsic voltammetric signals at different types of working electrodes. Some of these are sensitive to DNA structure changes. In this contribution we studied influence of forming of G- quadruplexes on electrochemical behavior synthetic ODN at mercury and carbon electrodes. Key words: DNA structure transitions, DNA secondary structures, G-quadruplex, Electroanalytical methods, Mercury electrodes, Carbon electrodes. Úvod Konformace DNA a její změny jsou biologicky významné a hrají důležitou roli v některých onemocněních způsobených genetickými poruchami nebo poškozením DNA. Nukleové kyseliny mohou v závislosti na jejich nukleotidové sekvenci a vnějších podmínkách zaujímat různé sekundární struktury, jako jsou například vlásenky, DNA triplexy, křížové struktury nebo G-tetraplexy 1. Tyto sekundární struktury se také vyskytují v přirozené DNA, kde jsou stabilizovány negativním nadšroubovicovým vinutím 2. Jedním z nástrojů pro studium těchto jevů jsou i elektroanalytické techniky. DNA je přirozeně elektroaktivní látka poskytující řadu vlastních elektrochemických signálů na různých typech pracovních elektrod 3. Některé z těchto signálů, především na rtuťových elektrodách, jsou velmi citlivé ke změnám struktury DNA. V tomto příspěvku budou prezentovány výsledky studia elektrochemického chování syntetických oligonukleotidů (ODN) tvořících G-tetraplexy na rtuťových a uhlíkových elektrodách. Experimentální část Použité ODN byly zakoupeny od firmy VBC-Biotech Service GmbH (Rakousko). Všechna elektrochemická měření byla prováděna pomocí potenciostatu/galvanostatu Autolab (Metrohm-Autolab, Holandsko) a elektrodového systému 663 VA-stand (Metrohm, Švýcarsko) v tříelektrodovém zapojení. Jako referenční elektroda byla použita Ag/AgCl/3M KCl a jako pomocná elektroda platinový drát. Jako pracovní elektroda byla použita visící rtuťová kapková elektroda (HMDE) anebo elektroda z pyrolytického grafitu (PGE). Elektrochemická měření byla prováděna adsorptivní přenosovou rozpouštěcí cyklickou voltametrií (AdTS CV), adsorptivní přenosovou rozpouštěcí voltametrií s vnuceným pravoúhlým napětím (AdTS SWV) a adsorptivní přenosovou rozpouštěcí voltametrií s vnuceným střídavým napětím (AdTS ACV). Výsledky a diskuse Zbytky bází DNA podléhají redukci při dostatečně negativních potenciálech na HMDE. Cytosin a adenin poskytují při katodickém scanu společný redukční signál pík CA 3. K redukci guaninového zbytku dochází při velmi negativních potenciálech (negativnějších 60

63 I [ A] než -1,6 V), kdy je proud způsobený touto redukcí překryt proudem spojeným s vylučování vodíku z roztoku základního elektrolytu. Pokud použijeme CV, pak můžeme v následném anodickém scanu naměřit voltametrický signál příslušející oxidaci redukčního produktu guaninu 7,8-dihydroguaninu zpět na guanin (pík G) 4. CA pík je citlivý ke změnám ve struktuře DNA a lze jej použít k rozlišení jednořetězcové DNA (ssdna) od dvouřetězcové (ds DNA) formy DNA. Použijeme li fázově citlivou ACV, můžeme na HMDE naměřit tenzametrické signály DNA (způsobené adsorpcí/desorpcí nebo reorientací DNA na povrchu HMDE). Ty mohou být například použity pro analýzu strukturních přechodů plasmidové DNA, kdy lze rozlišit superhelikální nadšroubovicovou DNA od otevřené kružnicové formy DNA (Obr. 1.). Další aplikací těchto signálů jsou pak elektrochemické senzory poškození DNA sc DNA 2 oc DNA 3 ss DNA E [V] Obr. 1. AdTS ACV záznamy různých forem DNA na HMDE. Frekvence 230Hz, E i = -0,6 V, E end = -1,6 V, t a = 60s, elektrolyt: 0,3M NaCl + 50mM Na 2 HPO 4. G bohaté ODN mohou za určitých podmínek tvořit čtyřřetězcové struktury stabilizované guaninovými tetrádami guaninové tetraplexy 6. Na HMDE a PGE byla studována série ODN obsahujících oligo G úsek se vzrůstajícím počtem G (0-15). Pokud byly tyto ODN analyzovány na PGE, voltametrický pík oxidace guaninu (G ox ) lineárně rostl se zvyšujícím se počtem guaninových zbytků v molekule ODN (Obr. 2). Naproti tomu pík G měřený na HMDE vykazuje v závislosti na počtu guaninových zbytků maximum (Obr. 2). Toto maximum, pro ODN obsahující 5 guaninových zbytků, koreluje s výsledky měření spekter cirkulárního dichroismu. Pomocí této metody byla potvrzena tvorba guaninového tetraplexu s paralelním uspořádáním řetězců u ODN s oligo G úsekem o délce 5 a více guaninových zbytků. Během strukturního přechodu tvorby tetraplexu pravděpodobně dochází ke změnám v dostupnosti guaninových zbytků pro interakci s pracovní elektrodou a tudíž k poklesu píku G s rostoucí počtem G v molekule ODN. Se vzrůstajícím počtem G navíc dochází také ke změnám, které mohou mít vliv na pokles píku G na HMDE. e 61

64 G Ip[ A] G ox Ip[ A] počet G 0 Obr. 2. Závislost výšky píku G ( ) a píku G ox ( ) na počtu guaninových zbytků v molekule ODN. Závěr Experimenty na HMDE a PGE byla jasně dokumentována aplikace elektroanalytických metod jako nástrojů pro detekci a analýzu strukturních přechodů DNA. Především rtuťové pracovní elektrody jsou, vzhledem ke svým specifickým vlastnostem, pro tyto účely vhodné. Poděkování Tato práce vznikla s podporou projektů GAČR (P206/12/2378, P206/12/G151) a projektu OPVK CZ.1.07/2.3.00/ Literatura 1. Blackburn G. M., Gait M. J.: Nucleic acids in chemistry and biology. Oxford university press, Oxford, Paleček, E.: Crit. Rev. in Biochem. Mol. Biol. 26, 151 (1991). 3. Paleček E., Bartošík M.: Chemical Reviews 112, 3427 (2012). 4. Studničková M., Trnková L., Zetěk J., Glatz Z.: Bioelectrochem. Bioenerg.21, 83 (1989). 5. Fojta M.: Electroanalysis, 14, 1449 (2002). 6. Phan A. T., Kuryavyi V., Patel D. J.: Curr. Opin. Struct. Biol. 16, 288 (2006). 62

65 Continuous Glucose Monitoring by Real Time Sensor in Interstitial Fluid (Kontinuální monitoring glukózy pomocí Real Time Sensoru v intersticiální tekutině) Šárka Honsová a and Tomáš Navrátil b a Charles University in Prague, Faculty of Physical Education and Sport, José Martího 31, Prague 6, Czech Republic, honsova@ftvs.cuni.cz b J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of the AS CR, v.v.i., Dolejškova 3, Prague 8, Czech Republic, navratil@jh-inst.cas.cz Abstract The aim of this contribution is to compare the differences between accuracy claimed by the manufacturer in continuous glucose monitoring using the MiniMed Paradigm REAL-Time system with the results obtained in a patient during physical activity. Electrochemical glucose sensor measures the glucose oxidase reaction products. Measurement accuracy was determined using Clarke Error Grid analysis. It can be concluded that in the normal glucose range (4.4 to 10.0 mmol/ l) was more accurate than the measurements given by the manufacturer, in the opposite case; hyperglycemia is less precise than declared. Key words: Continuous Glucose monitoring, Continuous Glucose Error Grid Analysis, Glucose Oxidase response. Úvod Diabetes mellitus (dále DM) je chronické metabolické onemocnění. V současnosti je v České republice evidováno cca 8 % populace jako diabetici. V roce 2011 to bylo DM 2, DM 1, Sekundární diabetes 1. Člověk bez klinických obtíží má koncentraci glukózy v krvi (glykemie) za fyziologických podmínek v rozmezí hodnot 3,9 5,6 mmol/l nalačno a po jídle nižší než 10 mmol/l. Podrobné hodnoty a způsoby stanovení jsou zpracovány v literatuře 2. Kontinuální monitoring glykémie (CGM) je zejména u diabetiků 1. typu základní možností zlepšení stavu a kvality života 3. Pro dobrou kompenzaci si diabetici 1. typu mají měřit glykemii nejméně 4x denně. CGM je založen nejčastěji na elektrochemickém principu, u některých typů senzorů se provádí měření na mikrodialyzačním principu nebo na principu reverzní iontoforézy, na fluorescenčním nebo viskozimetrickém principu, nově na principu Ramanovy spektroskopie 4, 5. Nejčastěji používané CGM fungují na principu jehlového senzoru, který elektrochemicky měří produkty glukózooxidázové reakce. V ČR jsou to senzory firmy Medtronic a DexCom. Senzor je převážně tvořen platinovou elektrodou povlečenou glukózooxidázou, ta je pak překryta semipermeabilní membránou. Po jejím zavedení do podkoží je senzor zvlhčen intersticiální tekutinou a následně se začíná inicializovat. Senzor vyžaduje cca dvouhodinovou inicializaci, pak generuje stabilní elektrický proud v rozsahu na. Tato hodnota převážně přímo úměrná koncentraci glukózy v podkoží. Glukóza a kyslík z intersticiální tekutiny difundují přes semipermeabilní membránu a reagují s glukózooxidázou na povrchu elektrody senzoru za vzniku peroxidu vodíku a kyseliny glukonové. Peroxid vodíku pak difunduje až na elektrodu, kde vlivem napětí dochází k jeho rozkladu na vodík a kyslík; přenesené elektrony vytvářejí elektrický signál ISIG (Input Signal of Glucose) a tento signál je úměrný koncentracím glukózy 2,2-22,2 mmol/l 6.. Pomocí Minilinku každých 10 sekund odesílá senzor hodnotu generovaného proudu i napětí do monitoru (pumpy). V pumpě je 1 x 5 minut vypočítávána průměrná hodnota z 30 měření, tu si pumpa uloží do paměti a zobrazuje uživateli. Za 24 hodin se do monitoru uloží 288 hodnot koncentrace glukózy 7. Glukometry se řídí ISO 15197:2003 8, ta udává, že 95 % změřených výsledků musí být v rozmezí ±20 % od skutečnosti v hodnotách glykémie nad 4,17 mmol/l. a odchylku maximálně 63

66 0,83 mmol při glykemii pod 4,17 mmol/l. Pro CGM jsou podobné standardy ve vývoji a neexistuje platná shoda na metodě hodnotící přesnost systémů CGM. Nejčastěji jsou využívány matematické metody lineární regrese, chybové analýzy a střední absolutní odchylky senzoru proti odpovídající referenční hodnotě měřené glukometrem. Nejpoužívanější metodou je Clarkova chybová analýza využívající vztahu senzorem měřených hodnot proti analyzátoru. Přesnost metody je závislá na tom, ve kterých čtvercích se body nacházejí, nejvyšší přesnost má metoda s maximem hodnot ve čtvercích A a B. Pokud se naměřené hodnoty dostanou do zón D a E, jedná se o klinicky nepoužitelnou metodu 9. Každý senzor má svou životnost ta se odvíjí od zánětlivé odpovědi na přítomnost senzoru v těle, životnosti jeho baterií, rychlostí degradace enzymu i vlastní elektrody, tvorby biofilmu a mnoha dalších faktorů. Hlavními faktor životnosti a přesnosti senzoru jsou zánět v oblasti vpichu senzoru a tvorba biofilmu. Vyvíjejí se tedy tzv. modifikátory tkáňové odpovědi, jimiž bývá potažen povrch senzoru. Nejčastěji dexamethason, vazodilatační oxid dusnatý, VEGF, antikoagulanty a další. Cílem této práce bylo navázat na předchozí měření 10 a porovnat větší množství vzorků zejména při fyzické zátěži a srovnat přesnost měření CGM versus glukometr uváděnou výrobcem. Experimentální část Do porovnání byly zařazeny vzorky jednoho pacienta a pro všechna měření byly použity dva Minilinky (transmiter). Ve třetině sledovaného období byla provedena výměna inzulínové pumpy, dle technických informací výrobce 11 inzulínová pumpa přesnost kontinuálního měření glykémie neovlivňuje. Data pocházejí z CGM získaná v průběhu čtyř let, celkem bylo využito 48 kontinuálních glukózových senzorů MMT-7002 a provedeno celkem 672 kalibrací senzoru. Došlo k vyřazení všech měření, která neměla dobu mezi posledním stanovením glykémie MMT a kalibračním měřením glukometrem Freestyle mini kratší než 10 min. (7,6 %) Do zpracování postoupilo 621 párů hodnot glykémie (senzor glukometr). Měření byla převážně prováděna při zvýšené fyzické zátěži při sportu a při nestandardních situacích, když se nedařilo dosáhnout cílových hodnot glykémie. Pacientova hladina glykovaného hemoglobinu (HbA1c) se v rámci celého sledovaného období vešla do intervalu 4,8 5,4 %. Referenční hodnoty k CGM byly pořízeny glukometrem Freestyle mini firmy Abbott, ten pracuje na principu elektrochemického coulometru. Měří se výsledný náboj anody, ten je úměrný množství glukózy v původním vzorku. Dle studie Institut für Diabetes-Technologie Forschungs - und Entwicklungs Gesellschaft mbh mají tyto glukometry přesnost % 7. Celková odchylka byla pro tento případ definována jako rozdíl mezi hodnotami glykémie zjištěnými senzorem a glukometrem. Shoda mezi párovanými hodnotami byla určena jako rozdíl mezi hodnotou naměřenou senzorem a hodnotou naměřenou glukometrem. Rozdíl je procento hodnoty glukometru (střední absolutní odchylka v procentech). Přesnost měření senzorů byla hodnocena prostřednictvím metody Clarkovy analýza chybové mřížky, protože tato metoda byla užita výrobcem 11. Pomocí Clarkovy analýza chybové mřížky u CG-EGA continuous glucose-error grid analysis byly analyzovány hodnoty primární metody glykémie ze senzoru MMT-7002 a referenční metody glukometru Freestyle mini v čase a trendu poklesu či vzestupu glykémie. Výsledky jsou zobrazeny v mřížkovém pětizónovém grafu. Zóna A poskytuje u analyzovaných hodnot nejvyšší přesnost, zóna E obsahuje zcela chybné hodnoty, ty vedou ke zcela chybným a 64

67 nebezpečným rozhodnutím pacienta, v zóně B se hodnoty liší o více než 20 % od referenční metody, ale klinická rozhodnutí na základě měření nevedou k výraznějším chybám, hodnoty v zóně C by mohly vést pacienta k nadměrné korekci normální glykémie, hodnoty v zóně D reprezentující nesprávnou detekci klinicky významné glykémie nebo změny glykémie a nesprávnou korekci. U změn glykémie rychlejších nebo pomalejších o více než 1,1 mmol/l/min, je nutno posunout hranice některých zón 12. Výsledky a diskuse Do analýzy byly zahrnuty všechny páry měření bez ohledu na rychlost změny glykémie. Výrobce provádí analýzu dat podle původní Clarkovy metody 12 také bez ohledu na rychlost změny glykémie. V našem vzorku byla sledována i rychlost změny glykémie, při rychlejší změně glykémie než 1,1 mmol/l/min provedeno 19 % kalibrací. Při sportovních aktivitách, při kterých byla převážná část vzorků získána, není možné čekat na ustálení hodnoty glykémie. Z 621 párů měření se 5 hodnot měřených glukometrem dostalo pod hranici 2,2 mmol/l proto je počet párů v hladinách glykémie stanovených výrobcem 616. Základní popis dat (Tabulka I) ukazuje, že senzory MMT-7002 většinou vykazují nižší hodnoty. Střední absolutní odchylka zásadně ovlivní krajní hodnoty, maximální rozdíl byl 250 %, (většinou chyba kalibrace). Výrobce 11 uvádí střední absolutní odchylku menší o 2,7 % a směrodatná odchylka (SD) je menší o 4,9 %. Tabulka I. Základní popis dat. počet použitých párů měření 621 střední absolutní odchylka v procentech (α=0.05) 22,5±2,7 % celková odchylka 151,5 mmol/l Dle údajů výrobce je v rozsahu glykémie 4,5 6,7 99,9 %, naše zjištění se shodují 100 % párů. Senzor tedy poskytuje vždy v tomto rozsahu glykémie správnou hodnotu.(v zóně A nebo B). Korelogram klinické relevance odchylek měření mezi senzorem a glukometrem pomocí Clarkovy analýzy chybové mřížky je na (Obr. 1) a Tabulka II. Tabulka II. Četnost spárovaných měření v jednotlivých zónách A-E * podle rozsahů koncentrací glukózy. rozsah glykémi absolutn í četnost relativn í A+ B A+B [%] A A [%] B B [%] C C [%] D D [%] e [mmol/l] měření četnost měření [%] 2,2-4, , , , ,6 0 0, ,7 4,5-6, , , , ,2 0 0,0 0 0,0 6,8-13, , , , ,2 10 3,8 0 0,0 >13,3 24 3, ,8 6 25,0 5 20,8 0 0, ,2 celkem , , , ,8 10 1,6 56 9,1 * V zóně E se nenacházejí žádné hodnoty, proto není v tabulce uvedena. 65

68 Obr. 1. Korelogram Clarkovy analýzy chybové mřížky. Tabulka III Porovnání hodnot uváděných výrobcem s naměřenými rozsah A+B glykémie [%] [mmol/l] naměř. A+B [%] dle výrobce 2,2-4,4 70,8 76,1 4,5-6,7 100,0 99,9 6,8-13,3 96,2 99,6 >13,3 45,8 86,8 Výrobce 11, námi získané hodnoty i další studie 13, 14 ukazují trend, že čím glykémie dosahuje extrémnějších hodnot, tím je přesnost senzoru menší. Závěr Dospěli jsme k závěru, že CGM významně pomáhá při prevenci akutních komplikací u pacienta s DM a to i v nadměrné zátěži. V pásmech normální glykémie jsou měření senzoru přesnější, než udává výrobce. V pásmech hypoglykémie a hyperglykémie však dochází k větším chybám měření, než udává výrobce, to je ovlivněno větším rozptylem hodnot glykémie, protože pacient se chová jemu obvyklým, zažitým způsobem, nikoli způsobem předepsaným klinickou studií. Práce se zaměřovala zejména na fyzické aktivity a s tím související rychlé změny glykémie. Metoda kontinuálního monitoringu glykémie je významnou pomocí u kompenzace a zjišťování trendů u pacienta s DM 1. typu a umožní tím zmírnění nebo odsunutí druhotných následků DM. 66

69 Poděkování Tato práce vznikla s institucionální podporou UK FTVS a s podporou grantů GA ČR (č. P208/12/1645 a č. P206/11/1638). Literatura 1. UZIS: Péče o nemocné cukrovkou. ÚZIS ČR, Prague Friedecky B., Zima T., Kratochvil A., Springer D.: Diabetes mellitus - laboratorní diagnostika a sledování stavu pacientů. Downloaded: Mueller A. J., Hasslacher C., Krivanek R., Knuth M., Nikolaus K. S., Kuester F., Theinert S.: Diabetes Technol. The. 15, A68 (2013). 4. English B. E.: European Endocrinology 8, 18 (2012). 5. Broz J.: DIAstyl 5, 24 (2009). 6. Jirkovska A.: Remedia 2, 1 (2009). 7. Pickova K.: Přesnost měření glukometrů. Downloaded: ISO 15197:2003 In vitro diagnostic test systems -- Requirements for blood-glucose monitoring systems for self-testing in managing diabetes mellitus (2003). 9. Zourek M.: Zdravotnicke noviny 3, 2 (2012). 10. Honsova S., Navratil T.: Modern Electrochemical Methods XXXI: Evaluating the Accuracy of Continuous Glucose Monitoring by the Patient through Continuous Glucose Error Grid Analysis, Jetrichovice, (Navratil T., Barek J., Eds.) Best servis, Jetrichovice 2011, p Medtronic: Guardian REAL-Time Continuous Glucose Monitoring System. Downloaded: Kovatchev B., Anderson S., Heinemann L., Clarke W.: Diabetes Care 31, 1160 (2008). 13. Hasanbegovic S.: HealthMED 4, 615 (2010). 14. Clarke W. L., Anderson S., Kovatchev B.: Cur. Diabetes Rev. 4, 193 (2008). 67

70 Voltammetric Determination of 4-Nitrobiphenyl at a Mercury Meniscus Modified Silver Solid Amalgam Electrode Eva Horáková, Vlastimil Vyskočil, and Jiří Barek Charles University in Prague, Faculty of Science, University Research Centre UNCE "Supramolecular Chemistry", Department of Analytical Chemistry, UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Albertov 6, CZ Prague 2, Czech Republic, eva.horakova@natur.cuni.cz Abstract A mercury meniscus modified silver solid amalgam electrode (m-agsae) was used as a working electrode for voltammetric study of electrochemical behavior and determination of 4-nitrobiphenyl (4-NBP). Optimal conditions for its determination in the concentration range from to mol L 1 at the m-agsae using DC voltammetry (DCV) and differential pulse voltammetry (DPV) were found in a mixture of 0.25 mol L 1 acetate buffer of ph 4.8 and methanol in a volume ratio of 7:3. Moreover, application of adsorptive stripping differential pulse voltammetry (AdSDPV) was tested to achieve a lower limit of quantification. The applicability of the developed methods was tested on model samples of drinking and river water. Key words: 4-Nitrobiphenyl, DC voltammetry, Differential pulse voltammetry, Adsorptive stripping differential pulse voltammetry, Mercury meniscus modified silver solid amalgam electrode, Supramolecular electrochemistry, Nitrated polycyclic aromatic hydrocarbons. Introduction The studied compound 4-nitrobiphenyl (4-NBP) belongs to the group of nitrated polycyclic aromatic hydrocarbons (NPAHs), which are known mutagenic agents 1. They can be found in coal fly ash, engine exhaust, waters, sediments, tobacco smoke etc. 2,3. Many NPAHs are also known as carcinogens. Therefore, there is an ever growing interest in their monitoring in the environment 4-6. They are metabolically reduced to nitroso compounds, hydroxylamines and amines, which can react with cellular macromolecules 1,7,8. The studied compound is biologically active compound according to the IARC 9, 4-NBP is ranked in the group 3, i.e., its carcinogenic effects were established on animals 7,10. For the separation of 4-NBP from complex samples and its following determination, chromatographic and spectrophotometric methods, respectively, were primarily described Nevertheless, electrochemical methods can represent a less expensive alternative with a similar sensitivity 14-16, with the limits of quantification being in submicromolar ranges. A mercury meniscus modified silver solid amalgam electrode (m-agsae) used in this work is very suitable for the determination of the studied compound, mainly because of the effort to limit the use of liquid mercury in analytical laboratories 17. Experimental The stock solution of 4-NBP (c = mol L 1 ) was prepared by dissolving g of 4-NBP (99%, Merck, Prague, Czech Rep.) in 100 ml of methanol. Solutions of lower concentrations were prepared by diluting the stock solution with methanol (99.9%, p.a. purity, Merck, Prague, Czech Republic). The stability of the stock solution was monitored by UV- Vis spectrophotometric measurements. Stock solution was kept in the dark and at the laboratory temperature. Boric acid, phosphoric acid (85%), sodium dihydrogen phosphate hydrate, disodium hydrogen phosphate heptahydrate, sodium acetate trihydrate (all p.a. purity, Lachema, Brno, Czech Rep.), sodium hydroxide and acetic acid (99.8%) (both p.a. purity, Lach-Ner, Neratovice, Czech Rep.) were used for the preparation of appropriate buffer solutions. Britton-Robinson 68

71 (BR) buffers (c = 0.04 mol L 1 ) were prepared in a usual way. Acetate buffer (AB, c = 0.25 mol L 1, ph 4.8) was prepared from appropriate amounts of sodium acetate trihydrate and acetic acid dissolved in deionized water 18. Deionized water produced by a Milli-Q Plus system (Millipore, Billerica, MA, USA) was used. All solutions were stored in glass bottles in the dark at the laboratory temperature. Measurements of ph were carried out using the ph meter Jenway 4330 (Jenway, Chelmsford, UK) with a combined glass electrode. It was calibrated by standard calibration buffers of ph 4.00, 7.00 and (Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany). Voltammetric measurements were carried out with the computer-controlled Eco-Tribo Polarograph driven by the Polar Pro 5.1 software (both Eco-Trend Plus, Prague, Czech Rep.) operating under the operating system Microsoft Windows 98. The measurements were performed in a three-electrode system with a m-agsae working electrode (Eco-Trend Plus, Prague, Czech Rep.), which was pretreated using previously described methods 19, a Ag AgCl (1.0 mol L 1 KCl) reference electrode and a platinum wire auxiliary electrode (both Monokrystaly, Turnov, Czech Rep.). All potentials are referred to the above-mentioned reference Ag AgCl electrode. For both DC voltammetry (DCV) and differential pulse voltammetry (DPV), the polarization rate was 20 mv s 1, for DPV and adsorptive stripping differential pulse voltammetry (AdSDPV), the modulation amplitude was 50 mv and the pulse duration was 100 ms. Samples were prepared by adding an appropriate volume of stock solution into a 10-mL volumetric flask, methanol was added to the volume of 3.0 ml, and the solution was filled up to 10.0 ml with a buffer solution. Model samples of drinking and river water were prepared using water from the public water line in Prague or from the Vltava river in Prague, respectively. 9.0 ml of drinking/river water spiked with an appropriate amount of 4-NBP were filled up to 10.0 ml with a buffer solution. The prepared solution was mixed, transferred to the electrochemical cell, and the oxygen was removed by bubbling with nitrogen for five minutes prior to a measurement. All voltammograms were measured three times and the peak current (I p ) values for the construction of calibration curves were calculated as arithmetic averages. All figures and mathematical operations were carried out using the Origin Pro 8.0 software (OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA). Results and Discussion Initially, the stability of the analyzed solution in dependence on the volume ratio of aqueous Britton-Robinson (BR) buffer and methanol was studied. The optimal ratio of BR buffer and methanol was found to be 7:3 (using DCV, DPV and UV-Vis spectrophotometry). As the next step, the dependence of the peak current (I p ) and peak potential (E p ) of 4-NBP on ph of the BR buffer used was investigated in the ph range of using DCV and DPV at the m-agsae with the application of electrochemical regeneration prior to each measurement 20. It was found that the optimal medium (for both DCV and DPV) is the BR buffer of ph 7.0 in the mixture with methanol (7:3) (with the resulting ph of 7.5). However, because of trace impurities present in the BR buffer, it was not possible to evaluate voltammetric peaks of 4-NBP correctly at its concentrations lower than mol L 1, and it was necessary to find another suitable buffer. The following aqueous supporting electrolytes were tested: tetrabutylammonium iodide (ph 8.0, c = 0.05 mol L 1 ), phosphate buffer (ph 7.0, c = 0.10 mol L 1 ), acetate buffer (ph 4.8, c = 0.25 mol L 1 ), BR buffer (ph 8.0, c = 0.04 mol L 1 ), borate buffer (ph 8.0, prepared by mixing of 0.25 mol L 1 sodium tetraborate and 0.10 mol L 1 hydrochloric acid) and sodium tetraborate (ph 9.2, c = 0.05 mol L 1 ). The acetate buffer 69

72 (ph 4.8, c = 0.25 mol L 1 ) was chosen as the optimal one, i.e., the one without the presence of interfering voltammetric signals of trace impurities. The repeatability of measurements for both voltammetric techniques was tested with and without application of an electrochemical regeneration step 20. Observed results showed that for DCV, it is not necessary to apply electrochemical regeneration, and, for DPV, the optimal regeneration potentials, that significantly enhanced the repeatability, were E reg,1 = 0 mv and E reg,2 = 1300 mv. The aforementioned optimal conditions were used for measuring calibration curves in the concentration range from to mol L 1 of 4-NBP. DC and DP voltammograms of 4-NBP and the appropriate calibration curves obtained in the lowest measurable concentration range (2 10) 10 7 mol L 1 are depicted in Fig. 1. The limit of quantification (L Q ) of 4-NBP reached for both techniques was mol L 1. Parameters of the calibration straight lines are then summarized in Table I. Fig. 1. DC (A) and DP (B) voltammograms of 4-NBP at the m-agsae in the AB methanol (7:3) medium. DC voltammograms measured without electrochemical regeneration, DP voltammograms measured using the regeneration potentials E reg,1 = 0 mv, E reg,2 = 1300 mv. c(4-nbp): 0 (1), 2 (2), 4 (3), 6 (4), 8 (5) and 10 (6) ( 10 7 mol L 1 ). Insets: the dependences of the peak current of 4-NBP on its concentration. Furthermore, the developed methods for the determination of 4-NBP at the m-agsae were tested on model samples of drinking and river water. The DC and DP voltammograms of 4-NBP were measured in the concentration range from to mol L 1 in solutions of spiked water (drinking or river) AB (9:1). Selected voltammograms of 4-NBP plotted in dependence on its concentration are depicted in Fig. 2 for the sake of an illustration. In Table I, parameters of the calibration straight lines for the determination of 4-NBP in model samples of drinking and river water are summarized as well. Finally, an attempt to utilize the AdSDPV at the m-agsae was made to reach a lower L Q of the studied compound. This technique was tested in buffer methanol (9:1 or 249:1) solutions containing 4-NBP in the concentration of mol L 1. The examined buffers were as follows: AB of ph 4.8, 0.10 mol L 1 phosphate buffer of ph 7.0, BR buffers of ph 2.1, 7.0 and Suitable accumulation potentials were tested (their values were selected as E p + (0, 100, 200 and 300 mv)) with the accumulation time of 60 s. However, under the 70

73 examined conditions, the effect of the adsorption was not sufficient to significantly increase the voltammetric response of 4-NBP. Fig. 2. Voltammograms of 4-NBP recorded at the m-agsae in spiked river water AB (9:1) using DCV (A) and in spiked drinking water AB (9:1) using DPV (B). DC voltammograms measured without electrochemical regeneration, DP voltammograms measured using the regeneration potentials E reg,1 = 0 mv, E reg,2 = 1300 mv. c(4-nbp) in the model water sample: 0 (1), 1 (2), 2 (3), 4 (4), 6 (5), 8 (6) and 10 (7) ( 10 7 mol L 1 ). Insets: the dependences of the peak current of 4-NBP on its concentration. Table I. Parameters of the calibration straight lines and the L Q s values for the determination of 4-NBP in the concentration range from to mol L 1 using DCV and DPV at the m-agsae. Method Matrix Concentration Slope Intercept [mol L 1 ] [na mol 1 L] [na] R 2 L Q [mol L 1 ] DCV AB methanol (7:3) (2 10) AB methanol (7:3) (2 10) AB methanol (7:3) (2 10) DPV AB methanol (7:3) (2 10) AB methanol (7:3) (2 10) AB methanol (7:3) (2 10) DCV Spiked DW AB (9:1) (2 10) DPV Spiked DW AB (9:1) (2 10) DCV Spiked RW AB (9:1) (2 10) DPV Spiked RW AB (9:1) (2 10) AB 0.25 mol L 1 acetate buffer of ph 4.8, DCV DC voltammetry, DPV differential pulse voltammetry, DW drinking water, L Q limit of quantification (10σ), R 2 coefficient of determination, RW river water. Conclusions It was shown in this contribution that the electrochemical response of the m-agsae towards 4-NBP is sufficient enough to be used for its sensitive determination. Using DCV and DPV for the determination of micromolar and submicromolar concentrations of 4-NBP, the m-agsae was exhibited to be a suitable alternative to mercury electrodes. It is also possible to apply the newly developed methods on real matrices like drinking and river water. All the dependences of the peak current of 4-NBP on its concentration were linear and the limits of quantification were about mol L 1. The methods of voltammetric determination of 71

74 4-NBP utilizing the m-agsae can thus offer reliable results comparable to those obtained by other methods (Table II). Table II. A survey of methods for the determination of 4-NBP and their limits of quantification. Method L Q [mol L 1 ] Method L Q [mol L 1 ] DPV at m-agsae HPLC-ED AdSDPV at HMDE HPLC-UVD AdSSWV at HMDE HPLC-FD AdSDPV adsorptive stripping differential pulse voltammetry, AdSSWV adsorptive stripping square-wave voltammetry, DPV differential pulse voltammetry, HMDE hanging mercury drop electrode, HPLC-ED HPLC with electrochemical detection, HPLC-FD HPLC with fluorescence detection, HPLC-UVD HPLC with UV spectrophotometric detection, L Q limit of quantification (10σ), m-agsae mercury meniscus modified silver solid amalgam electrode. Acknowledgement This research was carried out within the framework of the Specific University Research (SVV 2013). Financial support from the Grant Agency of the Czech Republic (Project P206/12/G151) is gratefully acknowledged. References 1. Moreira J. C., Barek J.: Quim. Nova 18, 362 (1995). 2. Havey C., Dane A. J., Abbas-Hawks C., Voorhees K.: Environ. Chem. Lett. 7, 331 (2009). 3. Tokiwa H., Ohnishi Y.: Crit. Rev. Toxicol. 17, 23 (1986). 4. Feilberg A., Nielsen T.: Environ. Sci. Technol. 35, 108 (2001). 5. Morris H. P., Dubnik C. S., Johnson J. M.: J. Natl. Cancer Inst. 10, 1201 (1950). 6. Senturk Z.: Curr. Drug. Deliv. 10, 76 (2013). 7. Ning S., Xiaobai X.: Carcinogenesis 18, 1233 (1997). 8. Heflich R. H., Howard P. C., Beland F. A.: Mutat. Res. 149, 25 (1985). 9. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans, Volume 4: Some Aromatic Amines, Hydrazine and Related Substances, N-Nitroso Compounds and Miscellaneous Alkylating Agents. International Agency for Research on Cancer. Lyon Crimmins B. S., Baker J. E.: Atmos. Environ. 40, 6764 (2006). 11. Jinhui X., Lee F. S. C.: Anal. Chim. Acta 416, 111 (2000). 12. Chen X., Li M. J., Yi C. Q., Tao Y.,Wang X. R.: Chromatographia 58, 571 (2003). 13. Prchal V., Krejčová J., Vyskočil V., Pecková K., Fischer J., Zima J., Barek J.: Int. J. Electrochem. Sci. 8, 2524 (2013). 14. Hernández P., Galan-Estella F., Hernández L.: Anal. Chim. Acta 271, 217 (1993). 15. Barek J., Berka A., Müller M., Zima J.: Collect. Czech. Chem. Commun. 50, 2853 (1985). 16. Štěpán R., Barek J., Mejstřík V., Zima J.: Sensors 3, 43 (2003) Downloaded October 28 th Lambert J., Muir T. A.: Practical Chemistry. Heinemann Educational Publishers. London Mikkelsen O., Schroder K. H.: Electroanalysis 15, 679 (2003). 20. Vyskočil V., Navrátil T., Polášková P., Barek J.: Electroanalysis 22, 2034 (2010). 72

75 Nanostructured Ag films on Silicon Wafers for Electrochemical and SERS Sensing Deposited by Electrochemical/Electrophoretic Method Jan Hrbac a, Vladimir Halouzka a,b, Petr Jakubec a, Libor Kvitek a, Vlassis Likodimos c, Athanassios G. Kontos c, Kyriakos Papadopoulos c, Polycarpos Falaras c a Department of Physical Chemistry, Palacky University, Faculty of Science, tr. 17. listopadu 12, Olomouc, Czech Republic, jan.hrbac@upol.cz b Masaryk University, Faculty of Science, Department of Chemistry, Kamenice 5, CZ Brno, Czech Republic c Institute of Physical Chemistry, NCSR 'Demokritos', Agia Paraskevi Attikis, Athens, Greece Abstract Electrolysis of ultrapure water in a two-electrode cell with silver anode and conductive substrate (Si wafer) as a cathode leads to the formation of nanostructured silver layers deposited on cathode. The results of the present study open a new, extremely simple and ultralow cost way to prepare nanostructured silver films on conducting and semiconducting substrates. The prepared nanosilver coated silicon substrates exhibit high performances as amperometric sensors for hydrogen peroxide and also as SERS substrates. As a by-product, silver nanoparticles are produced during the process. Key words: Electrophoretic deposition, Amperometry, SERS; 2D nanostructures; Silver nanoparticles; Si wafer. Introduction Deposition of nanostructured metallic layers (including noble metals) on conductive and/or semiconducting substrates is a specific issue of contemporary research, targeted into the development of novel, highly sensitive electrochemical and surface enhanced Raman scattering (SERS) sensors 1,2. Of the above, silver, especially in the form of nanoparticles, is a highly effective electrocatalyst for cathodic hydrogen peroxide sensing. Silver films also find an ideal application as substrates for surface-enhanced Raman spectroscopy. Experimental The deposition was carried out in a two-electrode cell composed of 20 ml quartz beaker containing Si wafer as a cathode and Ag wire (diameter = 1 mm) as anode. The electrolyte was a Millipore water (R > 15 MΩ.cm). The area of Si wafer immersed in water was 20 x 20 mm, silver wire anode was placed at the distance of 10 mm from Si wafer. The cell was connected to a stabilized power supply (E = V) for a desired period of time. The current flowing through the cell was monitored using Metex M-3890D multimeter connected to PC via USB. Simultaneously, temperature was monitored by Pt 1000 sensor interfaced to USB-6009 (National Instruments, Austin, U.S.A.) multifunction card and controlled by dedicated LabView software (L-Chem, Czech Republic). After deposition, the wafers were rinsed with water and dried in the air. Results and Discussion Progressive dissolution of silver anode during the electrolysis of ultrapure water in a twoelectrode cell with Si wafer as leads to nanosilver coated silicon substrates exhibiting high performances as amperometric sensors for hydrogen peroxide and also as SERS substrates. During the electrosynthesis, the silver oxide is formed as a primary product of the silver anode dissolution and fills the interelectrode space by the diffusion, electrophoresis and convection induced by the temperature gradients induced by the electrolysis. Silver oxide is partially soluble, forming silver cations and hydroxide anions, resulting in the ph increase up to the value of Silver cations are reduced on the Si wafer cathode. Direct decomposition 73

76 of silver oxide to silver nanoparticles accompanies the experiment, as can be proved by spectrophotometry after dissolution of silver oxide in ammonia, revealing plasmonic peak at 422 nm. The SEM image of silver layer, amperograms of H 2 O 2 sensing and SERS spectrum of Rhodamine 6G are shown in Fig. 1. Fig. 1. A: SEM image of Si wafer with deposited silver (E applied = 10 V, t = 20 min.); B: Amperometric response curves of hydrogen peroxide on bare silicon wafer (a) and on silicon wafer equipped with a silver layer. The measurements were performed in stirred B-R buffer, ph=7. Each addition corresponded to 1.0 mm H 2 O 2. The amperogram (c) shows the response at low hydrogen peroxide concentrations (5x 1µM, 2x 10 µm H 2 O 2 ). C: Raman spectra of Rhodamine 6G acquired on a bare silicon wafer (a: cr6g=1 µm, b: cr6g=10 µm) and (c) silver coated wafers cr6g=0.1 µm). 1µL drop of R6G solution was placed onto the substrate surface and allowed to dry. Inset: Raman spectra in dependence on R6G concentration. 74

77 Conclusion A simple method for the preparation of the silver nanostructures is suggested and application potential is demonstrated in two well-known applications as electrochemical and SERS sensors. The preparation process can be regarded as clean, since the starting materials are silver metal and water only. Excellent electrocatalytical activity towards hydrogen peroxide electrochemical reduction and high SERS activity are achieved. Acknowledgment Financial support from the Grant Agency of the Czech Republic (project no. P206/12/0796), and from the student project No. PrF_2012_028 is gratefully acknowledged. References 1. Plowman B. J., Bhargava S. K., O Mullane A. P.: Analyst 136, 5107 (2011). 2. Halouzka V., Jakubec P., Kvitek L., Likodimos V., Kontos AG., Papadopoulos K., Falaras P., Hrbac J: J. Electrochem. Soc. 160, B54-B59 (2013). 75

78 Detection of Thiram Pesticide using Copper Affinity Electrochemical Separation Electrospray Ionization Mass Spectrometry Jana Jaklová Dytrtová a, Tomáš Navrátil b, Michal Jakl c, and Kateřina Nováková b, d a Institute of Organic Chemistry and Biochemistry of the AS CR, v.v.i., Flemingovo náměstí 2, Prague 6, Czech Republic, dytrtova@uochb.cas.cz b J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of ASCR, v.v.i., Dolejškova 3, Prague 8, Czech Republic c Czech University of Life Sciences Prague, Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources, Department of Agro-Environmental Chemistry and Plant Nutrition, Kamýcká 129, Prague Suchdol, Czech Republic d University of Pardubice, Faculty of Chemical Technology, Institute of Environmental and Chemical Engineering, Studentská 573, Pardubice, Czech Republic Abstract The detection of pesticides in environmental matrices has a purpose in analytical chemistry and it is important for understanding their role in the environment 1-3. Direct detection of pesticides in environmental matrices is complicated due to many occurring interactions with metals (e.g., Ca, Cu, Mg, Zn). The experimental utilization of combining electrochemical cell with mass spectrometry is shown in the case of thiram (T). The method is based on high affinity of copper cations to many ligands. Key words: EC-ESI-MS, Fungicide, Copper, Sulfur, Complexes. Introduction The presence of pesticides in soil may cause significant changes of plant nutrition uptake as well as other changes on physiological level (e.g., expression of phytochelatin synthesis owing to masking of heavy metals via complexation with pesticides). Presence of pesticides has a negative impact on the environment Moreover, pesticides strongly interact with heavy metals (Pb, Cd), nutrients (Ca, Mg), and some essential metals (Cu, Zn). Pesticides are a very wide group of chemicals with several types of functional groups which enable to create complexes with cations 12. Thiram (T, C 6 H 12 N 2 S 4, Fig. 1) is a fungicide with two S= groups. The S= group has similar characteristics as the O= group and it is able to create stable coordination-covalent bonds T is highly toxic compound causing reduction of ceruloplasmine activity, and bone strength, and suppression of humoral immunity 15. Moreover, T causes rapid depletion of intracellular reduced glutathione; this depletion is explained by T oxidation of glutathione 16. The effect of T activity can be suppressed via CuSO 4, ZnSO 4 or MnSO 4 addition 15. The aim of this study is to prepare Cu/T complexes 17 in situ via electrochemical generation of copper cations with on-line detection by electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS). Experimental The electrochemical cell (EC) was designed for the sample flow rates of about 0.4 ml h -1, suitable for ESI-MS 19. The cell body is built from a peak cross (P-729 PEEK Cross thru-hole with F-300 Fittings completed, Upchurch Scientific Rheodyne, IDEX Health & Science, USA) with a sweep volume of 0.72 µl. The sample inlet and outlet consist of capillary PEEK Tubing 0.25 mm (Upchurch Scientific Rheodyne, IDEX Health & Science, USA). The electrochemical cell works in a two-electrode arrangement using a computercontrolled polarographic/voltammetric analyzer PC-ETP (Polaro-Sensors, Czech Republic) with the Multielchem 2.3 software (JH IPC ASCR, v.v.i., Czech Republic) 22 and POLAR.PRO software v. 5.1 (Polaro-Sensors, Czech Republic). Copper wire (diameter 76

79 Intensity 1 mm, Lachema, Czech Republic) and silver wire (diameter 1 mm, Goodfellow, USA) were used as working electrode (WE) and reference electrode (RE), respectively, depending on the actual voltage applied. The ESI-MS experiments were performed with a Finnigan LCQ Advantage ion-trap mass spectrometer (ThermoFinnigan, USA) fitted with an electrospray ionization source operating in positive and negative-ion mode 23. The sample solutions of T were introduced into the ESI source via a fused-silica capillary at a flow rate of 0.45 ml h -1 maintained using a syringe pump (KDScientific, USA). Nitrogen was used as the nebulizer gas. The operating conditions were set as follows: spray voltage 5.4 kv, capillary voltage -60 V and tube lens offset -70 V, heated capillary temperature 230 C, sheath gas flow rate, and auxiliary gas flow rate arbitrary units. Results and discussion Fig. 1 shows the MS spectrum of T solution. The creation of the Cu/T complexes was initiated in EC during the electrolysis. Copper cations generated during the electrolysis created with T two stable complexes: [Cu(T)] + and [Cu(T) 2 ] +. Their presence was confirmed voltammetrically (Fig. 2). In both complexes Cu was present as Cu +. During the nebulization in the electrospray process any Cu 2+ was reduced to Cu +, as it was demonstrated and explained in previous studies 12. In the spectrum, T is present also as protonated (TH + ) and as an adduct with potassium cation (K(T) + ). Additional presence of these two T species, except Cu/T species, caused any utilization of copper affinity electrochemical separation electrospray ionization mass spectrometry (CuAES/ESI-MS) to T detection in environmental matrices inapplicable, because the affinity of copper cations to T is lower than affinity of, e.g., triazolic compounds 6, 7, 18. 3x10 5 [Cu(T)] + 2x10 5 [K(T)] + 1x10 5 TH + [Cu(T) 2 ] m/z Fig. 1. Mass spectrum of T (10-4 mol L -1 ) in EtOH/H 2 O (1/1) solution, ammonium acetate (0.05 mol L -1 ), -100 mv was applied at the Cu electrode. 77

80 I [ A] I [µa] -20 A B E [mv] E [mv] -200 Fig. 2A. DPV voltammogram of T (10-4 mol L -1 ) in EtOH/H 2 O (1/1) solution, ammonium acetate (0.05 mol L -1 ) at Cu working electrode, E in = -100 mv, scan rate 100 mv/s. Fig. 2B. Cyclic voltammogram of T (10-4 mol L -1 ) in EtOH/H 2 O (1/1) solution, ammonium acetate (0.05 mol L -1 ) at Cu working electrode, scan rate 100 mv/s. Conclusion The application of copper affinity using electrochemical separation electrospray ionization mass spectrometry for the detection of T in environmental matrices is relatively complicated, because the readiness of sulfur to create coordination bond with Cu 2+ is too week to compete with other T adducts creation. Acknowledgement This work was supported by the Grant Agency of the Czech Republic (projects No P, No. P208/12/1645, and No. P206/11/1638), by the University of Pardubice (project No. SGFChT05/2012), by the Ministry of Education of the Czech Republic (S grant). References 1. Hromadova M., Sokolova R., Pospisil L., Fanelli N.: J. Phys. Chem. B 110, 4869 (2006). 2. Sokolova R., Gal M., Valasek M.: J. Electroanal. Chem. 685, 33 (2012). 3. Sokolova R., Pospisil L., Hromadova M., Ludvik J., Gal M., Giannarelli S.: Modern Electrochemical Methods Xxx, 154 (2010). 4. Barek J., Cabalkova D., Fischer J., Navratil T., Peckova K., Yosypchuk B.: Environ. Chem. Lett. 9, 83 (2011). 5. Cabalkova D., Barek J., Fischer J., Navratil T., Peckova K., Yosypchuk B.: Chem. Listy 103, 236 (2009). 6. Skopalova J., Navratil T.: Chem. Anal.-Warsaw 52, 961 (2007). 7. Sokolova R., Hromadova M., Pospisil L.: J. Electroanal. Chem. 552, 53 (2003). 8. Barek J., Fischer J., Navratil T., Peckova K., Yosypchuk B., Zima J.: Electroanalysis 19, 2003 (2007). 9. Pelclova D., Navratil T., Mrazova K., Rakovcova H., Fenclova Z., v knize: Pesticides in the Modern World - Pesticides Use and Management; (Stoytcheva M., ed. InTech, Rijeka, Pelclova D., Prazny M., Skrha J., Fenclova Z., Kalousova M., Urban P., Navratil T., Senholdova Z., Smerhovsky Z.: Hum. Exp. Toxicol. 26, 705 (2007). 11. Pelclova D., Fenclova Z., Urban P., Ridzon P., Preiss J., Kupka K., Malik J., Dubska Z., Navratil T.: Neuroendocrinology Letters 30, 219 (2009). 78

81 12. Jaklova Dytrtova J., Jakl M., Schroder D., Cadkova E., Komarek M.: Rapid Commun. Mass Spectrom. 25, 1037 (2011). 13. Schulze O., Voss J., Adiwidjaja G., Olbrich F.: Carbohydr. Res. 339, 1787 (2004). 14. Norkova R., Jaklova Dytrtova J., Jakl M., Schroder D.: Water, Air, Soil Pollut. 223, 2633 (2012). 15. Wu W., Cook M. E., Smalley E. B.: Nutr. Res. 10, 555 (1990). 16. Cereser C., Boget S., Parvaz P., Revol A.: Toxicology 163, 153 (2001). 17. Novakova K., Navratil T., Jaklova Dytrtova J., Chylková J.: J. Solid State Electrochem., accepted (2013). 18. Jaklova Dytrtova J., Jakl M., Schroder D., Norkova R.: Int. J. Mass Spectrom. 338, 45 (2013). 19. Jaklova Dytrtova J., Jakl M., Norkova R., Navratil T.: Modern Electrochemical Methods XXXII: Optimization of a Flow Rate for a Hyphenation of Voltammetry with Electrospray Ionization Mass Spectrometry, Jetrichovice, (Navratil T., Fojta M., Eds.), Best servis, Jetrichovice 2012, p Jaklova Dytrtova J., Jakl M., Schroder D.: Modern Electrochemical Methods XXXI: The oxidation of ferrocene; a hyphenation of voltammetry with electrospray ionization mass spectrometry, Jetřichovice, (Navratil T., Barek J., Eds.), Best servis, Ústí nad Labem, Jetřichovice 2011, p Jaklova Dytrtova J., Jakl M., Schroder D.: Modern Electrochemical Methods XXX: Electrochemistry with mass spectrometry as a tool of metal complexes with organic ligand studies, Jetrichovice, (Navratil T., Barek J., Eds.), Best servis, Usti nad Labem, Jetrichovice 2010, p Navratil T., Yosypchuk B., Barek J.: Chem. Anal.-Warsaw 54, 3 (2009). 23. Tintaru A., Roithova J., Schroder D., Charles L., Jusinski I., Glasovac Z., Eckert- Maksic M.: J. Phys. Chem. A 112, (2008). 79

82 Flow Electrochemical Biosensors for Measurements at High Negative Potentials (Biosenzory pro elektrochemická měření v průtokových systémech při vysokých negativních potenciálech) Bohdan Josypčuk a, Jiří Barek b, and Oksana Josypčuk a, b a J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of AS CR, v.v.i., Department of Biophysical Chemistry, Dolejskova 3, Prague, Czech Republic, josypcuk@jh-inst.cas.cz b Charles University in Prague, Faculty of Science, University research center UNCE Supramolecular chemistry, Department of Analytical Chemistry, UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Albertov 6, Prague 2, Czech Republic Abstract Flow amperometric enzymatic biosensors were constructed. The biosensors consist of a flow reactor based on porous silver solid amalgam (AgSA) and a flow tubular detector based on compact AgSA. All chemical components of the reactor surface are mutually connected by covalent bonds. Decrease of oxygen concentration (directly proportional to the concentration of the substrate) during enzymatic reaction was amperometrically measured on the tubular detector under flow injection conditions. The described procedure should be universal and it was successfully used, e.g., for deposition of glucose oxidase, cholesterol oxidase and sarcosine oxidase at the surface of the porous AgSA-reactor. Key words: Flow analysis, Amperometry, Solid amalgam, Porous reactor, Electrochemical biosensors, Glucose. Úvod Elektrochemická detekce (ED) při analýzách v průtokových systémech (FA), zvlášť ve spojení s biosenzory, je široce používána 1-4. Detekční (pracovní) elektroda (WE) je základem a jediným zdrojem analytického signálu v elektrochemických metodách. Nejlepší možnosti pro zajištění elektroredukčních procesů, zvlášť při vysokých negativních potenciálech, poskytují elektrody rtuťové a amalgámové. Vysoké přepětí vodíku na těchto materiálech dovoluje s nimi pracovat ve vodných roztocích až do 2 V. Pevné 5-8 a pastové 9-11 amalgámové elektrody se konstrukčně neliší od elektrod z jiných materiálů a jsou vhodné pro FA. Velkou užitnou přednosti pevných amalgámů je možnost připravení elektrod potřebného rozměru a tvaru. Detektory ze stříbrného pevného amalgámu (AgSA) byly použity pro práci ve wall-jet 12, 13 a thin-layer 12 uspořádání. Zavedení AgSA tubulárního detektoru velmi zjednodušilo konstrukci průtokové elektrochemické cely a podstatně zvýšilo spolehlivost a reprodukovatelnost měření 14. Pevné amalgámy se ukázaly být vhodnou podložkou pro thiolové monovrstvy (ML) 15-17, na základě kterých se dají připravit různé typy biosenzorů. Pokud je thiol navázaný na amalgám ukončen karboxylovou skupinou, dá se pomoci EDC-NHS technologie vytvořit amidová vazba mezí COOH thiolu a NH 2 vhodné bílkoviny. Touto bílkovinou může být např. avidin nebo streptavidin a připravený biosenzor se dá použit pro selektivní měření interakcí (strept)avidin biotin 16. Podobné navázání enzymu nebo protilátky na thiol dovoluje připravit enzymatický nebo imunologický biosenzor. Citlivost enzymatického biosenzoru záleží na ploše, která je pokrytá enzymem. Detekční elektrody mají relativně malou plochu a jedním ze způsobů jejího zvětšení je použití enzymatického reaktoru (ER). Aktivní povrch ER je mnohonásobně větší, než u detekční elektrody a tento reaktor je umístěn v průtokovém systému před detektorem. Detektor potom zaznamenává buď koncentraci produktu enzymatické rekce, nebo např. zmenšení koncentrace kyslíku v roztoku. Velkou plochu ER mohou zajišťovat porézní nebo práškovité materiály My jsme pro tyto účely připravili stříbrný pevný amalgám jako porézní hmotu. 80

83 Cílem této práce bylo navržení, příprava a testování enzymatického biosenzoru na základě porézního reaktoru ze stříbrného pevného amalgámu v průtokovém systému. Dlouhodobou stabilitu biosenzoru mělo zajišťovat zakotvení enzymu na povrchu amalgámu pomocí kovalentních vazeb 16. Použitý postup přípravy biosenzoru by měl být universální a měl by být vhodný pro navázání různých proteinu nebo jiných sloučenin obsahujících NH 2 skupinu. Experimentální část Amperometrická měření byla prováděna s využitím počítačového analyzátoru řízeného softwarem MultiElchem v. 2.3 (Ústav fyzikální chemie J. Heyrovského AV ČR, v.v.i.) a elektrochemického stojánku (Polaro-Sensors, Praha). Tubulární detektor ze stříbrného pevného amalgámu 14 byl použit jako pracovní elektroda. Jako referentní sloužila nasycená kalomelová elektroda připravená na základě stříbrného pastového amalgámu 9, 21. Pomocnou elektrodu tvořil Pt drátek o průměru 1,0 mm a délce 15 mm. Měření byla prováděna při laboratorní teplotě. Pro přípravu roztoků byla použita voda redestilovaná v křemenné aparatuře. Všechny použité chemikálie byly čistoty p. a. Výsledky a diskuse Pro testování navrženého amalgámového reaktoru byla zvolena glukóza oxidáza (GOx) jako jeden z velmi prozkoumaných a stabilních enzymů. V průběhu enzymatické oxidace glukózy se pro obnovení aktivity GOx spotřebovává kyslík. Snížení koncentrace O 2 v mobilní fázi (MP), která je úměrná koncentraci glukózy, se dá registrovat elektrochemickou cestou. Při použití platinové, zlaté nebo jiné elektrody s nízkým přepětím vodíku, se rozpuštěný v MP kyslík redukuje na peroxid vodíku během dvou elektronové reakce. Výhodou použitého amalgámového detektoru je možnost pracovat ve vodných roztocích při potenciálech až do 2 V. V oblasti potenciálů nad 1 V se při redukci molekuly kyslíku spotřebovávají 4 elektrony a v praxi to vede ke dvojnásobnému zvýšení píku (citlivosti). Vliv potenciálu detekce na odezvu biosenzoru je znázorněn na Obr. 1A. Jak je vidět, proud píku roste se zvýšením negativního potenciálu do 1 V a potom se prakticky nemění až do 1,5 V. Při vyšších potenciálech se podstatně zhoršuje reprodukovatelnost měření zřejmě kvůli zesilujícímu se vylučování vodíku, který na povrchu detektoru tvoři mikrobubliny a nekontrolovatelně mění aktivní plochu detektoru. Je nutné se zmínit, že zvýšení potenciálu detekce vede ke zvýšení proudu základní linie. Tento jev se neprojevuje negativně na citlivosti měření, protože šum celého systému je zhruba stejný a proud základní linie se odečítá z proudu píku. Potenciál detekce (E d ) 1,1 V byl zvolen jako optimální, zajišťující maximální citlivost a jak bude uvedeno dále i nejlepší reprodukovatelnost měření. Tento potenciál detekce byl použit pro všechny další experimenty. Rychlost pohybu roztoku (v) v celém průtokovém systému podstatně ovlivňuje účinnost enzymatického reaktoru a odezvu detektoru. Enzymatická reakce má určitou rychlost a záleží na době kontaktu enzymu se substrátem. Dá se předpokládat, že čím menší bude průtok, tím více se zmenší koncentrace kyslíku v roztoku. Rychlost průtoku ovlivňuje také odezvu detektoru, přičemž pro různé látky tato závislost múze mít opačný průběh 14. Maximální proud píku byl pozorován při v = 0,04 ml min 1 (doba scanu t scan = 360 s). Jenom při nejmenší zkoušené rychlosti (v = 0,02 ml min 1 ; t scan = 600 s) se odezva zmenšila a podstatně se zhoršila reprodukovatelnost a tvar píku, což bylo způsobeno pravděpodobně nestabilitou průtoku. Pro zvolení optimální rychlosti se hledal kompromis mezi odezvou biosenzoru a dobou trvaní jednoho měření. Musela se taky brát v potaz doba obnovení aktivity enzymu po každém měření glukózy. Bylo zjištěno, že jestli doba mezí nástřiky glukózy byla menší než s, odezva biosenzoru se postupně zmenšovala. Doba scanu 240 s je dostatečná pro 81

84 spolehlivý záznam celého píku při v = 0,10 ml min 1, a proto tato rychlost byla zvolená jako optimální a byla použitá pro další měření. Obr. 1. (A) Závislost proudu píku I p na potenciálu detekce E d. (B) FIA-ED záznamy glukózy v mobilní fázi a v modelových roztocích v rozsahu koncentrací 2, , mol l 1 (ve vloženém obrázku je znázorněn kalibrační graf). Experimentální podmínky: MP [0,10 mol l 1 octanový pufr; 0,001 mol l 1 Na 2 EDTA; ph 6,5]; objem dávkovací smyčky V inj = 50 µl; v = 0,10 ml min 1. (A) c(glukóza) = 4, mol l 1. (B) E d = 1,10 V. Opakovatelnost paralelních měření modelových roztoků glukózy v MP (c = 4, mol l 1, n = 11 měření) byla dobrá a relativní směrodatná odchylka (RSD) měla hodnotu 1,83 %. Dlouhodobá stabilita účinností enzymatického porézního reaktoru se studovala tak, že připravený reaktor se uchovával v mikrozkumavce s mobilní fází v lednici při 4 C. Jednou za 3 5 dnů se reaktor zapojil do průtokového systému, provedlo se 5 7 paralelních měření mol l 1 standardního roztoku glukózy a potom se reaktor znova umístil do lednice. Během 35 dnů se odezva biosenzoru zmenšila o 23 %. Tuto změnu nepovažujeme za kritickou, protože s biosenzorem se dá úspěšně pracovat dál, jen pro hodnocení výsledků analýzy by se měla používat buď metoda standardního přídavku, nebo porovnání výsledků měření vzorků s měřením standardního roztoku glukózy. Měření koncentrační závislosti je obvykle závěrečným krokem optimalizace parametrů analýzy. Pro hodnocení výsledků analýzy vzorku se kromě kalibrační křivky může použit i metoda standardního přídavku nebo metoda porovnání odezvy biosenzoru s roztokem vzorku a roztokem se známou koncentrací. Podmínkou aplikace dvou posledních metod hodnocení je použití lineárního úseku koncentrační závislosti a minimální hodnota úseku. Proudová odezva navrženého biosenzoru se měřila v koncentračním rozsahu glukózy od 0,02 do 2,0 mmol l 1. Lineární koncentrační závislost byla pozorována v rozmezí 0,02 0,80 mmol l 1 glukózy (R = 0,9997; I p = 0,04 5,03c). Amperometrické píky a kalibrační graf jsou zobrazeny na Obr. 1.B. Velmi dobré parametry linearity potvrzují, že podmínky měření byly zvoleny správně, a že uvedený biosenzor je vhodný pro měření koncentrace (obsahu) glukózy v reálných vzorcích. Při stanovení glukózy, fruktóza a sacharóza patří mezí nejčastější možné interferenty. Nástřiky 1 mmol l 1 roztoků sacharózy a fruktózy prakticky neovlivňovaly průběh základní linie. Měření obsahu glukózy ve vzorcích medu bylo dalším krokem v testování biosenzoru. Množství glukózy v medu záleží na mnoha podmínkách a obvykle kolísá mezí 30 a 40 %. Použitý postup analýzy byl velmi jednoduchý a rychlý. Bylo vzato 7 navážek tekutého medu (jedna kapka medu - jedna navážka) a rozpuštěno ve vodě (10 ml). Alikvotní objem roztoku medu (0,1 ml) byl smíchán s mobilní fází (1,9 ml) a nastřikován do systému. Amperometrické 82

85 píky roztoků vzorků medu se porovnávaly s píkem 0,5 mmol l 1 standardního roztoku glukózy ve stejné mobilní fázi. Obsah glukózy v analyzovaném medu se rovnal 35,5±1,0 % (n = 7; SD = 1,2 %; RSD = 3,2 %). Tento výsledek se dobře shoduje s údaje z literárních zdrojů. Závěr Byl navržen, přípraven a otestován enzymatický porézní reaktor ze stříbrného pevného amalgámu. Kovalentní vazby amalgám thiol enzym účinně přispívají dlouhodobé stabilitě biosenzoru. Velká plocha pórů zajišťovala vysokou enzymatickou aktivitu biosenzoru. Zapojení reaktoru do průtokového systému bezprostředně před tubulárním AgSA-detektorem dovolilo přesně měřit spotřebu kyslíku během enzymatické reakce. Vysoké přepětí vodíku na AgSA-detektoru umožnilo aplikovat potenciál detekce negativnější než 1,0 V a zvýšit tím citlivost měření kyslíku. Byla provedena optimalizace parametrů měření a dosažená mez detekce byla 0,01 mmol l 1 glukózy při dobré opakovatelnosti paralelních měření (RSD = 1,3 %). Proudová odezva biosenzoru byla lineární v koncentračním rozsahu glukózy od 0,02 do 0,8 mmol l 1 (R = 0,9997). Testovaný biosenzor byl použit pro stanovení obsahu glukózy v medu. Poděkování Autoři děkují za finanční podporu GA ČR (projekty čís. P206/11/1638 a P206/12/G151) a GA Univerzity Karlovy v Praze (projekt /2001/B-Ch/PrF) Tato práce vznikla v rámci Specifického vysokoškolského výzkumu. Literatura 1. Tessema M., Ruzgas T., Gorton L., Ikeda T.: Anal. Chim. Acta 310, 161 (1995). 2. Chi Q., Dong S.: Anal. Chim. Acta 278, 17 (1993). 3. Hasebe Y., Takamori K., Uchiyama S.: Anal. Chim. Acta 282, 363 (1993). 4. Choi B. G., Im J., Kim H. S., Park H.: Electrochim. Acta 56, 9721 (2011). 5. Yosypchuk B., Barek J.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 189 (2009). 6. Yosypchuk B., Fojta M., Barek J.: Electroanalysis 22, 1967 (2010). 7. Yosypchuk B., Novotný L.: Electroanalysis 15, 121 (2003). 8. Čížková P., Navrátil T., Šestáková I., Yosypchuk B.: Electroanalysis 19, 161 (2007). 9. Yosypchuk B., Sestakova I.: Electroanalysis 20, 426 (2008). 10. Danhel A., Yosypchuk B., Vyskocil V., Zima J., Barek J.: J. Electroanal. Chem. 656, 218 (2011). 11. Niaz A., Fischer J., Barek J., Yosypchuk B., Sirajuddin, Bhanger M. I.: Electroanalysis 21, 1786 (2009). 12. Danhel A., Shiu K. K., Yosypchuk B., Barek J., Peckova K., Vyskocil V.: Electroanalysis 21, 303 (2009). 13. Barek J., Fischer J., Navratil T., Peckova K., Yosypchuk B., Zima J.: Electroanalysis 19, 2003 (2007). 14. Yosypchuk O., Barek J., Yosypchuk B.: Electroanalysis 24, 2230 (2012). 15. Yosypchuk B., Marecek V.: J. Electroanal. Chem. 653, 7 (2011). 16. Josypčuk B., Fojta M., Yosypchuk O.: J. Electroanal. Chem. 694, 84 (2013). 17. Josypčuk B., Barek J., Josypčuk O.: Anal. Chim. Acta, DOI: /j.aca (2013). 18. Wang Y., Hasebe Y.: Materials Science and Engineering C 32, 432 (2012). 19. Ducey Jr. M. W., Meyerhof M. E.: Electroanalysis 10, 157 (1998). 20. Curey T. E., Salazar M. A., Oliveira P., Javier J., Dennis P. J., Rao P., Shear J. B.: Analytical Biochemistry 303, 42 (2002). 21. Yosypchuk B., Barek J., Yosypchuk O.: Electroanalysis 23, 2226 (2011). 83

86 Construction and Application of Tubular Detector and Porous Flow-through Detector/Reactor of Silver Solid Amalgam for Electrochemical Measurements in Flow Systems Oksana Josypčuk a,b, Jiří Barek a, and Bohdan Josypčuk b a Charles University in Prague, Faculty of Science, University research center UNCE Supramolecular chemistry, Department of Analytical Chemistry, UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Albertov 6, CZ Prague 2, Czech Republic oksana.yosypchuk@natur.cuni.cz b J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of the AS CR, v.v.i., Department of Biophysical Chemistry, Dolejskova 3, Prague, Czech Republic Abstract This paper presents the preparation and application of two new arrangements of silver solid amalgam (AgSA) electrodes for measurements in flow systems tubular detector based on compact AgSA, and flow-through detector (or reactor) prepared from porous AgSA. Both electrodes were tested for electrochemical determinations of reducible inorganic (Cd 2+, Zn 2+ ) and organic (4-nitrophenol, lomustine) compounds under FIA with amperometric detection (Cd 2+, Zn 2+, 4-nitrophenol) and flow-dpv (lomustine). Furthermore, by combination of the porous reactor with immobilized enzyme and tubular detector the flow amperometric enzymatic biosensor was constructed for determination of glucose in a sample of honey and cholesterol and sarcosine in model samples. Key words: electrochemical detector, amperometric detector, silver solid amalgam, enzymatic biosensor. Introduction The silver solid amalgam electrodes have been commonly used in a batch arrangement 1,2 and as a wall-jet or thin layer detector for HPLC/FIA 3-5 of reducible organic compounds. Although the wall-jet and thin layer cells are the most widely used for amperometric detection in flow systems 6,7 both of them have some disadvantages. In the case of the wall-jet arrangement, it is necessary to have the working electrode in well-fixed position at a defined distance from the inlet capillary for obtaining good results, what puts high demands on the precision of the cell construction. Similarly, the thin-layer cell requires precise and sometimes relatively expensive construction. Thus we decided to construct the flow detectors with simpler and robust cell design. The very useful advantage of solid amalgam is the possibility of preparing electrodes of required size and shape. In this presentation, the tubular detector based on compact silver solid amalgam and flow-through detector/reactor based on porous silver solid amalgam are described and tested. Apparatus, methods and chemicals Amperometric and voltammetric measurements were carried out using computer driven electrochemical stand (Polaro-Sensors, Czech Republic) with program MultiElchem v. 2.3 (J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of AS CR, v.v.i., Czech Republic). The FIA apparatus with electrochemical detector comprised of a linear syringe pump NE-1000 (New Era Pump Systems, USA) and sample injector Upchurch Scientific Valve V- 451, (USA) with laboratory-made injecting loop of 20, 50 and 100 µl. The three-electrode detector system consisted of a tubular detector of compact silver solid amalgam (inner diameter 0.5 mm) or flow-through detector of porous silver solid amalgam as a working electrode, a saturated calomel electrode based on silver paste amalgam 8 (laboratory-made, it has the same potential as saturated calomel electrode) and platinum wire 84

87 as auxiliary electrode. At the beginning of each working day an electrochemical activation of V during 300 s in mobile phase was applied. For determination of 4-nitrophenol and lomustine, oxygen was removed from mobile phase and measured solutions by bubbling with nitrogen. All measurements were performed at the room temperature. All chemicals were of p. a. grade and were purchased from Sigma-Aldrich. Results and discussions Preparation of the tubular detector and porous detector/reactor is described in detail in our papers 9,10 (Fig. 1A, B). Briefly, in case of the tubular detector a silver powder was strongly pressed into the Teflon tube (ID 1.5 mm, OD 2.1 mm) and a hole of the same diameter as the inner diameter of the inlet capillary (0.5 mm) was formed along the central part of the silver column. Into the Teflon tube with the silver column mercury was added and after about two hours an excess of mercury was removed. The inner diameter of the used tubular detector is the same (0.5 mm) as the inner diameter of connecting capillaries and the solid amalgam is a continuation of the inlet capillary. In a case of the porous detector (with contact) or reactor (without contact) a piece of Teflon capillary was inserted into the Teflon tube in the place of the planned beginning of the silver solid amalgam column. The Teflon tube and Teflon capillaries had the same parameters as it was mentioned above. A silver powder (particles size 100 mesh, Alfa Aesar, Germany) was gradually added into the upper hole of the tube and was mildly pressed by another piece of the Teflon capillary. As soon as the length of the silver powder column was 10 mm (or other if it was needed), it was rinsed 3 times by 2 mol dm 3 HClO 4 and then mercury was added into this tube to convert silver powder into amalgam. After about 5 min, an excess of mercury was carefully removed from the reactor. The tubular detector was tested under flow injection analysis (FIA) conditions with amperometric detection Nitrophenol, Cd 2+ and Zn 2+ were used as model reducible analytes. Following parameters of FIA-ED determination were optimized with respect to amperometric response: the supporting electrolyte (MP), its concentration and ph, the potential of detection (E d ), the flow rate (v), the sample volume injection (V inj ), and the length of an electrochemically active part of the silver solid amalgam. Under optimal condition (MP(Zn 2+, Cd 2+ ) 0.02 M AcB (ph 4.8), MP(4-NPh) 0.01 M HCl; E d (Zn 2+ ) = V, E d (Cd 2+ ) = V and E d (4-NPh) = V; v = 1.00 ml min 1 ; V inj (Zn 2+, Cd 2+ ) = 100 µl and V inj (4-NPh) = 20 µl) the calibration dependences were obtained over the concentration range mol dm 3 ( ppm) for Zn 2+, mol dm 3 ( ppm) for Cd 2+ and ( ppm) for 4-NPh. The limits of detections of 4-nitrophenol, Zn 2+, and Cd 2+ are , , and mol dm 3, respectively. The obtained results proved the long-term stability of the detector with RSD of the determination of 4-nitrophenol, Zn 2+ and Cd , 0.8 and 0.9 % (n = 10; c Zn = mol dm 3, c Cd = mol dm 3 and c 4-NPh = mol dm 3, e. i. 5 ppm for all substances). Moreover, we would like to show that tubular detector could be applied as an electrode in less frequently used methods in flow voltammetric techniques. For this purpose the antineoplastic drug lomustine was measured by difference pulse voltammetry in flowing system (flow-dvp). The following parameters were optimized: composition of the mobile 85

88 phase (ph of the buffer, concentration of the buffer and the amount of methanol), the flow rate of the mobile phase and the modulation amplitude. The best results were obtain in [0.1 M MES, 2.0 M NaCl, ph 6.0]:EtOH (9:1) with the flow rate of 0.10 ml min 1 and modulation amplitude of 70 mv. The limits of detections of lomustine is mol dm 3 and RSD of repeatability was 1.6 % (n = 25; c = mol dm 3 ). Proposed optimized procedure was successfully used for determination of lomustine in real samples of the medicinal drug CeeNU Lomustine. At this moment, the testing of porous flow-through detector is incomplete, but first results show, that it provides the signal of Cd 2+ about four times higher than the tubular detector. This fact is caused by substantially larger surface area of the porous flow-through detector in comparison with the tubular detector. By combination of the porous reactor with immobilized enzyme and tubular detector the flow amperometric enzymatic biosensor was constructed (Fig. 1C). The first step in preparation of biosensor is formation of self-assembled monolayer of 11-mercaptoundecanoic acid (MUA) at the surface of the porous reactor. Then, the enzyme was covalently attached to MUAmonolayer by EDC/NHS chemistry (N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl) carboimide and N- hydroxysuccinimide) (Fig. 1D). For now, three types of biosensor were prepared by immobilization glucose oxidase from Aspergillus niger (GOx), cholesterol oxidase from Brevibacterium (ChOx) and sarcosine oxidase from Bacillus sp. (SOx) for determination of glucose, cholesterole and sarcosine. During enzymatic reactions of all of these enzymes oxygen is consumed. This decrease of oxygen concentration, which is directly proportional to the concentration of glucose, cholesterol or sarcosine was amperometrically measured on the tubular detector under flow injection conditions. For now, the conditions of determination of glucose in real sample of honey are completely optimized. More detailed information is given in presentation of Bohdan Josypčuk and in our paper 9. The biosensors with immobilized cholesterol oxidase and sarcosine oxidase are under testing. Fig. 1. The schematic diagram of the (A) tubular detector and (B) porous detector/reactor of silver solid amalgam (AgSA); (C) FIA system with biosensor; (D) the scheme of covalent immobilization of enzyme (glucose oxidase, cholesterole oxidase, sarcosine oxidase) using EDC/NHS chemistry onto porous AgSA surface with 11-mercaptoundecanoic acid monolayer. 86

89 Fig. 2. (A) FIA-ED recordings of 4-nitrophenol ( mol dm 3 ) in 0.01 M HCl; E d = V; V inj = 20 µl; v = (1) 2.40, (2) 1.60, (3) 1.00, (4) 0.60 and (5) 0.20 ml min 1 ; (B) DPV voltammograms of lomustine in [0.1 M MES, 2.0 M NaCl, ph 6.0]:EtOH (9:1); v = 0.10 ml min 1 and modulation amplitude of 70 mv in concentration range mol dm 3. Conclusion It was demonstrated that the tubular detector and porous flow-through detector/reactor based on solid silver amalgam (compact and porous) are the effective and low cost devices suitable for monitoring reducible organic and inorganic analytes in flow systems. Moreover, by combination of the porous reactor with immobilized enzyme and tubular detector the flow amperometric enzymatic biosensor could be constructed. The detectors and biosensors show good baseline stability, good repeatability, long-term stability and possibility of measurement at highly negative potentials. Acknowledgements This work was financially supported by Grant Agency of the Czech Republic (Project P206/11/1638 and Project P208/12/1645), Grant Agency of Charles University in Prague (Project /2001/B-Ch/PrF), and Charles University in Prague (project SVV267215). References 1. Yosypchuk B., Barek J.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 189 (2009). 2. Barbosa A. M. J., de Araujo T. A., Trindade M. A. G., Ferreira V. S.: J. Electroanal. Chem. 68, 127 (2012). 3. Danhel A., Shiu K.K., Yosypchuk B., Barek J., Peckova K., Vyskocil V., Electroanalysis 21, 303 (2009). 4. Yosypchuk O., Karásek J., Vyskočil V., Barek J., Pecková K., TSWJ 2012, DOI: /2012/ (2012). 5. Jiranek I., Peckova K., Kralova Z., Moreira J.C., Barek J., Electrochim. Acta 54, 1939 (2009). 6. Trojanowicz M., Anal. Chim. Acta 653, 36 (2009). 7. Trojanowicz M., Anal. Chim. Acta 688, 8 (2011). 8. Yosypchuk B., Barek J., Yosypchuk O.: Electroanalysis 23, 2226 (2011). 9. Josypcuk B., Barek J., Josypcuk O.: Anal. Chim. Acta (2013), DOI: /j.aca Yosypchuk O., Barek J., Yosypchuk B.: Electroanalysis 24, 2230 (2012). 87

90 Simplified Pressure-Controlled Sample Introduction into Separation Capillary in Laboratory-Made Electrophoretic Apparatus (Tlakem řízené hydrodynamické dávkování vzorku do separační kapiláry v laboratorních elektroforetických aparaturách) Tereza Kadlecová a, František Opekar a, and Petr Tůma b a Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry, Albertov 2030, CZ Prague 2, Czech Republic, opekar@natur.cuni.cz b Charles University in Prague, Third Faculty of Medicine, Institute of Biochemistry, Cell and Molecular Biology, Ruská 87, CZ Prague 10, Czech Republic, petr.tuma@lf3.cuni.cz Abstract Standard and most frequently used method of introducing sample into the separation capillary in laboratory electrophoretic apparatus is based on elevation of the vessel with the sample solution sufficiently to generate gravity flow of solution into the sampling end of the capillary which is immersed in the sample vessel. The sample vessel is held in certain elevated position for a defined period of time and then returned to the basic position and replaced with the vessel containing separation buffer. The other modes of hydrodynamic injection require the application of positive pressure to the sample vessel or a negative pressure to the outlet vessel; these methods are common in commercial apparatus. A simplified pressure-controlled method usable in laboratory apparatus is described. It markedly accelerates sample introduction into a separation capillary. Without moving the capillary, sample is introduced by a pressure applied for a defined time-period into a vessel with the sample solution. The pressure is generated by a membrane pump. Except for the manual replacement of the vessel with separation electrolyte for the vessel with sample solution, all other sampling steps are controlled by a computer. The results were compared with those obtained by a standard sampling method utilizing an elevation of the capillary sampling end. Repeatability of the sampling expressed as RSD is for a peak area about one half of that obtained for the standard method. The basic analytical and separation parameters are quite comparable for both methods under identical sampling parameters, 50 mbar/4 s and 10 cm/20 s. The method was tested on the separation of 0.5 mm K +, Na + and tyramine mixture. Key words: Capillary electrophoresis, Hydrodynamic sampling, Pressure-controlled sampling, Laboratory-made apparatus. Úvod Nejběžnější dávkovací technikou v kapilární elektroforéze (CE) je hydrodynamické dávkování 1, u kterého je postupováno tak, že nádobka (vialka) se separačním elektrolytem, v níž je ponořen dávkovací konec kapiláry, je vyměněna za nádobku s roztokem vzorku. Poté je zvýšen tlak nad roztokem vzorku, případně snížen tlak v nádobce koncové. Po nadávkování vzorku je nádobka se vzorkem opět nahrazena nádobkou se separačním pufrem; u komerčních přístrojů se běžně dávkuje tlakem 25 až 100 mbar po dobu 0,5 10 s. V laboratorních elektroforetických sestavách, které jsou stále hojně používány v základním výzkumu 2 i ve školních laboratořích, je zvýšení hydrodynamického tlaku v nádobce se vzorkem realizováno vesměs tak, že experimentátor zvedne na definovanou dobu dávkovací konec kapiláry i s nádobkou se vzorkem do určité výšky oproti výstupnímu konci kapiláry v koncové nádobce 3. Vzorek je nadávkován tlakovým rozdílem p = Δh g, kde Δh je rozdíl výšek hladin u dávkovacího a výstupního konce kapiláry (obvykle 5 10 cm), je hustota roztoku vzorku a g je gravitační zrychlení. Po nadávkování vzorku vrátí experimentátor dávkovací konec kapiláry do základní polohy a nádobku se vzorkem nahradí nádobkou s elektrolytem. Celý postup dávkování je tak ovlivněn subjektivním přístupem experimentátora. 88

91 V této práci je vyvinuta a testována metoda pro dávkování zvýšeným tlakem nad hladinou roztoku v nádobce s roztokem vzorku využitelná i v laboratorních elektroforetických aparaturách. Tlak je generován pumpou, takže dávkovací konec kapiláry je stále ve stejné poloze. Dobu dávkování lze přesně řídit vhodným počítačovým programem, takže subjektivní přístup experimentátora je minimalizován. Jeho činnost spočívá pouze ve výměně nádobek se vzorkem a elektrolytem u dávkovacího konce kapiláry. Zvýšením tlaku nad roztokem v dávkovací nádobce lze řešit i promývání kapiláry mezi jednotlivými separacemi. Jde v podstatě o zjednodušený systém používaný v komerčních elektroforetických sestavách. Experimetální část Principiální schema dávkovací (a promývací) části aparatury je na obr. 1. V plexisklovém bločku (1) je plynotěsně (použitím vhodného těsnění) upevněn dávkovací konec separační kapiláry (2), vialka se separačním elektrolytem nebo roztokem vzorku (3) a elektroforetická elektroda (4). Trubičkou (5) je prostor nad roztokem ve vialce spojen zdrojem tlaku tvořeným dvěma membránovými pumpami (6) a (7) a třícestnými elektromagneticky ovládanými ventily (8) a (9). Na výstupech z pump jsou jednoduché mechanické manostaty pro nastavení a udržování požadovaného tlaku, který tak lze podle potřeby měnit. Dávkovací tlak generovaný pumpou (7) byl kontrolován elektronickým tlakoměrem (10), přesná hodnota promývacího tlaku generovaného pumpou (6) není důležitá. Obr. 1. Schéma dávkovací a promývací části laboratorní elektroforetické aparatury. (1) plexisklový bloček, (2) dávkovací konec kapiláry, (3) nádobka s roztokem vzorku či elektrolytu (vialka), (4) elektroforetická Pt elektroda, (5) vstup pro připojení ke zdoji tlaku, (6) a (7) membránové pumpy, (8), (9) elektromagneticky ovládané třícestné ventilky, (10) měřidlo tlaku. (A), (B) a (C) jsou jednotlivé pracovní pozice třícestných ventilků aktuální otevřená cesta je vyznačena tučně (klidový stav ventilků je znázorněn na obr. B); šipka značí výstup do atmosféry. Dávkovací zařízení pracuje takto: Membránové pumpy jsou v činnosti, manostaty udržují na jejich výstupech konstantní tlak a aparatura může být v jednom ze tří stavů: 89

92 a) Po přepnutí ventilku (9) z klidové do aktivované polohy je vzorek nadávkován tlakem přivedeným po definovanou dobu nad hladinu roztoku vzorku. Tlak je generován pumpou (7), obr. 1A. b) Po skončení dávkování se ventilek (9) vrací do klidové polohy a tlak v nádobce prakticky ihned klesne na hodnotu tlaku atmosférického, obr. 1B. Po výměně nádobky se vzorkem za nádobku se separačním elektrolytem je spuštěna separace. c) Při promývání kapiláry po skončené separaci je na definovanou dobu přepnut do aktivované polohy ventilek (8), takže na hladinu roztoku v nádobce s promývacím roztokem působí tlak generovaný pumpou (6), obr. 1C. Po skončení promývání se ventilek (8) vrací do klidové polohy a tlak v nádobce klesne na hodnotu tlaku atmosférického. V testované aparatuře bylo přepínání ventilků řízeno časovými pulsy generovanými programem vytvořeným v prostředí LabView a odebíranými z universální převodníkové desky PCI-6034E (National Instruments, USA). Je zřejmé, že k jejich přepínání lze použít i jiných způsobů generace potřebných pulsů. Dávkovací zařízení bylo upraveno tak, aby umožňovalo dávkovat i standardním způsobem, tj. zvednutím dávkovacího konce kapiláry, takže oba typy dávkování, testované a standardní, mohly být porovnány. Výsledky a diskuse Z optimalizačních měření vyplynulo, že vhodnými dávkovacími parametry jsou tlak 50 mbar po dobu 4 s. Za těchto podmínek je v použité kapiláře délka nadávkované zóny rovná asi 1 % z celkové délky kapiláry tato hodnota je v souladu s učebnicovým doporučením pro praktické CE analýzy, podle kterého by délka nadávkované zóny neměla překročit 1-2 % z celkové délky kapiláry 4. Promývání bylo prováděno tlakem 1000 mbar po dobu 40 s. Základní analytické parametry získané z elektroferogramů změřených za těchto podmínek byly srovnávány s parametry získanými při standardním způsobu dávkování se srovnatelnými parametry, tj. zvednutím dávkovacího konce kapiláry do výšky 10 cm na dobu 20 s. Ilustrační elektroferogramy jsou na obr. 2. Tabulka I. Porovnání základních analytických parametrů standardního a testovaného hydrodynamického dávkování roztoku vzorku o ekvimolární koncentraci 0,5 mm draselného a sodného iontu. Výsledky jsou z pěti opakovaných měření, statistické hodnocení je uvedeno pro hladinu významnosti 95 %. Experimentální podmínky měření: křemenná kapilára o vnitřním průměru 75 m, celkové délky 57 cm, délky k detektoru 49 cm, separační pufr 20 mm MES/His (ph 6,17), separační napětí/proud, 25 kv/7 A, detekce bezkontaktní vodivostní (C 4 D). Analyt K + ion Na + ion Podíl ploch píků a 1,09 0,03 1,05 0,02 Podíl výšek píků a 1,05 0,01 1,05 0,02 Podíl výšek teoretického patra a 0,99 0,01 0,99 0,12 RSD v %, plochy píků b 1,29 (2,41) 1,20 (2,46) RSD v %, výšky píků b 0,80 (1,22) 1,20 (1,54) a ) Podíl: standardní dávkování/testované dávkování. b ) V závorce jsou uvedeny RSD pro standardní dávkování. 90

93 Obr. 2. Elektroferogramy ekvimolární směsi 50 M draselného (1), barnatého (2), vápenatého (3), sodného (4), hořečnatého (5) a lithného (6) iontu získané při testovaném (A) a standardním (B) dávkování. Experimentální podmínky viz text u tab. I. Z dat v tab. I a obr. 2 je evidentní, že oba způsoby dávkování jsou zcela ekvivalentní. Relativní směrodatné odchylky (RSD) pro plochu píku jsou pro testované dávkování cca o 50 % nižší v porovnání se standardním dávkováním, což jednoznačně dokládá, že u testovaného dávkování je do značné míry eliminován vliv činnosti experimentátora. Dalšími výhodami testovaného dávkování je např. vysoká rychlost dávkování, což umožňuje analýzu většího počtu vzorků za jednotku času a parametry dávkování (tlak, doba) lze velice snadno a reprodukovatelně měnit (především při využití počítačem asistované obsluhy). Závěr Popsaná metoda výrazně usnadňuje a urychluje dávkování vzorku do separační kapiláry v laboratorně sestavovaných elektroforetických aparaturách. Lze ji vřadit do počítačového programu řídícího separační proces ovládání vysokonapěťového zdroje, sběr a zobrazování dat z detektoru atp., a tím minimalizovat lidský faktor při provádění analýz. Poděkování Práce vznikla za finanční podpory Ministerstva školství, mládeže a sportu České republiky, projekt MSM , a Grantové Agentury České republiky, grant č. P206/10/1231. Literatura 1. Jorgenson J. W., Lukacs K. D.: Anal. Chem. 53, 1298 (1981). 2. Vochyánová B., Opekar F., Tůma P., Štulík K.: Anal. Bioanal. Chem. 404, 1549 (2012). 3. Lauer H. H., Rozing G. P.: High Performance capillary Electrophoresis, A Primer. Agilent Technologies, Germany Altria K. D., Fabre H.: Chromatographia 40, 313 (1995). 91

94 Voltammetric Quantification of the Pollutants Nitro Compounds using Glassy Carbon Electrode Mahmoud Khodari, Ekram Rabie, and Omina Fahmy South Valley University, Faculty of Science, Chemistry Department, Qena, Egypt Abstract The voltammetric behavior of some nitro aromatic compound, such as p-nitrobenzoic acid, p- nitrobenzaldhyde and p-nitroaniline, was investigated and the method was developed for the simultaneous determination of these compounds. Adsorption of p-nitrobenzoic acid, p- nitrobenzaldhyde and p-nitroaniline at glassy carbon electrode has been studied using cyclic voltammetry and linear sweep techniques, it was found that p-nitrobenzoic acid in NaH 2 PO 4 (0.05M) as a supporting electrolyte (ph=2), p-nitrobenzaldhyde in Na 2 HPO 4 (ph=10) and p- nitroaniline in NaNO 3 (0.05M) supporting electrolyte (ph=2), give one defined reduction peak and one oxidation peak. The effect of different parameters on the peaks response as supporting electrolyte, ph, deposition time, accumulation potential and scan rate were examined. A detection limit of 1x10-5 mol l - ¹ was obtained under the optimum conditions for three compounds. Key words: Nitro compounds, Linear sweep Voltammetry, Supporting electrolyte, p- nitrobenzoic, p-nitroaniline, p-nitrobenzaldehyde, Glassy carbon electrode. Introduction The determination of Nitro-aromatic compounds is important. These compounds are stable, persistent and toxic Most of these compounds (i) are considered as poison by ingestion, subcutaneous, intraperitoneal and intramuscular routes, (ii) exhibit human mutagenic and carcinogenic potential, (iii) decompose to emit toxic fumes of NO x, and (iv) are potent uncouplers of oxidative- and photo phosphorylation. While those properties render them valuable feedstock for industry. The better electrochemical technique to study the reduction of nitro compound is the cyclic voltammetry. In fact, in aqueous medium, in the absence of inhibitor substances, only one irreversible cyclic voltammetric peak. As glassy carbon (GC) electrodes have been widely used for electrochemical measurements, the effects on the electrochemical responses, of various surface states driven by various surface pretreatments have been studied [1]. Besides polishing the surface with alumina powder, a generally known surface preparation method, other procedures such as heating, electrochemical and chemical oxidations, and laser activation have been employed [2-8]. Regarding these pretreatments, explanations of different electron transfer kinetics from different surface states were suggested [9-13]. It was reported that the activity of the electrode degraded with time because of the adsorption of impurities on the surface [3]. Xiao et al [14] studied the adsorption of p-nitrobenzoic acid (PNBA) at an Au electrode in 0.1 M HCIO4 solutions has been studied by combining cyclic voltammetry, electrochemical quartz crystal microbalance (EQCM), in situ Fourier transforms infrared spectroscopy (FTIRS) and surface enhanced Raman spectroscopy (SERS). Jiri Barek et al. [15] studied the possibilities of electrochemical detection of various explosives containing electrochemically active nitro group. Attention is paid both to the use of traditional mercury electrodes and non-traditional, recently developed electrodes based on mercury amalgams, bismuth films, boron-doped diamond films and carbon films in voltammetric and amperometric mode. 92

95 Experimental Preparation of solutions 1- p-nitrobenzoic acid, p-nitrobenzaldhyde and p-nitroaniline solutions: Stock solution (0.1M) of each (p-nitrobenzoic acid, p-nitrobenzaldehyde and p-nitroaniline) was prepared daily, the solutions of lower concentration for experiments were freshly prepared by appropriate dilution from stock solution prior to each run. The supporting electrolytes and buffers such as disodium hydrogen phosphate, sodium chloride, acetate buffer, and sodium nitrate were prepared using double distilled water. Ten ml of the selected buffer solution was studied in absence and presence of the mentioned compounds using cyclic and linear voltammetric technique at glassy carbon electrode Electrochemical cell and instrumentation A three electrode cell was used consisting of the GC working electrode, a Ag/AgCl reference electrode and a Pt wire auxiliary electrode. A computer-aided electrochemistry system used in the voltammetric studies consists of potentiostat model 263(EG&GPARC) Princeton applied corporation (made in USA) and electroanalytical software model 270/250 version 4.0 (PARC). Parameters for CV and LSV The parameters of cyclic voltammetric measurements at GC electrode were as follows: start potential +0.1 V, end potential -1.0 V, scan rate of 50 mv/s Results and discussion Voltammetric determination of p-nitrobenzoic acid, p-nitrobenzaldhyde and p-nitroaniline was studied using glassy carbon electrode. Different parameters in which affect the peak current and potentials were studied. Electrochemical behavior of the studied compounds The cyclic voltammetric measurement of p-nitrobenzoic acid showed one reduction peak at V and oxidation peak at V. The repetitive cyclic voltammograms of 1x10-4 M of p-nitrobenzoic acid in sodium dihydrogen phosphate buffer (ph 2.00) showed that the reduction peak current decreased in the second cycle.(fig 1) indicating the rapid desorption of the adsorbed form. The same behavior was observed for p-nitrobenzaldhyde in which the reduction peak was observed at V and the oxidation one at V. in the case p-nitroaniline, the reduction peak was detected at and the oxidation one at V. Effect of Supporting, Electrolyte, ph, and scan rate The influence of different supporting electrolytes was examined (sodium chloride, sodium dihydrogen phosphate, disodium hydrogen phosphate, sodium nitrate and B.R). The results showed that, sodium dihydrogen phosphate buffer gave the best peak also the effect of ph (Fig 1) and the concentration of the supporting or the buffer solution was examined. The collected data for the optimum conditions to determine the mentioned compounds are listed in Table I. 93

96 I P ( ) E P (mv) Fig. 1. Effect of ph on the peak response of p-nitrobenzoic, sodium dihydrogen phosphate, (0.05 M) and scan rate of 50mV/s. Effect of Concentration and Calibration Curve The effect of concentration of p-nitrobenzoic acid on the peak current was investigated. The peak current was increased by increasing concentration. Fig. 2 shows the linear sweep voltammograms for different concentrations p-nitrobenzoic acid, 50 mvs -1 scan rates in sodium dihydrogen phosphate buffer (ph 2.00). On plotting concentration of p-nitrobenzoic acid versus the peak current, a linear behavior was observed with standard deviation of 0.53 and correlation coefficient of IP ( ) (a)buffer 35 (b)2x10-4 mol/l k (c)3x10-4 mol/l (d)4x10-4 mol/l j 30 (e)5x10-4 mol/l i (f)6x10-4 mol/l (g)7x10-4 mol/l h 25 (h)8x10-4 mol/l g (i)8x10-4 mol/l (j)9x10-4 mol/l 20 f (k)1x10-3 mol/l c b a d e E P (mv) Fig. 2. Effect of the concentration on the peak response of p-nitrobenzoic, sodium dihydrogen phosphate (0.05 M) and scan rate of 50 mv/s. Analytical applications 94

97 By applying the selected conditions for each compound, the mentioned nitro compounds were determined in industrial waste water and in tap water by spiking. Table I. The optimum conditions for the determination of the compounds of interest. Compound p-nitrobenzoic p-nitrobenzaldhyde p-nitrobenzene acid Supporting or buffer Dihydrogen Dihydrogen Nitric acid phosphate phosphate ph Scan rate (mv/s) Deposition time (s) Deposition potential (V) Determination of the studied compounds in one run: The results indicated the possibility of determination both of p-nitrobenzaldhyde and p-nitroaniline in which two separate peaks were observed. In the presence of p-nitrobenzoic, the peak of p-nitrobenzaldhyde increased indicating that the first peak corresponds p-nitroaniline and the second one corresponds to the other compounds. Conclusion Linear sweep voltammetry can be applied for the determination of the p-nitrobenzoic acid, p- nitrobenzaldhyde and p-nitroaniline using glassy carbon electrode and the method was applied for the determination of the mentioned pollutants in different water samples. References 1. McCreery R. L. In: A. J. Bard (Ed.), Electroanalytical Chemistry, Vol. 17, Marcel Dekker, New York 1991, p Zak J., Kuwana T.: J. Am. Chem. Soc. 104, 5514 (1982). 3. Hu F., Karweik D. H., Kuwana T.: J. Electroanal. Chem. 188, 59 (1985). 4. Fagan D. T., Hu I. F.: Kuwana T.: Anal. Chem. 57, 2759 (1985). 5. Engstrom R. C.: Anal. Chem. 54, 2310 (1982). 6. Engstrom R. C., Strasser V. A.: Anal. Chem. 56, 136 (1984). 7. Poon M., McCreery R. L., Engstrom R.: Anal. Chem. 60, 1725 (1988). 8. Jaworski R. K., McCreery R. L.: J. Electroanal. Chem. 369, 175 (1994). 9. Cabaniss G. E., Diamantis A. A., Murphy W. R., Linton R. W., Meyer T. J.: J. Am. Chem. Soc. 107, 1845 (1985). 10. Chen M. P. C., Frying M. A., McCreery R. L.: Anal. Chem. 67, 3115 (1995). 11. Chen P. C., McCreery R. L.: Anal. Chem. 68, 3958 (1996). 12. Kuo T. C., McCreery R. L. L.: Anal. Chem. 71, 1553 (1999). 13. Rusling J. F.: Anal. Chem. 56, 575 (1984). 14. Xiao, X. Y., Sun, S. G., Electrochimica Acta,:45, 2897 (2000). 15. Barek J., Fischer J., Wang J.: Voltammetric and Amperometric Detection of Nitrated Explosives. In. Sensing in Electroanalysis Vol. 6.; (Kalcher K., Metelka R., Svancara I., Vytras K., Eds.), Vol. 6 University Press Centre, Pardubice, p

98 Applications of Capillary Electrophoresis in Enzyme Assays Tomáš Křížek a, Romana Velvarská a, Veronika Doubnerová b, Helena Ryšlavá b, and Pavel Coufal a a Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry, Albertov 2030, CZ Prague 2, Czech Republic, krizek@natur.cuni.cz b Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Biochemistry, Albertov 2030, CZ Prague 2, Czech Republic Abstract In this work, we present several applications that manifest the potential of capillary electrophoresis in enzyme assays. Capillary electrophoresis was employed to perform offline and online assays of -N-acetylhexosaminidase for three different substrates. Offline assays were successfully utilized to monitor the enzyme reaction and to determine parameters such as ph and temperature optimum. The offline assay was also used to compare activities of the enzyme towards the natural and chromogenic substrates. Finally, an online enzyme assay was developed and proved to be highly beneficial for inhibitor screening. Key words: Capillary electrophoresis, Enzyme activity, -N-acetylhexosaminidase, Chitotriose, Chitobiose, Electrophoretically mediated microanalysis. Introduction Determination of enzyme activity is an essential research tool in biochemistry and molecular biology. Enzyme assays are also utilized in medicine because an abnormal activity of certain enzymes can be used for diagnosis of many diseases including metabolic, infectious and cancer 1,2. Capillary electrophoresis (CE) is a well-suited technique for enzyme assays due to its high separation power, extremely low sample consumption and versatility of experimental design. The first offline enzyme assay (enzyme reaction was performed outside the CE system) was published in The first online assay (enzyme reaction was performed inside the capillary) was reported one year later 4. Online CE enzyme assays are frequently referred to as Electrophoretically Mediated Microanalysis (EMMA). Numerous works on offline and online enzyme assays have been published since then 5,6. Nowadays, at-inlet reaction technique, introduced into EMMA by van Dyck et al. 7, is the prevailing approach. Enzyme and substrate are mixed inside the inlet part of the capillary, either electrophoretically or by diffusion. Then reaction proceeds for a specified period of time followed by electrophoretic separation of products and remaining substrate. One of the recent developments in EMMA is so called Transverse Diffusion of Laminar Flow Profiles (TDLFP) model introduced by Krylov et al. 8 TDLFP enables in silico prediction and optimization of the at-inlet mixing of substrate and enzyme. Here, we present an EMMA assay developed using the TDLFP model. Enzyme assays presented in this work were developed for -N-acetylhexosaminidase (Hex, EC ). The enzyme in question hydrolyzes terminal -linked N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc) and N-acetyl-D-galactosamine residues of oligosaccharides and glycoconjugates. Hex is found in fungi and bacteria as a part of binary chitinolitic systems. Furthermore, it is present in humans. Certain mutations of human Hex genes cause inborn metabolic malfunctions known as Tay-Sachs and Sandhoff disease. In our study, dimer and trimer of GlcNAc, i.e. N,N -diacetylchitobiose (chitotriose) and N,N,N -triacetylchitotriose (chitobiose), served as substrates for Hex. Unlike UV/VIS spectrometry, CE enabled us to work directly with these natural substrates. Furthermore, 4-nitrophenyl-N,N -diacetyl- -Dchitobioside (NP-chitobiose) was used as a substrate in order to compare the activity of Hex towards the O-glycosidic bonds in natural and chromogenic substrates. 96

99 Experimental Sodium tetraborate, p.a., citric acid, p.a., and sodium hydroxide, p.a., were purchased from Lachema (Czech Republic). N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc), >99%, N,N - diacetylchitobiose (chitobiose), >96%, N,N,N -triacetylchitotriose (chitotriose), >95%, 4- nitrophenyl-n-acetyl- -D-glucosaminide (NP-GlcNAc), >99%, and 4-nitrophenyl-N,N - diacetyl- -D-chitobioside (NP-chitobiose), >95%, were ordered from Sigma-Aldrich (USA). -N-acetylhexosaminidase (Hex) from A. oryzae was isolated following the procedure described in ref. 9. All samples and background electrolytes (BGE) were prepared using deionized water produced by a Mili-Q system, Millipore (USA). CE experiments were performed on a G1600 CE instrument (Agilent Technologies, Germany). A fused-silica capillary of 75 m i.d. (CACO, Slovakia) was cut to 65.0 cm total length (56.5 cm to the detection window). Prior to the first use, capillary was rinsed with 1 M NaOH for 20 min and then with water for 10 min using a pressure of 100 kpa. Between consecutive runs, capillary was rinsed for 2 minutes with BGE. Capillary was tempered to 25 C using an air-cooling system. The 200 nm wavelength was used for data evaluation using the ChemStation software (Agilent Technologies, Germany). Separation voltage was 12 kv (15 kv for the ph 9.2 buffer), samples were injected using a voltage of 5 kv for 5 s. 25 mm tetraborate buffer was used as the BGE. The ph of BGE was adjusted to 9.2, 10.0 and 10.3 depending on the mixture of analytes to be separated. All samples were dissolved in 50 mm citrate buffer, ph 4.5, in which enzyme reactions were performed, too. To optimize the EMMA assay, TDLFP program 10 was used. In the optimized method, all the zones were injected using a pressure of 5 kpa in the following order: reaction buffer (3 s), enzyme (3 s), substrate (3 s), enzyme (3 s) and reaction buffer (9 s). All the injected zones had the matrix of reaction buffer. After completing the injection sequence, reaction proceeded for 10 min and then separation voltage of 12 kv was applied. 25 mm tetraborate buffer, ph 10.0 was used as BGE. Results and Discussion To perform enzyme assays with chitobiose, chitotriose and NP-chitobiose as substrates, three different sets of analytes had to be separated. 1) Chitobiose and GlcNAc, 2) chitotriose, chitobiose and GlcNAc, 3) NP-chitobiose, chitobiose, NP-GlcNAc, and GlcNAc. Separation of the first set was achieved in simple 25 mm sodium tetraborate, ph 9.2. To separate chitotriose from chitobiose in the second set, ph had to be elevated to 10.0, so that the increased dissociation of hydroxyl groups of the analytes in combination with the electroosmotic flow (EOF) slowing down enabled baseline separation. In order to separate analytes in the third set, the ph value had to be further elevated to However, the ph value was kept as low as possible in all cases because increasing ph resulted in prolonging analysis times and decreasing separation efficiency caused by slowing EOF and increasing current in the capillary. Separations of the three sets of analytes are shown in Figure 1. The three separation methods were utilized for offline enzyme assays of Hex. Enzyme reaction was performed in a sample vial in a total volume of 40 L. Reaction was terminated by injection to the capillary. Therefore, the reaction could continue in the rest of the reaction mixture. This was utilized for completely automated monitoring of the composition of reaction mixture during the reaction (Figure 2). Separation was shortly interrupted every 5 minutes and a new sample of the same reaction mixture was injected. Using this method, 10 separations were achieved in 60 minutes even though one separation lasted 15 minutes. 97

100 10 mau NP-B NP-G B ph 10.3 G ph 10.0 T B G ph 9.2 B G t mig [min] Fig. 1. Separation of substances, intermediates, and products of Hex enzyme in 25 mm tetraborate buffer of varied ph. Peak identification: NP-B, NP-chitobiose; NP-G, NP-GlcNAc; T, chitotriose; B, chitobiose; G, GlcNAc. Concentration of analytes: 1 mmol/l. Changes in concentrations of chitotriose as substrate, chitobiose as intermediate and GlcNAc as final product are depicted in Fig. 2B. The offline assay was also utilized to explore the differences in activity of Hex towards natural and chromogenic substrates. In chromogenic substrates, O-glycosidic bond between two saccharide units is simulated by O-glycosidic bond between one saccharide unit and 4-nitrophenyl moiety. The enzyme hydrolyzes this bond and releases 4-nitrophenol whose absorbance is utilized for UV spectrometric determination. We performed the offline Hex hydrolysis of NP-chitobiose that contains both, natural and chromogenic O-glycosidic bonds. Figure 3 shows that no chitobiose appeared during the reaction. Hence, the natural O-glycosidic bond is strongly preferred by the enzyme, giving rise to NP-GlcNAc and GlcNAc. NP-GlcNAc is consequently cleaved to GlcNAc and 4-nitrophenol in a significantly lower rate. 4-nitrophenol was impossible to determine using our method because its electrophoretic mobility was too high and its overall motion in the capillary was towards the anode. Analyte thus escaped from the capillary inlet. Nevertheless, determination of 4-nitrophenol was not necessary to draw the conclusions stated above. The EMMA assay of Hex for chitobiose as a substrate was developed using the TDLFP model 11. Results of in silica optimization were in an excellent agreement with the results of experiments. First, the order of injected zones was optimized. According to the TDLFP model, the most efficient mixing of the reagents occurs when a sequence substrate-enzymesubstrate or enzyme-substrate-substrate is injected using equal injection pressures and times. After this, a zone of reaction buffer is to be injected for a three times longer period of time. Both model and experiment, showed that the enzyme-substrate-enzyme order is more efficient due to the higher diffusion coefficient of the substrate. Injection time was the second parameter optimized. The predictions of the model were in agreement with experiment in this case, too. The longer injection time, the higher were peaks and thus the higher was measurement sensitivity. On the other hand, while the injection times were increased from 3 to 5 s the zones became too long to be efficiently mixed. The injection pressure was kept the highest value available in the instrument (5 kpa) in order to fulfill the presumption of TDLFP model parabolic profile of injected zones. 98

101 c.10 3 [mol.l -1 ] A A t mig [min] 1.5 B t reaction [min] Fig. 2. Monitoring of enzymatic cleavage of chitotriose. Offline assay with injections of the reaction mixture repeated in 5-minute intervals. (A) Electropherogram. (B) Composition of reaction mixture during the reaction. ( ) Chitotriose, ( ) chitobiose, ( ) GlcNAc. 25 mm tetraborate buffer, ph 10.0, separation voltage 12 kv, injection 5 kv 5 s. The online enzyme assay brings remarkable advantages of extremely low consumption of enzyme and substrate (tens of nanoliters per run) and complete automation. This kind of assay is very well suited especially for comparative enzyme assay, i.e. comparing activity of different samples and/or activities measured under different conditions. An example of such comparative measurement is screening for inhibitors of enzymes that is frequently performed in pharmaceutical research. Figure 4 shows the decrease of Hex activity with increasing concentration of N,N-dimethylformanide (DMF) in reaction mixture monitored using the EMMA assay. 99

102 % activity 5 mau NP-B NP-G 10 min G NP-G 30 min NP-B G 50 min NP-G G t mig [min] Fig. 3. Separation of reaction mixture components during the hydrolysis of NP-chitobioside with Hex after 10, 30 and 50 minutes of reaction. Peak identification: (NP-B) NP-chitobiose, (NP-G) NP-GlcNAc, (T) chitotriose, (B) chitobiose, (G) GlcNAc. 25 mm tetraborate buffer, ph 10.3, separation voltage 12 kv, injection 5 kv 5 s. A DMF B 0.1 % DMF 0.2 % DMF 0.5 % DMF 5 mau t mig [min] G 100 B % (v/v) DMF Fig. 4. Monitoring of inhibition of Hex enzyme by DMF using the online assay. (A) Electropherograms of reaction mixture containing varied concentration of DMF. (B) Proportion of original Hex activity in presence of different concentrations of DMF. Peak identification: (DMF) N,N-dimethylformamide, (B) chitobiose, (G) GlcNAc. 25 mm tetraborate buffer, ph 10.0, separation voltage 12 kv. Conclusion The versatility of capillary electrophoresis allowed us to tune the separation conditions in order to perform enzyme assays with different substrates and to achieve different goals. Offline assays were successfully employed for monitoring of enzyme reaction, its intermediates and final products. For comparative measurements of enzyme inhibition, we utilized online assay with high degree of automation and extremely low sample consumption. Acknowledgement This work was financially supported by Charles University in Prague, projects GAUK 710 and SVV , by the Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic, project MSM and by the Czech Science Foundation, project P206/12/G

103 References 1. Raja M. M. M., Raja A., Imran M. M., Santha A. M. I., Devasena K.: Biotechnology 10, 51 (2011). 2. Zhao Y., Liu H., Riker A. I., Fodstad O., Ledoux S. P., Wilson G. L., Tan M.: Fron. Biosci. 16, 1844 (2012). 3. Krueger R. J., Hobbs T. R., Mihal K. A., Tehrani J., Zeece M. G.: J. Chromatogr. 543, 451 (1991). 4. Bao J. M., Regnier F. E.: J. Chromatogr. 608, 217 (1992). 5. Glatz Z.: J. Chromatogr. B 841, 23 (2006). 6. Fan Y., Scriba G. K. E.: J. Pharm. Biomed. Anal. 53, 1079 (2010). 7. Van Dyck S., Van Schepdael A., Hoogmartens J.: Electrophoresis 22, 1436 (2001). 8. Okhonin V., Liu X., Krylov S. N.: Anal. Chem. 77, 5925 (2005). 9. Slámová K., Bojarová P., Petrásková L., Křen V.: Biotechnol. Adv. 28, 682 (2010). 10. Krylov S. N.: TDLFP program, York University, Toronto, Canada, Downloaded on 2 nd July Křížek T., Doubnerová V., Ryšlavá H., Coufal P., Bosáková Z.: Anal. Bioanal. Chem. 405, 2425 (2013). 101

104 Electrochemical Properties of Branched Pyridinium Cations (Elektrochemické vlastnosti rozvětvených pyridiniových kationtů) Štěpánka Lachmanová a, Magdaléna Hromadová a, Lubomír Pospíšil a, and Philippe P. Lainé b a J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of the AS CR, v.v.i., Dolejškova 3, Prague 8, Czech Republic, stepanka.lachmanova@jh-inst.cas.cz b University Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, ITODYS, UMR 7086 CNRS, 15 rue Jean Antoine de Baif, Paris, France Abstract The electrochemical properties of branched extended pyridinium cations depend strongly on the structure of the molecule. This work is focused on the redox processes of the electron transfer of four derivatives of pyridinium. The electron transfer mechanism was studied by various electrochemical methods. Although the structures of the studied molecules seem to be quite similar, 1-N-methyl-2,4,6-triphenylpyridinium and 1',3',5'-trimethyl-2,4,6-triphenyl-1,4'- bipyridine-1,1'-diium are reduced in two separate one-electron transfer steps. On the other hand, 1'-methyl-2,4,6-triphenyl-1,4'-bipyridine-1,1'-diium and 1',3,5-trimethyl-2,4,6- triphenyl-1,4'-bipyridine-1,1'-diium accept two electrons, but in a single two-electron transfer. The heterogeneous rate constants of the electron-transfer processes were determined. Key words: Pyridinium cation, Electron transfer, Heterogeneous rate constant, Phasesensitive AC voltammetry, Electrochemical impedance spectroscopy, DC polarography, Cyclic voltammetry. Úvod Vlastnosti prodloužených pyridiniových molekul jsou v současné době hojně studovány zejména pro jejich možné využití v elektronice. I poměrně malé změny v jejich struktuře mohou vést k významným rozdílům v jejich chování 1-3. V této práci byly studovány čtyři molekuly, jejichž struktura je znázorněna na Obr. 1 za účelem určení heterogenních rychlostních konstant procesu přenosu elektronů. Obr. 1. Strukturní vzorce studovaných pyridiniových kationtů. Experimentální část Veškerá elektrochemická měření byla prováděna za použití potenciostatu s rychlou odezvou, který byl zkonstruován v Ústavu fyzikální chemie J. Heyrovského AVČR, v.v.i., v Praze. Spojení potenciostatu s počítačem zajišťovalo IEEE rozhraní (PC-lab, AdvanTech Co., Model PCL-848). Digitalizace měřených výstupů byla provedena za využití PCL-818 karty o

105 bitové přesnosti (AdvanTech Co., USA). Pro AC voltametrii a elektrochemickou impedanční spektroskopii byl výše uvedený potenciostat použit v kombinaci s dvoufázovým lock-in zesilovačem SR 830 (Stanford Research Systems, USA). Měření probíhala v elektrochemické cele v tříelektrodovém zapojení. Jako pracovní elektrody byly použity statická (SMDE) a visící rtuťová kapková elektroda (HMDE, Laboratorní přístroje Praha). Jako pomocná elektroda sloužila platinová síťka. Referentní argentochloridová elektroda Ag AgCl 1M LiCl byla od měřeného roztoku oddělena solným můstkem. Rozpuštěný kyslík byl z roztoků před měřením odstraňován proudem argonu, samotná měření probíhala pod argonovou atmosferou. Získaná data byla zpracována v programu Origin 8 (OriginLab Co., USA). Postup syntézy a charakterizace studovaných látek 1-N-methyl-2,4,6-trifenylpyridinium (látka A), 1',3',5'-trimethyl-2,4,6-trifenyl-1,4'-bipyridin-1,1'-diium (B), 1'-methyl-2,4,6-trifenyl-1,4'- bipyridin-1,1'-diium (C) a 1',3,5-trimethyl-2,4,6-trifenyl-1,4'-bipyridin-1,1'-diium (D) byly již popsány. 1,2 Měřené roztoky byly vždy připraveny rozpuštěním odpovídajícího množství analytu v roztoku 0,1M hexafluorofosfátu tetrabutylamonného (TBAPF 6, Fluka, čistota minimálně 99 %, před použitím dosušen při teplotě C) zbaveného rozpuštěného kyslíku. Dimethyl sulfoxid (DMSO) byl dodán firmou Sigma-Aldrich, USA o čistotě p. a. a byl po dodání uchováván pod inertní atmosférou. Bezvodý acetonitril byl také dodán firmou Sigma-Aldrich, USA o čistotě 99,8 %. Výsledky a diskuze Elektrochemická analýza všech studovaných látek byla provedena ve dvou rozpouštědlech acetonitrilu a DMSO. Látky vykazují v DMSO vyšší rozpustnost, ale zároveň je v tomto rozpouštědle znesnadněné měření při vysokých frekvencích. Rozpustnost látek v acetonitrilu byla pro měření dostačující, nicméně se látky v tomto rozpouštědle silně adsorbovaly na povrch pracovní elektrody a tím docházelo ke zkreslení výsledných dat. Vliv adsorpce je obecně při studiu prodloužených pyridiniových molekul nezanedbatelný 4. Mnoho prodloužených pyridiniových molekul je přímo syntetizováno pro dosažení co nejsilnější adsorpce pro jejich snadnější studium některými metodami 5. Nicméně v tomto případě je žádoucí volit takové podmínky, aby byla adsorpce analytů co nejslabší. Látka A se v potenciálovém rozsahu 0,2 V až 1,5 V redukuje celkem dvěma elektrony, přičemž se jedná o oddělené reverzibilní jednoelektronové přenosy. Počet přenesených elektronů byl potvrzen nejen porovnáním výšky signálu se signálem ferrocenu, ale také úplnou elektrolýzou roztoku. Dva po sobě následující procesy přenosu jednotlivých elektronů byly zaznamenány v acetonitrilu i v DMSO. Obdobně jako látka A se v obou použitých rozpouštědlech chová i látka B, která také přijímá dva elektrony v oddělených krocích. Rozdíl ve struktuře těchto látek se projevil nejen posunem redukčních signálů do méně negativních potenciálových oblastí, ale i přítomností třetí redukční vlny v daném potenciálovém rozsahu, která je způsobena redukcí lutidylového substituentu látky B. Pro látky C a D bylo oproti předchozím případům zaznamenáno značně odlišné elektrochemické chování. Obě tyto látky vykazují obdobné redoxní chování, v potenciálovém rozsahu 0,2 V až 1,0 V se redukují dvěma elektrony, nicméně v pouze jednom dvouelektronovém procesu. Tento jev je pozorovatelný v acetonitrilu i v DMSO. Strukturní rozdíly mezi látkami C a D se projevily v odlišné reverzibilitě procesu elektronového transportu. Látka C vykazuje při cyklické voltametrii v DMSO reverzibilní přenos obou 103

106 elektronů při rychlostech polarizace elektrody 0,06 V/s až 2 V/s. Látka D se však redukuje reverzibilně až při rychlosti polarizace elektrody vyšší než 0,5 V/s. Tento jev ukazuje na probíhající strukturní změnu během procesu. Všechny zde uvedené látky byly studovány i za využití fázově citlivé AC voltametrie a elektrochemické impedanční spektroskopie (EIS). Vypočítané hodnoty heterogenní rychlostní konstanty ukazují na velice rychlý proces elektronového přenosu v obou krocích redukce látek A a B. U látek C a D dochází v DMSO v porovnání s předchozí dvojicí látek k výrazně pomalejšímu přenosu prvního elektronu. Závěr Přenos prvního elektronu na molekulu látky A i B je velice rychlý proces spojený se změnou struktury látky. Po překonání energetické bariéry vložením negativnějšího potenciálu na elektrodu dochází k rychlému přenosu druhého elektronu. U látek C a D je přenos prvního elektronu velice pomalý, ale redukce druhým elektronem probíhá velmi rychle a prakticky okamžitě, bez nutnosti překonat energetickou bariéru jako u předchozí dvojice látek. Z tohoto důvodu dochází ke kompresi potenciálů a tím i ke splynutí signálů přenosu jednotlivých elektronů. Acknowledgement This work was supported by the Academy of Sciences of the Czech Republic (M ). Literatura 1. Fortage J., Peltier C., Perruchot C., Takemoto Y., Teki Y., Bedioui F., Marvaud V., Dupeyre G., Pospisil L., Adamo C., Hromadova M., Ciofini I., Laine P.: J. Am. Chem. Soc. 134, 2691 (2012). 2. Fortage J., Peltier C., Nastasi F., Puntoriero F., Tuyeras F., Griveau S., Bedioui F., Adamo C., Ciofini I., Campagna S., Laine P.: J. Am. Chem. Soc. 132, (2010). 3. Fortage J., Tuyeras F., Peltier C., Dupeyre G., Calborean A., Bedioui F., Ochsenbein P., Puntoriero F., Campagna S., Ciofini I., Laine P.: J. Phys. Chem. A 116, 7880 (2012). 4. Hromadová M., Kolivoška V., Sokolová R., Gál M., Pospíšil L., Valášek M.: Langmuir 26, (2010). 5. Kolivoska V., Valasek M., Gal M., Sokolova R., Bulickova J., Pospisil L., Mezsaros G., Hromadova M.: J. Phys. Chem. Lett. 4, 589 (2013). 104

107 Malondialdehyde as a Biomarker of Oxidative Damage (Malondialdehyd jako biomarker oxidativního poškození) Jana Matějčková, Eva Samcová, and Petr Tůma Charles University in Prague, Third Faculty of Medicine, Department of Biochemistry, Cell and Molecular Biology, Ruská 87, CZ Prague 10, Czech Republic jana.matejckova@seznam.cz Abstract The level of malondialdehyde (MDA) as the most abundant metabolite of lipoperoxidation was determined by an optimized HPLC method with UV detection in blood plasma. Two groups of patients along with healthy controls were examined, diabetics (found the average concentration of MDA 9 M in Diabetes mellitus I, and 7 M in Diabetes mellitus II) and patients with gynaecological cancer (11 M). Another study verified that surgical removal of the tumour led to increase plasmatic concentration of MDA and vitamin E was shown as a suitable supplement in the surgical procedure. The other examined group were vegans, which was found the lowest level of MDA i. e. 5 M concentration of MDA in blood plasma. Key words: Malondialdehyde, Diabetes mellitus, Vegans, Gynaecological cancer, vitamin E Úvod Jedním z biomarkerů oxidativního poškození biomembrán je malondialdehyd (MDA) 1. MDA vzniká při peroxidaci polyenových mastných kyselin. Neenzymatická peroxidace lipidů je vyvolána nespecifickým, mnohdy patologickým, faktorem. Při této reakci se řetězce modifikovaných mastných kyselin snadno štěpí na kratší produkty, včetně uhlovodíků, které vydechujeme (ethan, pentan) a toxických aldehydů jako je MDA (Obr. 1). Obr. 1. Peroxidace lipidů a vznik malondialdehydu. Peroxidací lipidů dochází ke změně propustnosti membrán, zvyšuje se membránová propustnost pro ionty a tím působí lýzu buněk a snižuje se membránový potenciál. Lipoperoxidací uvolněný MDA se kovalentně váže přes aminovou nebo thiolovou skupinu na proteiny a nukleové kyseliny a tím je poškozuje. U proteinů dochází k agregaci a stávají se citlivější k proteolytické degradaci 2,3. Vysoká hladina MDA byla nalezena v souvislosti s četnými akutními i chronickými patologickými procesy v organismu. Vysoké hladiny MDA byly prokázány u pacientů s Diabetes mellitus 4-6, neurodegenerativním onemocněním (Alzheimerova a Parkinsonova choroba) 7,8, u preeklampsie 9,10, u rakovinného bujení 11,12, ale také např. u kuřáků

108 Experimentální část Klinický experiment Hladina MDA byla sledována u několika skupin pacientů. Všechny vzorky krve byly odebírány do odběrových zkumavek Vacuette s antikoagulantem EDTA (Greiner Bio-one, Německo) a následně byly centrifugovány 4 min. při zrychlení 1780 g. Vzorky krevní plazmy byly dlouhodobě uchovány při teplotě 20 o C. Sledované skupiny pacientů: 1. Diabetes mellitus Do studie bylo zahrnuto 22 pacientů s indikovaným diabetes mellitis I. typu a 28 pacientů s Diabetes mellitus II. typu léčených na II. interní klinice Fakultní nemocnice Královské Vinohrady v Praze. Pacienti přišli na odběr krve v ranních hodinách, nalačno. 2. Onkologické pacientky: celkem 19 pacientek s indikací karcinomu endometria, cervicis nebo ovarií léčené na Gynekologicko-porodnické klinice Fakultní nemocnice Královské Vinohrady v Praze. Do studie bylo zahrnuto 7 zdravých kontrol stejného věku. Pacientky podstoupily chirurgické odstranění karcinomu a byly rozděleny do dvou skupin. První den, 24 hodin před plánovanou operací (ve 13 hodin), byl každé pacientce odebrán vzorek venózní krve. Jedné skupině bylo 18 hodin před plánovanou operací podáno 1200 mg vitaminu E (Zentiva Sanofi, Česká Republika). Kontrolní skupina byla bez suplementace vitaminem E. Druhý den podstoupily pacientky operaci, kdy jim byl nádor chirurgicky odstraněn a hned po operaci (opět ve 13 hodin) jim byl odebrán další vzorek krve. Následující den, tj. 24 po operaci, byl odebrán poslední vzorek krve. 3. Vegani: 13 vzorků krve bylo získáno od veganů ze studie Vegge, která probíhala na II. interní klinice Fakultní nemocnice Královské Vinohrady. Odběr byl proveden v ranních hodinách, pacienti byli na lačno. HPLC stanovení HPLC měření byla provedena na přístroji HPLC (Schimadzu, Japonsko), zahrnujícím pumpu LC-10ADvp, autosampler SIL-10ADvp, UV/Vis detektor SPD-10Avp. Použita byla kolona Ascentis Express C18 (Sigma-Aldrich / Supelco, Německo) o rozměrech 100 x 3,0 mm s velikostí částic 2,7 m, která byla termostatována na 30 o C. Mobilní fáze byla míchána z acetonitrilu (LachNer, 99%) a deionizované vody (okyselené CH 3 COOH) v poměru 40:60 (v/v) po celou dobu analýzy. Průtok mobilní fáze byl 0,4 ml/min s maximálním tlakem 27 MPa. Odezva detektoru byla zaznamenávána při vlnové délce 307 nm. Pro ovládání přístroje a vyhodnocení chromatogramů byl použit software LCSolution verze 1.11SP1. Vzorky krevní plazmy byly připraveny použitím 100 l rozmražené krevní plazmy, která byla smíchána se 100 l interního standardu methylmalondialdehyd (MeMDA, 50 M) a 400 l 1,5 mol l -1 NaOH. Takto připravená směs pro alkalickou hydrolýzu biologického materiálu byla zahřívána při teplotě 60 o C po dobu 60 min. Po vychladnutí bylo ke směsi přidáno 200 l 35% HClO 4. Směs byla protřepána a centrifugována po dobu 4 min při zrychlení 7000 g. Veškerý supernatant byl odebrán a derivatizován 50 l 5 mm 2,4-dinitrofenylhydrazinem (po dobu 30 min při 60 o C) a následně extrahován dvakrát do 2 ml hexanu. Extrakt byl vysušen proudem dusíku při 40 o C, rozpuštěn v 250 µl mobilní fáze a 5 µl takto připraveného vzorku bylo nadávkováno na kolonu

109 Výsledky a diskuse Diabetes mellitus I. a II. typu Diabetes mellitus (DM) je vždy provázen oxidačním stresem. V krvi a tkáních diabetiků je prokazatelná vyšší tvorba reaktivních forem kyslíku a lipoperoxidů 2. To bylo potvrzeno i naším měřením, kdy pacienti s DM I měli o 50 % a pacienti s DM II mají o 25 % vyšší hladinu MDA než kontrolní skupina (Tabulka I). Tyto rozdíly jsou na hladině významnosti 0,05 statisticky významné dle testu ANOVA i t-testu. MDA způsobuje zesíťování (cross linking) s kolagenem a ten může být posléze glykován a takto glykovaný kolagen způsobuje další peroxidaci lipidů a tím další vznik MDA 5,15. Tabulka I. Koncentrace MDA u pacientů s DM I, DM II a zdravých kontrol. Parametr DM I DM II Kontrola Průměrná koncentrace MDA, M 8,9 ± 2,8 7,4 ± 2,2 5,9 ± 0,8 Koncentrační rozmezí MDA, M 5,2 13,3 4,4 12,4 4,8 7,7 Průměrný věk pacientů, roky 43,9 ± 14,9 64,9 ± 11,3 42,3 ± 10,6 Počet jedinců Pacientky s indikací gynekologického karcinomu U pacientek s gynekologickým karcinomem je průměrná hladina koncentrace MDA 10,7 M a u zdravých kontrol byla koncentrace MDA 6,9 M (Tabulka II). Koncentrace MDA u pacientek s karcinomem je o 55 % vyšší než u zdravých kontrol. Tento rozdíl je statisticky významný na hladině významnosti 0,05, což bylo prokázáno použitím testu ANOVA i t-testu. Zvýšená hladina MDA u pacientek s karcinomem je způsobena zvýšenou mírou oxidativního stresu v průběhu karcinogeneze, který se projevuje zvýšenou lipoperoxidací 16,17. Pacienti mají sníženou antioxidační ochranu, protože karcinom antioxidanty spotřebovává. MDA může podporovat vznik a růst nádoru, protože může reagovat s funkčními skupinami dalších buněčných složek a ty mohou poté působit další růst karcinomu 18. Tabulka II. Koncentrace MDA u pacientek s karcinomem a zdravých kontrol. Parametr Karcinom Kontrola Průměrná koncentrace MDA, M 10,7 ± 1,5 6,9 ± 1,8 Koncentrační rozmezí MDA, M 8,2 13,1 4,3 9,0 Průměrný věk pacientů, roky 65,2 ± 11,6 55,6 ± 12,3 Počet jedinců 19 7 Vliv podání vitaminu E u pacientek s gynekologickým karcinomem Na začátku sledování měly obě skupiny (s vitaminem E i kontrolní skupina) srovnatelnou hladinu MDA. Statisticky významný rozdíl (p > 0,05, ANOVA, t-test) se potvrdil mezi skupinami již u druhého vzorku (1 hod po operaci). I druhý den po operaci byly hodnoty koncentrace MDA u obou skupin statisticky rozdílné. Zároveň byl odhalen i rozdíl u skupiny bez vitaminu E mezi odběrem 24 hodin před operací a hodinu po operaci, stejně tak i 24 hodin po operaci, tzn. chirurgický zákrok vedl ke zvýšení hladiny MDA. Výsledky ukazují, že jednorázové podání vitaminu E několik hodin před operací účinně ovlivnilo negativní účinek operace na poškození biomembrán. Tento výsledek potvrzuje výsledky studie účinků vitaminu E na snížení hladiny MDA u pacientů s DM I

110 Tabulka III. Koncentrace MDA v průběhu operace odstranění gynekologického karcinomu u pacientek s podaným vitaminem E a bez něj. Parametr Vitamin E Kontrola 1. odběr 24 hod. před operací, MDA, M 10,1 ± 1,2 10,1 ± 1,0 2. odběr 1 hod. po operaci; MDA, M 11,2 ± 1,2 13,8 ± 2,9 3. odběr 24 hod. po operaci; MDA, M 10,2 ± 1,5 13,1 ± 1,8 Počet jedinců 10 8 Vegani Hladina MDA byla proměřena u veganů, kteří minimálně tři roky nepožívali žádné živočišné produkty. Vegani nekonzumují žádné maso, ale ani vejce a mléčné výrobky 20. Většina veganů suplementovala vitamin B12 a vitamin D2. Koncentrace MDA u kontrolní skupiny (5,8 ± 0,8 M) je o 20 % vyšší než průměrná koncentrace MDA u veganů (4,9 ± 0,8 M). Tento rozdíl je na hladině významnosti 0,05 statisticky významný podle obou testů ANOVA i t-testu. Průměrný věk obou skupin je srovnatelný a také je téměř stejná hodnota body mass indexu (BMI). Nižší hladina MDA může být způsobena veganskou stravou, která obsahuje vysoké množství rostlinných bílkovin, polysacharidů, vlákniny, hořčíku, draslíku, kyseliny listové a antioxidantů, jako je vitamín C a E a tím chrání lipidy před lipoperoxidací 20. Tabulka IV. Koncentrace MDA veganů a kontrolní skupiny. Parametr Vegani Kontrola Průměrná koncentrace MDA, M 4,9 ± 0,8 5,8 ± 0,8 Koncentrační rozmezí MDA, M 3,8 6,7 5,1 8,0 Průměrný věk, roky 29,1 ± 4,8 28,1 ± 3,6 Průměrné BMI, kg m -2 22,4 ± 2,82 22,8 ± 3,4 Počet jedinců Závěr Optimalizovaná metoda HPLC umožňuje provádět rychlý screening indikátoru MDA v krevní plasmě. Provedené klinické studie odhalily zvýšenou hladinu MDA u pacientů s Diabetes mellitus a u pacientek s nádorem vaječníků, děložního čípku a endometria. Naopak u veganů, kteří po tři roky nekonzumovali masné výrobky, je hladina MDA nižší. Dále bylo prokázáno, že plazmatická hladina MDA se zvyšuje po provedení chirurgického zákroku v podobě operace. Tento nežádoucí efekt lze účinně potlačit jednorázovým podáním vitamínu E před operací. Poděkování Tato práce vznikla s podporou projektu PRVOUK 31. Literatura 1. Nielsen F., Mikkelsen B. B., Nielsen J. B., Andersen H. R., Grandjean P. P: Clinical Chemistry 43, 1209 (1997). 2. Štípek S.: Antioxidanty a volné radikály ve zdraví a nemoci, Grada Publishing. Praha Murray R. K., Grayer D. K., Mayes P. A., Rodwell V. W.: Harperova biochemie, H&H, Praha

111 4. Kesavulu M. M., Rao B. K., Giri, R., Vijaya J., Subramanyam G., Apparao C.: Diabetes Research and Clinical Practice 53, 33 (2001). 5. Slatter D. A., Bolton C. H., Bailey A. J.: Diabetologia 43, 550 (2000). 6. Su Y., Liu X. M., Sun Y. M., Jin H. B., Fu R., Wang Y. Y., Wu Y., Luan Y.: International Journal of Clinical Practice 62, 877 (2008). 7. Dib M., Garrel C., Favier A., Robin V., Desnuelle C.: Journal of Neurology 249, 367 (2002). 8. Casado A., Lopez-Fernandez M. E., Casado M. C., de la Torre R.: Neurochemical Research 33, 450 (2008). 9. Rudra C. B., Qiu C. F., David R. M., Bralley J. A., Walsh S. W., Williams M. A.: Clinical Biochemistry 39, 722 (2006). 10. Kaur G., Mishra S., Sehgal A., Prasad R.: Molecular and Cellular Biochemistry 313, 37 (2008). 11. Cirak B., Inci S., Palaoglu S., Bertan V.: Clinica Chimica Acta 327, 103 (2003). 12. Esme H., Cemek M., Sezer M., Saglam H., Demir A., Melek H., Unlu M.: Respirology 13, 112 (2008). 13. Lykkesfeldt J.: Clinica Chimica Acta 380, 50 (2007). 14. Matejckova J., Samec M., Jacek M., Tuma P.: Chemicke Listy 105, 375 (2011). 15. Bhatia S., Shukla R., Madhu S. V., Gambhir J. K., Prabhu K. M.: Clinical Biochemistry 36, 557 (2003). 16. Looi M. L., Dali A. Z. H. M., Ali S. A. M., Ngah W. Z. W., Yusof Y. A. M.: European Journal of Cancer Prevention 17, 555 (2008). 17. Beevi S. S., Rasheed M. H., Geetha A.: Clinica Chimica Acta 375, 119 (2007). 18. Buzby G. P., Mullen J. L., Stein T. P., Miller E. E., Hobbs C. L., Rosato E. F.: Cancer 45, 2940 (1980). 19. Jain S. K., Mcvie R., Smith T.: Diabetes Care 23, 1389 (2000). 20. McEvoy C. T., Temple N., Woodside J. V.: Public Health Nutrition 15, 2287 (2012). 109

112 Determination of Thymol Using Flow Injection Analysis on New Coulometric Detector with Renewable Working Material Based on Glassy Carbon Microparticles Jan Mika, Jiří Barek, Jiří Zima, and Hana Dejmková Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry, UNESCO Laboratory of Enviromental Electrochemistry, Albertov 6, CZ Prague 2, Czech Republic, Abstract Application of coulometric detectors in HPLC might be complicated by the passivation of the working material and its difficult renewal. This paper deals with the new type of coulometric detector with renewable working material based on spherical microparticles of glassy carbon. Detector was tested by determination of hydroquinone and thymol using flow injection analysis. The obtained results confirmed that this detector can be successfully applied for flow measurements. Key words: Coulometry, Flow injection analysis, Hydroquione, Thymol, Glassy carbon microparticles. Introduction In modern analytical chemistry, there is a great requirement for the determination in flow arrangement, especially for HPLC and flow injection analysis (FIA) 1 ; these requirements are connected with the demands on detectors, such as low price of an individual analysis, sensitivity, reproducibility etc. Electrochemical detectors meet these conditions well and thus they are suitable candidates 2. Amperometry and coulometry are the most common electrochemical detection techniques. Coulometry works with high conversion degree and so the working material must have sufficiently large active surface 3. It can be accomplished by using porous material or material based on microparticles, such as crushed vitreous carbon 4. Nevertheless, passivation is a serious problem for these materials, especially in case of determination of samples with complex matrix. The working material must be then periodically and reproducibly renewed. Mechanical cleaning is almost impossible 5 and electrochemical cleaning does not always guarantee sufficient repeatability of working material surface; therefore, the replacement of whole working material is often necessary, which is expensive and time-consuming. Special design of detectors, such as jet ring detector, tried to enable faster and cheaper replacement of passivated working material 6-8. This work attempts to test new coulometric detector with renewable working material based on glassy carbon microparticles for determination of electrochemically well-known substance, hydroquinone, and to develop new electrochemical method for the determination of thymol, component of herbs and some pharmaceutical preparations with antibacterial and antiseptic effects 9. Experimental Chemicals Appropriate amount of hydroquinone (Fig. 1A, Lachema Brno, Czech Republic) was dissolved in distilled water to prepare stock solutions of concentration mol L 1 ; thymol (Fig. 1B, Thymolum, Tamda, Czech Republic) was dissolved in methanol (Merck, Germany, 99,9%) to prepare stock solution of concentration mol L 1. Solutions of lower concentrations were obtained by their dilution with Britton-Robinson (B-R) buffer. Alkaline component of B-R buffer was prepared from sodium hydroxide (98%, Lach-Ner, Czech Republic) and acidic component from phosphoric acid (85%, Lach-Ner, Czech Republic), boric acid (99,5%, Lach-Ner, Czech Republic), and acetic acid (99%, Lach-Ner, Czech Republic). Detector was filled by the mixture of 10 mg of spherical carbon particles (particles 110

113 size µm, Alfa Aesar, Germany) and 2 ml of nitromethane (POCH, Gliwice, Poland). This mixture was filled into the detector by methanol. Millipore Q-plus System (Millipore, USA) was used for the preparation of distilled water for all aqueous solutions. Fig. 1. Chemical structure of hydroquione (A) and thymol (B). Apparatus FIA system used for the determination of both analytes was composed of HPP 5001 high pressure pump with ADLC2 detector (both Laboratorni pristroje, Prague, Czech Republic) and it worked in three-electrode arrangement, consisting of working coulometric detector with renewable working material, platinum auxiliary electrode with large surface and Ag/AgCl (3 M KCl) reference electrode (both Monokrystaly Turnov, Czech Republic). Coulometric detector was filled by HPP 4001 high pressure pump (Laboratorni pristroje Prague, Czech Republic). All the measurements were made in triplicate, unless stated otherwise. The detection limit was calculated as the concentration corresponding to three times the standard deviation (α = 0.05) of the lowest measured concentration. Result and discussion Basic electrochemical properties of the newly developed coulometric detector were tested, using FIA determination of hydroquinone at ph 2 (Ref. 10). Optimal determination conditions were found: detection potential V, flow rate 0.7 ml min 1 and injected volume 100 µl. At these conditions detector worked in coulometric mode with conversion degree of 112 % and the signal of detector was stable for 30 injection of hydroquinone with RSD 1.39 %. Repeatability of signal obtained from 5 different fillings of detector was high (RSD 1.86 %); thanks to this, there is possibility to use this detector for strongly passivating analytes such as thymol. Concentration dependences of FIA measurements were linear in the range from 4 to 100 µmol L 1 and detection limit was 0.44 µmol L 1 ; other parameters of the dependence are summarized in Table 1, while the concentration dependence is shown in Fig. 3B. After the successful determination of hydroquinone as the model compound, new electrochemical method for determination of thymol using new coulometric detector was developed. First step was the optimization of ph of the carrier solution in the range from ph 2 to 12. Area and height of the peak were similar in the observed range, but slightly better parameters were obtained at ph 10, which was therefore selected as optimal value. At this ph, optimal conditions were determined: detection potential +1.1 V, flow rate 0.6 ml min 1 and injected volume 50 µl. Some of the dependences obtained during the optimization measurements are shown in Fig. 2. Conversion degree and repeatability were determined under the optimal conditions. As well as in the preliminary measurements, the conversion degree slightly exceeded the theoretical full conversion and reached 114 %. Passivating properties of thymol were much stronger than those of hydroquinone and the signal of the repetitive injections was stable for just 6 injections of thymol (100 µmol L 1 ), after that the signal reduced rapidly (Fig 3A); RSD of 111

114 signal during five refillings of the detector was 4.23%. Parameters of the concentration dependence measured under the optimal conditions are summarized in Table 1 and the dependence is shown in Fig. 3B; the dependences are linear from 4 to 100 µmol L 1 and limit of detection was 0.29 µmol L 1. Fig. 2. Hydrodynamic voltammograms of thymol (100 µmol L 1 ) (A) in B-R buffer of ph 4 ( ), 6 (Δ), 8 ( ) and 10 ( ) and background current of ph 10 ( ); flow rate 0.5 ml min 1 and injected volume 20 µl and FIA recordings of thymol (B) of injected volume 10 (1), 20 (2), 50 (3) and 100 (4) µl; concentration of thymol 100 µmol L 1 in B-R buffer of ph 10, detection potential +1,1 V and flow rate 0.6 ml min 1. Fig. 3. FIA recording of 10 injections of thymol (100 µmol L 1 ) (A) in B-R buffer of ph 10; flow rate 0.5 ml min 1, injected volume 20 µl, and detection potential 1.1 V and concentration dependences (B) of hydroquinone ( ) and of thymol ( ); measured at the optimal conditions. 112

115 Table I. Parameters of calibration dependences of the respective analytes. dynamic linear slope intercept analyte range (μmol L 1 (μa s mol 1 L) (μa s) ) correlation coefficient limit of detection (µmol L 1 ) hydroquione thymol Conclusion New method for the determination of thymol by FIA with coulometric detection was developed. In spite of the strong passivating properties of thymol, the renewable electrode material enabled to obtain stable and repeatable signal and provided fast and easy work with coulometric detection. Coulometric detector works with similar detection limits as other common methods such as HPLC with UV 11 detection or DPV 12, although it cannot compete with highly sensitive methods such as GC/MS 13. Other detection techniques (HPLC-ED 14 ) obtained better limit of detection thanks to extraction step, so it can be assumed, that the same procedure could also improve results of this newly developed method. Acknowledgements This work was performed in the framework of Specific university research (SVV ). Financial support from the Grant Agency of Charles University (project no ) is gratefully acknowledged. References 1. Bond A. M.: Anal. Chim. Acta 400, 333 (1999). 2. Toth K., Stulik K., Kutner W., Feher Z., Lindner E.: Pure Appl. Chem. 76, 1119 (2004). 3. Stulik, K., Pacakova, V.: Electroanalytical measurements in flowing liquids. E. Horwood Beinrohr E., Nemeth M., Tschopel P., Tolg G.: Fresenius. J. Anal. Chem. 343, 566 (1992). 5. Schieffer G. W.: Anal. Chem. 52, 1994 (1980). 6. Mayer M., Ruzicka, J.: Anal. Chem. 68, 3808 (1996). 7. Pollema C. H., Ruzicka, J.: Anal. Chem. 66, 1825 (1994). 8. Ruzicka J.: Anal. Chim. Acta 308, 14 (1995). 9. Český lékopis 2007, 3.díl: léčivé a pomocné látky, léčivé přípravky. Grada publisher. Prague de Oliveira A. C., dos Santos S. X., Cavalheiro E. T. G.: Talanta 74, 1043 (2008). 11. Newbery J. E., Dehaddad M. P. L., Charlwood K. A.: Anal. Chim. Acta 147, 387 (1983). 12. Michelitsch A., Rittmannsberger A., Hufner A., Ruckert U., Likussar, W.: Phytochem. Anal. 15, 320 (2004). 13. Hudaib M., Speroni E., Di Pietra A., Cavrini, V.: J. Pharm. Biomed. Anal. 29, 691 (2002). 14. Newbery J. E., Dehaddad M. P. L.: J. Chromatogr. 260, 173 (1983). 113

116 Electrochemical Generation of Drug Metabolites (Elektrochemické generování metabolitů léčiv) Tomáš Mikysek, Robert Jirásko, Michal Holčapek and Karel Vytřas University of Pardubice, Faculty of Chemical Technology, Department of Analytical Chemistry, Studentská 573, Pardubice,Czech Republic, Abstract Within this study, an electrochemical characterization of atorvastatin by cyclic voltammetry, coulometry and preparative electrolysis accompanied by UHPLC/MS/MS analysis has been presented. Atorvastatin undergoes the oxidation showing one irreversible process at about +1.0 V involving two electrons. The influence of ph showed drop of current at ph>6 which is connected to atorvastatin-lactone formation driving the electrochemical reaction. The products of preparative electrolysis were compared to those obtained by biotransformation. Key-words: Electrode, Metabolites, Preparative electrolysis, Cyclic voltammetry. Úvod Léčivo atorvastatin (obr. 1) patří do skupiny statinů a slouží jako inhibitor 3-hydroxy-3- methylglutaryl reduktázy při léčbě hyperlipidémie 1. Jedná se stále o nejprodávanější léčivo svého druhu. Již dříve mu byla věnována celá řada studií zabývajících se nejen jeho stanovením v biologických vzorcích 2,3, ale i charakterizací jeho metabolismu 4-6 včetně popsání oxidativních produktů degradace 7,8. Ke studiu metabolismu léčiv se využívá převážně in vitro a in vivo experimentů založených na enzymaticky katalyzovaných reakcích, které poskytují informaci o přítomných metabolitech v daném organismu 9,10. Simulaci metabolismu lze rovněž provést elektrochemicky buď v on-line nebo off-line uspořádání 11,12. Navíc preparativní elektrolýza může být využita pro elektrosyntézu drahých a nebo těžce dostupných standardů metabolitů léčiv. Obr. 1. Struktura léčiva atorvastatin. V tomto příspěvku je prezentována základní elektrochemická charakterizace léčiva atorvastatin pomocí cyklické voltametrie a coulometrie. Výsledky nabízejí nejen srovnání navrhovaného mechanismu oxidace atorvastatinu s dříve publikovanými pracemi, ale i srovnání s metabolity získanými biotransformací. Experimentální část Chemikálie. Atorvastatin trihydrát vápenaté soli 3R,5R-7-[2-(4-fluorophenyl)-3-phenyl-4- phenylcarbamoyl-5-propan-2-ylpyrrol-1-yl]-3,5-dihydroxyheptanové kyseliny (European Directorate for the Quality of Medicines & HealthCare Council of Europe, Strasbourg, Francie). Pro přípravu základních elektrolytů v podobě 0,1 mol/l roztoků HCl, H 2 SO 4, NaCl a k přípravě série Britton-Robinsonových pufrů bylo použito běžných laboratorních chemikálií. 114

117 Všechny potřebné roztoky byly připraveny z deionizované vody pomocí systému Milli-Q od firmy Millipore. Instrumentace. Všechna elektrochemická měření byla prováděna na přístroji AUTOLAB (model "PGSTAT-128"; Metrohm - Autolab B.V., Utrecht, Nizozemí), ke kterému byla připojena měřicí cela s tří-elektrodovým systémem obsahujícím pracovní elektrodu ze skelného uhlíku/pyrolitického grafitu referentní elektrodu Ag AgCl 3 M KCl a pomocnou elektrodu (Pt). Pro účely preparativní elektrolýzy byly výše uvedené elektrody umístěny do cely tvaru H, která nabízí oddělení anodického a katodického prostoru. Postupy Cyclická Voltametrie (CV). Tyto experimenty byly prováděny v roztoku výše uvedených elektrolytů obsahujících 0,1 mg/ml atorvastatinu, připraveného z jeho metanolického zásobního roztoku o koncentraci 1mg/ml. U většiny experimentů počáteční potenciál byl 0,0 V vs. Ag/AgCl a změna potenciálu probíhala v anodickém směru a následně pak v katodickém při rychlosti polarizačního napětí 50 mv/s; vše při trojím opakování. Před každým měřením byl roztok důkladně probublán argonem. Preparativní elektrolýza a coulometrie. Na potenciostattu byl nastaven potenciál 1,2 V a doba elektrolýz se pohybovala mezi 1-2 hodinami, následně ze závislosti proudu na čase byl integrací získán počet spotřebovaných elektronů. Výsledky a diskuse V této práci bylo studováno elektrochemické chování atorvastatinu v různých elektrolytech s cílem popsat mechanismus a následně i produkty elektrochemických a chemických reakcí. K tomuto účelu byly nejprve vybrány roztoky 0.1 mol/l H 2 SO 4, 0.1 mol/l HCl or 0.1 mol/l NaCl, které byly testovány jako základní elektrolyty. Ve všech třech byl pozorována jedna ireverzibilní oxidace při potenciálu +1.0 V vs. Ag/AgCl, která přísluší oxidaci atorvastatinu a jeho laktonu (obr.2). Z opakovaných cyklů, při rychlosti změny polarizačního napětí 50 mv/s, docházelo k poklesu proudu píku atorvastatinu vlivem pomalého transportu látky k elektrodě, což se potvrdilo při nižší rychlosti skenu. Další část byla zaměřena na studium vlivu ph. Pomocí série Britton-Robinsonových pufrů bylo zjištěno, že se vzrůstajícím ph dochází k posunu potenciálu píku atorvastatinu k nižším hodnotám. Co se týče proudu, i zde byla pozorována závislost na ph, přibližně u ph 5 docházelo k poklesu proudu se vzrůstajícím ph a u ph 9 byl proud na úrovni pozadí. Toto chování lze vysvětlit tím, že při nižším ph dochází k tvorbě laktonu atorvastatinu, který podléhá elektrochemické oxidaci, jehož přítomnost byla zjištěna pomocí UHPLC/MS/MS. Naopak při vyšším ph dochází k hydrolýze zmíněného laktonu, což bylo již dříve popsáno v literatuře 13. Coulometrické experimenty ukázaly, že studované léčivo je oxidováno dvěma elektrony. K určení produktů oxidace byla poté použita preparativní elektrolýza v kyselém a neutrálním prostředí s následnou UHPLC/MS/MS analýzou, kde se ukázala složitost oxidace atorvastatinu v podobě již dříve zmíněné tvorby atorvastatin-laktonu, ale bylo evidováno celkem asi 20 různých produktů. K oxidaci dochází nejen na isopropylu ale také na konjugovaném skeletu molekuly atorvastatinu. Při porovnání produktů preparativní elektrolýzy s experimenty biologické transformace dojdeme k závěru, že se liší nejen v počtu (u biologické transformace cca 10 produktů) ale i ve struktuře, např. hydroxylaci fenylkarbamoylové skupiny, beta-oxidaci aj. Výčtu jednotlivých produktů elektrolýz jako i biotransformace se přehledně věnuje publikace 14. Bohužel, vzhledem k jejich počtu 115

118 a množství nebylo možné provést jejich izolaci a identifikaci pomocí NMR jako v případě jiné studie 15. Obr. 1. Cyklická voltametrie atorvastatinu v Britton Robinsonově pufru ph 1,71, koncentrace atorvastatinu 0,05 mg/ml, rychlost skenu 50 mv/s. Závěr Tato práce se zabývá elektrochemickou charakterizací atorvastatinu pomocí cyklické voltametrie, coulometrie a preparativní elektrolýzy. Atorvastatin je oxidován dvěma elektrony, a poskytuje ireverzibilní elektrodovou reakci při potenciálu cca 1 V. Zásadní roli v jeho elektrochemickém chování hraje vliv ph ze kterého vyplývá i tvorba atorvastatin laktonu zajišťujícího elektrochemickou aktivitu tohoto systému. Pomocí analýzy UHPLC/MS/MS se podařilo určit produkty elektrolýz, kde bylo zjištěno asi 20 různých produktů. Oxidace se odehrává jak na isopropylovém substituentu atorvastatinu tak na kojugovaném skeletu. Naproti tomu biotransformace atorvastatinu v krysích hepatocytech poskytovala 10 metabolitů např. hydroxylaci fenylkarbamoylové skupiny nebo beta-oxidaci na alkylovém řetězci. Tato metoda by mohla být v budoucnu uplatněna i u jiných léčiv nejen k objasnění reakčního mechanismu, ale i při generování standardů metabolitů. Poděkování Tato práce vznikla za finanční podpory Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy České Republiky projektu CZ.1.07/2.3.00/ "Posílení excelentních týmů výzkumu a vývoje na Univerzitě Pardubice" a Grantové agentury ČR projekt č.: P206/12/P065. Literatura 1. Curran M.P.: Drugs 70,191 (2010). 2. Bahrami G., Mohammadi B., Mirzaeei S., Kiani A.: J. Chromatogr. B 826, 41 (2005). 3. Nováková L., Satinský D., Solich P.: Anal. Chem. 27, 352 (2008). 4. Vlčková H., Solichová D., Bláha M., Solich P., Nováková L.: J. Pharmaceut. Biomed. 55, 301 (2011). 116

119 5. Bořek-Dohalský V., Huclová J., Barrett B., Němec B., Ulc I., Jelínek I.:Anal. Bioanal. Chem. 386, 275 (2006). 6. Hermann M., Christensen H., Reubsaet J.L.E.: Anal. Bioanal. Chem. 382, 1242 (2005). 7. Shah R.P., Kumar V., Singh S.: Rapid Commun. Mass Sp. 22, 613 (2008). 8. Kracun M., Kocijan A., Bastarda A., Grahek R., Plavec J., Kocjan D.: J. Pharmaceut. Biomed. 50, 729 (2009). 9. Jirásko R., Holčapek M., Nobilis M.: Rapid Commun. Mass Sp. 25, 2153 (2011). 10. Jirásko R., Holčapek M., Vrublová E., Ulrichová J., Šimánek V. J. Chromatogr. A 1217, 4100 (2010). 11. Faber H., Jahn S., Kunnemeyer J., Simon H., Melles D., Vogel M., Karst U.: Angew. Chem. Int. Edit. 50, A52 (2011). 12. Baumann A., Lohmann W., Schubert B., Oberacher H., Karst U.: J. Chromatogr. A 1216, 3192 (2009). 13. Jemal M., Zheng O., Chen B.C., Teitz D.: Rapid Commun. Mass Sp. 13, 1003 (1999). 14. Jirásko R., Mikysek T., Chagovets V., Vokřál I., Holčapek M.: Anal. Bioanal. Chem. (submitted february 2013). 15. Mikysek T., Švancara I., Bartoš M., Vytřas K., Drabina P., Sedlák M., Klíma J., Urban J., Ludvík J.: Electroanalysis 19, 2529 (2007). 117

120 Pencil Graphite Electrodes as a Tool for Analysis of Xanthine and 8-Methylxanthine (Grafitová elektroda jako nástroj pro analýzu xanthinu a 8-methylxanthinu) Rudolf Navrátil a, František Jelen b, and Libuše Trnková a,c a Department of Chemistry, Faculty of Science, Masaryk University, Kamenice 5, Brno, Czech Republic b Institute of Biophysics, v.v.i., Academy of Sciences of the Czech Republic, Kralovopolska 135, CZ Brno, Czech Republic c Central European Institute of Technology CEITEC, Brno, University of Technology, Technicka 3058/10, Brno, Czech Republic, libuse@chemi.muni.cz Abstract Electrochemical behavior of xanthine (Xan) and 8-methylxanthine (8-mXan) on a pencil graphite electrode (PeGE) in the presence of copper ions is reported. For this purpose we used linear sweep voltammetry (LSV) in combination with adsorptive stripping (AdS) technique and the elimination (EVLS) procedure. The sensitive detection of purine oxidation signals was performed depending on scan rate, ph, concentration of Cu(II), and modification of PeGE surface. To achieve the best electroanalytical determination of Xan and 8-mXan the optimal experimental conditions were chosen, and to understand the electrode processes of both xanthines on Cu(I)-modified PeGE spectral and microscopic methods were used. Key words: Xanthine (Xan), 8-methylxanthine (8-mXan), Pencil graphite electrode (PeGE), linear sweep voltammetry (LSV), Elimination voltammetry with linear scan (EVLS), SEM, EDX. Úvod Xanthin a jeho methyl deriváty jsou důležité látky, které mohou být nalezeny v krvi, moči a dalších fyziologických tekutinách jako produkty katabolismu purinů 1. Moderní techniky používané pro stanovení methyl-xanthinů zahrnují spektrofotometrické, chromatografické a elektroanalytické metody 2. Elektrochemická oxidace xanthinů byla studována mnoha autory a předpokládá se, že výměna elektronů na povrchu elektrody probíhá na uhlíku C8 a dusíku N Byl též popsán detailní oxidační mechanismus a vliv methyl skupin na oxidační proces xanthinu 6-9. Některé další publikace jsou věnovány analýze těchto látek v přítomnosti mědi Přídavkem iontů mědi Cu(II) do roztoku s purinem dochází při vhodném potenciálu k akumulaci mědi na elektrodě podložené redukcí na Cu(I). Díky Cu(I) je získávána další voltametrická odezva v oblasti 0,4 V, která odpovídá oxidaci málo rozpustného komplexu Cu(I)-purin a zároveň je zaznamenáno zvýšení intenzity původního oxidačního signálu odpovídajícího purinu S využitím adsorpční stripping techniky za přítomnosti Cu(II) iontů pomocí a cyklické voltametrie (CV) na grafitových elektrodách (PeGE) byla provedena detekce xanthinů. Ke zvýšení citlivosti byla využita eliminační voltametrie (EVLS), konkrétně eliminační funkce E4 zachovávající difúzní proudovou složku a eliminující kinetický a kapacitní proudovou složku. Tyto metody se ukázaly jako vhodné pro zlepšení zkoumání rozdílů mezi puriny, vzniku komplexu na elektrodě a objasnění reakčního mechanismus na PeGE Cílem práce byl vývoj biosenzoru pro kvalitativní a kvantitavní analýzu z hlediska analytické chemie a především pro citlivou a selektivní detekci methyl-xanthinů využitelnou v medicíně a farmaceutickém průmyslu ke stanovení těchto látek. Za tímto účelem byla provedena analýza redoxního chování xanthinu a 8-methyl-xanthinu probíhající na povrchu PeGE elektrody v přítomnosti iontů Cu (II). 118

121 Experimentální část Všechna měření byla provedena na analyzátoru AUTOLAB (Elektrochemický Analyzér společnosti EcoChemie, Metrohm, Švýcarsko) doplněný VA-Standem 663 (Metrohm, Zurich- Schwitzerland) s tří-elektrodovým uspořádáním (pracovní elektroda - PeGE - 0,5 HB Tombow, Japonsko, argento-chloridová referenční elektroda (Ag/AgCl/3M KCl a platinový drát - pomocná elektroda), ovládaným programem GPES 4.9. Zaznamenané a vyhlazené křivky (Savitzky-Golay filtr - úroveň 2) byly vyexportovány a zpracovány programem MS Excel. K aktivaci elektrody (pretreatment) bylo využito metody diferenční pulzní voltametrie (DPV) s nastavením: aktivační potenciál: 1,4 V, doba trvání: 30 s, depoziční potenciál: 0 V, doba trvání: 0 s, vyrovnávací čas: 2 s, modulační čas: 0,05 s, doba intervalu: 0,5 s, iniciační potenciál: 0 V, konečný potenciál: 0 V, step potenciál: 0,00495 V, modulační amplituda: 0, Následné stanovení bylo provedeno lineární sweep voltametrii (LSV) s nastavením: Akumulační potenciál: 0 V, doba trvání: 120 s, vyrovnávací čas: 5 s, počet skenů: 2, počáteční potenciál: -0,1 V, potenciál prvního vrcholu: 1,4 V, potenciál druhého vrcholu: -0,1 V, step potenciál: 0,002 V, rychlost scanu: 25 mv/s, 50mV/s, 100mV/s, 200mV/s, 400 mv/s, 800 mv/s. Výsledky a diskuse Naše laboratoř se dlouhodobě zaměřuje na voltametrickou analýzu purinových derivátů na pentelkové grafitové elektrodě (PeGE) v přítomnosti mědi. Pro výběr optimální pracovní elektrody z hlediska citlivé analýzy byla využita celá řada různých grafitových tuh a s nejlepším výsledkem (nejvyšší oxidační píky) obstála pentelková tuha Tombow japonské výroby. Na této elektrodě byla provedena voltametrická měření xanthinu (Xan) a 8- methylxanthinu (8-mXan) v přítomnosti mědi, a to za účelem získat informace: (a) o oxidačním chování těchto dvou sloučenin, kdy u jedné je methyl navázán ne na dusíku, ale na uhlíku imidazolového kruhu a (b) o interakci obou látek s povrchem elektrody, který může být modifikován jednomocnou mědí. Bylo zjištěno, že povrch elektrody Tombow je potažen polymerem, který může být pro modifikaci elektrody pomocí mědi velmi důležitý. Zatím je známo, že se na povrchu elektrody vložením vhodného potenciálu Cu(II) redukuje na Cu (I) a tato jednomocná měď je schopna tvořit s příslušným purinovým derivátem (xanthinem) slabě rozpustný komplex Cu(I)-purin. Tento komplex se při polarizaci elektrody do pozitivních potenciálů (kolem 0,4 V vs. Ag/AgCl/3M KCl) rozpouští a jednomocná měď se v něm oxiduje na měď dvojmocnou. Zároveň dochází ke zvýšení odpovídajícího oxidačního píku purinu (v našem případu Xan nebo 8-mXan) - Obrázek 1. Vliv změny methyl substituentu na Xan v poloze C8 je uveden na Obrázku 1., na kterém jsou zobrazeny jednotlivé LSV křivky v závislosti na rychlosti polarizace elektrody v 0,1 M acetátovém pufru (ph 5,1) o koncentracích xanthinů 20 µm a stejně tak velkých koncentracích iontů Cu(II) v roztoku. 119

122 Obr.1. LSV křivky Xan a 8-mXan bez přítomnosti iontů mědi Cu(II) (A, B) a v přítomnosti iontů mědi Cu(II) (C, D) pro různé rychlosti polarizace (spodní červená čára mv/s, střední modrá čára 400 mv/s, horní černá čára 800 mv/s) v acetátovém pufru (ph 5.1); c mxan =20 µm, c Cu =20 µm. Obrázek 1. ukazuje závislost intenzity píku na rychlosti polarizace pro mxan, kde v souladu s teorií ireverzibilní oxidace s rostoucí rychlostí polarizace dochází ke zvýšení intenzit píků a k jejich posun k pozitivnějším potenciálům. Lze také pozorovat, že navázání methylu na C8 způsobuje u xanthinu mírný posun v poloze píku, ale hlavně, velkou změnu v intenzitě signálu, a to jak v případě oxidačního signálu komplexu, tak i v případě oxidačního signálu odpovídajícího derivátu. V případě 8-mXan se jedná o posun píku směrem do méně pozitivních potenciálů (785 mv), což naznačuje snazší oxidaci, ovšem vzhledem k intenzitě píku dochází k tvorbě komplexu s mědí mnohem méně ochotně než je tomu v případě xanthinu (820 mv), kdy jsou intenzity píků Xanthinu asi 6x vyšší než je tomu v případě 8-methyl xanthinu a přibližně 3x vyšší v roztoku obsahujícím ionty mědi Cu(II). Navíc, na rozdíl od 8-mXan, xanthin poskytuje v přítomnosti mědi druhý oxidační pík v oblasti 960 mv. Tento jev jsme popsali v naší předchozí práci. Pík je velmi silně závislý na čase a byl detekován jen při velmi detekčních metodách s rychlou změnou potenciálu (vysoká rychlost polarizace u LSV nebo CPSA). Domníváme se, že se jedná o přeměnu oxidačních intermediátů xanthinu 13. EVLS analýza Eliminační voltametrie s lineární polarizací (EVLS) je netradiční elektrochemická metoda, která je schopna eliminovat nebo zachovat vybrané dílčí proudy (např. difúzní, nabíjecí nebo kinetické proudy) z celkového voltametrického proudu, čímž se zvýší citlivost a zlepší rozlišení naměřených voltametrických signálů 17. EVLS procedura vyžaduje tři voltametrické 120

123 křivky měřené při různých rychlostech polarizace. Jedna rychlost polarizace je vybrána jako referenční (I ref, 400 mv/s) a zbylé dvě jsou polovinou respektive dvojnásobkem referenční rychlosti (I 1/2ref a I 2ref, 200 a 800 mv/s). Tyto tři proudy byly použity pro výpočet EVLS funkce E4 s odstraněním nabíjecí a kinetické proudové složky a zachováním difúzního proudu. Z analytického hlediska tato EVLS funkce výrazně zvyšuje LSV signály, separuje překrývající se signály a rychle potvrzuje adsorpční stav elektroaktivní látky (peakcounterpeak signály) Výsledky aplikace EVLS funkce E4 na voltametrické signály Xan a 8-mXan jsou zobrazeny na obrázku 2. Byla použita rovnice: f ( I) I I I 0; I 0; I I d k c Obr.2. EVLS křivky Xan (A) a 8-mXan (B) bez přítomnosti iontů mědi Cu(II) (modrá plná čára E4 funkce, modrá přerušovaná čára referenční scan rate 400 mv/s) a v přítomnosti iontů mědi Cu(II) (C, D) (černá plná čára E4 funkce, černá přerušovaná čára referenční scan rate 400 mv/s) v acetátovém pufru (ph 5.1); c mxan =20 µm, c Cu =20 µm. EVLS křivky potvrzují adsorbovaný stav obou purinových derivátů (pík-protipík) a podstatně zvyšují proudovou odezvu. V případě oxidace Xan eliminace přispívá k separaci signálů. Závěr Tato práce studuje redoxní chování xanthinu a jeho 8-methyl derivátu na pencil grafitové elektrodě v přítomnosti Cu(II) iontů s využitím adsorpčních technik v kombinaci s eliminační voltametrií jako citlivou metodou pro sledování elektrodových procesů na povrchu elektrody. Cílem práce bylo optimalizovat experimentální podmínky pro jejich stanovení a charakterizovat vliv substituentu na C8 imidazolového kruhu na jeho oxidaci a tvorbu Cu(I)- purin komplexu. Z důvodu velmi blízkých oxidačních signalů obou látek (Xan 840mV a 8- mxan 790mV) bylo z hlediska jejich možné separace využito možností dalších změn v experimentálních podmínkách (ph a poměr koncentrací Cu:ligand). Tyto výsledky mohou být využity při vývoji senzoru (Cu-modifikované PeGE), který by mohl nalézt uplatnění v medicíně, ve farmacii a v potravinářské chemii. Poděkování Tato práce vznikla s podporou projektů OPVK (NanoBioMetalNet) CZ.1.07/2.4.00/ , MUNI/A/0992/2009 a LH KONTAKT II od MŠMT ČR. Literatura 1. Ashihara H., Sano H., Crozier A.: Phytochem. 69, 841 (2008). 2. Talik P., Krzek J., Ekiert R. J.: Sep. and Purific. Rev. 41, 1 (2012). 3. Yao T., Wasa T., Musha S.: Bull. Chem. Soc. Japan 50, 2917 (1977). 121

124 4. Yao T., Musha S.: Bull. Chem. Soc. Japan 52, 2307 (1979). 5. Palanti S., Marrazza G., Mascini M.: Anal. Lett. 29, 2309 (1996). 6. Goyal R. N., Rastogi A.: Croatica Chemica Acta 73, 495 (2000). 7. Goyal R. N., Singhal N. K.: Bull. Chem. Soc. Japan 71, 199 (1998). 8. Goyal R. N., Srivastava A. K.: Indian J. Chem. 33, 212 (1994). 9. Goyal R. N., Thankachan P. P., Kumar N., Sangal A.: Indian J. Chem. 39, 953 (2000). 10. Shiraishi H., Takahashi R.: Bioelectrochem. Bioenerg. 31, 203 (1993). 11. Shengshui H., Dafu C., Mascini M.: Wuhan Univ. J. Natur. Sci. 4, 99 (1999). 12. Aladag N., Trnkova L., Kourilova A., Ozsoz M., Jelen F.: Electroanalysis 22, 1675 (2010). 13. Navratil R., Pilarova I., Jelen F., Trnkova L.: Int. J. Electrochem. Sci. 8, 4397 (2013). 14. Trnkova L. in: Adam V. and Kizek R. (Eds.): Utilizing of Bio-electrochemical and Mathematical Methods in Biological Research. Research Signpost, Kerala, India Jelen F., Hason S., Trnkova L. in: Adam V. and Kizek R. (Eds.): Utilizing of Bioelectrochemical and Mathematical Methods in Biological Research. Research Signpost, Kerala, India Trnkova, L., Jelen, F., and Ozsoz, M. in: Ozsoz M. (Ed.): Electrochemical DNA Biosensors, Pan Stanford Publishing, Singapore Dracka O.: J. Electroanal. Chem. 402, 19 (1996). 18. Trnkova L., Kizek R., Dracka O.: Electroanalysis 12, 905 (2000). 19. Trnkova L.: J. Electroanal. Chem. 582, 258 (2005). 122

125 Short Information on Methanol Outbreak in the Czech Republic in the year 2012 Tomáš Navrátil a, Sergey Zakharov b, Daniela Pelclová b, and Karolina Mrazová b a J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of ASCR, v.v.i., Dolejškova 3, Prague 8, Czech Republic, navratil@jh-inst.cas.cz b Charles University in Prague, First Faculty of Medicine, Department of Occupational Medicine, Czech Toxicological Information Centre and General University Hospital in Prague, Na Bojišti 1, Prague 2, Czech Republic Abstract This contribution reports briefly on the large methanol outbreak in the Czech Republic (CR) in autumn The first case was registered in September 2012 in Havířov. The source was unknown at that time, but it was connected with the illegal production and sale of adulterated spirits. More than 130 cases of methanol intoxication have been reported during September 2012 April people died, about 1/5 of intoxicated patients have suffered by sequels of intoxication and their number have been increasing. Moreover, the samples of methanol can be found in some illegal stores and in some households up to now. Key words: Methanol, Formate, Outbreak, Intoxication, 2012, Czech Republic. Introduction Methanol belongs to very dangerous substances. Methanol poisonings are characterized by high morbidity and mortality, even when small doses are ingested (minimum lethal dose is estimated about 1 g/kg -1 ) 1. This organic substance is not produced in the Czech Republic (CR) at present (its annual world production amounts to 54 million tons in 245 factories, 54% of them in China). Its utilization had been strongly limited in CR by national standards till In 2010, EU legislative 2 approved that the windscreen washer system shall be filled and fully primed with a low-temperature windscreen washer fluid consisting of a 50 % solution of methanol, or alternatively isopropyl alcohol, in water with hardness not exceeding 205 mg/l (Ca). Until then, ethanol had been used for these purposes. Methanol outbreaks occur rather frequently worldwide with large numbers of victims, e.g., (Cambodia 1998 affected >400, dead 60; Estonia 2001 affected 154, dead 68; India 2009 affected >600, dead 50; Haiti 2011 affected 40, dead 20; Norway affected >50, dead 18; Libya 2013 affected >138, dead 51). The last mass methanol poisoning occurred in CR in During the last 60 years, methanol intoxications were episodic in our country. Yearly the Czech Toxicological Information Centre (TIC) received only about 3-4 inquiries regarding methanol ingestions. These cases were mostly related to occasional ingestions of methanol in laboratories where it was used, e.g., in spectrometry 3, 4, chromatography 5, voltammetry 4, It is necessary to note that home distilled spirits were not considered as significant toxicological problem (TIC consulted it on average once a year). The first phone inquiry about the case of acute methanol poisoning to the TIC was recorded by the toxicologist on duty on September 6 th, 2012, and it was the case from the hospital in Havířov. It was the second similar poisoning in the same city within a week. Media began to air warnings about the toxic spirits that caused the first fatal poisoning from September 7 th. The number of intoxicated persons increased very fast. Because it could be supposed that a relatively high amount of contaminated alcohol was distributed among consumers, Czech hygienic stations and some universities repeatedly tested the alcoholic beverages brought by people. Partial prohibition (sale of beverages with declared alcohol concentration above 20%) was declared on September 27 th, 2012 in CR. Similarly, some neighboring countries limited import of alcoholic beverages from CR. 123

126 Methanol, ethanol as well as ethylene glycol are oxidized in human body under catalysis of alcohol dehydrogenases (EC ) in liver. They are members of dehydrogenase enzymes, and facilitate the interconversion between alcohols and aldehydes or ketones with the reduction of NAD + to NADH (Fig. 1). The final oxidation product is an acid which can be further oxidized to CO 2 and H 2 O. While acetic acid in usual doses does not represent a serious problem, formic acid, originating by methanol oxidation, is considered as very toxic. This toxicity results from a combination of the metabolic acidosis (H + -production) and an intrinsic toxicity of the anion formate. Metabolism and hence elimination of formate is folate dependent 13. Three principal ways can solve ingestion of toxic methanol or ethylene glycol: 1) removing from stomach (e.g., vomiting) this solution is realizable in very short time after ingestion; 2) enhanced elimination of the toxic compounds from blood (by hemodialysis (HD) or oxidation) and 3) inhibition of alcohol dehydrogenase by an antidote. The second and third steps are used in their combinations in the most serious cases. Methanol Ethanol Ethanol 4-methylpyrazol - NAD + Alcohol dehydrogenase NADH+H + EC Formate dehydrogenase F ormaldehyde Formate NAD + NADH+H + Leucovorin Acetaldehyde Aldehyde NAD + dehydrogenase NADH+H + 10-formyl tetrahydrofolate synthetase CO2 + H2O Fig. 1. Metabolic pathways of methanol and ethanol in human body + Acetate Experimental part Determined species and parameters There are many laboratory parameters and clinical features which can confirm the diagnosis and characterize the severity of acute methanol intoxication: levels of serum methanol, serum ethanol, serum formate, serum creatinine, serum glucose, urine methanol, urine ethanol, ph, pco 2, HCO 3 -, base deficit, level of lactic acid, anion gap, osmolality, and osmolal gap, applied treatment (first aid), history of chronic alcohol abuse (alcoholism), time interval from ingestion, etc. Venous blood for methanol and formate analysis is commonly sampled on admission, at the start of HD, each 2-4 hours during and at the end of HD. Blood samples must be spun, serum separated and frozen until analyses. Analytical Methods Due to the rare incidence of methanol intoxication the situation was a bit complicated in CR. The laboratories in some small hospitals were not able to analyze the serum methanol and formate; some hospitals did not have in stock a sterile solution of ethyl alcohol for intravenous application. Methanol (and similarly ethanol) in the serum can be measured by headspace gas chromatographic method with flame ionization detection and a headspace injector 14. However, formate must be derivatized in hot sulfuric acid by ethanol to ethyl formate. Therefore, for formate determination a new, but already published, method 15, 16, based on enzymatic decomposition of formate in presence of formate dehydrogenase and NAD +, was introduced. Formate is decomposed to CO 2 and the simultaneously formed NADH + can be spectrophotometrically detected at 340 nm. New electrochemical method for 124

127 serum formate determination was developed in Brno in This method is based on electrophoresis and should be fast, simple and reliable. The specialists have had to correct some disinformation and myths which were wide-spread among people, e.g., that it is possible to differentiate methanol from ethanol according to their taste or flame color. Similarly, the initial symptoms of intoxication are often similar to those caused by ethanol (mainly when the beverage contains both alcohols). Therefore, some laboratories tried to develop cheap, routine, but above all fast method for methanol determination in hard drink samples, if it would be possible, directly in closed bottles. One of them is based, e.g. 18, on application of infrared spectroscopy. However, the situation is complicated in case of some colored drinks and some colored bottles. Results and Discussion Two antidotes have been used in case of methanol or ethylene glycol intoxication: traditional ethanol and fomepizole (active compound 4-methylpyrazol). Ethanol does not block the liver enzyme activity directly, its activity is based on competitive inhibition (ethanol is processed contemporarily with methanol). Fomepizole application was not approved for the use in CR. Nevertheless, its application was legal within many countries in the European Union, and therefore it was not necessary to start the complete approving process from the beginning. The first packages were donated by the Oslo PCC and delivered by Dr. E. Hovda, Ph.D., to the CR on September 13 th, Ethanol is available, cheap, and easily applicable by laymen. Nevertheless, it is often difficult to maintain its serum concentration on the therapeutic level 19, it is frequently underdosed, especially during HD 20, its level should be monitored 19, it causes the CNS depression, and the patients get drunk during its application 21. It is applied in the form of 10% solution in 5% glucose solution intravenously. It can be applied as first aid by laymen: in the form of high quality alcohol per os (1-2 dl of 40% or more, it is possible to dilute it by water or juice). The level of ethanol should be maintained on about (e.g., ml of 40% alcohol per hour for a person weighing 70 kg). Indication of ethanol therapy is the methanol level above 200 mg/l, or osmolar gap above 15 mmol/l, or the history of ingestion of significant amount of methanol, or metabolic acidosis 14. Availability of fomepizole is relatively limited, because it is rather expensive. On the other hand, fomepizole is considered to be more effecient (it has x stronger affinity to alcohol dehydrogenase than methanol, a plasma concentration of 10 μmol/l seems to inhibit the production of formic acid) 22, easily administered, more predictable, also during HD 22. It is not necessary to monitor its level, it does not cause the CNS depression, the patients remain sober, in some cases the HD is not necessary 22, and its application can reduce the burden on intensive care units 23. It is primarily transformed and eliminated in the liver, and partly eliminated by HD. Altogether, 192 fomepizole packages were imported in CR (112 fomepizole packages were donated to CR from Norway (some of them brought Dr. Hovda already by his first visit in September 2012) and 80 were purchased) 24. They were partly distributed into hospitals with intoxicated patients (42 Olomouc, 53 Ostrava, 30 Zlín, etc.) and certain reserve has been available in TIC in Prague as central deposit of antidotes 24. The total expenditures on the treatment of intoxicated persons have amounted to about 50 million CZK (about 2 million ) (including CZK for fomepizole and 7.5 million CZK for drink samples testing) till the March One fomepizole package costs about CZK and the treatment of one poisoned patient with antidote only can costs from to CZK. TIC has been focusing on evaluation of health consequences of acute methanol poisonings during the present mass methanol outbreak in CR. Information about the diagnostics and treatment in 101 intoxicated patients was collected and analyzed thoroughly. The protocols for the collection of information on diagnosis and treatment established during the Norwegian 125

128 methanol outbreak 25 were used, and the hospital discharge reports of all these patients with the detailed information on clinical features, laboratory data, treatment and outcomes were collected and analyzed. Later the actual health condition of the patients within 4-6 months after dismission was examined and compared with the information from the hospital discharge reports. The results were analyzed, medically and statistically evaluated 26. The hospitalized patients were retrospectively separated into three groups according to the outcomes: group I, the patients who survived without sequel; group II, the patients who survived with sequel(s); group III, the patients who died. In group I 40 % of patients were asymptomatic on admission, at least 16 of them with measurable ethanol in blood; 11 appeared inebriated. Among symptomatic patients, the clinical symptoms were: gastrointestinal (43%); visual disturbances (27%), dyspnoea (20%), coma (8.3%) and chest pain (3%). Other symptoms involved fatigue, headache, dizziness, hangover, somnolence, anxiety, tremor, seizures. In group II only one patient (5%) was asymptomatic on admission, the most frequent symptoms were visual disturbances (70%), gastrointestinal (60%); dyspnoe (45%), coma (45%) and chest pain (15%). Other symptoms involved fatigue, headache, dizziness, somnolence, seizures, alcoholic delirium, respiratory and cardiac arrest. In group III all the patients were symptomatic on admission and no one had measurable ethanol in blood. The most frequent symptom in this group was coma (81%), visual disturbances (57%), and dyspnea (52%), gastrointestinal symptoms (48%); chest pain (33%), cardiac (29%) and respiratory arrest (19%). The patients in all groups were treated by alkalization, by antidotes ethanol, fomepizole, or their combination, by folates (folic acid, folinic acid). HD was performed in 65% subjects in group I (continuous veno-venous HD/hemodiafiltration CVVHD/HDF in 30% of subjects; conventional intermittent HD (IHD) in 35%), in group II in 90% of subjects (CVVHD/HDF in 65% of subjects, IHD in 25% subjects), and in group III in 86 % (CVVHD/HDF in 62% subjects; IHD in 24% subjects. Time of start and duration of HD differed. Generally, the attention has been paid to some special aspects of treatment and sequels, e.g., differences in formate and methanol kinetics in the treatment: CVVHD/HDF vs. IHD 27, epidemiology, clinical features and outcomes 26. Conclusion 44 people (25 of them in North Moravian region) died due to methanol poisonings between September 2012 and April 2013 in the CR (41 in 2012). The last victim was a woman died on April 6 th, More than 130 people (121 in 2012) were intoxicated and in about 20 % of them the visual and CNS sequels were diagnosed according to the discharge reports and the percentage of the cases with sequels can increase in course of time. The patients were treated in 30 medical hospitals in 11 regions of the Czech Republic. Fortunately, none person abroad died on the acute poisoning with the Czech methanol (some Slovaks were intoxicated, but due to the adequate layman prevention they recovered without sequel. Huge amount of alcoholic beverages has been analyzed since the start of mass methanol outbreak in CR Due to this measure about 300 contaminated samples were identified at the end of It is supposed that more than one half of all methanol containing liquids ( L) was seized from illegal stores. Nevertheless, substantial quantity of contaminated alcohol was distributed among consumers, so certain amounts can be stored in household stocks of private drinkers, other can be stored by the distributors or producers. So it cannot be excluded that methanol poisonings will continue. Acknowledgements This work was financially supported by Grant Agency of the Czech Republic GA CR (Project P206/11/1638 and Project P208/12/1645). 126

129 References 1. Roe O.: CRC Crit. Rev. Toxicol. 10, 275 (1982). 2. European_Commission: No. 1008/2010 concerning type-approval requirements for windscreen wiper and washer systems of certain motor vehicles and implementing Regulation (EC) No 661/2009 of the European Parliament and of the Council concerning type-approval requirements for the general safety of motor vehicles, their trailers and systems, components and separate technical units intended therefor (2010). 3. Ramesova S., Sokolova R., Degano I., Bulickova J., Zabka J., Gal M.: Anal. Bioanal. Chem. 402, 975 (2012). 4. Sokolova R., Degano I., Hromadova M., Bulickova J., Gal M., Valasek M.: Collect. Czech. Chem. Commun. 75, 1097 (2010). 5. Bulickova J., Sokolova R., Giannarelli S., Muscatello B.: Electroanalysis 25, 303 (2013). 6. Bandzuchova L., Selesovska R., Navratil T., Chylkova J.: Electrochim. Acta 56, 2411 (2011). 7. Cabalkova D., Barek J., Fischer J., Navratil T., Peckova K., Yosypchuk B.: Chem. Listy 103, 236 (2009). 8. Peckova K., Barek J., Navratil T., Yosypchuk B., Zima J.: Anal. Lett. 42, 2339 (2009). 9. Vyskocil V., Navratil T., Danhel A., Dedik J., Krejcova Z., Skvorova L., Tvrdikova J., Barek J.: Electroanalysis 23, 129 (2011). 10. Vyskocil V., Navratil T., Polaskova P., Barek J.: Electroanalysis 22, 2034 (2010). 11. Selesovska-Fadrna R., Navratil T., Vlcek M.: Chem. Anal.-Warsaw 52, 911 (2007). 12. Barek J., Fischer J., Navratil T., Peckova K., Yosypchuk B., Zima J.: Electroanalysis 19, 2003 (2007). 13. Hovda K. E., Andersson K. S., Urdal P., Jacobsen D.: Clin. Toxicol. 43, 221 (2005). 14. TIC: Methanol. Downloaded: Hovda K. E., Urdal P., Jacobsen D., v knize: Methanol poisoning: Clinical features, diagnosis, treatment and prognosis.; (Hovda K. E., ed. Faculty of Medicine, University of Oslo, Oslo, Schaller K. H., Triebig G. T., v knize: Methods of enzymatic analysis; (Bergmeyer H. U., ed. Verlag Chemie, Weinheim, Downloaded: Downloaded: McCoy H. G., Cipolle R. J., Ehlers S. M., Sawchuk R. J., Zaske D. E.: Am. J. Med. 67, 804 (1979). 20. Paasma R., Hovda K. E., Tikkerberi A., Jacobsen D.: Clin. Toxicol. 45, 152 (2007). 21. Paasma R., Hovda K. E., Hassanian-Moghaddam H., Brahmi N., Afshari R., Sandvik L., Jacobsen D.: Clin. Toxicol. 50, 823 (2012). 22. Brent J., McMartin K., Phillips S., Aaron C., Kulig K., Methylpyrazole for Toxic Alcohols Study G.: N. Engl. J. Med. 344, 424 (2001). 23. Hovda K. E., Jacobsen D.: Hum. Exp. Toxicol. 27, 539 (2008). 24. TIC; Toxicological Information Centre: Prague, Hovda K. E., Hunderi O. H., Tafjord A. B., Dunlop O., Rudberg N., Jacobsen D.: J. Intern. Med. 258, 181 (2005). 26. Zakharov S., Pelclova D., Navratil T., Hovda K. E., Hubacek J., Ruzicka E., Klempir J., Diblik P., Pilin A., Miovsky M., Popov P.: In preparation (2013). 27. Zakharov S., Pelclova D., Navratil T., Kurcova I., Hovda K. E., Bocek R., Salek T., Hubacek J., Fenclova Z., Petrik V.: In preparation (2013). 127

130 Characterization of Electrochemical Behavior of Lecithin-Cholesterol Mixture in Formation of Model Phospholipid Membranes Kateřina Nováková a,b, Tomáš Navrátil a, Ivana Šestáková, Vladimír Mareček, and Jaromíra Chýlková b a J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of ASCR, v.v.i., Dolejškova 3, Prague 8, Czech Republic, katerina.novakova@jh-inst.cas.cz b University of Pardubice, Faculty of Chemical Technology, Institute of Environmental and Chemical Engineering. Studentská 573, Pardubice, Czech Republic Abstract Electrochemical behavior of lecithin-cholesterol mixture in the form of phospholipid membranes (PLMs) was studied in this contribution. Lecithin (phosphatidylcholine) and cholesterol were chosen for this research, because they are essential for living cells. Electrochemical behavior of this system was studied using an electrochemical cell developed in our laboratory and with applying electrochemical impedance spectroscopy (EIS). Different ratios between lecithin and cholesterol placed on different polycarbonate substrates were tested. The influence of time and of temperature on formation of PLMs in presence of cholesterol was investigated. Key words: Phosphatidylcholine, Cholesterol, Model phospholipid membrane, Electrochemical impedance spectroscopy. Introduction Biological membranes play one of the most important roles in the normal functioning of living cells. The cell membrane separates the interior of all cells from the outside milieu. The cell membrane is selectively permeable for ions and organic molecules and has substantial influence on movement of substances into and out of cells. Investigation of cell membrane structure began in 17 th century, when the microscope was invented. One of the basic studies about structure of membrane was created by Overton. He formed fundamental concept of the structure and function of the cell membrane. It was the lipid theory of cell permeability 1. He did the conclusion that the cell membrane might be made of lecithin (phosphatidylcholine) and cholesterol 2. In the present time, it is used fluidic mosaic model described by Singer and Nicolson 3 for presenting real phospholipid (PL) bilayers. According to this model biological membranes are consisting mainly of PL bilayers with proteins penetrating either half way or all the way through the membrane. The bilayer is completely liquid and the proteins float freely. This model was first which correctly incorporated fluidity, membrane channels and multiple modes of protein/bilayer into one theory. The cell membrane is created of a thin layer of amphiphatic PLs. They are spontaneously organized so that the hydrophobic tail regions are isolated from the surrounding polar fluid. The hydrophilic head regions are kept in touch with the intracellular and extracellular faces of the resulting bilayer. Forces as Van der Walls, electrostatic, hydrogen bonds, and noncovalent interactions help to form the PL membrane (PLM). For better understanding of properties and functionality of real membranes, the different model PLMs are used (i.e., planar lipid bilayers, supported lipid bilayers, tethered lipid bilayers, liposomes, micelles ). For formation of planar lipid bilayer, there are two main methods (Mueller 4 and Langmuir-Blodget technique 5 ). On planar lipid bilayers, the mechanism of transporting processes and the properties of membranes can be studied. The advantage is that both sides of the membrane can be easily altered. The measurement of 128

131 electrical parameters of the model membrane is enabled by electrodes placed in the aqueous compartment on each side of the PLMs. Cholesterol is a very important component of real cell membranes. It has structural and regulatory role in biomembranes. It does not form bilayers by itself, but it is dissolved readily in phospholipid membranes 6. Cholesterol is not homogeneously distributed in cell membranes. Its high concentration can be found in plasma membrane and its low concentration in the membranes of intracellular organelles 7. The reason for engaging cholesterol in the model membranes is its positive effect on stability of biomembranes. Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) is an important tool in research of planar lipid membranes and in characterization of the electrical properties of these membranes. Planar lipid membrane can be easily presented as a parallel-plate capacitor. The typical resistance is very high. The electrical properties of model membranes are dependent on the physical properties and o composition of the lipids that form the bilayer 8. Experimental The 0.1 M KCl was used as base electrolyte solution. It was prepared from KCl Suprapur, acquired from Merck, Prague, Czech Republic. The p.a. solvents (ethanol 99.88%, n-heptane 99%) were obtained from Penta-Švec, Prague, Czech Republic. All the other chemicals used were of analytical grade. For all the measurements, deionized water from Milli-Q-Gradient, Millipore, Prague, Czech Republic (conductivity < 0.05 μs.cm -1 ) was utilized. For the preparation of lipid membrane 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (lecithin, DPPC, GPCho (16:0/16:0)) (Avanti Polar lipids, alabaster, USA) and cholesterol (Sigma Grade, 99%, from Sigma-Aldrich, Prague, Czech Republic) were used. The lipid membranes were created by self-assembling in the holes of the Isopore Membrane Filters (Millipore, USA), polycarbonate, hydrophilic 8.0 μm and 2.0 μm. Nuclepore Track-Etch Membrane (Whatman, USA), polycarbonate, hydrophilic 0.2 μm and 0.05 μm were used. For our experiments glass cell was used. The cell was composed of two glass columns (these two compartments can represent inner and outer medium of the cell). The compartments were separated by two Teflon parts with holes (0.07 cm 2 ), where the polycarbonate porous membrane was deposited. The electrodes were placed into the holes on the top of glass compartments. The same supporting electrolyte (0.1 M KCl) was inserted into both compartments. The membranes were formed in the way described in, e.g., Lecithin-cholesterol mixture was prepared by dissolving lecithin and cholesterol in ethanol (10 μl) and n-heptane (100 μl). The ratios of lecithin and cholesterol were changed according to scheme suggested by us. 25 μl of the phospholipid-cholesterol mixture was applied to one side of the polycarbonate membrane, the solvent was let to evaporate and then another volume of 25 μl was applied to the other side of the membrane. Both sides were simultaneously exposed to aqueous electrolyte at a certain time before the start of measurement. The EIS measurements were performed with the use of CHI 650C Electrochemical Analyzer/Workstation, Software: CHI version 8.1 (IJ Cambria Scientific, UK) and with potentiostat PGSTAT302N + FRA2 module (Metrohm, Czech Republic), software Nova

132 The measurements were realized using two silver/silver chloride electrodes (silver wire, diameter 1 mm, electroplated by silver chloride) (working and reference electrode). Platinum wire, diameter 1 mm, was used as the auxiliary electrode. In our EIS measurements, recorded in 0.1 M KCl the system provided reliable results in the frequency range from 0.1 Hz to 1 MHz, amplitude V. The voltage of -0.1 V has been used in all EIS-measurements (this value is relatively close to the plant membrane potential). The measurements were performed at laboratory temperature (25 ± 2 C). Results and discussion The behavior of lecithin mixture with cholesterol was elucidated by EIS. Lecithin-cholesterol mixtures were prepared in weight ratios 3:1, 2:1, 1:1, and 1:2. The weight ratio 2:1 (molar ratio 1:1) was found as the most suitable. Another tested parameter was the size of holes in polycarbonate substrate. The diameters 8.0 μm, 2.0 μm, 0.2 μm and 0.05 μm were tested. Time and temperature during membrane formation of bilayer are very important parameters for membrane stabilization. The effect of cholesterol presence on the PL membrane capacitance and resistance was examined in the above given range of concentrations with the use of EIS. The spectra confirmed that cholesterol has been successfully incorporated into the model phospholipid membrane and it had significant effect on the electrical properties of the membrane. The positive influence of cholesterol on the stability of biological membranes was proved. Conclusions In our research, planar PLM was utilized as a model of a real biological membrane. Geometry of this planar PLM provided chemical and electrical access to both aspects of this membrane, so that the physical attributes of this bimolecular film can be easily measured. PLM was created from two lipid monolayers at an air-water interface in holes of polycarbonate membrane. Lipid monolayers were formed by mixture of phosphatidylcholine and cholesterol in different ratios. Formation of the membrane was proved by an increase of the electrical capacitance and its values were much higher in presence of cholesterol than in its absence. We will use our results to obtain more information about PLM and about transport across it and to study the properties of real cell membrane gained, e.g., from protoplasts of various plants and from their different parts (roots, leaves). Acknowledgments The research was supported by GACR (project No. P208/12/1645) and by University of Pardubice (project No. SGFChT05/2012). References 1. Kleinzeller A.: News in Physiological Sciences 12, 49 (1997). 2. Hintzensterna U. V., Schwarzb W., Goerigc M., Petermann H.: The history of anesthesia 1242, 609 (2002). 3. Singer S. J., Nicolson G. L.: Science 175, 720 (1972). 4. Mueller P., Rudin D. O., Tien H. T., Wescott W. C.: The Journal of Physical Chemistry 67, 534 (1963). 5. Langmuir I., Blodgett K. B.: Kolloid-Zeitschrift 73, 257 (1935). 6. Melzak K. A., Melzak S. A., Gizeli E., Toca-Herrera J. L.: Materials 5, 2306 (2012). 7. Bach D., Wachtel E.: BBA-Biomembranes 1610, 187 (2003). 8. Kramar P., Miklavčič D., Kotulska M., Lebar A. M., v knize: Advances in Planar Lipid Bilayers and Liposomes; (11 Elsevier Inc., Navratil T., Sestakova I., Stulik K., Marecek V.: Electroanalysis 22, 2043 (2010). 130

133 10. Navratil T., Sestakova I., Marecek V., Stulik K.: Modern Electrochemical Methods XXX: Transport of cadmium ions across model supported phospholipid membranes, Jetrichovice, (Barek J., Navratil T., Eds.), Best servis, Jetrichovice 2010, p Navratil T., Sestakova I., Jaklova Dytrtova J., Jakl M., Marecek V.: 7th WSEAS International Conference on Environment, Ecosystems and Development: Study of charged particles transport across model and real phospholipid bilayers, Puerto de la Cruz, SPAIN, (Otesteanu M., Celikyay S., Mastorakis N., Lache S., Benra F. K., Eds.), World Scientific and Engineering Acad. and Soc., Puerto de la Cruz, SPAIN 2009, p Navratil T., Sestakova I., Jaklova Dytrtova J., Jakl M., Marecek V.: WSEAS Trans. Environ. Dev. 6, 208 (2010). 13. Navratil T., Sestakova I., Marecek V.: Development, Energy, Environment, Economics (DEEE '10): Supported phospholipid bilayers and transport of heavy metals across them, Puerto de la Cruz, (Mladenov V., Psarris K., Mastorakis N., Caballero A., Vachtsevanos G., Eds.), Puerto de la Cruz 2010, p Navratil T., Sestakova I., Marecek V.: Int. J. Energy Env. 5, 337 (2011). 15. Navratil T., Sestakova I., Marecek V.: Modern Electrochemical Methods XXXI: Transport of divalent cations across the gel supported phospholipid membranes, Jetrichovice, (Navratil T., Barek J., Eds.), Best servis, Jetrichovice 2011, p Navratil T., Sestakova I., Marecek V.: Int. J. Electrochem. Sci. 6, 6032 (2011). 17. Parisova M., Navratil T., Sestakova I., Marecek V.: Modern Electrochemical Methods XXXII: Transport of copper ions in the presence and absence of ionophore calcimycin and the influence of LMWOAs on this transport, Jetrichovice, (Navratil T., Fojta M., Eds.), Best servis, Jetrichovice 2012, p Jaklova Dytrtova J., Jakl M., Navratil T., Schroder D.: Collect. Czech. Chem. Commun. 76 (2011). 131

134 Impact of the Silver Nanoparticles on Carpio Embryos, evaluation of their gradual agglomeration (Působení nanočástic stříbra na plůdek kapra, hodnocení jejich postupné agregace) Jakub Opršal, Renáta Petráňková, Ladislav Novotný, and Miloslav Pouzar University Pardubice, Faculty of Chemical Technology, Department of Environmental and Chemical Engineering, Studentská 573, CZ Pardubice, Czech Republic, Abstract Impact of the silver nanoparticles on carpio embryos was observed. Gradual agglomeration (aggregation) process of solver particles was described and evaluated. A possible utilization of the proposed approach for the toxicity test of Ag nanoparticles was recommended. Key words: Ecotoxicity, Carp, Embryo, Silver, Nanoparticles, Agglomeration. Úvod Aplikace nanomateriálů využívaných v různých oblastech průmyslu, zdravotnictví a jinde vede ke zvýšenému riziku jejich úniku do životního prostředí. Možnosti zjišťování jejich skutečného vlivu na prostředí jsou však velmi omezené 1. Jde přitom o heterogenní skupinu materiálů a to jak z pohledu jejich chemického složení (byly připraveny již z více než 44 prvků 2 ), tak i průměrné velikosti částic a jejich distribuce, náboje atd. Ty ovlivňují chování nanomateriálů a jejich toxicitu. Voda patří mezi potencionálně nejvíce ohrožená prostředí. O negativním vlivu nanočástic však nejsou ucelené informace 3-6. Příkladem může být toxicita nanostříbra (nag). Zájem o něho roste zejména v souvislosti s jeho antibakteriálními účinky 7,8. Testy toxicity nag byly provedeny na množství organismů. Nicméně výsledky studií i laboratorních testů jsou zatím velmi nejednoznačné 11, jelikož toxicita/ekotoxicita nanostříbra je ovlivněna širokou škálou vnitřních (velikost částic, měrný povrch apod.) i vnějších (ph, iontová síla, přítomnost chelatujících látek aj.) faktorů 12. Běžnou praxí je stabilizace připraveného koloidního systému pomocí stabilizačních činidel, jako je arabská guma 9, sacharidy 13 nebo biomolekuly 10. Mezi nejčastěji používané techniky analýzy velikosti a tvaru částic patří transmisní/rastrovací elektronová mikroskopie (TEM, SEM), dynamický rozptyl světla (DLS) případně i ultrafialovo-viditelná (UV-VIS) spektroskopie. K analýze prvkového složení bývá užito metod AAS (atomová absorpční spektrometrie), ICP-OES (optická emisní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem) a ICP-MS (hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem). K charakterizaci stability slouží měření ζ-potenciálu 14. Z dřívějších publikací 15 plyne, že různé formy typu nanočástice, mikročástice nebo volný iont téhož prvku vykazují rozdílnou toxicitu. Je proto nutné odlišit toxicitu nanočástic od toxicity aglomerátů či volných iontů. Cílem práce je předběžné studium vlivu koloidních částic nag na plůdek kapra, při zohlednění jejich časově závislé velikosti. Experimentální část Pro přípravu nanostříbra byl použit modifikovaný Tollensův proces 13 založený na smíchání redestilované vody, roztoků dusičnanu stříbrného, amoniaku, hydroxidu sodného a glukózy. Takto vzniklý roztok byl míchán při laboratorní teplotě po dobu 15 minut a poté byl slit do tmavé zásobní láhve. Koncentrace Ag v takto připraveném roztoku byla 1 mmol/l. Roztoky o nižší nominální koncentraci byly připraveny ředěním tohoto zásobního roztoku Médiem 203 a jejich koncentrace byla ověřena pomocí ICP-OES. Médium 203 bylo připraveno podle směrnice OECD ze solí CaCl 2, MgSO 4, NaHCO 3 a KCl. Hydrodynamický průměr byl měřen na přístroji ZetaPALS Potential Analyzer (Brookhaven Instruments Corp., USA) na základě dynamického rozptylu světla (DLS). 132

135 Mikroskopie atomárních sil (AFM) byla uskutečněna na přístroji Solver Pro M (NT-MDT; Rusko), v semikontaktním modu nastaveným na 40 % volné oscilace. Vzorky byly připraveny metodou spin-coating na vysoce orientovaném pyrolytickém grafitu a vysušeny za vakua 17. Koncentrace stříbrných iontů byla měřena pomocí metody ICP-OES na přístroji INTEGRA XL 2 (GBC, Dandenong Australia). Výsledky a diskuse V rámci studia byla sledována relativní rychlost růstu aglomerátů Ag na základě změn časové závislosti růstu jejich poloměru r pro koncentrace okolo 10 µmol/l a cca desetkrát vyšší. Pro obě zkoumané koncentrace Ag v koloidních roztocích nag dochází díky aglomeračnímu procesu k růstu střední hodnoty r v čase. Velikosti aglomerátů v různých časových úsecích byly vztaženy vůči hodnotám naměřeným při t = 5 min. Tyto relativní změny r přitom ukazovaly na rychlejší nárůst r při vyšších koncentracích Ag, přičemž se poměr těchto veličin s rostoucím časem stával na čase nezávislým. Na základě takto získaných dat je možné určit dobu, za kterou dojde ke stavu, kdy se velikost aglomerátů u Ag mění s časem již poměrně málo. Vodní organismus bývá v reálných podmínkách dlouhodobě vystaven působení právě takových aglomerátů. Jak Tabulka I. ukazuje, klesal procentickýk rozdíl mezi okamžitým poloměrem nag (r) v čase t a jeho limitním poloměrem (r m ) v čase t blížícím se nekonečnu. Kinetika (resp. rychlost) přibližování se limitní velikosti r m se přitom s časem zpomalovala, přičemž se po cca 80 minutách měnil r již relativně málo. Tato pozorování kvalitativně odpovídala i vztahu (1) převzatému z práce 35 t inf 0 inf k t D D ( D D ) e (1) kde D t, D inf a D 0 značí průměr v čase t, t blížícímu se nekonečnu a výchozí průměr a k je konstanta charakterizující kinetiku změn. V našem případě byly změny r s časem t vyhodnocovány pomocí modifikované rovnice (1) po jejím zlogaritmování s využitím postupů a i některých vztahů uplatněných dříve 18,19 při specifickém popisu a vyhodnocování adsorpčního chování látek za vzájemné interakce částic. Konstanta k nabývala v závislosti na koncentraci nag hodnot mezi 1 až 3 [hodin -1 ]. Tabulka I. Procentický rozdíl mezi okamžitým poloměrem nag (r) v čase t a jeho limitním poloměrem (r m ) v čase t blížícím se nekonečnu. Čas [min] Rozdíl [%] Testovaným organismem byly zárodky kapra. Byly použity pouze zdravé jikry bez nežádoucích abnormalit. Pro každý experiment bylo použito třicet jiker. Experiment byl proveden pro výše zmíněné dvě úrovně koncentrace Ag. Kontrolní skupina embryií vykazovala po celou dobu testu normální růst bez abnormalit v jejich chování. Mortalita u kontrolních skupin nepřesahovala po dobu experimentu hodnotu 3 %. Kultivace embryí v koloidním roztoku nag vedla naopak při cca 10 µmol/l k výsledné mortalitě 30 %. Docházelo-li k výměně kultivačního média během experimentu, bylo možné pozorovat abnormality ve fenotypu zárodků. Šlo zejména o deformace páteře nebo ocasu. Při testu prováděném (jak bylo zmíněno) i při výrazně vyšších hodnotách nag, byla zjištěna 133

136 přibližně stejná mortalita, vývoj embryí byl však pomalejší a jejich deformace výraznější. Jikry byly na povrchu chorionu obaleny vrstvou aglomerátů stříbra a některé byly i uvnitř chorionu. Někdy došlo i k neschopnosti plůdků vykulit se z chorionu. V několika případech došlo pouze k částečnému vykulení. Závěr Za všech použitých koncentrací nag byla pozorována vyšší mortalita a pomalejší vývoj embryí s rostoucí frekvencí výměny média. Vyšší toxicita byla zjištěna pro koloid s vyšší koncentrací Ag, přičemž se ukázalo, že by bylo možné do určité míry vliv rychlosti a míry aglomerace nanočástic eliminovat řízením maximální velikosti aglomerátů cestou výměny kapalného média s různou koncentrací aktivních částic. Tímto způsobem by patrně bylo možné získat monotónní závislost toxicity daného nanomateriálu (při normalizovaném obsahu) na jeho koncentraci v koloidním roztoku. Námi prezentované zjištění je však nutné chápat zatím pouze jako předběžné výsledky, které představují nezbytný první krok při ověřování aplikovatelnosti navrhovaného postupu. Poděkování Tato práce vznikla s podporou projektu č. TACR TA , MSM č a MPO TIP č. FR-TI3/288. Literatura 1. Navarro E., Baun A., Behra R., Hartmann N. B., Filser J., Miao A. J., Quigg A., Santschi P. H., Sigg L.: Ecotoxicology 17, 372 (2008). 2. Kahru A., Dubourguier H. C., Blinova I., Ivask A., Kasemets K.: Sensors 8, 5153 (2008). 3. Franklin N. M., Rogers N. J., Apte S. C., Batley G. E., Gadd G. E., Casey P. S.: Environ. Sci. Technol. 41, 8484 (2007). 4. Griffitt R. J., Luo J., Gao J., Bonzongo J. C., Barber D. S.: Environ. Toxicol. Chem. 27, 1972 (2008). 5. Blaise C., Gagne F., Ferard J. F., Eullaffroy P.: Environ. Toxicol. 23, 591 (2008). 6. Crane M., Handy R. D., Garrod J., Owen R.: Ecotoxicology 17, 421 (2008). 7. Lara H. H., Ayala-Nunez N. V., Turrent L. D. I., Padilla C. R.: World J. Microbiol. Biotechnol. 26, 615 (2010). 8. Lee S. M., Song K. C., Lee B. S.: Korean J. Chem. Eng. 27, 688 (2010). 9. Yin L. Y., Cheng Y. W., Espinasse B., Colman B. P., Auffan M., Wiesner M., Rose J., Liu J., Bernhardt E. S.: Environ. Sci. Technol. 45, 2360 (2011). 10. Asharani P. V., Wu Y. L., Gong Z. Y., Valiyaveettil S.: Nanotechnology 19 (2008). 11. Oberdorster E.: Environ. Health Perspect. 112, 1058 (2004). 12. Romer I., White T. A., Baalousha M., Chipman K., Viant M. R., Lead J. R.: J. Chromatogr. A 1218, 4226 (2011). 13. Tolaymat T. M., El Badawy A. M., Genaidy A., Scheckel K. G., Luxton T. P., Suidan M.: Sci. Total Environ. 408, 999 (2010). 14. Fabrega J., Luoma S. N., Tyler C. R., Galloway T. S., Lead J. R.: Environ. Int. 37, 517 (2011). 15. Zhang Q. W., Kusaka Y., Zhu X. Q., Sato K., Mo Y. Q., Kluz T., Donaldson K.: J. Occup. Health 45, 23 (2003). 16. OECD guideline for testing chemicals No. 203 Fish acute toxicity test. 17. Bilkova E., Sedlak M., Imramovsky A., Charova P., Knotek P., Benes L.: International Journal of Pharmaceutics 414, 42 (2011). 18. Novotný L.: DrSc.-disertační práce. AV ČR, Praha Novotný L., Krista J.: Electroanalysis 10, 965 (1998). 134

137 Monitoring of Activities of DNA-Processing Enzymes by Electrochemical Methods (Monitorování aktivity enzymů působících na DNA pomocí elektrochemických metod) Petr Orság a, Hana Pivoňková a, Luděk Havran a, Petra Horáková a, Eva Šimková a, Miloslava Fojtová a, Hana Macíčková-Cahová b, Michal Hocek b, and Miroslav Fojta a a Institute of Biophysics, ASCR,v.v.i., Královopolská 135, Brno, Czech Republic, petr.orsag@gmail.com b Institute of Organic Chemistry and Biochemistry, ASCR v. v. i., Flemingovo nam. 2, Prague 6, Czech Republic Abstract Electrochemical methods have been applied in a number of studies of DNA structure and interactions. DNA-processing enzymes include a variety of proteins catalysing synthesis, degradation and/or various modifications of the nucleic acid. These enzymes, on one hand, can be utilized as tools for preparation of DNA molecules for studying DNA structure interactions, as well as for DNA pretreatment prior to analysis by means of different techniques. On the other hand, activities of the enzymes and effects of different factors on them can naturally be assayed using the same principles. Key words: DNA-processing enzymes, Electrochemistry, Label-free, DNA modification. Úvod Elektrochemické metody se osvědčily jako citlivé nástroje analýzy struktury a interakcí DNA. Přírodní DNA je elektrochemicky aktivní látka díky přítomnosti redukovatelných (na rtuťových a amalgámových elektrodách) nebo oxidovatelných (obvykle na uhlíkových elektrodách) zbytků bází 1. Elektrochemické a adsorpčně-desorpční vlastnosti DNA jsou ovlivněny její strukturou. Především chování DNA na rtuťových a amalgámových elektrodách je silně závislé na přístupnosti zbytků bází a jejich interakci s povrchem elektrody, což umožňuje rozlišit nejen jednořetězcovou DNA od dvouřetězcové a přítomnost jednořetězcových úseků v dvouřetězcových molekulách DNA, ale také konformační změny dvoušroubovice DNA na základě specifických voltametrických signálů. Díky povrchové denaturaci DNA na negativně nebitém povrchu rtuťové elektrody je možno od sebe odlišit DNA obsahující volné konce (která této povrchové denaturaci podléhá) od kovalentně uzavřené kružnicové DNA (která je vůči tomuto procesu rezistentní). Vznik a zánik zlomů, případně jednořetězcových úseků v DNA působením enzymů je tedy možno monitorovat elektrochemicky bez jakéhokoli značení. Další možnosti pro využití elektrochemické analýzy v oblasti sledování enzymových přeměn na DNA otevírá aplikace různých způsobů značení DNA, ať již elektrochemicky aktivními skupinami nebo analogy nukleobazí lišícími se od přirozených stavebních kamenů DNA svými elektrochemickými vlastnostmi, nebo enzymovými značkami obvykle připojenými k DNA prostřednictvím bioafinitního adaptoru (antigen-protilátka, biotin-streptavidin). Tyto přístupy lze využít k řadě aplikací zaměřených na monitorování aktivity enzymů odbourávajících, syntetizujících nebo modifikujících DNA. Následující odstavce přinášejí stručný popis enzymových aktivit na DNA, které lze sledovat elektrochemickými nástroji vyvíjenými v naší laboratoři, a přehled našich výsledků. Nukleázy Nukleázy jsou obecně enzymy hydrolyticky štěpící fosfodiesterovou vazbu v DNA. Působí buďto uvnitř molekuly DNA (endonukleázy), nebo odštěpují jednotlivé nukleotidy z konce polynukleotidového řetězce (exonukleázy). Produktem působení endonukleáz je obecně zlom tedy volný konec DNA, což umožňuje pro detekci jejich aktivity využít kovalentně uzavřenou kružnicovou DNA a voltametrii na rtuťových nebo amalgámových elektrodách. Po vzniku zlomu se DNA stává citlivou k povrchové denaturaci a objeví se signál odpovídající odvinutým úsekům. Touto metodou bylo studováno 2 např. štěpení DNA pankreatickou 135

138 deoxyribonukleázou I (DNázou I) v roztoku a na povrchu elektrody a bylo ukázáno, že interakce DNA s DNázou a štěpení DNA je ovlivněno potenciálem elektrody. Specifickým případem endonukleáz jsou enzymy účastnící se oprav DNA, které rozpoznávají poškozené báze nebo místa, kde tyto báze chybí, a zavedením zlomů do těchto míst zahajují opravný proces. S využitím těchto enzymů byla navržena metoda citlivé a specifické detekce modifikovaných (poškozených) bází 3. Restrikční endonukleázy (restriktázy) jsou enzymy, které v DNA vyhledávají specifické nukleotidové sekvence a v nich DNA štěpí přesně definovaným způsobem. Štěpení DNA restriktázami je obecně citlivé k modifikaci bází v rozpoznávané sekvenci, ať již přirozené (metylací bází, např. cytosinů) nebo syntetické za účelem např. dočasné ochrany DNA před štěpením 4. Restrikčních endonukleáz lze využít pro nepřímé sledování aktivity jiných enzymů, např. metyltransferáz (viz dále). Jako příklad exonukleázy lze uvést exonukleázu III z E. coli, která odbourává v dvouřetězcové DNA jeden řetězec od jeho 3 -OH konce a vzniklý jednořetězcový úsek lze stanovit buďto přímo na rtuťových elektrodách 3, nebo nepřímo po jeho modifikaci elektroaktivní chemickou strukturní sondou na bázi komplexu oxoosmia 5. Topoizomerázy Topoizomerázy jsou enzymy, jejichž biologickou funkcí je odstraňovat nebo vytvářet v DNA nadšroubovicové závity. Kovalentně uzavřená kružnicová DNA může existovat v různých topologických formách, které se liší globální konformací a tendencí k vytváření alternativních struktur. Negativní superhelicita je spojena s tvorbou struktur, ve kterých je snížen zkrut (twist) dvoušroubovice a jsou tak zpřístupněny zbytky bází ve srovnání s relaxovanou dvoušroubovicí DNA. Tyto přechody lze monitorovat pomocí voltametrie na rtuťových elektrodách 6. Na stejném principu je pak v principu možno monitorovat aktivitu topoizomeráz. DNA ligázy Jde o enzymy zacelující zlomy v DNA za účasti makroergického kofaktoru, NAD nebo ATP (podle typu ligázy). Pro sledování jejich aktivity jsme využili metodu založenou na rozdílu ve voltametrickém chování DNA obsahující a neobsahující volné konce, tedy stejný princip, jaký je využíván k detekci štěpení DNA endonukleázami, avšak v opačném uspořádání (v případě ligační reakce je zlom zacelen a signál odpovídající DNA odvinuté na negativně nabitém povrchu elektrody vymizí) 7. Druhou možností je využití varianty metody založené na imobilizaci DNA sondy na magnetických mikročásticích, jejíž princip je ukázán na obr. 1 pro případ detekce metylace DNA s využitím štěpení DNA restriktázou (ligázou jsou dvě části řetězce DNA k sobě spojeny, takže vznik elektrochemického signálu indikuje ligázovou aktivitu). DNA metyltransferázy Enzymatická metylace specifických nukleobází je u prokaryot využívána jako nástroj obrany proti cizorodé DNA (např. při infekci bakteriofágy), u eukaryot jako tzv. epigenetická modifikace sloužící spolu s dalšími mechanismy k regulaci genové exprese a modulaci struktury chromatinu. Metylace bází uvnitř restrikčního místa vede v některých případech k zablokování jeho štěpení příslušnou restriktázou. Metylaci DNA a aktivitu DNA metyltransferázy tak lze detekovat nepřímo analýzou restrikčního štěpení DNA sondy metylačně citlivými restrikčními endonukleázami. Jedna z možností, jak pro detekci této enzymové aktivity využít elektrochemické metody, je znázorněna na obr

139 I/ A magnetická mikročástice nemethylované restrikční místo restriktáza alkalická fosfatáza odstraněno neštěpená (metylovaná) DNA oxidační signál 1-naftolu methylované restrikční místo restriktáza 30 0 štěpená (nemetylovaná) DNA E/V Obr. 1. Příklad elektrochemické detekce DNA pomocí methylačně citlivé restrikční endonukleázy, s využitím magnetického nosiče a koncové enzymové značky. Pokud není vazebné místo pro restriktázu methylováno, dojde ke štěpení DNA, koncová značka je odstraněna a v souladu s tím není pozorován signál produktu enzymové reakce (zde 1-naftolu uvolněného alkalickou fosfatázou z 1-naftylfosfátu). Pokud je restrikční místo methylováno, ke štěpení DNA nedojde, čemuž odpovídá intenzívní signál produktu enzymatické reakce ten tak nepřímo indikuje aktivitu DNA metyltransferázy, jíž byla sonda DNA vystavena před působením restriktázy. DNA polymerázy DNA polymerázy jsou enzymy syntetizující řetězec DNA podle sekvence komplementárního řetězce, sloužícího jako předloha (templát) s využitím deoxynukleosid trifosfátů (dntp) jako monomerních stavebních kamenů. V buňkách mají zásadní význam v procesech replikace a oprav DNA. Moderní metody analýzy nukleotidových sekvencí a DNA diagnostiky jsou z velké části založeny na využití DNA polymeráz. Komerčně je dostupná celá řada těchto enzymů, z nich značná část patří mezi termostabilní polymerázy využitelné v technikách PCR. Liší se mezi sebou přesností čtení předlohy na jedné straně, rychlostí polymerace a tolerancí k chemicky modifikovaným (značeným) dntp na straně druhé 8. Aktivitu DNA polymeráz a jejich schopnost inkorporovat modifikované dntp lze v principu monitorovat na základě stanovení značených nukleotidů inkorporovaných do DNA pomocí metod prodlužování primeru nebo PCR. Terminální deoxynukleotidyl transferáza Reakce katalyzovaná tímto enzymem spočívá v připojování nukleotidů, dodaných do reakční směsi ve formě dntp, na 3 -OH konec primeru bez komplementární předlohy. Vznikají tak jednořetězcové úseky, jejichž nukleotidová sekvence je určena statisticky složením směsi dntp v dané reakci. Stejně jako v případě DNA polymeráz, i u terminálních transferáz je možno enzymovou aktivitu monitorovat pomocí elektrochemické analýzy na základě sledování inkorporace určitého typu báze, jeho analogu nebo konjugátu s elektrochemicky aktivní skupinou do molekuly DNA

140 Závěr Enzymové reakce na DNA jsou obecně rozšířeným nástrojem konstrukce molekul DNA pro účely genového a proteinového inženýrství a pro diagnostické aplikace. Na základě kombinace enzymových a elektrochemických přístupů byla navržena řada metod vhodných k analýze nukleotidových sekvencí, detekce sekvenčních polymorfismů a poškození DNA. Podobné přístupy mohou být naopak využity k detekci aktivity a studiu vlastností enzymů samotných. Poděkování Tato práce vznikla za podpory grantů GAČR (P206/11/P739, P301/11/2076) a OPVK CZ.1.07/2.3.00/ Literatura 1. Palecek E., Bartosik M.: Chem Rev 112, 3427 (2012). 2. Fojta M., Kubicarova T., Palecek E.: Electroanalysis 11, 1005 (1999). 3. Cahova-Kucharikova K., Fojta M., Mozga T., Palecek E.: Anal. Chem. 77, 2920 (2005). 4. Macickova-Cahova H., Pohl R., Hocek M.: Chembiochem 12, 431 (2011). 5. Havran L., Vacek J., Cahova K., Fojta M.: Anal Bioanal Chem 391, 1751 (2008). 6. Fojta M., Bowater R.P., Stankova V., Havran L., Lilley D.M.J., Palecek E.: Biochemistry 37, 4853 (1998). 7. Vacek J., Cahova K., Palecek E., Bullard D.R., Lavesa-Curto M., Bowater R.P., Fojta M.: Anal Chem 80, 7609 (2008). 8. Hocek M., Fojta M.: Chem Soc Rev 40, 5802 (2011). 9. Horakova P., Macickova-Cahova H., Pivonkova H., Spacek J., Havran L., Hocek M., Fojta M.: Org Biomol Chem 9, 1366 (2011). 138

141 Characterization of Liposomes Used as Model System of Biological Membranes by Glassy Carbon Electrode Martina Parisová a,b, Tomáš Navrátil a, Ivana Šestáková a, and Jiří Barek b a J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of the AS CR, v.v.i., Dolejškova 3, Prague 8, Czech Republic, martina.parisova@jh-inst.cas.cz b Charles University in Prague, Faculty of Science, University Research Centre UNCE Supramolecular electrochemistry, Department of Analytical Chemistry, UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Albertov 6, Prague 2, Czech Republic Abstract This contribution deals with study and characterization of liposomes. These vesicles may serve as model membranes used for study of transporting processes of heavy metal ions across the real phospholipid membranes (PLMs). 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine was used for the formation of large unilamellar vesicles (LUV). These vesicles were prepared by hydration method. Interactions of cadmium ions with LUV in solution have been characterized using voltammetry, where glassy carbon electrode was used as the working electrode. Size and presence of liposomes in sample was proved by dynamic light scattering and free cadmium ions in samples were determined by differential pulse voltammetry. Key words: Liposomes, Transport, Biological membranes, Model system, Glassy carbon electrode. Introduction Consumption of metals and metalloid, organic and inorganic compounds has been constantly increasing with development of society, industry and other human progress. Heavy metals get into soils by erosion of rocks and minerals and also in consequence of various natural processes (e.g., volcanic activity, atmospheric precipitations). However, the most important source of heavy metals in the environment are various human activities like application of various fertilizers, pesticides, sludge, irrigation water etc. 1, 2. Rapid and intensive industrialization have caused contamination of soils, waters and air by substances that are not biodegradable. In some cases these elements and substances are carcinogenic or toxic at higher concentrations and their presence can be considered as risk for the environment and human health 1, 2. Cadmium, copper, lead, zinc (generally heavy or risk metals) and their compounds belong to them 3-5. They are used for surface plating of other metals, in metallurgy 6-8, in agriculture or chemical industry Those substances may pass into living organisms, specifically into cells, where they can be partially accumulated and at higher concentrations they can form specific complex compounds 3, 9, 14, 15. Elucidation of transport mechanisms of these compounds across the biological membranes can help to affect the selectivity and amount of transported substances into plants and human organisms 4, 5, Therefore, this work is aimed at studying of interactions of cadmium with suitable model membranes. Biological membranes are essential for life on Earth. They separate inner, organized space of the cell from outer, entropic space and provide many important processes that are necessary for living cells. Biological membranes are mechanically resistant, can be deformed in a certain range without damage and they have a certain degree of fluidity. These unique properties are ensured by mobile building elements phospholipids (PLs), which form the plasmatic membrane. Phospholipids are amphipathic molecules containing hydrophobic and hydrophilic parts. The hydrophobic part is created from saturated and unsaturated fatty acid tails and the hydrophilic part contains phosphatidic acid, glycerol and a polar group as inositol, choline, ethanolamine etc. PL molecules are oriented by their hydrophobic chains towards nonpolar part of the membrane and by their hydrophilic parts towards aqueous environment. So, PL bilayer structure is formed. This arrangement is the best in terms of 139

142 thermodynamics and optimal for all processes, which are ensured by plasmatic membrane. Biological membranes are investigated in many types of laboratories and the aim is to elucidate the biological processes connected with phospholipid membranes (PLMs). One of these processes is transport of various compounds across PLMs. Biological membrane represents a semipermeable barrier which enable transport of some compounds across it only. Small molecules and gases (CO 2, O 2, N 2 ) easily diffuse across PLM, as well as compounds with hydrophobic character (steroidal hormones) are capable to be transported across nonpolar core of membrane. On the contrary, compounds with polar character as ions, nutrients (amino acids, water ) and other hydrophilic compounds, which are not able to pass across the PLM, require presence of specific proteins, specific transporters incorporated in membrane. These trans-membrane proteins can bound compounds with hydrophilic character and transport them across hydrophobic part of membrane 20. Ionophore calcimycin, highly selective for bivalent metal cations, has been used for this purpose. Because work with real biological membranes is very complicated, for the study of biological processes it is necessary to create a model system which properties would be close to real membrane. In this work liposomes were used as model membranes. Liposomes or PL vesicles are spherical and self-closed vesicles which represent a type of microencapsulation. Thus, fluid or gas parts are closed with help of multilamellar structures of liposomes formed from lipid bilayers 21, 22. Composition of liposomes is very similar to biological membranes, because their basic structure is formed from PLs too. This is one of the reasons why liposomes are used as models of artificial PLMs. Liposomes can be imagined as extremely twisted plasmatic membranes forming the vesicles 23. Liposomes have number of characteristics which can be useful in various applications. They are nontoxic, biodegradable, and can encapsulate a wide range of dissolved compounds. Due to physicochemical properties of liposomes, they have many specific biological characteristics and they can interact with biological membranes of various cells. Therefore, the liposomes can be used as model membranes to study properties, structures, transport mechanisms and other associated processes.. Moreover, they can be used in several industries, especially, in medicine and pharmacy as drug delivery vesicles, solubilizers for various ingredients and penetration compounds in cosmetics 24, 25. These microscopic vesicles can be formed from one or more lipid bilayers (in dependence on method of preparation) surrounding water phase. There are three basic types of liposomes multilamellar vesicles (MLVs), which contain several bilayers, small unilamellar vesicles (SUVs) and large unilamellar vesicles (LUVs). LUVs, which were prepared by hydration method, were used in our measurements. In this method, a solution of PLs in an organic solvent is evaporated and dried in vacuum to form thin film on side of a flask 26. Then the film is hydrated by addition of aqueous buffer and the dispersion is vortexed for 5 minutes. This hydration step must be done at a temperature above the gelliquid crystalline transition temperature Tc of the PL, because otherwise a precipitate in solution is formed and liposomes are not created. Size (100 nm) and presence of ĹUVs in solution was confirmed by dynamic light scattering. Voltammetric technique was used for determination of free cadmium ions in solutions and for characterization of interaction of ions with liposomes. Experimental Apparatus The voltammetric determinations of cadmium ions were carried out using a PC-controlled voltammetric analyzer ECO-TRIBO polarograph (Polaro-Sensors, Prague, Czech Republic), equipped with MultiElchem v 3.0 software (J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of the AS CR, v.v.i., Prague, Czech Republic). Glassy carbon electrode SESV 12 (Elektrochemické Detektory, Turnov, Czech Republic) was used as the working electrode, 140

143 Ag/AgCl/KCl (3 mol L -1 ) (Elektrochemické Detektory, Turnov, Czech Republic) as reference electrode and platinum wire (1 mm diameter) served as the counter electrode. The free cadmium ions were determined in 0,1 M phosphate buffer, ph 7.0 and analyzed using anodic stripping differential pulse voltammetry under following conditions: Accumulation potential (E acc ) = mv, accumulation time (t acc ) = s, initial potential (E in ) = mv, final potential (E fin ) = 1200 mv, scan rate 20 mv s -1, pulse amplitude 50 mv, pulse duration 80 ms, sampling interval 20 ms, sample volume 10 ml. Surface of the glassy carbon electrode was cleaned on soft emery paper and then polished on polishing polyurethane pad using a polishing kit, (Electrochemical Detectors, Turnov, Czech Republic), consisting of Al 2 O 3 suspension (particle size 1.1 mm) and soft polishing Al 2 O 3 powder (particle size 0.3 mm). After finishing this step, the electrode was ready for measurement. Usually, the electrode surface should be polished once a week. Before starting of the work, the glassy carbon electrode surfaces was activated in a 0.1 M phosphate buffer using cyclic voltammetry under following conditions: initial potential (E in ) = mv, final potential (E fin ) =+1000 mv, scan rate 150 mv s -1. Electrode surface was cleaned before each measurement of sample: cleaning potential was mv and cleaning time was 60 s. The cleaning step ensures that the adsorbed species are removed from the surface. ph-value was measured by a digital ph meter 3505, Jenway (Bibbi Scientific Limited, UK). To obtain a homogenous dispersion of liposomes, Mini-Extruder Set was used and polycarbonate membranes with 100 nm pores (Both Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama) were applied. Size of LUVs was determined by dynamic light scattering Zetasizer Nano S (Malvern, United Kingdom), scattering angle 173, He-Ne laser with 4mW output power at 633 nm wavelength). Reagents and Materials The base electrolyte solutions 0.1 M phosphate buffer was prepared from Na 2 HPO 4.12 H 2 O p.a. and NaH 2 PO 4.2H 2 O p.a. (Sigma Aldrich, Prague, Czech Republic). All the other chemicals were used of the analytical reagent purity grade. 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3- phosphocholine (Sigma Aldrich, Prague, Czech republic) was used for preparation of liposome solutions. Characterization of liposomes Large unilamellar liposomes were prepared by hydration method and passed through a polycarbonate filter. Thus prepared liposomes were characterization by dynamic light scattering. By using this method, it has been determined that their size is about 100 nm. Different amounts of liposome stock solution (50, 100, 150, 200, 250 µl) were pipetted into the voltammetric cell containing 10 ml of basic electrolyte and different times of accumulation were applied. Interactions of cadmium ions with liposomal membrane were studied by additions of adequate amounts of cadmium solution (1 mg/ml) to liposomal solution, which was stirred for 2 h. After then, free cadmium ions were determined by standard addition method. Results and Discussion The main attention of this work was aimed toward preparation and characterization of LUVs. Hydration method, which proved to be suitable and easily reproducible, was used to obtain the required mixture of liposomes. An interaction of cadmium ions with liposomes was monitored using glassy carbon electrode. If only liposomes were present in the polarographic cell, none peak corresponded to their presence in the investigated potential interval. After addition of cadmium ions, two peaks at potentials -800 mv and +750 mv were detected (Fig. 141

144 I [na] 1.). Peak at -800 mv corresponded to free cadmium ions in solution and peak at +750 mv represent complex of liposomes with cadmium ions. Because these measurements were performed in absence of an ionophore, it is possible to suppose that cadmium ions were not transported into liposomes ulLIP_60s 250ulLIP_120s 250ulLIP_60s_10ulCd 250ulLIP_120s_10ulCd E [mv] Fig. 1. Direct current (DC) striping voltammetry of cadmium in presence liposomes. 0.1 M phosphate buffer (ph = 7.0); Accumulation potential (E acc ) = mv, accumulation time (t acc ) = 60, 120 s, initial potential (E in ) = mv, final potential (E fin ) = 1200 mv, scan rate 20 mv s -1, cleaning procedure: mv for 60 s with stirring. Liposomes concentration: 0.5 mg/ml; Cd 2+ concentration: 0.05 mg/l. Conclusion For preparation of liposomes the suitable hydration method was used. Liposomes were characterized by dynamic light scattering. Voltammetry with glassy carbon electrode was proved as useful for investigation of interactions of cadmium ions with liposomes. Thus prepared liposomes will be used further as model system for study of transporting processes of cadmium ions in the absence and in the presence of ionophore calcimycin and the transporting conditions will be characterized and optimized. Acknowledgement The authors gratefully acknowledge the financial support by the GA AV CR (Project No. P208/12/1645). References 1. Klusackova P., Lebedova J., Kacer P., Kuzma M., Brabec M., Pelclova D., Fenclova Z., Navratil T.: Prostag. Leukotr. Ess. 78, 281 (2008). 2. Navratil T., Petr M., Senholdova Z., Pristoupilova K., Pristoupil T. I., Heyrovsky M., Pelclova D., Kohlikova E.: Physiol. Res. 56, 113 (2007). 3. Jaklova Dytrtova J., Jakl M., Schroder D., Navratil T.: Curr. Org. Chem. 15, 2970 (2011). 4. Parisova M., Navratil T., Sestakova I., Jaklova Dytrtova J., Marecek V.: Int. J. Electrochem. Sci. 8, 27 (2012). 5. Parisova M., Navratil T., Sestakova I., Marecek V.: Modern Electrochemical Methods XXXII: Transport of copper ions in the presence and absence of ionophore calcimycin and the influence of LMWOAs on this transport, Jetrichovice, (Navratil T., Fojta M., Eds.), Best servis, Jetrichovice 2012, p

145 6. Novotny L., Navratil T., Sander S., Basova P.: Electroanalysis 15, 1687 (2003). 7. Sander S., Navratil T., Basova P., Novotny L.: Electroanalysis 14, 1133 (2002). 8. Sander S., Navratil T., Novotny L.: Electroanalysis 15, 1513 (2003). 9. Cizkova P., Navratil T., Sestakova I., Yosypchuk B.: Electroanalysis 19, 161 (2007). 10. Jaklova Dytrtova J., Jakl M., Sestakova I., Zins E. L., Schroder D., Navratil T.: Anal. Chim. Acta 693, 100 (2011). 11. Navratil T., Sestakova I., Marecek V.: Int. J. Energy Env. 5, 337 (2011). 12. Navratil T., Kopanica M.: Crit. Rev. Anal. Chem. 32, 153 (2002). 13. Navratil T., Sebkova S., Kopanica M.: Anal. Bioanal. Chem. 379, 294 (2004). 14. Jaklova Dytrtova J., Sestakova I., Jakl M., Navratil T.: Electroanalysis 21, 573 (2009). 15. Sestakova I., Navratil T.: Bioinorg. Chem. Appl. 3, 43 (2005). 16. Navratil T., Sestakova I., Jaklova Dytrtova J., Jakl M., Marecek V.: 7th WSEAS International Conference on Environment, Ecosystems and Development: Study of charged particles transport across model and real phospholipid bilayers, Puerto de la Cruz, SPAIN, (Otesteanu M., Celikyay S., Mastorakis N., Lache S., Benra F. K., Eds.), World Scientific and Engineering Acad. and Soc., Puerto de la Cruz, SPAIN 2009, p Jaklova Dytrtova J., Navratil T., Marecek V.: Collect. Czech. Chem. Commun. 76, 1917 (2011). 18. Navratil T., Sestakova I., Marecek V.: Modern Electrochemical Methods XXXI: Transport of divalent cations across the gel supported phospholipid membranes, Jetrichovice, (Navratil T., Barek J., Eds.), Best servis, Jetrichovice 2011, p Jaklova Dytrtova J., Jakl M., Navratil T., Schroder D.: International Journal of Electrochemical Sciences 8, 1623 (2013). 20. Navratil T., Sestakova I., Marecek V.: Development, Energy, Environment, Economics (DEEE '10): Supported phospholipid bilayers and transport of heavy metals across them, Puerto de la Cruz, (Mladenov V., Psarris K., Mastorakis N., Caballero A., Vachtsevanos G., Eds.), Puerto de la Cruz 2010, p Hsieh Y. F., Chen T. L., Wang Y. T., Chang J. H., Chang H. M.: J. Food Sci. 67, 2808 (2002). 22. Gregoriadis G.: Boca Raton, Florida, USA, CRC Press 3, 1 (1984). 23. Dua J. S., Rana, A. C., Bhandari, A. K.,: Interantional Journal of Pharmaceutical Studies and Research 3, 14 (2012). 24. Lasic D.: Am. Sci. 80, 20 (1992). 25. Lipowsky R.: Nature 349, 475 (1991). 26. Bangham A. D.: Prog. Biophys. Mol. Biol. 18, 29 (1968). 143

146 Very Fast Electrophoretic Determination of Creatinine and Uric Acid in Human Urine using a Combination of Two Capillaries with Different Inner Diameters (Velmi rychlé elektroforetické stanovení kreatininu a kyseliny močové v lidské moči pomocí spojení dvou kapilár o různých vnitřních průměrech) Václav Pavlíček a and Petr Tůma a a Institute of Biochemistry, Cell and Molecular Biology, Third Faculty of Medicine, Charles University in Prague, Ruská 87, Prague 10, Czech Republic, VPavlicek@gmail.com Abstract Very fast electrophoretic methods have been developed for determination of creatinine and uric acid in human urine with diode-array detection. The separations were performed in a laboratory-made combination of two capillaries with different inner diameters. Determination of creatinine was successfully performed in 20 mm citric acid/naoh (ph 3.0) and the determination of uric acid in 30 mm MES/NaOH (ph 6.0) as background electrolytes. The developed methods are characterized by a separation time around 10 s and limits of detection 1.4 µm for both analytes. A dilution of the urine sample with water was the only step necessary before the electrophoresis analysis. Key words: Capillary electrophoresis, Creatinine, Diode-array detector, Uric acid. Úvod Mezi hojně stanovované analyty v lidské moči patří kreatinin a kyselina močová. Kreatinin je cyklickým imidem kreatinu (Obr. 1). Kreatin je syntetizován v játrech a ledvinách z glycinu, guanidinové skupiny argininu a methylové skupiny poskytované S-adenosylmethioninem 1. Krví je dopraven do svalu, kde se vyskytuje ve fosforylované formě jako kreatinfosfát. Zhruba 2 % kreatinfosfátu je denně cyklizováno na kreatinin, který je z těla vyloučen jako odpadní látka. Kreatinin vzniká ve svalech jako konečný produkt degradace kreatinfosfátu. Produkce a vylučování kreatininu jsou za normálních okolností rovnocenné. Veškerý kreatinin přefiltrovaný ledvinami je z těla vyloučen močí. V tubulech není zpětně resorbován. Vylučování kreatininu závisí na množství svalové hmoty, funkci ledvin a jeho příjmu v potravě, především na příjmu masa a masných výrobků. Přítomnost kreatininu lze dokázat v moči, mozku, krvi a svalové tkáni 2. Patologické hodnoty kreatininu mají různé druhy původu 3,4. Stanovení koncentrace kreatininu má význam při sledování poruch funkce ledvin a je nejčastěji prováděno Jaffého kolorimetrickou metodou 5,6. V současné době lze kreatinin stanovit enzymatickou metodou 7, ale i řadou různých chromatografických systémů, jako je kapalinová chromatografie s UV 8 a MS 9 detekcí (HPLC-UV/MS), vysokotlaká papírová chromatografie (HPTLC) 10, plynová chromatografie s hmotnostní detekcí (GC-MS) 11 a kapilární elektroforéza (CE) Obr. 1. Neenzymatická přeměna kreatinu na kreatinin. 144

147 Kyselina močová (obr. 2) je u člověka a primátů konečným metabolitem purinů, které jsou součástí nukleových kyselin a řady koenzymů (ATP, NAD + aj.). Kyselina močová je považována za významnou antioxidační látku 4. Některé studie však naznačují, že kyselina močová vstupuje do buněk prostřednictvím specifických transportérů a vyvolává zde prozánětlivé a prooxidační reakce. Porucha metabolismu kyseliny močové souvisí se vznikem řady onemocnění, jako je dna, Lesch-Nyhanův syndrom aj. Její zvýšená koncentrace v organismu (hyperurikémie) indikuje hypertenzi, kardiovaskulární a renální onemocnění. V klinické praxi se stanovení kyseliny močové provádí enzymatickými metodami. Nejběžnější z nich využívá oxidace kyseliny močové kyslíkem za katalýzy enzymem urikázou na allantoin a peroxid vodíku. Využít lze však i řadu dalších metod, jako je vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC) 15, plynová chromatografie (GC) 16, hmotnostní spektrometrie (MS) 17 a kapilární elektroforéza (CE) 18. Obr. 2. Strukturní vzorec kyseliny močové. Experimentální část Separace byly prováděny v laboratorně sestavené kapiláře vytvořené spojením dvou standardních křemenných kapilár o vnějším průměru 363 µm (Composite Metal Services, UK). Separační kapilára, vnitřní průměr 25 μm, délka 9,7 cm, a pomocná kapilára, vnitřní průměr 100 μm, délka 22,9 cm, byly spojeny pomocí polyethylenové trubičky, jejíž vnitřní průměr je o něco menší než vnější průměr spojovaných kapilár. Polyethylenová trubička o délce cca 1 cm byla nahřáta pomocí horkovzdušné pistole na 450 C a poté převlečena přes rovně zaříznuté konce obou kapilár. Tím bylo vytvořeno hydrodynamicky těsné spojení dvou elektroforetických kapilár, které je elektricky izolované 19. Kapilára byla vložena do kazety elektroforetického přístroje (HP 3D CE, Agilent Technologies) a separace byly prováděny při dávkování z krátkého konce kapiláry. Vzdálenost injekčního konce kapiláry k diode-array detektoru byla 8,2 cm. Před použitím byla nová kapilára aktivována promytím 0,1 M roztokem NaOH po dobu 15 min, poté 10 min deionizovanou vodou a na závěr 10 min separačním elektrolytem. Mezi jednotlivými analýzami modelových vzorků i upravené moče byla kapilára promývána pouze separačním elektrolytem po 2 min. Pro stanovení kreatininu byl elektroosmotický tok v kapiláře potlačen pokrytím kapiláry komerčním roztokem (INST coating solution, Biotaq, USA) po dobu 2 min. Vzorek byl dávkován hydrodynamicky tlakem 50 mbar po dobu 5 s. Separace probíhaly při napětí +25 kv a konstantní teplotě 25 C. Pro statistické zpracování dat byl použit program Origin 8.0 (OriginLab Corporation, USA). Veškeré použité chemikálie vykazovaly analytický stupeň čistoty: kyselina citronová (Penta, ČR), kyselina močová (Fluka), hydroxid sodný (Fluka), kyselina p-aminosalicylová (PAS, Sigma - Aldrich), 2-(N-morpholin)ethansulfonová kyselina (MES, Sigma Aldrich), kreatinin (Fluka). K přípravě separačních elektrolytů a zásobních roztoků standardů byla použita deionizovaná voda (18,2 MΩ.cm, Millipore, Bedford, USA). Standardní roztoky kreatininu, kyseliny močové a PAS o koncentraci 1 mg.ml -1 byly získány rozpuštěním pevných látek v deionizované vodě; přídavek 1 M NaOH byl použit k úplnému rozpuštění kyseliny močové a PAS. Separační pufry (BGE) o složení 30 mm MES + 15 mm NaOH (ph 145

148 Signal (mau), 191 nm kreatinin 6,0) a 20 mm kyselina citronová + 9 mm NaOH (ph 3,0) byly připravovány každý den čerstvé. ph bylo měřeno laboratorním ph metrem pmx 3000 WTW (Německo). Vzorky moči byly filtrovány přes centrifugační filtry (Amicon, Millipore, USA) při ot. min -1 po 3 minuty a uchovávány v plastových uzavíratelných zkumavkách při teplotě 2 C. Před elektroforetickou separací byly vzorky temperovány na laboratorní teplotu, poté zpracovány dle následující metodiky: Pro stanovení kreatininu v moči bylo 20 l vzorku smícháno s 980 l deionizované vody. Pro stanovení kyseliny močové v moči bylo 20 l vzorku smícháno s 20 l 1 mg.ml -1 roztoku kyseliny p-aminosalicylové (PAS) a 960 l deionizované vody. Tímto postupem je získán 50krát zředěný vzorek. Výsledná koncentrace PAS je 20 mg.l -1, jež je použita jako vnitřní standard pro zvýšení přesnosti elektroforetického stanovení. Výsledky a diskuze Moč jako komplexní vzorek obsahuje značné množství ionizovatelných látek, které mohou potenciálně ovlivnit elektroforetické stanovení. Z tohoto důvodu je důležitá správná volba separačního pufru (BGE), ve kterém dochází k úplnému oddělení analytu od ostatních složek moče. Kreatinin je dusíkatý heterocyklus s hodnotou pk a 4,8. V kyselém BGE o složení 20 mm kyselina citronová 9 mm NaOH (ph 3,0) migruje jako kationt. Pro omezení adsorpce kreatininu na stěnu kapiláry byla separace provedena v pokryté kapiláře se zastaveným elektroosmotickým tokem v kationtovém módu při napětí 25 kv. Na elektroferogramu, 50krát ředěné lidské moče je patrný výrazný, dobře kvantifikovatelný pík kreatininu, viz obr čas [s] Obr. 3. Záznam elektroforetického stanovení kreatininu v lidské moči, po 50násobném zředění (36,9 mg.l -1 ). Experimentální podmínky: separační elektrolyt; 20 mm kyselina citronová 9 mm NaOH (ph 3,0), hydrodynamické dávkování 250 mbar.s, napětí 25 kv, UV detekce při 191 nm. Kyselina močová je slabá dvojsytná kyselina s hodnotou pk a 5,4. Pro CE stanovení kyseliny močové byl testován separační elektrolyt o složení: 30 mm MES + 15 mm NaOH (ph 6,0) a separace byla provedena v kationtovém módu při napětí 25 kv. Za těchto podmínek migruje kyselina močová jako aniont proti elektroosmotickému toku, který je při ph 6,0 146

149 Signal (mau), 292 nm kyselina močová PAS rychlý a strhne kyselinu močovou do detektoru. Elektroferogram 50krát ředěné lidské moči s přídavkem interního standardu PAS je znázorněn na obr Obr. 4. Záznam elektroforetického stanovení kyseliny močové v lidské moči, po 50násobném zředění (8,8 mg.l -1 ). Koncentrace PAS 20 mg.l -1. Experimentální podmínky: separační elektrolyt; 30 mm MES 15 mm NaOH (ph 6,0), hydrodynamické dávkování 250 mbar.s, napětí 25 kv, UV detekce při 292 nm. Kvalitativní i kvantitativní parametry stanovení kreatininu a kyseliny močové jsou shrnuty v tabulce I. Tabulka I. Migrační čas (t M ), počet teoretických pater (N), limity detekce (LOD), citlivost a korelační koeficient (R) v 50krát ředěné moči s přídavkem kreatininu a kyseliny močové v koncentračním rozmezí 0 až 70 mg.l -1. Hodnoty RSD byly určeny pro 3 analýzy jednoho vzorku moče. Vzorek moče obsahoval 37 mg.l -1 kreatininu a 9 mg.l -1 kyseliny močové. Parametr kreatinin t M, s 10,6 10,1 N, m N, s LOD, mg.l -1 0,16 0,23 LOD, µm 1,41 1,37 Citlivost, mau.mg.l -1 0,112 0,149 R 0,998 0,998 RSD pro t M, % 0,8 4,3 RSD pro plochu píku, % 4,4 3,7 Fyziologické hodnoty v moči, mm 5,7 14,7 1,5 4,5 Hodnoty LOD byly určeny jako výška píku odpovídající trojnásobku průměrné hodnoty šumu. čas [s] Analyt kyselina močová 147

150 Vyvinuté metodiky poskytují pro oba sledované analyty velmi krátké migrační časy kolem 10 s. Počet teoretických pater (N) se pohybuje kolem 400 tisíc na metr kapiláry pro kreatinin a 250 tisíc pater/m pro kyselinu močovou. Pro velmi rychlé separace je vhodnější vyjádřit separační účinnost jako N za jednotku času (N/t M ), která lépe vystihuje rychlost separačního procesu 20 ; 3300 s -1 pro kreatinin a 2180 s -1 pro kyselinu močovou. Dosažené LOD v moči se pro oba analyty pohybují kolem 1 µm. Tyto LOD jsou dostatečně nízké pro kvantifikaci kreatininu i kyseliny močové v 50krát ředěných vzorcích moče. Získané relativní směrodatné odchylky (RSD) pro migrační čas i plochu píku byly určeny ze 3 následných analýz jednoho vzorku moče a odpovídají běžným hodnotám pro CE analýzu. Závěr Spojením dvou kapilár o různých vnitřních průměrech se podařilo zvýšit hodnotu intenzity elektrického pole v kapiláře na cca 3 kv/cm. Za těchto podmínek jsou dosažené migrační časy pro kreatinin a kyselinu močovou cca 10 s. Vyvinutá metodika velmi rychlého stanovení obou analytů je dostatečně citlivá pro jejich monitorování v lidské moči. Je zřejmé, že spojená kapilára je účinným nástrojem pro velmi rychlé elektroforetické separace, které se v budoucnu mohou stát silným partnerem nejen pro klinickou analýzu. Poděkování Práce vznikla za finanční podpory Grantové agentury Univerzity Karlovy, grant č a UNCE Literatura 1. Čermáková M., Štěpánová I.: Klinická biochemie 1.díl, NCO NZO. Brno Murray R. K., et al.: Harperova biochemie, 4. vyd.. H&H Masopust J.: Požadování a hodnocení biochemických vyšetření, Karolinum. Praha Racek J., et al.: Klinická biochemie, Galén. Praha Downloaded Jaffé M. Z.: Physiol. Chem. 10, 391 (1886). 7. Dastych M., et al.: Klinická biochemie, LF MU. Brno Werner G., Schneider V., Emmert J.: J. Chromatogr. 525, 265 (1990). 9. Takatsu A., Nishi S.: Biol. Mass Spectrom. 22, 643 (1993). 10. Klaus R., Fischer W., Hauk H. E.: Chromatographia 32, 307 (1991). 11. Welch M. J., Cohen A., Hertz H. S., Ng K. J., Schaffer R., Van Der Lijn, P., White, E.: Anal. Chem. 58, 1681 (1986). 12. Rodríguez J., Berzas J. J., Castaneda, G., Mora, N., Rodrígez J., M.: Anal. Chim. Acta. 521, 53 (2004). 13. Costa O. A. C., Da Costa L. J., Tonin G. F., Tavares M. F. M., Micke, A. G., J.: Chromatogr. A. 1171, 140 (2007). 14. Tůma P., Samcová E., Duška F.: J. Sep. Sci. 31, 2260 (2008). 15. Kanďár R., Žáková P., Mocová P., Skalický J., Kovařík J.: Klin. Biochem. Metab. 18, 167 (2010). 16. Lakshmi D., Whitcombe M. J., Davis F., Skarun P. S., Prasad B. B.: Electroanalysis. 23, 305 (2011). 17. Chen X. B., Calder A. G., Prasitkusol P., Kyle D. J., Jayasuriya M. C.: J. Mass Spectrom. 33, 130 (1998). 18. Pormsila W., Krähenbühl S., Hauser P. C.: Anal. Chim. Acta. 636, 224 (2009). 19. Tůma P., Opekar F., Samcová E.: Electrophoresis. 34, 522 (2013). 20. Monnig C. A., Jorgensen J. W.: Anal. Chem. 63, 802 (1991). 148

151 Adsorptive Transfer Stripping Voltammetry in DNA and RNA Oligomer Research Iveta Pilařová a, Zdeňka Balcarová a, and Libuše Trnková a, b a Department of Chemistry, Faculty of Science, Masaryk University, Kamenice 5, Brno, Czech Republic, @mail.muni.cz, libuse@chemi.muni.cz b Central European Institute of Technology CEITEC, Brno, University of Technology, Technická 3058/10, CZ Brno, Czech Republic Abstract Adsorptive transfer stripping (AdTS) technique in combination with electrochemical methods, such as cyclic voltammetry (CV), linear sweep voltammetry (LSV) and elimination voltammetry with linear scan (EVLS), was applied for the electrochemical investigation of DNA and RNA oligomers with sequences d(gcgaagc), r(gcgaagc) and d(gcgagc), forming hairpins. On the mercury electrode in buffered aqueous solutions, all the oligomers studied provide reduction signals of adenine and cytosine and an oxidation signal of guanine. The AdTS voltammetry at ph 1.8, 5.8 and 12.8 showed differences between DNA and RNA fragments and confirmed that the shortest and most stable hairpin is formed by the DNA heptamer d(gcgaagc). Key words: Adsorptive transfer stripping, hairpins, DNA heptamer d(gcgaagc), neurodegenerative diseases, voltammetric methods, mercury electrode. Introduction Adsorptive transfer stripping voltammetry (AdTSV) presents a new analytical method, based on the adsorptive preconcentration of biomacromolecules on the electrode, the transfer of the adsorbed layer into a new medium containing supporting electrolyte and subsequent voltammetric analysis. It is known, that the combination of cyclic voltammetry with adsorptive transfer stripping is a suitable tool for the anaylsis of nucleic acids. In addition, AdTS enables us not only to perform voltammetric analysis of biomacromolecules adsorbed from media not suitable for voltammetric analysis of the conventional type, but also to utilize the differences in the adsorbability of substances to separate them on the electrode 1. Nowadays, great attention has been devoted to the electrochemical study of DNA and RNA oligomers, forming hairpin or hairpins like structures in dependence on the number of bases in the chain. Hairpins, consisting of single-stranded loop and base paired stem regions and naturally occurring not only in single-stranded DNAs and RNAs but also in double stranded DNAs 2-4, are very important in many biological processes. They play a crucial role in expansion events of triplet repeat expansion associated with neurodegenerative diseases, such as fragile chromosome X syndrome, Huntington disease, Friedreich ataxia, or myoclonic epilepsy. The shortest and most stable hairpin is formed by the DNA heptamer d(gcgaagc). This sequence is found in replication origins of phage ФX 174 4, 5 and herpes simplex virus 4, 6, in the promoter region of an Escherichia coli heat-shock gene 4, 7, and in rrna genes 4, 8. Our contribution deals with the application of adsorptive transfer stripping in combination with cyclic voltammetry (CV), linear sweep voltammetry (LSV), and elimination voltammetry with linear scan (EVLS) for the investigation of DNA and RNA heptamers d(gcgaagc) and r(gcgaagc) respectively, and DNA hexamer d(gcgagc) on the mercury electrode. Experimental Chemicals The lyophilized samples of DNA and RNA oligomers d(gcgaagc), r(gcgaagc) and d(gcgagc) were purchased from Integrated DNA Technologies, Inc., USA. The exact concentration of all the oligomers studied was determined by UV/VIS spectroscopy. 149

152 I [μa] f (I) I [μa] f (I) Phosphate acetate buffer as the supporting electrolyte was prepared as a mixture of acetic acid (glacial, Sigma Aldrich; ACS reagent), phosphoric acid (84%; p.a.; Penta Chrudim) and sodium hydroxide (Sigma Aldrich; 97%; p.a.). All solutions were prepared in distilled MILI Q water. Methods The voltammetric experiment was carried out using the electrochemical analyzer AUTOLAB PGSTAT 20 (EcoChemie, Utrecht, The Netherlands). A solution of DNA or RNA oligomer sample with a concentration of mol L -1 was injected into the polarographic vessel equipped with three electrodes: a hanging mercury drop electrode (HMDE) as the working electrode, and Ag/AgCl/3M KCl and Pt wire as a reference and an auxiliary electrode, respectively. The phosphate-acetate buffer (ph 1.8, 5.8 and 12.8) was used as the supporting electrolyte. In the first step, adsorptive transfer stripping followed by voltammetric analysis was performed. Adsorptive transfer stripping voltammetry (AdTSV) Fifty μl of phosphate-acetate buffer (ph 1.8, 5.8 and 12.8) with the addition of the sample measured (DNA, RNA oligomer; c = mol L -1 ) is put on the parafilm and afterwards it is adsorbed on HMDE for 120 s. In the next step, this adsorbed layer is transferred into water and then into the new medium containing only the supporting electrolyte (phosphate acetate buffer; ph 5.8), and the voltammetric analysis is carried out. The LSV curves were measured in a potential range from 0 to -1.7 V at scan rates from 100 to 800 mv/s. From the smoothed voltammetric curves (Savitzky-Golay filter, level 2), the elimination function E4 with simultaneous elimination of kinetic and charging currents and diffusion current conservation, according to EVLS E4 equation 9-12 : f(i) = I I 1/ I 2, was calculated. Results and discussion In cyclic voltammetry (CV) the DNA and RNA oligomers studied provide typical reduction signals of adenine (A) and cytosine (C) and an oxidation signal of guanine (G) on the mercury electrode (HMDE) in buffered aqueous solution (phosphate acetate buffer). The oxidation peak of guanine (G peak) corresponds to the oxidation of reduced product of G (7,8- dihydrogenguanine) formed at very negative potentials with hydrogen discharge Cathodic part A+C peaks AdTS from ph 12.8 to ph 5.8 AdTS from ph 5.8 to 5.8 AdTS from ph 1.8 to ph E [mv] Anodic part GII AdTS from ph 12.8 to ph AdTS from ph 5.8 to ph GI AdTS from ph 1.8 to ph G peaks E [mv] EVLS E4 AdTS from ph 12.8 to ph EVLS E4 AdTS from ph 5.8 to ph EVLS E4 AdTS from ph 1.8 to ph Cathodic part Anodic part EVLS E4 AdTS from ph 12.8 to ph 5.8 EVLS E4 AdTS from ph 5.8 to ph 5.8 EVLS E4 AdTS from ph 1.8 to ph 5.8 Fig. 1. Adsorptive transfer stripping of DNA heptamer d(gcgaagc). E [mv] E [mv] 150

153 I [μa] f (I) I [μa] f (I) Both signals are studied by CV, LSV and EVLS in combination with adsorptive transfer stripping technique which enabled us to utilize differences in the adsorbability of substances to separate them on the electrode (accumulation time t a 120 s). The voltammetric curves obtained are divided into two parts: (a) a cathodic part, involving the reduction signals of A and C residua and (b) an anodic part, involving the oxidation signals of the G residua of the DNA and RNA oligomer studied. Cathodic part: It follows from Fig.1 that the LSV experiment provides two, quite huge reduction signals of A and C residua in the more negative potential region. The best resolution of these signals is observed in the case of AdTS of DNA heptamer from a buffer with ph 12.8 to ph 5.8. The highest signals are monitored for DNA heptamer from a buffer with ph 5.8 to buffer with ph 5.8. In contrast, the lowest signal without well readable current maxima in the case of AdTS from a solution with ph 1.8 to ph 5.8 is monitored. Elimination voltammetry with linear scan (EVLS E4) in combination with adsorptive transfer stripping yields a twofold increase of reduction signals. Anodic part: The LSV experiment yields two oxidation signals of guanine residua, GI (~ -300 mv) and GII (~ -200 mv) of the DNA heptamer studied. In addition, the GI signal is significantly higher than the GII signal in the case of AdTS of DNA heptamer studied from buffer with ph 5.8 to ph 5.8 and AdTS from ph 12.8 to ph 5.8. Compared to AdTS from a buffer with ph 1.8 to ph 5.8, both oxidation signals are sharp and narrow. It can be seen that decreasing the ph value of the buffer in which the DNA heptamer studied is adsorbed causes a shift of GI and GII peaks into the more positive potential region. EVLS in combination with AdTS verified the adsorption of guanine residua of the DNA heptamer studied on the electrode (readable peak counterpeak signals) Cathodic part AdTS from ph 12.8 to ph 5.8 AdTS from ph 5.8 to ph AdTS from ph 1.8 to ph A+C peaks E [mv] E [mv] EVLS E4 AdTS from ph 12.8 to ph 5.8 EVLS E4 AdTS from ph 5.8 to ph 5.8 EVLS E4 AdTS from ph 1.8 to ph 5.8 Cathodic part AdTS from ph 12.8 to ph 5.8 AdTS from ph 5.8 to ph 5.8 AdTS from ph 1.8 to ph 5.8 G peaks EVLS E4 AdTS from ph 12.8 to ph 5.8 EVLS E4 AdTS from ph 5.8 to ph 5.8 EVLS E4 AdTS from ph 1.8 to ph Anodic part E [mv] Fig. 2. Adsorptive transfer stripping of RNA heptamer r(gcgaagc) Anodic part Cathodic part: Compared to DNA heptamer, RNA heptamer yields only one reduction signal of A and C residua on the HMDE. The highest reduction signal is observed in the case of AdTS of the RNA heptamer studied from a buffer with ph 1.8 to ph 5.8. EVLS verified the -1 E [mv] 151

154 f (I) I [μa] I [μa] f (I) adsorption of adenine and cytosine residua on the electrode (readable peak counterpeak signal). Anodic part: RNA heptamer yields only one sharp oxidation signal of guanine residua (~ -200 mv). The decreasing ph value of the buffer in which the RNA heptamer is adsorbed causes a shift of the G signals into the more positive potential region. In addition, it follows from Fig. 2 that the intensity of G signals of RNA heptamer (I p = 0.13 μa) is significantly higher than in the case of DNA heptamer (I p = 0.04 μa). EVLS in combination with adsorptive stripping verified the adsorption of guanine residua on the HMDE (readable peak counterpeak signals). Apart from the DNA and RNA heptamer also the DNA hexamer was studied Cathodic part AdTS from ph 12.8 to ph AdTS from ph 5.8 to ph 5.8 AdTS from ph 1.8 to ph A+C peaks E [mv] EVLS E4 AdTS from ph 12.8 to ph 5.8 EVLS E4 AdTS from ph 5.8 to ph 5.8 EVLS E4 AdTS from ph 1.8 to ph Cathodic part -2 E [mv] AdTS from ph 12.8 to ph 5.8 AdTS from ph 5.8 to ph 5.8 AdTS from ph 1.8 to ph E[mV] G I G II G peaks Anodic part Anodic part Fig 3. Adsorptive transfer stripping of DNA hexamer d(gcgagc). E [mv] EVLS E4 AdTS from ph 12.8 to ph 5.8 EVLS E4 AdTS from ph 5.8 to ph 5.8 EVLS E4 AdTS from ph 1.8 to ph 5.8 Cathodic part: The DNA hexamer studied provides two, quite identical reduction signals of adenine and cytosine residua. It can be stated that the character of these signals is not changed with the increasing ph value of the buffer in which the DNA hexamer studied is adsorbed, compared to the heptamers studied. EVLS in combination with AdTS yields significantly resolved reduction signals of A and C residua. Anodic part: Analogous to the DNA heptamer, also the DNA hexamer provides two oxidation guanine signals GI (~ -300 mv) and GII (~ -200 mv) and the character of these signals is not changed with the increasing ph value of the buffer in which the hexamer studied is adsorbed. EVLS in combination with adsorptive stripping verified the adsorption of guanine residua of the hexamer studied on the electrode (readable peak counterpeak signal). Conclusion The DNA and RNA oligomers studied provided the typical reduction signals of adenine and guanine residua and oxidation signals of guanine, on the mercury electrode in aqueous buffered solutions (phosphate acetate buffer; ph 1.8, 5.8 and 12.8). It was found that DNA oligomers provided two reduction signals of adenine and cytosine residua which in the case of DNA heptamer d(gcgaagc), are quite huge and with worse readable current maxima I p. The intensity of reduction signals is changed with increasing ph. It can be stated that the

155 highest effectivity of adsorption is noted in the case of AdTS in the more alkaline buffered media. In the case of DNA hexamer d(gcgacg) we obtain two identical reduction signals without any effect of ph on the intensity of the reduction signals obtained. And, for this reason, we can conclude, that the effectivity of the hexamer studied is similar in all media buffered. Concerning the oxidation signals of G it was found that DNA oligomers yielded two G oxidation signals, GI (~ -300 mv) and GII (~ -200 mv) on the HMDE. These oxidation signals are in the case of DNA heptamer shifted into the more positive potential region with the decreasing ph value of the buffer in which the heptamer studied is adsorbed. AdST EVLS verified the adsorption of G residua on the electrode (readable peak counterpeak signals). The RNA heptamer r(gcgaagc) yielded only one reduction signal of A and C residua of the heptamer studied. Analogous to DNA heptamer, the intensity of the reduction signals is changed with increasing ph and the highest effectivity of adsorption is noted in the case of AdTS in the more acidic buffered media. Compared to the DNA oligomers studied, the RNA heptamer provided only one oxidation signal of guanine residua. This oxidation signal is shifted into the more positive potential region as the effect of the decreasing ph value of the buffer in which the RNA heptamer studied is adsorbed. AdTS EVLS verified the adsorption of A, C and G residua on the mercury electrode (readable peak counterpeak signals). Acknowledgement This research was supported by (a) the CEITEC Central European Institute of Technology Project CZ.1.05/1.1.00/ , (b) MUNI/A/0992/2009 project of the Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic and (c) the OPVK project (NanoBioMetalNet) CZ.1.07/2.4.00/ The authors wish to thank Metrohm Company for the possibility of presenting these results. References 1. Palecek E., Postbieglova I.: J. Electroanal. Chem. 214, 359 (1986). 2. Hirao I., Nishimura Y., Naraoka T., Watanabe K., Arata Y., Miura K.: Nucleic Acids Research. 17, 2223 (1989). 3. Yoshizawa S., Kawai G., Watanabe K., Miura K., Hirao I.: Biochemistry. 36, 4761 (1997).4. Trnkova L., Postbieglova I., Holik M.: Bioelectrochemistry. 63, 25 (2004). 5. Arai K., Low R., Kobori J., Shlomai J., Kornberg A.: Journal of Biological Chemistry,256, 5273 (1981). 6. Elias P., Lehman I.R.: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85, 2959 (1988). 7. Cowing D.W., Bardwell J.C.A., Craig E.A., Woolford C., Hendrix R.W., Gross C.A.: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82, 2679 (1985). 8. Hirao I., Kawai G., Yoshizawa S., Nishimura Y., Ishido Y., Watanabe K., Miura K., Nucleic Acids Research, 22, 576 (1994). 9. Dracka O.: J. Electroanal. Chem. 402, 19 (1996). 10. Dracka O., Trnkova L.: J. Electroanal. Chem. 413, 123 (1996). 11. Trnkova L.: Application of elimination voltammetry with linear scan in bioelectrochemistry. In: Utilizing of bio-electrochemical and mathematical methods in biological research. Ed.: Adam V. and Kizek R., Signpost, Kerala, Chapter 4, p. 51 (2007). 12. Trnkova L., Friml J., Dracka O.: Bioelectrochemistry. 54, 131 (2001). 13. Studničková M., Trnková L., Zetěk J., Glatz Z.: Bioelectrochem. Bioenerg. 21, 83 (1989). 153

156 Preparation of DNA Probes for Electrochemical Bioassays by Sequence-Specific Incorporation of a Single or More Redox Labels into a DNA-Strand (Příprava DNA sond pro elektrochemické bioanalytické aplikace pomocí sekvenčně specifické inkorporace jedné nebo více redoxních značek do řetězce DNA) Medard Plucnara a, Petra Ménová b, Jana Balintová b, Hana Macíčková-Cahová b, Luděk Havran a, Michal Hocek b, and Miroslav Fojta a a Institute of Biophysics, AS CR, v.v.i., Královopolská 135, Brno, Czech Republic b Institute of Organic Chemistry and Biochemistry, AS CR, v.v.i., Flemingovo nam. 2, Prague 6, Czech Republic, @mail.muni.cz Abstract Incorporation of different types of labels into DNA strand by single step primer extension reaction is for a long time commonly used method for preparing products bearing labels in whole synthesized strand. Drawback of single-step primer extension procedure is global modification of the whole synthesized DNA stretch which may affect structure and interactions of the DNA (protein-binding ability, stability of double helix and others) in an undesirable way. For these reasons development of two- or multistep techniques enabling introduction of a single label or combination of labels only into specific positions in DNA sequence is subject of our research. Key words: Electrochemical labeling of DNA, Enzymatic incorporation, Ligation, Multipotential DNA coding. Úvod Podstatnou předností elektrochemického značení je zejména nižší cena a konstrukční jednoduchost měřících zařízení. To by mohlo být jejich hlavním přínosem ve srovnání s optickými metodami využívajícími fluorescenčního značení. V naší práci vyvíjíme nové způsoby značení nukleových kyselin různými elektrochemicky aktivními skupinami, které by umožnily jejich efektivnější aplikaci pro nejpoužívanější typy analýz, jako je detekce hybridizace DNA, identifikace jednonukleotidových polymorfismů, detekce interakcí proteinů s DNA apod. 1, 2 Kromě samotných bioanalytických aplikací je součástí tohoto výzkumu rovněž problematika vlivu chemické modifikace DNA na její interakce s dalšími molekulami, včetně komplementárních vláken DNA a specifických bílkovin. Příprava značených DNA sond je obvykle založena na enzymatické inkorporaci jedné nebo více různých elektrochemických značek do jediného řetězce prodloužením primeru ( primer extension dále PEx ) v jednom kroku. U takto připravených řetězců nesoucích různé kombinace značek se sleduje korelace intenzity signálů se zastoupením příslušně značených nukleotidů v sekvenci (tzv. vícepotenciálové kódování), čehož lze v principu využít pro detekci změn zastoupení jednotlivých bazí v dané sekvenci. V případě jednokrokové PEx metody dochází k inkorporaci značených (tj. chemicky modifikovaných) nukleotidů do celého syntetizovaného úseku, což je pro některé aplikace nežádoucí (modifikace DNA podél jejího delšího úseku může např. ovlivnit interakce této DNA s proteiny nebo ovlivnit stabilitu dvoušroubovice DNA). V jiných případech je pak výhodné vkládat modifikovanou nukleobázi do přesně definovaného místa v DNA (studium vlivu modifikace DNA na interakce s proteiny na úrovni jednonukoetidového rozlišení). Pro tyto účely jsme vyvinuli dvoukrokové techniky konstrukce sekvenčně-specificky modifikovaných DNA sond. Experimentální část Jedním ze způsobů zavádění značky na jedno konkrétní místo uvnitř sekvence je enzymatická inkorporace PEx reakcí o dvou krocích s využitím primeru, přiléhajícího 3 - koncem k modifikovanému místu 3. V tomto případě dojde v prvním kroku při ideálním molárním poměru primeru (1 : 1,3) a značeného trifosfátu k prodloužení primeru o jednu modifikovanou 154

157 bázi. Následným přídavkem přebytku nemodifikovaných nukleosid trifosfátů je poté řetězec dosyntetizován (Obr. 1A). Vzniká zpravidla směs produktů, ve které proporce modifikovaných řetězců závisí na úspěšnosti prvního kroku PEx reakce. Pro inkorporace značených nukleotidů do řetězce byla použita polymeráza KOD XL. Templáty jsou značené biotinem na 5 -konci. Duplex je izolován ze směsi s využitím magnetických částic se streptavidinem. Modifikované ssdna řetězce jsou izolovány následnou tepelnou denaturací při 75 C. Jinou možností je připojení zbytku řetězce ke 3 - koncovému modifikovanému nukleotidu primeru DNA ligázou (Obr. 1B). U této metody je zajištěna přítomnost značeného nukleotidu v řetězci o plné délce, neboť v případě absence značeného nukleotidu na 3 -konci primeru nemůže dojít k ligaci. V prvním kroku se provede připojení značené báze podobně jako v předchozí variantě. Poté, ještě před samotnou ligací, je provedena purifikace řetězců pomocí soupravy Nucleotide removal kit (Quiagen). Následuje přídavek ligázy spolu s ligovaným řetězcem do směsi a inkubace 30 min. při 16 C. Tento experiment je zatím ve fázi optimalizace. Obr. 1. Schéma provedení monoinkorporace s využitím dvoustupňové PEx reakce (A), resp. s využitím ligace T4 DNA ligázou. Výsledky a diskuze Na Obr. 2 je vidět výsledek monoinkorporace tří různých elektrochemických značek s využitím obou výše uvedených postupů. V případě syntézy řetězce KOD XL polymerázou byly úspěšně inkorporovány všechny typy modifikací a dvoukrokovou PEx reakcí (starty 9-12) se podařilo získat velmi dobrý výtěžek řetězců s monoinkorporovanou modifikovanou bází uvnitř sekvence (50 nukleotidů dlouhý produkt). V případě ligace řetězce T4 ligázou probíhá reakce méně účinně a za daných podmínek se podařilo získat cca 50 % úspěšně dosyntetizovaných produktů (50 nt.) (starty 13-16). Je ale vidět, že ligáza toleruje přítomnost modifikovaných nukleotidů na 3 -konci řetězce v místě ligace, jelikož se výrazněji neliší zastoupení produktů v případě použití modikovaných konců značek od nemodifikované kontroly. To je pro další aplikaci této metody klíčové zjištění. 155

158 Obr. 2. Monoinkorporace modifikovaného adeninu (vyznačen šipkou) do pozice 15 ve vazebné sekvenci ppgm1: 1, 3, 5, 7 - kontrola primer ; 2, 4, 6, 8 primer prodloužený PEx reakcí o 1 (modifikovaný) adenin, 9-12 řetězce dosyntetizované polymerázou se směsí nemodifikovaných dntp, řetězce dosyntetizované připojením zbytku řetězce ligázou; 2, 9, 13 A nemodifikovaná kontrola; 4, 10, 14 A-NO 2 (nitroskupina vázaná přes fenyl); 6, 11, 15 A-EBF (benzofurazan vázaný přes ethinyl); 8, 12, 16 A-PAQ (antrachinon vázaný přes propargyl). Sekvence primeru je podtržena, vazebná sekvence ppgm1 je vyznačena žlutým obdelníkem. Obr. 3. Porovnání intenzit signálů řetězců různým způsobem značených nitroskupinou. Měřeno adsorpční přenosovou volumetrií na rtuti (HMDE). Pro účely elektrochemických analýz byly do řetězce monoinkorporovány konjugáty různých nukleotidů s nitroskupinou, která se pro enzymatickou inkorporaci a následnou elektrochemickou detekci dosud dobře osvědčila 3. Tato značka poskytuje při cyklické voltametrii ve zvoleném potenciálovém rozsahu (-0,2V -0,65 V 0,1 V -0,2V) tři výrazné signály ireverzibilní redukce nitroskupiny a reverzibilní oxidace vzniklého hydroxylaminu na nitrososkupinu. Obrázek 3 ukazuje porovnání signálů plně modifikovaných řetězců, primerů s jednou nitroskupinou na 3 -konci, resp. řetězce s jednou nitroskupinou uvnitř sekvence, při měření cyklickou voltametrií na rtuťové elektrodě (HMDE). Je vidět, že přítomnost jediné nitroskupiny uvnitř řetězce lze poměrně spolehlivě elektrochemicky detekovat. 156

159 Obr. 4. Ukázka měření signálů řetězce modifikovaného bázemi nesoucími nitroskupinu, a benzofurazan (BF) (vlevo), porovnání intenzit signálů obou skupin normalizovaných velikostí píku G při jejich různém zastoupení v řetězci (vpravo). V dalších experimentech jsme kombinovali značení DNA nitroskupinami se značením další reducibilní organickou skupinou, benzofurazanem. Signály nitroskupiny a benzofurazanu na HMDE bylo možno díky dostatečnému rozdílu potenciálu jejich ireverzibilní redukce (obr. 4 vlevo) pozorovat v jednom měření. Jak je patrno, za daných podmínek (bod obratu CV při potenciálu -1.3 V) již detekovat signály oxidace hydroxylaminu a redukce nitrososkupiny (viz obr. 3). Pokud je bod obratu posunut až do potenciálu -1,85 V, lze získat pík G poskytovaný guaninovými zbytky v DNA (v obr 4 vlevo byl CV s bodem obratu při -1.8 V změřen jako druhý sken po změření CV s bodem obratu při -1.3 V, proto na této křivce již nejsou píky redukce nitroskupiny a benzofurazanu). Pomocí píku G lze kvantifikovat množství DNA ve vzorku a tudíž provést normalizaci signálů (výšky píků) inkorporovaných značek na jednotkové množství DNA. Ve sloupcovém grafu (Obr. 4, vpravo) vidíme porovnání intenzit signálů nitroskupiny (NO 2 red.) a benzofurazanu (BF red.) normalizované výškou G-píku v oligonukleotidech, kde jsou tyto značky zastoupeny v různém poměru. Je patrný vztah mezi velikostí signálu a zastoupení značek v daném oligonukleotidu. Závěr U výše popsaných způsobů enzymatického značení řetězců DNA se podařilo získat výsledky naznačující univerzálnost těchto postupů pro konstrukci DNA sond nesoucích různé značky (modifikace). Některé postupy, například metoda využívající ligaci DNA v sousedství značených nukleotidů, však ještě vyžadují optimalizaci postupu. Zvládnutí těchto metod značení by přineslo mnoho relativně nenákladných možností přípravy sond prakticky využitelných pro detekci polymorfizmů, vazebné experimenty, analýzy sekvence nukleových kyselin a dalších typů analýz. Poděkování Tato práce vznikla díky podpoře grantů GA ČR (P206/12/G151) a GA AV ČR (IAA ). Literatura 1. Hocek M., Fojta M.: Chem. Soc. Rev. 40, 5802 (2011). 2. Cahova H., Havran L., Brazdilova P., Pivonkova H., Pohl R., Fojta M., Hocek M.: Angew. Chem. Int. Edit. 47, 2059 (2008). 3. Menova P., Cahová H., Plucnara M., Havran L., Fojta M., Hocek M. Chem. Commun in press (2013). 157

160 Evaluation of Measured Data Validation of a New Analytical Method (Vyhodnocení naměřených dat - Validace nové analytické metody) Petr Pořický The Dukovany Nuclear Power Station, ČEZ, a. s., Dukovany, Czech Republic, porickyp@cez.cz Abstract The present contribution deals with validation of a new analytical method. The article describes one of possible ways, how to realize this validation. Key words: Analytical chemistry, Validation, Evaluation. Úvod Jeden z problémů je jak validovat novou analytickou metodu. V tomto článku je popsán jeden z možných postupů jak validaci provést. Experimentální část 1. Změří se sada vzorků původní metodou a novou metodou 2. Získaná data původní metodou se vynesou na osu x a na osu y data získaná novou metodou 3. Závislost se vyhodnotí metodou nejmenších čtverců pomocí regresního tripletu 4. Výsledný model se vyhodnotí Příklad Byla testována a porovnávána nová metoda stanovení koncentrace rozpuštěného kyslíku na optickém principu s původní elektrochemickou metodou. Naměřená data (Tabulka I) porovnejte a rozhodněte, zda nová optická metoda je vhodná pro stanovení koncentrace rozpuštěného kyslíku. Tabulka I Porovnávaná naměřená data. O 2 [%] opt 2,686 2,943 3,555 4,135 4,558 4,835 4,964 5,036 O 2 [%] pův 2,860 2,940 3,560 4,130 4,560 4,840 4,960 5,010 Výsledky a diskuse Návrh modelu Navrhneme regresní model (přímky) y = β 0 + β 1 x, u které budeme testovat nulovou hypotézu H 0 : β 0 = 0, β 1 = 1 Předběžná analýza dat Poloha a proměnlivost proměnných y, x se posuzuje na základě průměru a směrodatné odchylky hodnot každé proměnné. Pearsonův párový korelační koeficient ukazuje vysokou korelaci proměnných y a x (Tabulka II). Tabulka II Předběžná analýza dat. Proměnná Průměr Směrodatná odchylka Párový korelační koeficient Y E E X E E Spočtená hladina výz. 158

161 Odhadování parametrů Klasickou metodou nejmenších čtverců (MNČ) byly nalezeny odhady parametrů (Tabulka III), úseku β 0 a směrnice β 1. Studentův t-test ukázal, že úsek (absolutní člen) β 0 je statisticky nevýznamný, zatímco směrnice β 1 je statisticky významná, když t 0,95 (8-2) = 2,447. Tabulka III. Odhady parametrů získané MNČ. Parametr Odhad Směrodatná odchylka H 0 : b j = 0 vs. t-kriterium H A : b j <> 0 hypoteza H0 je Spočtená hlad. význam b E E E-01 Akceptována b E E E+02 Zamítnuta Párový korelační koeficient r (Tabulka IV) ukazuje, že navržený lineární regresní model je statisticky významný. Vysoká hodnota koeficientu determinace D (= 99,988%), představující procento bodů vyhovujících regresnímu modelu, ukazuje, že všechny body výtečně korespondují s modelem přímky. Střední kvadratická chyba predikce MEP a Akaikovo informační kritérium AIC se užívají k rozlišení mezi několika navrženými modely. Za optimální se považuje model, pro který dosahuje MEP a AIC minimálních hodnotu. Tabulka IV Základní statistické charakteristiky. Vícenásobný korelační koeficient, r: Koeficient determinace, D [%]: 99,988 Predikovaný korelační koeficient, R 2 p: 0,99989 Střední kvadratická chyba predikce, MEP: E-04 Akaikeho informační kritérium, AIC: E+01 Regresní diagnostika Obsahuje pomůcky a postupy pro interaktivní analýzu (a) dat, (b) modelu, (c) metody, což jsou složky regresního tripletu. Kritika dat Na základě grafu regresního modelu (Obr. 1) lze posoudit významnost nalezených odhadů parametrů 0, 1. Obr. 1. Graf regresního modelu Rezidualní součet čtverců, RSC: E-04 Průměr absolutních hodnot reziduí, M e : E-03 Průměr relativních reziduí, M e,rel : E

162 Odhad reziduálního rozptylu, s 2 (e): E-04 Odhad směrodatné odchylky reziduí, s(e): E-02 Odhad šikmosti reziduí, g 1 (e): E-01 Odhad špičatosti reziduí, g 2 (e): E+00 Odhad směrodatné odchylky s(e) se blíží svou velikostí experimentální chybě, kterou je zatížena závisle proměnná. Odhad šikmosti a špičatosti prokazují normální rozdělení reziduí, normalitu. Grafy vlivných bodů Grafy vlivných bodů (Obr. 2) jsou schopny indikovat přítomnost odlehlých hodnot a extrémů. A B C D Obr. 2. A. Graf predikovaných reziduí; B. Pregibonův graf; C. Williamsův graf; D. L-R graf Graf predikovaných reziduí ukazuje na odlehlý bod č. 8. Pregibonův graf ukazuje na silně vlivný bod č. 8. Williamsův graf indikuje č. 8 jako odlehlý bod. L-R graf dokazuje extrém č. 8. Lze uzavřít, že bod č. 8 je většinou diagnostik indikován jako odlehlý. Model Vhodnost modelu se posuzuje přímo v grafu obsahujícím data a průběh modelové funkce. Je patrné, že je přímka akceptovatelná a data nevykazují nelineární průběh. Metoda Vyšetření splnění základních předpokladů metody nejmenších čtverců (MNČ), za kterých by měla metoda vést k nejlepším lineárním nestranným odhadům regresních parametrů: Testování regresního tripletu (data + model + metoda) shrnuje Tabulka V. Tabulka V Testování regresního tripletu (data model metoda). 160

163 Fisher-Snedocorův test významnosti regrese,f exp : E+04 Tabulkový kvantil, F 1- (m-1, n-m) : E+00 Závěr : Navržený model je přijat jako významný. Spočtená hladina významnosti : Scottovo kriterium multikolinearity, M : E-13 Závěr : Navržený model je korektní. Cook-Weisbergův test heteroskedasticity, S f : E+00 Tabulkový kvantil, 2 1- (1) : E+00 Závěr : Rezidua vykazují heteroskedasticitu. Spočtená hladina významnosti : Jarque-Berraův test normality reziduí, L(e) : E+00 Tabulkový kvantil, 2 1- (2) : E+00 Závěr : Normalita je přijata. Spočtená hladina významnosti : Waldův test autokorelace, W a : E-01 Tabulkový kvantil, 2 1- (1) : E+00 Závěr : Rezidua nejsou autokorelována. Spočtená hladina významnosti : Znaménkový test, D t : E-01 Tabulkový kvantil, N 1- /2 : E+00 Závěr : Rezidua nevykazují trend. Spočtená hladina významnosti : Fisherův- Snedecorův test významnosti regrese potvrdil, že navržený model je přijat jako významný. Scottovo kriterium multikolinearity nemá smysl u jednorozměrného regresního modelu. Cookův-Weisbergův test heteroskedasticity dokazuje, že rezidua vykazují heeskedasticitu (nekonstantnost rozptylu). Jarqueův Berraův test reziduí ukazuje, že klasická rezidua vykazují Gaussovo rozdělení. Waldův test autokorelace ukazuje, že klasická rezidua nejsou autokorelována. Znaménkový test prokazuje, že znaménko klasických reziduí se dostatečně střídá, a proto rezidua nevykazují žádný trend. Konstrukce zpřesněného modelu a) po odstranění bodu č. 8 byly nalezeny nové odhady parametrů zpřesněného modelu (Tabulka VI). Tabulka VI. Nové odhady parametrů zpřesněného modelu. Parametr Odhad Směrodatná odchylka H 0 : b j = 0 vs. t-kriterium H A : b j <> 0 hypoteza H 0 je b E E E+00 Akceptována b E E E+02 Zamítnuta Zpřesněný model (v závorce je uveden odhad směrodatné odchylky parametru): y = 0, (0, ) + 0,99765 (0, ) x je doložen statistickými chrakteristikami: Vícenásobný korelační koeficient, r: 0,99999 Koeficient determinace, D [%]: 99,997 Predikovaný korelační koeficient, R 2 p: 0,99997 Spočtená hlad. význam 161

164 Střední kvadratická chyba predikce, MEP: E-05 Akaikeho informační kritérium, AIC: -72,069 Střední kvadratická chyba predikce MEP a Akaikovo informační kritérium AIC dosáhly nižších hodnot, čímž dokazují kvalitnější model než předešlý. Rezidua vykazují normální rozdělení a nevykazují trend, stále však vykazují heteroskedasticitu, a proto lze doporučit užití metody vážených nejmenších čtverců. b) Užitím statistické váhy (w i = 1/y 2 i)se kompenzuje heteroskedasticitu v datech. Získáme nové správnější odhady parametrů (Tabulka VII). Tabulka VII. Správnější odhady parametrů. Parametr Odhad Směrodatná odchylka H 0 : b j = 0 vs. t-kriterium H A : b j <> 0 hypoteza H 0 je b E E E+00 Akceptována b E E E+02 Zamítnuta Spočtená hlad. význam Opravený model má tvar (v závorce je uveden odhad směrodatné odchylky parametru): y = 0, (0, ) + 0,99702 (0, ) x je doložen statistickými charakteristikami: Vícenásobný korelační koeficient, r: 0,99999 Koeficient determinace, D [%]: 99,997 Predikovaný korelační koeficient, R 2 p: 0,99997 Střední kvadratická chyba predikce, MEP: E-05 Akaikeho informační kritérium, AIC: -72,491 Jelikož došlo ke snížení rozhodujících kriterií, střední kvadratické chyby predikce MEP a Akaikova informačního kritéria AIC, lze považovat tyto odhady za lepší než předešlé. Pearsonův korelační koeficient r a koeficient determinace zůstávají stejné. Závěr Nalezený model má tvar (závorce je vždy uveden odhad směrodatné odchylky parametru): y = 0, (0, ) + 0,99702 (0, ) x a intervalový odhad parametrů úseku 0 a směrnice 1 bude b t D( b ) b t 5 D( ) 0 1 / / 2 b0 a po dosazení 0, ,5706 x 0, , ,5706 x 0,11374 vyjde -0, ,305 Tento interval spolehlivosti úseku regresní přímky zahrnuje nulu, takže lze úsek 0 považovat za nulový. Dosazením do intervalu spolehlivosti směrnice obdržíme nerovnost 0, ,5706 x 0, , ,5706 x 0,9985 a po vyčíslení -1, ,564 Protože tento interval obsahuje jedničku, lze považovat směrnici 1 za jednotkovou. Lze uzavřít, že úsek regresní přímky lze považovat za nulový 0 = 0 a směrnice 1 není odlišná od jedničky. Výsledky nové metody se proto statisticky významně neliší od původní metody. 162

165 Electrochemical Study of Rhamnazin (Elektrochemická studie rhamnazinu) Šárka Ramešová a, Romana Sokolová a, and Ilaria Degano b a J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of the ASCR, v.v.i., Dolejškova 3, Prague 8, Czech Republic, sarka.ramesova@jh-inst.cas.cz b Department of Chemistry and Industrial Chemistry, University of Pisa, Via Risorgimento 35, Pisa, Italy Abstract The natural flavonoid compound rhamanzin (3,5,4 -trihydroxy-7,3 -dimethoxyflavone) is important bioactive compound with antioxidative, anti-allergic, and anti-inflammatory properties. The cyclic voltammetry is used for the electrochemistry behavior of rhamnazin. The determination of oxidation pathways is supported by the identification of degradation products using separation technique. Key words: Flavonoids, Antioxidants, Oxidation mechanism. Úvod Rhamnazin (3,5,4 -trihydroxy-7,3 -dimethoxyflavone) patří do skupiny přirozeně se vyskytujících bioflavonoidů. Flavonoidy jsou zpravidla syntetizovány rostlinami a jsou hlavními chromofory ve většině používaných žlutých barviv 1. Flavonoidy byly využívány k barvení tapiserií a dalších historických předmětů již v 16. století 2. Rhamnazin je široce rozšířený v přírodě, především v ovoci, zelenině a čajích 3,4. Tato sloučenina je známá pro své terapeutické účinky, užívá se jako preventivní léčivo při kardiovaskulárních onemocněních, rakovině a hepatitidě 5,6. Molekula rhamanzinu obsahuje ve své chemické struktuře několik hydroxylových skupin vázaných na aromatický kruh (Obr. 1.). Rhamnazin je v přítomnosti vzdušného kyslíku nestabilní, což způsobuje degradaci a komplikaci při měření 7. Během oxidačního měření se uplatňuje následná chemická reakce, hydroxylace nebo dimerizace 8. Obr. 1. Strukturní vzorec rhamnazinu. Experimentální část Zásobní roztoky nebyly připravovány a uchovávány, protože studovaná látka je nestabilní. Pro přípravu základních elektrolytů byly použity chemikálie: chlorid draselný (Lachema, Brno, Česká republika), hydroxid draselný (Lachema, Brno, Česká republika), ethanol (AppliChem, Darmstadt, Německo) vše čistoty p.a. Kyslík byl z používaných roztoků odstraněn proudem argonu (Messer Technogas, Praha, Česká republika). K chromotagrafickému měření byl použit dusík (Messer Technogas, Praha, Česká republika). Brittonovy Robinsonovy (BR) tlumivé roztoky o příslušném ph byly připraveny smísením 0,2 mol dm -3 hydroxidu sodného (Lachema, Brno, Česká republika) s roztokem obsahujícím 163

166 kyselinu boritou (min 99,5%, Sigma-Aldrich, Praha, Česká republika), fosforečnou (Lachema, Brno, Česká republika) a octovou (Lachema, Brno, Česká republika), každou o koncentraci 0,04 mol dm -3. Chemikálie pro přípravu pufru byly v kvalitě p.a. Hodnota ph byla měřena digitálním ph-metrem ph 340 s kombinovanou skleněnou elektrodou (Radiometer, Bronshoj, Dánsko). Kalibrace ph-metru byla prováděna standardními vodnými pufry za laboratorní teploty. Pro přípravu všech roztoků byla používána deionizovaná voda ze systému Milli Q (Millipore, Praha, Česká republika). Použité roztoky byly uchovány ve skleněných nádobách. Pro elektrochemická měření byl použit rychlý potenciostat s elektrochemickou celou v tříelektrodovém zapojení. Jako pracovní elektroda byla použita elektroda ze skelného uhlíku (o průměru 0,7 mm). Referentní argentchloridová elektroda Ag AgCl 1M LiCl byla oddělena od roztoku elektrolytu solným můstkem. Jako pomocná elektroda byla použita platinová síťka. Elektrolýza a coulometrie při konstantním potenciálu byla prováděna na potenciostatu Autolab PGSTAT30 (Ecochemie, Utrecht, Holandsko) s elektrochemickou celou v tříelektrodovém zapojení. Jako pracovní elektroda byla použita uhlíková pastová elektroda (PIGE parafilmem impregnovaná grafitová elektroda). Roztok byl míchán pomocí elektromagnetického míchadla. Produkty elektrolýzy byly identifikovány pomocí chromatografické metody HPLC s DAD detekcí za pomocí stroje Waters Quattro PremierXE s pumpou Waters 1525µ Binary HPLC Pump a detektorem Waters 2487 Dual λ Absorbance Detektor (Waters, Massachusetts, USA) s kolonou HyPurity C8, 150 x 3 mm, 5 µm (Thermo Scientific, Dubuque, USA). Pro separaci byla použita rozpouštědla (A): vodný roztok s 0,1% kyselinou fosforečnou (Sigma-Aldrich, Praha, Česká republika) a (B): acetonitril (Merck, Praha, Česká republika). Použitý gradient: 0-2 min 95 % A a 5 % B, 2-30 min lineární gradient do 40 % A a 60 % B, min lineární gradient do 0 % A a 100 % B, min 0 % A a 100 % B, min 95% A a 5% B. Průtok byl nastaven na 0,2 ml min -1 a nástřikový objem byl 40 µl. Optický detektor byl nastaven na vlnové délky 250 nm a 280 nm. Výsledky a diskuze Cyklická voltametrie rhamnazinu byla měřena při různých hodnotách ph v rozmezí ph 4,3 až 11,4. Rhamnazin v roztoku o ph 6,7 vykazuje tři oxidační vlny, které souvisejí s oxidací hydroxylových skupin obsažených v chemické struktuře (Obr. 2) 9. S rostoucí hodnotou ph dochází k posunu potenciálu oxidačních vln rhamnazinu směrem k nižším hodnotám potenciálu. Z tohoto je patrné, že na celkovém mechanismu oxidace se účastní vodíkové ionty. 164

167 Obr. 2. Cyklický voltamogram M rhamnazinu ve 40% ethanolu s BR pufrem (v/v). Výsledné ph=6,7. Rychlost polarizace 0,25V/s. Pro zjišťování oxidačních produktů po elektrolýze byla zvolena chromatografická metoda HPLC s DAD detektorem (Obr. 3). Konečné produkty oxidace byly identifikovány analýzou složek roztoku po částečné nebo úplné elektrolýze při konstantním potenciálu. Hlavní oxidační produkt rhamnazinu je 2,4-dihydroxy-2-(4 -hydroxy-3 -methoxybenzoyl)-6- methoxy- benzofuran-3(2h)-on (R1), který se dále rozkládá na nízkomolekulární látky a to 2- (2,6-dihydroxy-4-methoxyfenyl)-2-oxooctovou kyselinu (R2) a 2,6-dihydroxy-4-methoxybenzoovou kyselinu (R3) 10,11. Obr. 3. HPLC chromatogram během elektrolýzy rhamnazinu, detekce při 280 nm. Závěr Za pomoci elektrochemických a chromatografických metod byly zjištěny oxidační produkty studované látky. 165

168 Acknowledgement This work was supported by the Academy of Sciences of the Czech Republic (M ). Literatura 1. Sokolová R., Degano I., Ramešová Š., Bulíčková J., Hromadová M., Gál M., Fiedler J., Valášek M.: Electrochimica Acta 56, 7421 (2011). 2. Hofenk de Graaff J. H.: The Colourful Past, Origins Chemistry and Identification of Natural Dyestuffs, Abegg-Stiftung/Archetype Publications Ltd., London/Riggisberg, Biesaga M., Pyrzynska K.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 95 (2009). 4. Hollman P., Arts I.: J. Sci. Food Agric. 80, 1081 (2000). 5. Chokchaisiri R., Innok P., Suksamrarn A.: Phytochemitry Letters 5, 361 (2012). 6. Zhao Y., Yu Z., Fan R., Gao X., Yu M., Li H., Wei H., Bi K.: Chem. Prahrm. Bull. 59, 1322 (2011). 7. Ramešová Š., Sokolová R., Degano I., Žabka J., Bulíčková J., Gál M.: Anal. Bioanal. Chem. 402, 975 (2012). 8. Hendrickson H. P., Kaufman A. D., Lunte C. E.: J. Pharm. Biomed. Anal. 12, 325 (1994). 9. Ramešová Š., Sokolová R., Pecková K.: Chemické Listy 105, S62 (2011). 10. Sokolová R., Ramešová Š., Degano I., Hromadová M., Gál M., Žabka J.: Chem. Commun. 48, 3433 (2012). 11. Ramešová Š., Sokolová R., Degano I., Hromaodvá M., Gál M., Kolivoška V., Colombini M. P.: Collect. Czech. Chem. Commun 76, 1651 (2011). 166

169 Effect of tetraalkylammonium cations on amperometric detection of heparin at a polarized water/ionic liquid membrane interface Zdeněk Samec a, Jan Langmaier a, Eva Samcová b, and Petr Tůma b a J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of the AS CR, v.v.i., Dolejškova 3, Prague 8, Czech Republic, zdenek.samec@jh-inst.cas.cz b Charles University in Prague, Third Faculty of Medicine, Charles University in Prague, Ruská 87, Prague 10, Czech Republic Abstract Amperometric detection of heparin, which combines the spontaneous extraction of heparin into the ionic liquid (IL) membrane with its potential-driven stripping, is studied using IL composed of the tetradodecylammonium (TDDA + ) cation and tetrakis[3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl]borate (TFPB - ). In contrast to the IL membrane composed of tridodecylmethylammonium cation (TDMA + ) and TFPB -, no promotion effect of the tetrapentylammonium cation (TPeA + ) is observed. The absence of the effect is ascribed to a much weaker ion association between heparin and TDDA +, which does not support the accumulation of heparin into the IL phase. Key words: Heparin, Ionic liquid membrane, Amperometric detection, Tetraalkylammonim cation. Introduction Heparin is a highly sulfated linear glucosaminoglycan which has been used for many years as a unique agent preventing blood coagulation in medical procedures. The unfractionated heparin is a mixture of glucosaminoglycans with a molar mass M h in the range 12 kda to15 kda, and an average charge number of Medically relevant activities a 0 of heparin are in the range U ml -1 (therapy) and 1-10 U ml -1 (surgery) 2. Conversion of the activity of heparin to its molar concentration c 0 is accomplished as a 0 = c 0 u M h, where u is the heparin activity expressed in U mg -1. Activity of 1 U ml -1 corresponds to c 0 = mol L -1, assuming that M h = 12 kda and u = U mg -1. Clinical assays of heparin have been based on monitoring of the activated clotting time (ACT), or the activated partial thromboplastin time 2. Analytical methods for the heparin detection have been developed using the colorimetric 3, fluorescent 4, potentiometric 5,6 or amperometric 7,8 techniques, which have not been ingraded in medical practice, in spite of their plausible LOD. Amperometric and potentiometric detection of heparin at polymeric membranes is facilitated by asymmetric tetraalkylammonium cations (R(CH) 3 N + and R 3 (CH 3 )N +, R = long-chain alkyl functional group) via the counter-ion association mechanism 9, M k Hep x- (w) + r S + (m) s M + (w) + M n S r Hep y- ( ) s M + (w) + M n S r Hep y- (m) (1) where (w) and (m) denote the membrane (or organic solvent) and the aqueous phase of the electrochemical detector, respectively, ( ) stands for the interphase, and M + represents the cation of the aqueous phase, and S + denotes the membrane cation (R(CH) 3 N +, R 3 (CH 3 )N + ). Tridodecylmethylammonium (TDMA + ) cation has been found to be most convenient counterion for the potentiometric detection of heparin using the PVC plasticized membrane 10. These effects have motivated us to investigate the amperometric detection of heparin using the polarized ionic liquid (IL) membrane composed of TDMA + and tetrakis[3,5- bis(trifluoromethyl)phenyl]borate (TFPB - ) 11. TDMATFPB belongs to the family of highly hydrophobic ILs, which provide a wide polarized potential window, and which have been previously exploited in voltammetric studies of both the simple and facilitated transfer of univalent ions across the water-il interface 12. Study revealed a tunable effect of the 167

170 I / A I p + / A semihydrophobic tetraalkylammonium cations (TAA + ) present at trace concentrations in the aqueous solution containing heparin. Theoretical considerations based on the mixed-potential concept and experimental evidence suggested that the TAA + cations promote the extraction of heparin into the IL phase, from which heparin can be stripped off by applied potential providing a well-separated current signal. The promoting effect of tetrapentylammonium cation (TPeA + ) is demonstrated in Figure 1 (panel A). The enhancement I p + of the TPeA + peak current at ca. 0 V was found to increase linearly with the heparin concentration in the test aqueous phase, cf. Figure 1 (panel B) 11. Main aim of this work has been to examine the promotion effect of the tetrapentylammonium 0.4 A Hep+TPeA B 0.0 TPeA + BGR E / V a 0 / U ml -1 Fig. 1. (A) CVs (5 mv s -1 ) of ion transfer processes at the TDMATFPB membrane in the absence (dotted line) and presence of 5x10-5 M TPeACl (dashed line), or 5x10-5 M TPeACl + 5 U ml -1 (full line) in the aqueous phase (w) containing 0.1 M NaCl; ohmic potential drop compensation 100 k. (B) Plot of the positive peak current increment I p + vs. the heparin activity a 0. Adapted from ref. 11. cation on the extraction of heparin into the IL membrane composed of the TFPB - anion and a hydrophobic symmetric tetradodecylammonium (TDDA + ) cation. Experimental The supported IL membrane was prepared by using a PVDF microporous filter (Millipore, type GVHP 1300, pore size of 0.22 μm, thickness of ~112 μm), which was impregnated by soaking with TDDATFPB. The membrane disk was cut and mounted in a four-electrode cell, so that the membrane area exposed to the aqueous electrolyte solution was 0.07 cm 2 13,14. The scheme of the membrane cell can be described as Ag AgCl 0.1 M LiCl (w ) TDDATFPB (m) 0.1 M LiCl, 0.2 mm TPeACl, x Hep (w) AgCl Ag (2) where x = 1-20 U ml -1. Voltammetric measurements were carried out at the ambient temperature of 25 ± 2 o C using Solartron ModuLab System (Solartron Analytical, Ametek). The capillary electrophoresis (CE) measurements were carried out using Agilent CE Instrument G1600A equipped with a diode-array detector, a contactless conductivity detector and a fluorescence detector. 168

171 I / A Results and Discussion Figure 2 shows the voltammetric behavior of TPeA + at the TDDATFPB membrane in the absence (squares) and the presence (circles or crosses) of heparin at two different concentrations (5 and 20 U ml -1 ) in the aqueous phase (w) containing 0.1 M LiCl. In contrast to the TDMATFPB membrane, cf. Figure 1, the voltammetric peak of the TPeA + ion transfer from the aqueous to the membrane phase at E 0 V is obviously unaffected by the presence of heparin E / V Fig. 2. CVs (10 mv s -1 ) of ion transfer processes at the TDDATFPB membrane in the absence (dashed line) and presence of 0.2 mm TPeACl (squares), 0.2 mm TPeACl + 5 U ml -1 (circles), or 0.2 mm TPeACl + 20 U ml -1 (crosses) in the aqueous phase (w) containing 0.1 M LiCl; ohmic potential drop compensation 130 k. In general, the positive peak current enhancement at E 0 V could be associated with the amplification of either the cation transfer from the aqueous to the membrane phase, or the anion transfer in the opposite direction. We have speculated that binding of TPeA + on heparin could lead to an overcompensation of the negative heparin charge and to the formation of the new transferable hydrophobic cation 11. However, the CE measurements do not support this idea. Figure 2 demonstrates the CE separation of heparin in the absence (peak A) and the presence (peak B) of an excess of TPeA +. The migration times which are presumably related to the charge carried by heparin are practically identical (96.4 s vs s), though the presence of TPeA + leads to a better CE resolution, as indicated by a larger peak height (14.3 vs. 9.7 mv) and a smaller peak half-width (5.4 s vs. 8.3 s). On the other hand, the current enhancement could be associated with the back transfer of heparin after its extraction into the membrane phase 11. The spontaneous accumulation of heparin under the zero-current conditions must be balanced by the transfer of an anion in the opposite direction (e.g. TFPB - ), or by the coextraction of a cation (e.g. TPeA + ). According to the mixed-potential theory of extraction 15, the extraction rate depends on the degree of matching of the standard ion transfer potential differences of the coextracted ions. The detailed analysis indicates, that the heparin polyanion and TPeA + meet this requirement, while the coextraction of Cl - may interfere

172 electric current B A 5 mv time / s Fig. 3. CE separation of heparin (15 U ml -1, 75% acetonitrile) in two different background electrolytes: (A) 1 M acetic acid (migration time 96.4 s) and (B), 1 M acetic acid mm TPeACl (migration time 95.9 s). Experimental conditions: capillary 50 µm id, 32 cm total length, 18 cm to CCD; voltage -20 kv; hydrodynamic injection 1000 mbar.s. Figure 4 shows schematically the partial electric currents of heparin, TPeA + and Cl -, which determine the position of the mixed-potential difference (mpd) at the water-tdmatfpb interface 11. The absence of the promotion effect of TPeA + for the polarized TDDATFPB membrane, cf. Figure 2, could be then ascribed to a much weaker ion association between heparin and TDDA +, i.e., the facilitated transfer of heparin into the membrane phase according to Eq. 1 is not supported. As a result, the partial electric current of heparin is largely suppressed, and the accumulation of heparin in the membrane phase by coextraction with TPeA + is negligible. TPeA + sum Cl - M k Hep x- potential difference Fig. 4. Partial currents associated with the coextraction of TPeA + ( ), heparin ( ) and Cl - ( ) from the aqueous to the membrane phase, and their sum (dashed line) indicating the position of the mixed potential difference. Adapted from ref. 11. Conclusions In contrast to the IL membrane composed of TDMA + and TFPB -, no promotion effect TPeA + on the amperometric detection of heparin is observed for the TDDATFPB membrane. The absence of the effect is ascribed to a much weaker ion association between heparin and TDDA +. As a result the facilitated transfer of heparin proceeds slowly, and the accumulation of heparin in the membrane phase by coextraction with TPeA + is negligible. 170

173 Acknowledgements This work was supported by the grant No. P206/11/0707 from the Grant Agency of the Czech Republic. References 1. Linhardt R. J.: J. Med. Chem. 46, 2551 (2003). 2. Abildgaard U. in Lane D. A. and Lindahl U. (Eds.): Heparin: Chemical and Biological Properties, Clinical Applications, CRC Press, pp , Boca Raton, FL, Zhan R., Fang Z., Liu B.: Anal. Chem. 82, 1326 (2010). 4. Pu K.-Y., Liu B.: Adv. Funct. Mater. 19, 277 (2009). 5. Ma S., Yang V.C., Meyerhoff M.E.: Anal. Chem. 64, 694 (1992). 6. Langmaier J., Samcová E., Samec Z.: Anal. Chem. 79, 2892 (2007). 7. Samec Z., Trojánek A., Langmaier J., Samcová E.: Electrochem. Commun. 5, 867 (2003). 8. Guo J., Yuan Y., Amemiya S.: Anal. Chem. 77, 5711 (2005). 9. Amemiya S., Kim Y., Ishimatsu R., Kabagambe B.: Anal. Bioanal. Chem. 399, 571 (2011). 10. Fu B., Bakker E., Yang V.C., Meyerhoff M.E.: Macromolecules 28, 5834 (1995). 11. Langmaier J., Samec Z., Samcová E., Tůma P.: Electrochem. Commun. 24, 25 (2012). 12. Samec Z., Langmaier J., Kakiuchi T.: Pure Appl. Chem. 81, 1473 (2009). 13. Langmaier J., Olšák J., Samcová E., Samec Z., Trojánek A.: Electroanalysis 18, 115 (2006). 14. Samec Z., Trojánek A., Samcová E.: J. Electroanal. Chem. 389, 1 (1995). 15. Koryta J., Skalicky M.: J. Colloid Interface Sci. 124, 44 (1988). 171

174 Blister Formation on Polymer Coated Galvanised Steel during Immersion in Oxidizing Alkaline Solutions Ernst Dietmar Schachinger a,b, Roland Braidt a, and Achim Walter Hassel b a voestalpine Stahl GmbH, voestalpine Straße 3, A-4020 Linz, Austria, ernst.schachinger@voestalpine.com b Institute for Chemical Technology of Inorganic Materials, Johannes Kepler University Linz, Altenberger Straße 69, A-4040 Linz, Austria Abstract The performance of polymer coated galvanized steel sheet in alkaline solutions with and without saline components containing sodium percarbonate as an oxidising agent was investigated by visual inspection, light microscopy and electrochemical impedance spectroscopy (EIS) measurements. It was found that ionic species are necessary to initiate blistering, but also contribute to blister growth. The nascent oxygen evolving from percarbonate accelerates blister growth enormously. Detailed investigations concerning the effect of temperature and salt concentration were made. Blister growth kinetics was followed by EIS and is in good agreement with visual inspection. Key words: Galvanised steel, Organic coating, Blistering, EIS, Alkaline solution, Sodium percarbonate. Introduction Wet adhesion is a very important parameter for protecting metallic substrates against corrosion. The formation of blisters is usually the first visually noticeable sign for insufficient protection of the substrate. The reduction of paint adhesion by water accumulation at the coating-substrate-interface is a requirement for blistering 1-3. Osmotic blistering is considered to be the most important mechanism of blister formation. Soluble salts at the polymer-substrate-interface can form a concentrated salt solution. Due to the concentration gradient formed, water can be drawn through the coating, which acts as a semipermeable membrane 3-4. Soluble salt contamination at the interface may originate from insufficient cleaning of the substrate 5 or diffusion of ions from the environment to the interface, but may also arise from substrate corrosion 6. Cathodic blistering is an important mechanism in the presence of corrosion of the substrate. It is caused by the highly alkaline environment at local cathodes under the coating. In neutral to alkaline environments the cathodic reaction is the reduction of oxygen, which can easily diffuse through the coating. The high ph-values at the local cathodes cause a delamination of the coating 3,7-8. Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) is a very powerful tool to characterise the barrier properties and to monitor the degradation kinetics of organic coatings and is widely used nowadays. Important parameters like the coating capacitance (C c ) and the pore resistance (R ap ) of the coating can be determined by fitting of equivalent circuit models The impedance modulus Z at low frequencies, which can be derived directly from the Bode-plot was also suggested to be a significant parameter to estimate the barrier properties of organic coatings Whereas the majority of coated panel testing is conducted in solutions of sodium chloride or deionised water, there is only one study dealing with the immersion of coated steel sheets in alkaline solution 14. The aim of this work is to investigate the performance of organic coated hot dip galvanised steel sheet in alkaline solution containing various amounts of sodium 172

175 Z / Ohm phase angle / carbonate, sodium sulfate and sodium percarbonate the latter being an oxidising agent. The findings are discussed in terms of a comprehensive model for blister initiation and growth. Experimental Coil Coated hot dip galvanised steel sheets with 150 x 100 mm in size and a total coating thickness of 25 µm were immersed in alkaline solutions at 95 C containing different amounts of salts and percarbonate under stirring for 5 h, followed by a drying stage for 15 h at room temperature and another immersion stage as described above. The solution was replaced before a new immersion period was started. EIS spectra were taken after each immersion period with the Colt Laminate Tester by Zahner (working electrode area: 20 cm 2 ). Detailed investigations were made concerning the effect of increasing salt concentration with an immersion time of 5 h at 95 C. The immersion time was extended to 16 h to investigate the effect of temperature variation. EIS spectra were taken with an in house developed double wall electrochemical cell with 3-electrode arrangement suitable for thermostatic measurements (reference electrode: Ag/AgCl, counter electrode: graphite). All EIS spectra were taken with a Zahner IM6 potentiostat in borate buffer solution (ph 8.5). The perturbation voltage amplitude was 20 mv. Spectra were recorded from 1 Hz to 100 khz and from 0.01 Hz to 100 khz for the cyclic test and the detailed investigations, respectively. Results and Discussion Fig. 1 shows the optical micrographs and impedance spectra after immersion in 1.5 g/l sodium percarbonate solution. Although there was a difference in the impedance spectrum already after 5 hours, no blistering was observed visually. After 10 hours of immersion blistering was evident and the phase angle approaches 0 at low frequencies also indicating delamination. The value of Z at 1 Hz which is related to the barrier properties of the coating decreased to approx. 2 MΩ after 10 hours of immersion h 5h h frequency / Hz Fig. 1. Bode plots and optical micrographs after immersion in 1.5 g/l sodium percarbonate. Although there is sometimes blistering after immersion in 1.5 g/l percarbonate without additional saline components for 10 hours as shown in Fig. 1, it is the general case that no blistering is observable over a long period of time when additional saline components are absent. Instead of blistering, a superficial degradation of the coating takes place as shown in Fig

176 Z / Ohm phase angle / Fig. 2. Optical micrographs after immersion in 1.5 g/l sodium percarbonate for 10, 20 and 30 hours. When the panels were immersed in 1.5 g/l sodium percarbonate and 1.6 g/l Na 2 SO 4, the first blisters appeared after 5 hours and Z at 1 Hz dropped below 10 MΩ. After 10 hours large blisters were observed and Z at 1 Hz decreased tremendously to a value of approx. 10 kω indicating that nearly the whole coating is detached from the substrate surface h 5h h frequency / Hz Fig. 3. Bode plots and optical micrographs after immersion in 1.5 g/l percarbonate and 1.6 g/l sodium sulfate solution. An immersion of the panels in a solution of 1.5 g/l sodium percarbonate, 1.6 g/l Na 2 SO 4 and 1.5 g/l Na 2 CO 3, as shown in Fig.3, resulted in severe blistering already after 5 hours of immersion. A second time constant associated with corrosion processes seemed to develop in the Bode plot and Z at 1 Hz decreased to a few kω. After 10 h of immersion the coating is fully detached from the substrate surface and can be easily removed by hand. A replacement of the sulfate anion with the same amount of carbonate lead to fewer blistering indicating that also the anion plays a role in blister initiation and growth. When sodium percarbonate was replaced by the same molar amount of sodium carbonate, there was an enormous reduction in blistering, which led to the conclusion that nascent oxygen evolved by percarbonate accelerates the blister growth. Fig. 4 shows the influence of sodium sulfate concentration on the amount of blistering and Z values at 0.1 Hz. At first the amount of blistering is increasing with increasing salt concentration, leading to a drop of impedance values. When the concentration exceeds a 174

177 Z / Ohm phase angle / certain limit, blister growth is retarded. Also sodium carbonate concentration was increased stepwise (not shown here), leading to similar results. These findings might be attributed to reduced osmosis when a certain concentration is reached. Variation of the temperature has a large effect on coating deterioration kinetics as shown in the Bode plots in Fig. 5. Also the permeability of the unaffected coating increases with increasing temperature, as measured with EIS in borate buffer solution (not shown here). Fig. 4. Influence of Na 2 SO 4 concentration on blistering and Z at 0.1 Hz after immersion for 5 h pristine coating 60 C C 80 C C pristine coating 60 C 70 C 80 C 90 C frequency / Hz frequency / Hz Fig. 5. Bode plots in borate buffer solution (22 C) after immersion for 16 h in 1.5 g/l percarbonate g/l Na 2 CO g/l Na 2 SO 4 solution at different temperatures. Conclusion The formation of blisters in alkaline solutions with and without saline components containing percarbonate as an oxidising agent was investigated. The contributions of the single components to blistering are as follows: Ionic species Na , SO 4 and CO 3 are necessary to initiate blistering and also contribute to blister growth SO 4 has a larger effect on blister growth than the same amount of CO 3 Nascent oxygen evolved from sodium percarbonate accelerates blister growth enormously. 175

178 Sodium percarbonate without additional saline components result in a degradation of the organic coating without onset of blistering in most of the cases. Blister growth kinetics was followed by EIS and is in good agreement with visual observations: Below a threshold value of approx. 1 MΩ (impedance modulus at 1 Hz) blister formation can be detected after an induction period of 1 hour. If the concentration of ions exceeds a certain limit, blister growth is retarded. This might be attributed to a lower amount of water penetrating the blister due to reduced osmosis. Temperature has an enormous effect on the permeability of the unaffected coating and the blister growth kinetics. References 1. Funke W.: Prog. Org. Coat. 28, 3 (1996). 2. Funke W.: J. Oil Colour Chem. Assoc. 68, 229 (1985). 3. Funke W.: Prog. Org. Coat. 9, 29 (1981). 4. Leidheiser H. Jr.: Corrosion 38, 374 (1982). 5. Appleman B. R.: J. Prot. Coat. Lin. 4, 38 (1987). 6. Hare C. H.: J. Prot. Coat. Lin. 15, 45 (1998). 7. Hare C. H.: J. Prot. Coat. Lin. 15, 17 (1998). 8. Schwenk W.: Corrosion Control by Organic Coatings. Houston 1981, p Geenen F. M., de Wit J. H. W.: Prog. Org. Coat. 18, 299 (1990). 10. Murray J. N.: Prog. Org. Coat. 30, 225 (1997). 11. Murray J. N.: Prog. Org. Coat. 31, 375 (1997). 12. Bierwagen G., Tallman D., Li J., He L., Jeffcoate C.: Prog. Org. Coat. 46, 148 (2003). 13. Hinderliter B. R., Croll S. G., Tallman D. E., Su Q., Bierwagen G. P.: Electrochim. Acta 51, 4505 (2006). 14. Deflorian F., Rossi S., Kamarchic P., Fedrizzi L., Bonora P.L.: Prog. Org. Coat. 47, 103 (2003). 176

179 Ion Current Enhancement at Glass Microcapillaries Barry R. Silver, Karel Holub, and Vladimir Mareček J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of ASCR, v.v.i., Dolejškova 3, Prague 8, Czech Republic, Abstract Ion conductivity has been investigated at a reusable borosilicate glass microcapillary using DC and AC electrochemical techniques. The ion current enhancement at low frequencies is modeled using a simple serial resistance inductor circuit. The enhancement effect is ascribed to an electrokinetic mass transport process at the capillary wall. Key words: Ion conductivity, Current enhancement, Microcapillary. Introduction Our recent paper 1 reported the existence of an interesting low-frequency pseudo-inductive behavior 2 at novel micron-sized glass capillaries under an AC perturbation. Our previous work proposed the existence of an electrokinetic wall-effect as a possible cause for the observed enhancement in current and potential-dependent resistance effects under DC polarization. In this contribution, we further investigate this novel low-frequency pseudoinductive behavior in more detail, using a single, re-useable glass capillary (and using different chloride-based electrolytes) under both an AC and a DC perturbation. Our results provide more compelling evidence for our postulated cation-specific, potential-dependent wall-effect. The results are significant, as within certain electrochemical contexts, such as those involving kinetic measurements made at the interface of two immiscible electrolyte solutions supported at the tips of glass microcapillaries for example, considerable error could arise from the presence of such electrokinetic wall-effects if not properly described and accounted for. Experimental Microcapillary and electrolyte solutions (10 mm LiCl, 10 mm TEACl and 10 mm CsCl) were prepared as previously described 1. The three-electrode cell with two Ag/AgCl reference electrodes, one placed inside the capillary was used throughout. Conventional AC impedance measurements were conducted with a CHI 600C potentiostat (CHI Instruments). Another experimental set-up was used which involved interfacing of an EG&G 263A potentiostat (Princeton Applied Research), a LeCroy Waverunner LT322 oscilloscope and a DS340 function generator (Stanford Research Systems). AC impedance data were analyzed using EIS Spectrum Analyzer software 3. Results and discussion Figure 1 (A) is a micrograph of the tip region of the microcapillary which was used for electrochemical measurements made throughout this study. The orifice diameter was difficult to measure accurately with an optical microscope and is approximately 1 μm. An experimental I-V curve (2 mv/s, 10 mm LiCl) is shown in Figure 1 (B). Also shown, for comparative purposes, is a derived ohmic I-V curve. The derived ohmic I-V curve is plotted using a single resistance value (see Figure 5) obtained from fitting impedance data conducted at 0 V DC bias (40 mv peak-to-peak (pk-pk) perturbation 10 khz - 1 Hz frequency range). The extent of the current enhancement at negative potentials at -0.7 V, above that of the derived ohmic I-V curve is 1.8 na. A similar enhancement in current was found when using CsCl as an electrolyte. However, no significant current enhancement was found when using TEACl as the electrolyte in conjunction with this particular capillary. 177

180 - Z'' / Ohm - Z'' / Ohm I / A 2.0x10-8 A 1.5x10-8 B b 1.0x x10-9 a x x na -1.5x x10-8 a Fig. 1. (A): An optical micrograph indicating a pulled glass capillary. Diameter of the orifice is 1 µm; (B): a - experimental I-V curve (2 mv/s, 10 mm LiCl), b - ohmic I-V curve plotted using a single resistance value R = 5.8x10 7 Ω. To further explore the origin of this current enhancement, AC impedance was conducted at V DC (200 mv pk-pk perturbation, 10 khz to 0.1 Hz). The experimental impedance data is shown in Figure 2 (A) in the form of a Nyquist plot. An equivalent circuit (Figure 3 (A)) was used to model the experimental data (solid line overlaying the experimental data in Figure 2 (A)). AC impedance data collected using the same capillary, but filled on each separate occasion with different electrolyte solution, enables comparison between Li +, Cs + and TEA + cations. Figure 2 (B), indicates that the TEA + cation is less conductive, although a small pseudo-inductive loop indicating current enhancement is still evident on the Nyquist plot. In the case of TEA +, under DC polarization, one observes constant resistance commensurate with Ohm s Law. The resistance does not appear potential-dependent, as it is in the case of Li + (Figure 1 (A)) and Cs + (data not shown). E / V 4x10 7 9x10 7 3x10 7 A 8x10 7 7x10 7 B TEACl 6x10 7 2x10 7 5x10 7 4x10 7 1x10 7 3x10 7 CsCl 2x x10 7 LiCl 0-1x x10 7 2x10 7 3x10 7 4x10 7 5x10 7 6x10 7 7x10 7 Z' / Ohm x x x x x x x x10 8 Fig. 2. Nyquist plots representation of the impedance data. Capillary filled with (A): 10 mm CsCl; (B): 10 mm solution of LiCl or CsCl or TEACl. The extent of the current enhancement is shown more clearly in Figure 3 (B), where resistance values from various AC and DC experiments are plotted at various potentials (10 mm LiCl as an electrolyte). For the non-enhanced or ohmic case (upper dotted line, Figure 3 (B)) one observes constant resistance as expected from a purely ohmic response (as in the case of TEA+). The resistance value (point at 0 V, Fig. 5) was obtained from modeling impedance data conducted at 0 V DC bias. Current enhancement above that predicted via Ohm s Law is indicated by line a. The capillary resistance derived from AC impedance data (-0.7 V DC bias, 200 mv pk-pk amplitude perturbation, 10 khz 0.1 Hz frequency range) is -1x10 7 Z' / Ohm 178

181 R / Ohm given by a point at the end of line b. It is interesting to note that the overall resistance under DC bias is larger than that of the capillary resistance (R) as derived from modeling AC impedance data. A 5.8x10 7 B R E C 5.6x x10 7 a R L L 5.2x x10 7 R 4.8x x10 7 b E / V Fig. 3. (A): Scheme of the equivalent circuit; (B): Resistance values R vs. applied potential for the experimental data shown in Fig. 1 (B), points ( ) represent the value of R derived from AC impedance measurements at 0 and -0.7 V DC potential. To further explore this interesting difference, we used an experimental set-up which allowed a constant DC bias (typically -0.7 V, applied via an EG&G 263A potentiostat) to be added to a separate AC perturbation (typical pk-pk amplitude in this case of 200 mv, at varied frequency, produced via the DS340 function generator). The supposition of the two signals produces a voltage perturbation similar to that of a conventional impedance experiment which is usually conducted on the CHI instrumentation. An important difference between this experimental set-up and that of a conventional AC impedance experiment is that we are able to collect the value of the current via a DC-coupled oscilloscope which is generated in response to an AC+DC voltage perturbation signal. The collection of current values from the CHI instrumentation is not possible. In all cases, we made sure that, the frequency of output current matched that of the perturbation signal. Another important difference between this experimental set-up and that of a conventional AC impedance experiment conducted on the CHI instrumentation is that we do not monitor phase angle. In this experimental arrangement we pay attention to, and monitor solely, the average maximum, the average minimum and the average mean output currents achieved over the course of an experiment lasting 3 minutes in duration (at bias with a particular frequency). We term this experiment the EG&G experiment for brevity herein. The results for the EG&G experiment are featured in Figure 4. At higher frequency (approx. 20 Hz) we observe little difference between the maximum and minimum currents (Fig. 4 (A)), however, at low frequency there is a large difference (Fig. 4 (A, B)). The average mean current increases with decreasing frequency. The reason why the mean current increases at lower frequency can be explained by an incorrect evaluation of a linear mean response current value from the data which are inherently non-linear. In other words, either the maximum and/or the minimum currents appear to be changing in a non-linear fashion in response to the applied voltage perturbation. One notes, however, that the conventional AC impedance experiment (conducted on the CHI instrumentation, using a 200 mv pk-pk perturbation at -0.7 V DC bias) was conducted on a 179

182 I / A I / na linear portion of the I-V curve which gives one the impression that the linearity condition has been fulfilled. Figure 4 (B) shows the dependence of the maximum, minimum and mean currents on the reciprocal of frequency A a c b B f / Hz a c b 1/f / Hz -1 Fig. 4. Dependence of the maximum (a), minimum (b) and average mean current (c) on frequency (A) and on the reciprocal of frequency (B) derived from the EG&G experiment (see the text). The difference in pk-pk currents (curve a, b. Fig 4) versus the reciprocal of frequency is shown in Figure 5. At high frequency (approx. 20 Hz) this difference goes to zero. At low frequency (0.1 7 Hz), the dependence of the pk-pk vs. 1/f can be simulated by a simple serial R L L circuit neglecting other components of the equivalent circuit shown in Fig. 3 (A). It should be noted that the values of R L and L strongly depend on the applied DC potential. At zero DC potential their values are very high as compared with the other components of the equivalent circuit and therefore the inductive behavior is not observed. The R L = 4x10 7 Ω and L = 4.2x10 6 H values used in this modeling (in Figure 5) differ from the R L = 4.6x10 8 Ω and the single L = 1.8x10 8 H value of the inductive branch derived from modeling conventional AC impedance data, obtained from the CHI instrument. The reason for this discrepancy could be explained by a non-linear response of a microcapillary system to the applied perturbation resulting in an error in the determination of the amplitude and phase angle (in the case of the impedance experiment conducted on the CHI instrumentation). In contrast, the EG&G experiment uses only pk-pk values, and hence there will be no phase angle error in this measurement. The inductive behavior could be explained by another type of ion transport, which occurs parallel to bulk ion transport. The only aspect of the capillary tip region which could cause this type of behavior is the negatively charged glass wall. Clearly no migrational effects occur in bulk as evidenced from the TEACl data (which displays ohmic behavior). Potentialdependent surface conductivity effects seem a likely candidate for our previously proposed wall-effect. Such phenomena could be caused by longitudinal polarization of the electric double-layer (formed by the fixed negatively charged glass surface and adjacent electrolyte cations). It also seems likely that cation-specific interactions with the glass surface could be present 4,5, which in turn helps to explain cation-specific enhancement effects which we have observed herein. The presence of these proposed cation-specific effects could also explain for instance, why current enhancement was very obvious with Li + as the cation but not so obvious 180

183 I / A in the case of the TEA + cation. Importantly though, it is very clear that the effect is not due to the electrolyte anion. 5.0x x x x10-9 calculated experiment 1.0x /f / Hz -1 Fig. 5. The difference in pk-pk currents (curve a, b. Fig 4) versus the reciprocal of frequency. Conclusions We have presented further, more compelling evidence which suggests that the previously observed low frequency pseudo-inductive behavior is linked to an electrokinetic wall or potential-dependent surface conductivity effect. Values of the inductance obtained in modeling procedures (in units of Henry) are abnormally large. In future work, these large inductance values need to be reconciled with physically meaningful physico-chemical processes and properties such as surface conductivity, glass zeta-potential, the magnitude and direction of the applied electric field, cation-glass effects as well as cation-specific thermodynamic measures. Future efforts will also be aimed at quantifying the error which may be produced by the wall effect within the context of electrochemical kinetic measurements at the interface between two immiscible electrolyte solutions supported at the tips of glass microcapillaries. Acknowledgements This research has been supported by the Czech Science Foundation (project No S). References 1. Silver B. R., Holub K., Mareček V.: Electrochim. Acta in print (2013). 2. Feng J., Liu J., Wu B., Wang G.: Anal. Chem. 82, 4520 (2010). 3. EIS Spectrum Analyser, Version 0.1b, Downloaded April 6th, Tadros T. F., Lyklema J.: J. Electroanal. Chem. 17, 267 (1968). 5. Dishon M., Zohar O., Sivan U.: Langmuir 27, (2011). 181

184 Electrochemical Determination of Adrenaline in Human Urine by Boron-doped Diamond Film Electrode (Elektrochemické stanovenie adrenalínu v ľudskom moči na bórom dopovanej diamantovej filmovej elektróde) Jozef Sochr, Ľubomír Švorc, Miroslav Rievaj, Dušan Bustin, and Ján Labuda Slovak University of Technology in Bratislava, Faculty of Chemical and Food Technology, Institute of Analytical Chemistry, Radlinského 9, Bratislava, Slovak Republic, jozef.sochr@stuba.sk Abstract In the present work we are dealing with the development of new electrochemical method using a relatively new electrode material - boron-doped diamond as sensitive electrochemical sensor for determination of trace amounts of adrenaline. The main aim was to study and optimize the experimental and instrumental conditions using pulse voltammetric techniques. The influence of some urine components as possible interfering agents on the current response of oxidation of adrenaline was also investigated. The proposed method was successfully applied in the determination of adrenaline in spiked human urine samples with good recovery values. Key words: Adrenaline, Boron-doped diamond film electrode, Differential pulse voltammetry, Square-wave voltammetry, Human urine. Úvod Adrenalín (ADR) je hormón tvoriaci sa v dreni nadobličiek a patriaci do skupiny tzv. katecholamínov. Je vhodnou voľbou pri liečbe anafylaktického šoku, pri resuscitácii po infarkte a pôsobí aj ako kardiostimulant pri operačných zákrokoch. Nízke koncentrácie ADR v telesných tekutinách sú najčastejšie prejavom Parkinsonovej a Alzheimerovej choroby, schizofrénie a anorexie. Vyššie koncentrácie spôsobujú stres, náhle zlyhanie srdca alebo jeho arytmiu, prípadne indikujú prítomnosť nádorov. Z týchto dôvodov patrí analytické stanovenie ADR a ostatných katecholamínov v telesných tekutinách k dôležitým aspektom klinickej chémie. Navyše súčasný trend v analytickej chémii vyžaduje požadovaný analyt v danej matrici stanoviť maximálne jednoducho a rýchlo, ale zároveň citlivo a selektívne 1,2,3. Pre účely stanovenia ADR boli vo výskumných a klinických laboratóriách vypracované viaceré analytické postupy využívajúce HPLC a kapilárnu elektroforézu 2, obvykle v spojení s fluorescenčným 4 alebo elektrochemickým detektorom 5. Pri spektrálnych metódach sa na stanovenie ADR vo veľkej miere využíva jeho oxidačná schopnosť 6,7. Na stanovenie ADR možno využiť diazotačné a kopulačné reakcie 8, enzymatické reakcie s pôsobením polyfenoloxidáz 1 alebo aj elektrochemiluminiscenciu 9. Na základe dostupných informácií z vedeckej literatúry možno konštatovať, že problematika elektroanalýzy ADR je výlučne spojená s využitím modifikovaných elektródových povrchov, obvykle za účelom zvýšenia citlivosti a selektivity stanovenia. Pomerne rozsiahle spektrum elektrochemických metód využíva elektródy s polymérnymi filmami 3,10,11, uhlíkovými nanočasticami 12-14, ale aj biosenzory 15,16. Využitie holých (nemodifikovaných) elektród je skôr rarita, čo súvisí s faktom, že pri elektrochemickom stanovení ADR dochádza k ireverzibilnej adsorpcii reakčných produktov elektródovej reakcie 17,18. Tu sa otvárajú možnosti pre využitie perspektívneho elektródového materiálu - bórom dopovaného diamantového filmu (BDDF). V porovnaní s tradičnými uhlíkovými elektródami má široký pracovný rozsah potenciálov, nízku kapacitu elektrickej dvojvrstvy, nízku adsorpčnú schopnosť vďaka parafinickému charakteru povrchu elektródy a výbornú mechanickú robustnosť

185 V tejto práci je pozornosť venovaná vývoju novej elektrochemickej metódy na stanovenie ADR využitím citlivých pulzových techník na holej (nemodifikovanej) BDDF elektróde. Je potrebné zdôrazniť, že stanovenie ADR na tomto perspektívnom elektródovom materiály doposiaľ nebolo publikované v žiadnom referáte na základe dostupných informácii z vedeckej literatúry. V porovnaní s inými elektrochemickými metódami stanovenia ADR je významný aj fakt, že sa jedná o elektródový materiál nevyžadujúci chemickú modifikáciu povrchu. Praktická aplikovateľnosť metódy je demonštrovaná na modelových vzorkách ľudského moču. Experimentálna časť Zásobný roztok ADR (Sigma-Aldrich, Česká republika) o koncentrácii mol.dm -3 bol pripravený v HClO 4 (c = 0,5 mol.dm -3 ) a skladovaný v chladničke pri 4 C a v tme po dobu 7 dní. Roztoky elektrolytov anorganických kyselín, octanových tlmivých roztokov (ABS) a potenciálnych interferujúcich látok ako glukóza, sacharóza, močovina, kreatinín, kyselina citrónová, barbiturová, močová (všetky Lachema, Brno) o koncentrácii 0,1 mol.dm -3 boli pripravené v prevarenej redestilovanej vode. Všetky chemikálie boli požadovanej analytickej čistoty. Elektrochemické merania boli realizované pomocou elektrochemického analyzátora AUTOLAB PGSTAT 302N (EcoChemie, Utrecht, Holandsko) s 3-elektródovým systémom: pracovná bórom dopovaná diamantová filmová elektróda (BDDFE, film s priemerom 3 mm, odporom 0,075 Ω cm a koncentráciou bóru 1000 ppm; Windsor Scientific Ltd., United Kingdom), platinový drôtik ako pomocná elektróda a Ag/AgCl/3M KCl ako referenčná elektróda. Obsluha analyzátora a získavanie základných údajov z nameraných voltampérogramov bolo vykonávané pomocou elektrochemického softvéru NOVA 1.8, získané dáta boli ďalej spracovávané v softvéri Origin 8.0. Kalibračné závislosti sa určili pomocou metódy najmenších štvorcov s 95% pravdepodobnosťou, z parametrov ich regresných priamok sa vypočítali hodnoty detekčných limitov (LOD) ako 3-násobok chyby úseku podelenej smernicou. Modelová vzorka bola pripravená 20-násobným riedením ľudského moču so základným elektrolytom a obohatená o ADR tak, aby výsledná koncentrácia ADR bola mol.dm -3. Na kvantitatívne vyhodnotenie bola použitá metóda prídavku štandardu. Výsledky a diskusia V prvom kroku bolo pomocou cyklickej voltampérometrie (CV) študované elektrochemické správanie ADR na povrchu BDDF elektródy. Pre tento účel bol pripravený roztok ADR s koncentráciou mol.dm -3 v rôznych prostrediach. Namerané CV voltampérogramy vo vybraných prostrediach sú zobrazené na Obr. 1. V prípade ABS (ph 6) boli v anodickej oblasti pri potenciáloch 0,8 (oxidácia adrenalínu na adrenalínchinón) a 1,2 V (oxidácia adrenalínchinónu na adrenochróm) pozorované dva oxidačné píky, pričom každý prislúcha dvojelektrónovému procesu na povrchu elektródy. Tento jav bol charakteristický pre ph hodnoty elektrolytu v rozmedzí 2-7. V zásaditom prostredí sa tvar oboch oxidačných píkov výrazne deformoval a súčasne narastal šum (výsledky neuvádzame). S klesajúcou hodnotou ph elektrolytu však klesal oxidačný pík pri 1,2 V a súčasne rástol oxidačný pík pri 0,8 V. V silne kyslom prostredí (ph < 1) sa oxidačný pík pri 1,2 V už neobjavil vo voltampérometrickom zázname. Pre kvantifikačné účely bolo preto vhodné vybrať silno kyslé prostredie, kde sa v CV zázname nachádza len jeden oxidačný pík. Z Obr. 1 je zrejmé, že ADR v prostredí kyseliny chloristej (HClO 4 ) podlieha elektrochemickej premene, čo sa prejavilo výrazným oxidačným píkom pri potenciály 0,8 V, pričom redukčný pík dosahoval maximum pri -0,1 V. Môžeme konštatovať, že sa jedná o ireverzibilný elektródový proces. Z CV voltampérogramov bez prítomnosti ADR (Obr. 1, krivka 1) je zrejmé, že zvyškové prúdy (hlavnou zložkou je kapacitný prúd) boli relatívne nízke, čo potvrdzuje spomínané 183

186 výhody a aj opodstatnenosť použitia BDDFE. Navyše prostredie HClO 4 vykazovalo spomedzi ostatných študovaných kyselín (HNO 3, H 2 SO 4, HCl) najmenší šum a najvyšší oxidačný prúd adrenalínu. Za optimálnu hodnotu koncentrácie roztoku HClO 4 bola zo sledovaného rozsahu 0,01 2 mol.dm -3 vybraná koncentrácia 0,5 mol.dm -3 (ph 0,3). Obr. 1. CV voltampérogramy: 1.) 0,5 M HClO 4, 2.) ADR (c = mol.dm -3 ) v ABS (ph 6), 3.) ADR (c = mol.dm -3 ) v 0,5 M HClO 4 (ph 0,3) na BDDFE pri polarizačnej rýchlosti 100 mv.s -1. Polarizačná rýchlosť (v) má veľký význam pre pochopenie mechanizmu redoxného deja prebiehajúceho v difúznej vrstve pracovnej elektródy. Jednotlivé CV voltampérogramy boli namerané pri rôznych polarizačných rýchlostiach (5 až 500 mv.s -1 ). S rastúcou polarizačnou rýchlosťou narastala aj veľkosť oxidačného (I ox ) a redukčného (I red ) prúdu ADR na základe Randles-Ševčíkovej rovnice, ktorá má platnosť pre difúziou kontrolované deje: I ox = 6, , v 1/2 (R = 0,9985) I red = 1, , v 1/2 (R = 0,9965) Z týchto rovníc je zrejmé, že elektródový dej je kontrolovaný výlučne difúziou. Bol tiež pozorovaný aj mierny posun oboch potenciálových maxím smerom k pozitívnejším (oxidačný pík) a negatívnejším (redukčný pík) potenciálom. Na stanovenie ADR boli použité diferenčná pulzová (DPV) a square-wave (SWV) voltampérometria, pričom bolo potrebné najskôr optimalizovať inštrumentálne parametre oboch techník. Pre DPV bola optimalizovaným parametrom modulačná amplitúda. Z rozsahu hodnôt modulačných amplitúd mv pre roztok ADR s koncentráciou mol.dm -3 bola vybraná hodnota 200 mv z nasledovných dôvodov. S rastúcou hodnotou modulačnej amplitúdy narastala prúdová odozva, pričom tento efekt bol súčasne sprevádzaný s rozširovaním a posunom oxidačného píku smerom k negatívnejším hodnotám a zároveň narastal aj šum. Nad hodnotou 200 mv boli píky veľmi deformované (šírky na základni presahovali cez 0,5 V). Analogickým spôsobom boli vybrané optimálne parametre pre SWV metódu: amplitúda 100 mv a frekvencia 50 Hz. S optimalizovanými parametrami sa pre sériu kalibračných roztokov ADR v rozsahu koncentrácii až mol.dm -3 získali kalibračnej krivky spolu s hodnotami parametrov regresných rovníc. Získané kalibračné krivky pre SWV sú zobrazené na Obr. 2. Príslušné regresné rovnice, z ktorých boli určené hodnoty LOD, sú: DPV: I ox = -3, ,032c (R = 0,9994) LOD = 4, mol.dm

187 SWV: I ox = -1, ,018c (R = 0,9996) LOD = 4, mol.dm -3 Obr. 2. SWV voltampérogramy pre koncentrácie ADR: 1.) , 2.) , 3.) , 4.) , 5.) , 6.) , 7.) , 8.) , 9.) , 10.) , 11.) , 12.) , 13.) , 14.) mol.dm -3 a kalibračné závislosti pre a.) DPV, b.) SWV. Opakovateľnosť merania vyjadrená vo forme relatívnej smerodajnej odchýlky pre 50 za sebou idúcich (paralelných) meraní roztoku ADR o koncentrácii mol.dm -3 bola 3,5%, čo potvrdzuje nízku adsorpciu produktu oxidácie ADR na povrchu BDDFE. Vypracovaný postup bol aplikovaný na vzorku ľudského moču so známym obsahom ADR využitím metódy prídavku štandardu z dôvodu potlačeniu vplyvu matrice. Získané výsledky sú uvedené v Tab. I. Vypočítané hodnoty koncentrácie adrenalínu v modelovej vzorke sú v dobrej zhode s očakávanými hodnotami, pričom výťažnosti sa pohybujú v rozmedzí 100 až 103%. Interferenčné štúdium bolo vykonané za účelom overenia dostatočnej selektivity navrhovanej metódy. Z pomedzi širokej škály potenciálnych interferentov bežne sa nachádzajúcich v moči (glukóza, sacharóza, močovina, kreatinín, kyselina citrónová, kyselina barbiturová, kyselina močová) nemal ani jeden v značnom nadbytku významný vplyv na signál adrenalínu. Tabuľka I. Analýza vzorky ľudského moču, * interval spoľahlivosti bol počítaný podľa vzťahu 1/ 2 x tn SD pre n = 5, t 2, Pridané množstvo (μl) 1, n Očakávaná koncentrácia (mol.dm -3 ) n 1, Stanovená koncentrácia (mol.dm -3 ) SD (mol.dm -3 ) Interval spoľahlivosti* (mol.dm -3 ) Výťažnosť (%) 0 5, , , (5,14 ± 0,03) ,8 50 5, , , (5,23 ± 0,02) , , , , (5,51 ± 0,02) , , , , (5,64 ± 0,01) , , , , (5,87 ± 0,01) ,1 Záver V tejto práci sme sa zaoberali vývojom novej metódy na stanovenie adrenalínu využitím BDDF elektródy ako citlivého elektrochemického senzora bez chemickej modifikácie 185

188 povrchu. Navrhovaná analytická metóda je jednoduchá, rýchla a dostatočne citlivá v porovnaní s inými elektrochemickými metódami stanovenia adrenalínu využívajúcimi rôzne modifikátory pre účely zvýšenia citlivosti a selektivity. Relatívne nízke detekčné limity boli dosiahnuté v prostredí 0,5 mol.dm -3 HClO 4 využitím pulzových techník. Praktická aplikovateľnosť metódy bola overená na modelových vzorkách ľudského moču, pričom vysoké hodnoty výťažnosti ( %) poukazujú aj na správnosť metódy. Navrhovaný postup zapadá do koncepcie zelenej analytickej chémie a ponúka citlivú možnosť pre monitorovanie obsahu adrenalínu v ľudskom moči. Práca nadväzuje aj na aktuálny trend v oblasti využitia nových elektródových materiálov na riešenie úloh potravinárskej, klinickej a environmentálnej stopovej analýzy v našom laboratóriu. Poďakovanie Táto práca bola podporovaná Agentúrou na podporu výskumu a vývoja na základe zmluvy č. APVV Autori ďakujú za podporu Vedeckej grantovej agentúre VEGA MŠ SR a SAV (projekt č. 1/0182/11 a 1/0051/13). Literatúra 1. Poliakov A. E., Dumshakova A. V., Muginova S. V., Shekhovtsova T. N.: Talanta 84, 710 (2011). 2. Chen D., Zhan D., Cheng Ch., Liu A., Chen Ch.: J. Chromatogr. B 750, 33 (2001). 3. Tavana T., Khalilzadeh M. A., Karimi-Maleh H., Ensafi A. A., Beitollahi H., Zareyee D.: J. Mol. Liq. 168, 69 (2012). 4. Kehr J.: J. Chromatogr. A 661, 137 (1994). 5. He H., Stein C. M., Christman B., Wood A. J. J.: J. Chromatogr. 701, 115 (1997). 6. Palop S. G., Romero A. M.: J. Pharm. Biomed. Anal. 27, 1017 (2002). 7. Nevado J. J. B., Gallego J. M. L., Laguna P. B.: J. Pharm. Biomed. Anal. 14, 571 (1996). 8. Nagaraja P., Vasantha R. A., Sunitha K. R.: Talanta 55, 1039 (2001). 9. Zheng X., Guo Z., Zhang Z.: Anal. Chim. Acta 441, 81 (2001). 10. Kalimuthu P., John S. A.: Anal. Chim. Acta 647, 97 (2009). 11. Li J., Lin X.-Q.: Anal. Chim. Acta 596, 222 (2007). 12. Zare H. R., Nasirizadeh N.: Sens. Actuators, B 143, 666 (2010). 13. Goyal R. N., Rana A. R. S., Aziz M. A., Oyama M.: Anal. Chim. Acta 693, 35 (2011). 14. Yaghoubian H., Beitollah H., Soltani-Nejad V., Mohadesi A., Afzali D., Zamani H., Roodsaz S.: Int. J. Electrochem. Sci. 6, 1307 (2011). 15. Brondani D., Scheeren C. W., Dupont J., Vieira I. C.: Sens. Actuators, B 140, 252 (2009). 16. Akyilmaz E., Turemis M., Yasa İ.: Biosens. Bioelectron. 26, 2590 (2011). 17. Hasanzadeh M., Karim-Nezhad G., Shadjou N., Khalilzadeh B., Saghatforoush L., Hajizadeh M., Abnosi M. H.: Anal. Bioanal. Electrochem. 2, 98 (2010). 18. Sochr J., Švorc Ľ., Rievaj M., Bustin D.: Bioelectrochemistry, submitted 19. Kraft A.: Int. J. Electrochem. Sci. 2, 355 (2007). 186

189 The Adsorption of Phospholipids at the Interface (Adsorpce fosfolipidů na mezifází) Romana Sokolová a, Jana Bulíčková a, Martina Parisová a, Tomáš Navrátil a, and Miroslav Gál b a J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of ASCR, v.v.i., Dolejškova 3, Prague 8, Czech Republic, sokolova@jh-inst.cas.cz b Department of Inorganic Technology, Faculty of Chemical and Food Technology, Slovak University of Technology in Bratislava, Radlinského 9, Bratislava, Slovakia. Abstract The adsorption of phospholipids on different types of substrate was studied. The adsorbatesurface interactions play an important role in the formation of supported phospholipid bilayer. The deposition of phospholipids on atomically flat surfaces as mica, gold(111), highly oriented graphite and rough surface of polycarbonate membrane is compared. The supported phospholipids bilayer covers some small defects (5 30 nm deep) present in rough polycarbonate membrane. Key words: Supported phospholipid bilayer, Phospholipid membranes, Polycarbonate membrane, Atomic force microscopy, Surface topography. Úvod Na každém fázovém rozhranní se uplatňují interakce mezi povrchem a adsorbovanou látkou a mezi molekulami adsorbátu vzájemně. Změna interakcí mezi povrchem a adsorbovanou látkou může vést k reorientaci adsorbované vrstvy. Silné interakce mezi adsorbovanými molekulami často vedou k přeměně adsorbované vrstvy na kompaktní dvourozměrný film 1-5. K charakterizaci povrchu vrstvy nanesené na elektrodě lze použít buď elektrochemické metody jako je elektrochemická impedanční spektroskopie 1,6, chronopotenciometrie 7,8 nebo mikroskopii rastrovací sondou Fosfolipidy jsou široce zkoumány v mnoha vědních oborech, elektroanalytice 12,13, farmacii, lékařství nebo kosmetice. V závislosti na jejich koncentraci v roztoku vytvářejí dvojvrstvy, micely nebo liposomy (vesikuly) 14. Jejich adsorpci na povrchu substrátu nebo elektrody výrazně ovlivňuje materiál substrátu, jeho hydrofilnost nebo hydrofobicita, hrubost materiálu a teplota při depozici. Studované materiály zahrnují sklo, slídu, křemen, SiO 2, TiO 2, zlato, vysoce orientovaný pyrolytický uhlík (HOPG) Významný vliv má samoorganizace molekul při měření pod vodou, zde se uplatňuje vliv ph, iontové síly a složení roztoku (přítomnost alkalických kovů a kovů alkalických zemin). V předkládaném příspěvku je diskutován vliv typu substrátu na tvorbu fosfolipidové vrstvy, ať už fosfolipidové dvojvrstvy nanesené na povrchu (supported phospholipids bilayer, SPB) nebo vrstvy vesikul fosfolipidu nanesené na povrchu (supported vesicular layer, SVL). Studium je zaměřeno hlavně na vlastnosti fosfolipidové vrstvy nanesené na polykarbonátovou membránu. Experimentální část Chemikálie 1,2 dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfocholin (DPPC) byl zakoupen od firmy Avanti Polar Lipids (Alabaster, USA). Jako rozpouštědlo byl použit roztok absolutního ethanolu (AppliChem, Germany 99,8 %, GC, Chemos, Cítov, ČR) a n-heptanu (p.a., Penta Švec, Pentachemicals, Praha, ČR), v poměru 1:10 (v/v). Destilovaná voda byla získána z Milli-Q RG systému (18MΩ.cm, Millipore Co., USA). 187

190 Substráty Vyžíhané monokrystalické zlato Au(111) na slídě dodávané od firmy Agilent Technologies (USA), vysoce orientovaný pyrolytický grafit (HOPG, Structure Probe Inc., USA), polykarbonátová membrána s velikostí pórů 8 μm (Isopore TM Membrane Filters, Millipore, USA). Příprava fosfolipidové dvojvrstvy nanesené na povrchu Depozice DPPC na polykarbonátovou membránu uchycenou na podložce byla provedena nadávkováním 10 mm roztoku DPPC předem temperovaného na 60 ºC ve vodní lázni. Po 4 min byl povrch omyt rozpouštědlem ethanol/n-heptan 1:10 (v/v) o stejné teplotě. Postup uvedený v literatuře byl přizpůsoben potřebám měření AFM 21. Depozice DPPC na substráty Au(111) na slídě a HOPG probíhala ponořením substrátu do roztoku ethanol/n-heptan 1:10 (v/v) při 60 ºC. Poté byl substrát omyt teplým roztokem samotných rozpouštědel a vysušen pod proudem argonu. Přístroje Měření AFM byla prováděna na přístroji Agilent Technologies 5500 SPM za použití sondy a nosiče vhodného pro zobrazování povrchu pomocí tzv. tapping režimu (TM AFM). Byl použit hrot typu 2 (MACLevers TM, Agilent Technologies, USA) s nominální rezonanční frekvencí f N = 75 khz a hodnotou nominální silové konstanty kn = 2,8 N/m. Vzorky byly měřeny na vzduchu (ex-situ) a také in-situ pod vodou. Výsledky z topografie (výška vrstev apod.) byly odečteny v programu PicoView (Agilent Technologies, USA) a zpracovány v programu Origin 8 (OriginLab Corporation, USA). Obrázky topografie, amplitudy a fáze byly zpracovány v programu Gwyddion 2.7 (Český metrologický ústav, ČR). Výsledky a diskuze Charakterizace polykarbonátové membrány byla prováděna pomocí metody AFM. Obrázek topografie povrchu membrány v oblasti mezi póry zobrazen v magneticky řízeném přerušovaně kontaktním AFM režimu ukazuje Obr. 1. Je vidět, že membrána není rovná. Obsahuje řadu defektů, které lze rozdělit na prohlubně a špičky. Velikost defektů byla vyhodnocena pomocí histogramu distribuce výšky (nebo hloubky) defektu z 220 měření (80 měření). Hloubka prohlubní se pohybuje v rozmezí 5 30 nm, jejich šířka je od 100 po 700 nm, nejčastěji byla zjištěna šířka 245 nm. Šířka špiček je nejčastěji 105 nm, jejich výška 16,8 nm, získaný histogram je zobrazen na Obr

191 Obr. 1. Topografie povrchu polykarbonátové membrány zobrazená ex-situ v magneticky řízeném přerušovaně kontaktním AFM režimu. Velikost zobrazované oblasti 5 μm, osa Z: 75 nm. Obr. 2. Histogram výšky špiček, defektů nalezených na povrchu polykarbonátové membrány. V závislosti na koncentraci a době depozice fosfolipidu bylo zjištěno, že fosfolipid buď vytváří fosfolipidovou dvojvrstvu, která pokrývá některé prohlubně membrány, špičky vystupují nad povrch vrstvy, nebo dochází k utvoření vrstvy vesikul a tzv. panelů. Metodou nanoshaving AFM (NS AFM) 11,22,23 byla odstraněna povrchová vrstva ve vybrané oblasti a zjištěna pomocí histogramu výška vrstvy 5,7 nm. Tato výška odpovídá výšce dvojvrstvy DPPC. Závěr Byl diskutován vliv typu substrátu na tvorbu fosfolipidové vrstvy. Tvorba fosfolipidové dvojvrstvy nanesené na povrchu nebo vrstvy vesikul fosfolipidu nanesené na povrchu závisí na podmínkách depozice, tj. koncentraci roztoku fosfolipidu, teplotě, typu použitého substrátu. 189

192 Acknowledgement This work was supported by the the Academy of Sciences of the Czech Republic (M ). Literatura 1. Pospíšil L., Záliš S., Sokolová R., Fanelli N.: Acta. Chim. Models in Chem. 137, 383 (2000). 2. Sokolová R., Hromadová M., Pospíšil L.: J. Electroanal. Chem. 552, 53 (2003). 3. Hromadová M., Sokolová R., Pospíšil L., Fanelli N.: J. Phys. Chem. B, 110, 4869 (2006). 4. Hromadová M., Kolivoška V., Sokolová R., Gál M., Pospíšil L., Valášek M.: Langmuir 26, (2010). 5. Sokolová R., Kolivoška V., Gál M.: J. Electroanal. Chem., DOI: /j.jelechem , in press (2013). 6. Navrátil T., Šestáková I., Mareček V.: Int. J. Electrochem. Sci. 6, 6032 (2011). 7. Naumowicz M., Petelska A. D., Figaszewski Z. A.: Steroids 76, 967 (2011). 8. Naumowicz M., Figaszewski Z. A.: J. Electrochem. Soc. 160, H166 (2013). 9. ZhiHua W. U., XueHua Z., XiaoDong Z., JieLin S., YaMing D., Jun H. U.: Chin. Sci. Bull. 52, 1913 (2007). 10. Kada G., Kienberger F. Hinterdorfer P.: Nano today 3, 12 (2008). 11. Kolivoška V., Gál M., Lachmanová Š., Janda P., Sokolová R., Hromadová M.: Collect. Czech. Chem. Commun. 76, 1075 (2011). 12. Navratil T., Sestakova, I., Marecek V., Stulik, K.: Electroanalysis 22, 2043 (2010). 13. Jaklova Dytrtova J., Navratil T., Marecek V.: Collect. Czech. Chem. Commun. 76, 1917 (2011). 14. Švecová H., Součková J., Skopalová J., Novotný R., Barták P.: Chem. Listy 106, 200 (2012). 15. Giocondi M. C., Yamamoto D., Lesniewska E., Milhiet P.-E., Ando T., Le Grimellec C.: Biochim. Biophys. Acta 1798, 703 (2010). 16. Hui S. W., Viswanathan R., Zasadzinski J. A., Israelachvili J. N.: Biophys. J. 68, 171 (1995). 17. Richter R. P., Brisson A.: Langmuir 19, 1632 (2003). 18. Richter R. P., Berat R., Brisson A. R.: Langmuir 22, 3497 (2006). 19. Bayerl, T. M., Bloom, M.: Biophys. J. 58, 357 (1990). 20. Koenig B. W., Kruger S., Orts W. J., Majkrzak C. F., Berk N. F., Silverton J. V., Gawrisch K.: Langmuir 12, 1343 (1996). 21. Parisova M., Navratil T., Sestakova I., Jaklova Dytrtova J., Marecek V.: Int. J. Electrochem. Sci. 8, 27 (2013). 22. Liu G. Y., Xu S., Qian Y.: Acc. Chem. Res. 33, 457 (2000). 23. Wendel M., Kuhn S., Lorenz H., Kotthaus J. P., Holland M.: Appl. Phys. Lett. 65, 1775 (1994). 190

193 Applicability of Novel Antimony- and Bismuth-Based Electrodes in Advanced Electroanalysis Hanna Sopha a,b, Samo B. Hočevar b, and Ivan Švancara a a Department of Analytical Chemistry, Faculty of Chemical Technology, University of Pardubice, CZ Pardubice, Czech Republic, HannaIngrid.Sopha@upce.cz b Analytical Chemistry Laboratory, National Institute of Chemistry Hajdrihova 19, SI-1000 Ljubljana, Slovenia Abstract Different kind of bismuth and antimony based electrodes were investigated towards their application in modern electroanalytical chemistry for measuring trace heavy metal ions and some selected organic compounds. For instance, for the first time an antimony film electrode was prepared in-situ in alkaline media, i.e. ammonia buffer solution of ph 9.0. Furthermore, a new type of bismuth based electrodes, the ammonium tetrafluorobismuthate bulk modified carbon paste electrode, was introduced and ordinary bismuth and antimony based electrodes were employed for measuring new electrolytes. All applied electrode modifications showed excellent electroanalytical performances. Key words: Bismuth electrode, Antimony electrode, Heavy metals, Organic compounds, Electroanalytical measurements. Introduction Electrochemical (stripping) analysis in combination with different working electrode materials still belong to the most powerful and convenient analytical techniques for measuring trace metal ions and some organic compounds 1. In the last six to seven decades mercury was most commonly used as electrode material due to its auspicious electroanalytical performance. Due to its well-known toxicity there is still increasing interest for new non-toxic or less toxic materials with performances similar to those of mercury. This trend is particularly important in a view of growing demands for on-site environmental analysis and decentralized clinical testing. However, a great variety of different mercury-free electrode materials has been reported, such as gold, platinum, silver, iridium or carbon 2-4. Although offering useful stripping signals, none of these materials approaches the performance of their mercury analogues exhibiting unfavorable cathodic potential limits for hydrogen evolution, broad or doubled stripping signals, high background contribution and/or poor precision and resolution. In the year 2000 bismuth was introduced as an alternative electrode material to mercury 5. Bismuth based electrodes show a similar applicable potential window as mercury electrodes due to a favorable high hydrogen overvoltage 6. In comparison with mercury, bismuth, as an electrode material, also revealed good performance in the presence of dissolved oxygen and is known as a non-toxic green element 7. Till today, bismuth electrodes have been accepted in numerous laboratories worldwide in different modifications, e.g. in-situ and ex-situ bismuth film electrode prepared on a glassy carbon (BiFE) or carbon paste (BiF-CPE) substrate 8-10, bismuth bulk electrode (BiBE), bismuth screen printed electrode, bismuth powder modified 11 carbon paste electrode (Bi-CPE) and Bi 2 O 3 - (Bi 2 O 3 -CPE) and ammonium 12 tetrafluorobismuthate (BiF 4 -CPE) bulk-modified carbon paste electrodes. Bismuth electrodes have been used for measuring many trace metals as well as for some selected organic compounds 13. Despite bismuth approximately 5 years ago also antimony was found as a convenient electrode material for advanced electrochemical stripping analysis 14. Antimony reveals a similar potential window to bismuth and mercury, an attractive performance for 191

194 measurements in more acidic media and in the presence of oxygen and an interestingly low stripping signal for antimony itself. By now several applications of the antimony electrodes are published, e.g. antimony film carbon paste electrodes (SbF-CPE) 15, antimony screenprinted electrode and antimony nanoparticle modified boron doped electrodes etc 16,17. Experimental Voltammetric and potentiometric (stripping) measurements were performed using a modular electrochemical system (Autolab, Eco Chemie, The Netherlands), equipped with a potentiostat PGSTAT12 and driven by GPES 4.9 software (Eco Chemie, The Netherlands). For all experiments a three electrode system was employed using different kinds of bismuth and antimony based electrodes as working electrodes, an Ag/AgCl(satd. KCl) as reference electrode and a platinum rod as counter electrode. Bismuth and antimony film electrodes were usually plated on a glassy carbon disk (d = 2 mm) or carbon paste (d = 2 mm or 3 mm) substrate. All measurements were carried out in a 20 ml voltammetric cell equipped with a computer controlled magnetic stirrer at room temperature (23 ± 2 C). If not stated otherwise measurements were carried out in non-deaereted solutions. All chemicals were of analytical purity grade and used as received. Ammonium tetraflurobismuthate was synthesized in Pardubice, Czech Republic. Water used for solution preparation was first deionized and further purified via an Elix/Milli-Q unit (Millipore, Bedford, USA). In- and ex-situ prepared bismuth film electrodes were prepared from 0.1 M acetate buffer solution (ph 4.5) containing Bi(III) by applying a sufficient negative potential. Antimony film electrodes were prepared from 0.01 M hydrochloric acid containing Sb(III). The BiF 4 -CPE was prepared by mixing 0.5 g of the bare carbon paste material with 3 % (w/w) of ammonium tetrafluorobismuthate. Results and discussion The in-situ prepared SbF-CPE revealed excellent possibilities for the measurements of In(III) and Tl(I) in the presence of Zn(II) in 0.01 M hydrochloric acid in combination with the chronopotentiometric stripping mode. The performance of the SbF-CPE was compared to its bismuth (BiF-CPE) and mercury (MF-CPE) counterparts. Due to the low ph the measurement of Zn(II) was precluded at the BiF-CPE, whereas at the MF-CPE the signal of Tl(I) was suppressed and not well separated from the signal of In(III) (Fig. 1). Interestingly, at the SbF- CPE two signals of In(III) were obtained. This phenomenon might be explained with the intermetallic film formation between antimony and indium and the successive stripping of deposited indium and indium-antimony intermetallic compound from the electrode surface. Another possible explanation is the oxidation of In(0) to In(III) in two steps via In(I). Moreover it is interesting that at deposition potentials less negative than -1.2 V no signal of In(III) was observed suggesting the possibility of a selective determination of Tl(I). The electrode exhibited excellent reproducibilities for all three examined analytes, i.e. for Zn(II), In(III) and Tl(I) of 2.1 %, 1.6 % and 4.0 %, respectively. Detection limits (3σ) of 2.4 μg L -1 for In(III) and 1.4 μg L -1 for Tl(I) were calculated in combination with deposition times of 120 s. 192

195 50 s/v In A Zn Tl (dt/de) / s V -1 Zn Tl In B Tl In C Potential / V vs. Ag/AgCl(sat.) Fig. 1. Comparison chronopotentiometric measurements of 50 μg L -1 In(III), Tl(I) and Zn(II) at MFE (A), SbFE (B) and BiFE (C) using a CPE substrate in 0.01 M HCl containing 1 mg L -1 Hg(II) (A), 1 mg L -1 Sb(III) (B) and 1 mg L -1 Bi(III). Deposition potential: -1.3 V, deposition time: 120 s. An in-situ prepared antimony film electrode on a glassy carbon substrate (SbFE) was employed for the determination of Ni(II) in the presence of DMG in ammonia buffer solution (ph 9.0) using adsorptive cathodic stripping voltammetry. In the alkaline ammonia buffer solution the antimony ions were stabilized from hydrolysis by means of complexation with tartrate. The measurement protocol was optimized and it was found that employing an unique four step procedure assured an excellent performance of the SbFE, including (i) the predeposition of the antimony film on the substrate electrode, (ii) the accumulation of the Ni(II) complex together with further deposition of the antimony film, (iii) the cathodic stripping voltammetric step, and (iv) the cleaning step at +0.5 V. A RSD of 1.2 % was found and the LoD (3σ) was calculated to 110 ng L -1 in combination with a deposition time of just 60 s. The signals obtained at the in-situ prepared SbFE were considerably higher than at the ex-situ prepared SbFE. In comparison to its bismuth counterpart the in-situ prepared SbFE revealed slightly lower peak currents; however, the reproducibility was significantly improved. With the BiF 4 - CPE, for the first time, an ionic liquid was introduced as a reservoir of bismuth ions for the metal film formation. Interestingly, the BiF 4 -CPE revealed its highest electroanalytical performance in solutions of ph 1 for the determination of Cd(II) and Pb(II) as test metal ions, whereas most other bismuth based electrodes exhibited more favorable results in higher ph, i.e. in ph 4.5. This phenomenon can be beneficially exploited for measurements in solutions of low ph when an increase of the ph is not desirable. In ph 1 the BiF 4 -CPE exhibited significantly higher stripping signals of Cd(II) and Pb(II) than at the Bi 2 O 3 -CPE, the BiF-CPE and the BiFE. The BiF 4 -CPE revealed a RSDs of 8.7 % and 4.6 % and LoDs (3σ) of 9.8 μg L -1 and 1.2 μg L -1 for Cd(II) and Pb(II), respectively. The applicability of the BiFE was expanded for measuring pharmaceutics, i.e. sildenafil citrate using the cathodic stripping voltammetric mode. The measurements were carried out in acetate buffer solution of ph 4.5. The performance of the BiFE was compared to the performances of its lead (PbFE) and mercury (MFE) analogues, as well as to the bare glassy 193

196 Current / A carbon electrode (GCE). The BiFE revealed a considerably higher reproducibility than the bare GCE. Furthermore, higher signals were obtained at the BiFE than at the PbFE and MFE. As an optimal measurement solution acetate buffer solution with ph 4.5 was selected. The comparison of the in-situ and ex-situ preparation protocol revealed that the ex-situ prepared BiFE exhibited a lower background contribution than the in-situ prepared analogue (Fig. 2) and a relative standard deviation of 1.5 %. The LoD (3σ) was calculated to 1.8 x 10-8 mol L -1 in combination with a deposition time of 120 s B Potential / V vs. Ag/AgCl(sat.) A -1.5 Fig. 2. Cathodic square-wave stripping voltammograms of 8 x 10-7 M sildenafil citrate at the ex-situ (A) and the in-situ (B) prepared BiFE in 0.1 M acetate buffer solution with ph 4.5. Accumulation of sildenafil citrate at -0.6 V for 90 s. As another organic compound the neonicotinoid thiamethoxam was measured at the ex-situ prepared SbFE in 0.1 M phosphate buffer solution (ph 7.0) combined with direct differential pulse voltammetry. For this purpose the preparation procedure of the antimony film was studied in detail and as the most suitable procedure a deposition of antimony at -0.5 V for 60 s from a solution of 10 mg L -1 Sb(III) was chosen. Employing lower deposition times than 60 s caused lower reproducibility of the TMO signal probably due to too thin antimony films, since the signal resembled that obtained at the bare GCE. On the contrary, if longer deposition times were applied a higher background was observed. The comparison between the ex-situ prepared SbFE, the ex-situ BiFE and the bare GCE revealed similar signals and peak shapes at all three electrodes. However, the signal obtained at the SbFE was slightly higher than the ones obtained at the other electrodes. Additionally, the bare GCE revealed a poor reproducibility. A RSD of 1.6 % was found for TMO whereas the LoD (3σ) was calculated to 560 μg L -1. Conclusions Excellent results were obtained at all examined bismuth and antimony electrodes with favorable reproducibility and detection limits. In this work, for the first time an antimony film electrode was prepared in-situ in mildly alkaline media, i.e. in ammonia buffer solution of ph 9.0, for the determination of nickel. An advantage of using in-situ prepared electrodes is that just one solution is required for the deposition of film and analyte since the film preparation step for ex-situ prepared film electrodes is often time-consuming. Additionally, with the BiF 4 - CPE, for the first time, an ionic liquid had been used as a reservoir of bismuth ions for the film formation and the favorable properties of the bismuth film electrodes have been combined with the properties of ionic liquid modified carbon paste electrodes. Two different 194

197 organic compounds had been measured, namely sildenafil citrate and the neonicotinoid thiamethoxam. With the application of the BiFE the voltammetric determination of sildenafil citrate was carried out for the first time at a non-toxic metal film electrode. Acknowledgements Financial support from the Slovenian Research Agency (P and BI-CZ/ ) is gratefully acknowledged. Literature 1. Wang J.: Analytical Electrochemistry, 3rd ed., Wiley-VCH, Hoboken, New York Wang J., Tian B.: Anal. Chem. 65, 1529 (1993). 3. Nolan M. A., Kounaves S. P.: Anal. Chem. 71, 3567 (1999). 4. Mikkelsen Ø., Schrøder K. H.: Electroanalysis 13, 687 (2001). 5. Wang J., Lu J., Hocevar S.B., Farias P.A.M., Ogorevc B.: Anal. Chem. 72, 3218 (2000). 6. Hutton E., Ogorevc B., Hocevar S.B., Weldon F., Smyth M., Wang J.: Electrochem. Commun. 3, 707 (2001). 7. Wang J.: Electroanalysis 17, 1341 (2005). 8. Wang J., Lu J., Kirgöz Ü. A., Hocevar S. B., Ogorevc B.: Anal. Chim. Acta 434, 29 (2001). 9. Sopha H., Hocevar S. B., Pihlar B., Ogorevc B.: Electrochim. Acta 60, 274 (2012). 10. Baldrianova L., Svancara I., Vlcek M., Economou A., Sotiropoulos S.: Electrochim. Acta 52, 481 (2006). 11. Krolicka A., Pauliukaite R., Svancara I., Metelka R., Bobrowski A., Norkus E., Kalcher K., Vytras K., Electrochem. Commun. 4, 193 (2002). 12. Sopha H., Baldrianova L., Tesarova E., Grinciene G., Weidlich T., Svancara I., Hocevar S. B.: Electroanalysis 22, 1489 (2010). 13. Buckova M., Gründler P., Flechsig G. U.: Electroanalysis 17, 440 (2005). 14. Hocevar S. B., Svancara I., Ogorevc B., Vytras K., Anal. Chem. 79, 8639 (2007). 15. Sopha H., Baldrianova L., Tesarova E., Hocevar S. B., Svancara I., Ogorevc B., Vytras K., Electrochim. Acta 55, 7929 (2010). 16. Kokkinos C., Economou A., Raptis I., Speliotis T.: Electrochem. Commun. 11, 250 (2009). 17. Toghill K. E., Xiao L., Wildgoose G. G., Compton R. G.: Electroanalysis 21, 1113 (2009). 195

198 Determination of Nicotine at a Carbon Paste Electrode Using Square-Wave Voltammetry (Stanovení nikotinu na uhlíkové pastové elektrodě technikou square-wave voltametrie) Matěj Stočes, Iveta Ksandrová, and Ivan Švancara Department of Analytical Chemistry, Faculty of Chemical Technology, University of Pardubice, CZ , Pardubice, Czech Republic. Matej.Stoces@upce.cz Abstract Unmodified carbon paste electrode was employed for determination of nicotine in samples of nicotine mouth spray by using square-wave voltammetry with method of multiple standard additions. The samples did not require any prior pre-treatment process and were directly analysed in phosphate buffer (ph 7.5). In order to avoid decreasing of nicotine signal with subsequent measurement it was necessary add condition step before each measurement, finding that the best conditioning step consist of 30 second potentiostatic hold at -0.2 V. The found amount of nicotine in each sample correlated with the amount declared by manufacturer. Key words: Carbon paste electrode, Square-wave voltammetry, Unmodified, Nicotine determination. Úvod Nikotin, 3-[(2S)-1-methylpyrrolidin-2-yl]pyridin, je jedním z hlavních alkaloidů obsažených v listech tabákovníku (Nicotiana tabacum, česky Tabák virginský), které jsou zpracovávány do podoby cigaret, řezaného tabáku, nebo doutníků. Nikotin se dostává do lidského těla nejčastěji ve formě cigaretové kouře a následnou inhalací v plicích. Do našeho těla se ale dostává i skrz kůži (například pomocí tzv. nikotinových náplastí) nebo přes dutinu ústní nebo nosní sliznici. Kouření má na lidské zdraví celou řadu negativních vlivů 1,2 (nemocnění plic, kardiovaskulárního systému, nádorové bujení a mnoha dalších). Na druhou stranu a navzdory jeho vysoké toxicitě je dle některých posledních studií doporučován při terapeutické léčbě neurogenerativních onemocněních jako je Alzheimerova nebo Parkinsonova choroba 3. Stanovení nikotinu je důležité jak pro samotný tabákový průmysl (kdy obsah nikotinu je jednou ze sledovaných složek při dodržování a kontroly kvality tabákových výrobků), tak z pohlednu toxikologického a medicínského. K zjištění obsahu nikotinu ve vzorcích cigaret, tabákových listů, přípravků určených k odvykání kouření, ve vzorcích vlasů, krvi a moči je využíváno moderních analytických a separačních metod a technik jako je kapalinová 4-8 a plynová chromatografie 9-12, kapilární elektroforéza 13, spektrofotometrie 14,15 nebo spektrofluorometrie 16. Elektroanalytických metod pro stanovení nikotinu není mnoho, a to zejména z toho důvodu, že ke sledovaným oxidačním procesům nikotinu dochází při značně pozitivních hodnotách potenciálu, což může být limitující pro některé typy běžně používaných elektrod. S úspěchem bylo využito bórem dopované diamantové elektrody pro stanovení nikotinu v alkalickém prostředí 17, sledování redukce nikotinu byla prováděna na kapající rtuťové elektrodě 18 s následným stanovením v nikotinových náplastích, tabletách a žvýkačkách. Amperometrické stanovení bylo provedeno na elektrodě TiO 2 /poly(3,4-ethylenedioxythiophene) připravené technikou molekulárního imprintu 19 a byla rovněž popsána metoda injekční průtokové analýzy spolu s elektrochemicko-luminiscenční technikou pro stanovení obsahu nikotinu 20. Snížení potenciálu nutného k detekci nikotinu bylo dosaženo na elektrodě založené na uhlíkových nanotrubičkám pokrytých vrstvou nanočástic hlinitomřemičitanů 21. V současnost narůstá obliba alternativního přijímání nikotinu do lidského organismu například populární elektronické cigarety nebo například tzv. nikotinové ústní spreje. Tato 196

199 práce se soustředí na elektroanalytické využití uhlíkové pastové elektrody pro stanovení nikotinu ve vybraných reálných vzorcích. Experimentální část Chemikálie Všechny použité chemikálie byly čistoty p.a. od firmy Aldrich nebo Merck. Standardní zásobní roztok nikotinu byl připraven o koncentraci 63,16 mm (102,46 mg / 10 ml) a zásobní roztok fosfátové pufru o koncentraci 0,1M a ph 7,5. Příprava pracovní elektrody Uhlíková pastová elektroda (CPE) byla připravena důkladným smícháním 0.3 g uhlíkového prášku (CR-5, Lučební závody Kolín) s vysoce viskózním silikonovým olejem (SO, typ LUKOIL MV 8000; Lučební závody Kolín), aby výsledná pasta obsahoval 20% hm. silikonového oleje. Zhotovená pasta byla vpravena do pouzdra vlastní konstrukce. Příprava reálných vzorků Vzorky nikotinových sprejů NicoStar byly před vlastní analýzou pouze odplyněny v ultrazvukové lázni. Další úpravy se vzorkem nebyly prováděny. K vlastní analýze bylo pipetováno 1 ml vzorku do 19 ml základní elektrolytu (fosfátový pufr). Stanovení bylo prováděno metodou vícenásobného standardního přídavku. Instrumentace Pro všechna měření v režimu square-wave voltametrie bylo použito elektrochemické pracovní stanice Autolab PGSTAT12 (Metrohm) ovládané pomocí softwaru NOVA 1.9 (tentýž výrobce). Pracovní elektrodou byla uhlíková pastová elektroda; referenční elektrodou pak Ag/AgCl/3M KCl a pomocnou platinová elektroda. Všechna měření byla prováděna ve voltametrické nádobce v objemu 20 ml při konstantní laboratorní teplotě (22 ± 2 ºC). Postup a měření Všechna měření probíhala v režimu square-wave voltametrie (frekvence 50 Hz, amplituda 50 mv) v potenciálovém rozsahu 0,3 až 1,3 V. Před každým měření byla rovněž prováděna kondicionace elektrody po dobu 30 s při potenciálu -0,2 V. Výsledky a diskuse Uváděné výsledky dokumentují uplatnění uhlíkových elektrod a obecněji elektroanalytických metod při praktických analýzách reálných vzorků. Odráží i velmi důležitý fakt, že při vhodném výběru analytické metody lze minimalizovat náklady potřebné na analýzu jednoho vzorku, což v soukromém sektoru hraje jednu z klíčových rolí. Uhlíková pasta elektroda (CPE), která si na poli elektrochemie vydobyla své pevné postavení, ve spojení s technikou přímé square-wave voltametrie je toho konkrétním příkladem. Při stanovení nikotinu v nikotinových ústních sprejích NicoStar byly sledovány oxidační procesy nikotinu, ke kterým dochází na povrchu CPE dochází při cca při 0,9 V. Nezbytným krokem před každým voltametrickým záznamem bylo zařazení kondicionace elektrodového povrchu při vloženém potenciálu -0,2V po 30s. Pokud tento krok nebyl zařazen, docházelo při opakovaném měření k rapidnímu poklesu proudového signálu nikotinu (Obr. 1). Delší doby kondicionace než 30s neměly na měřený signál žádný vliv (pozitivní ani negativní). Vliv vloženého potenciálu při kondicionačním kroku byl studován v rozsahu od -1,6 v do + 0,6 V a byly zaznamenány jen nepatrné změny v proudové odezvě signálu nikotinu s maximem pro potenciál -0,2 V. 197

200 Obr. 1: Vliv kondicionace elektrody na proudovou odezvu nikotinu. (A) bez kondicionace; (B) s kondicionací. Experimentální podmínky: CPE; c (Nik) = 0,5 mmol L -1 ; 0,05 M fosfátový pufr ph 7,5. Podmínky kondicionace: E cond = -0,2 V; t cond = 30 s. Podmínky square wave voltametrie viz experimentální část. 198

201 Stanovení vzorků bylo prováděno metodou vícenásobného standardního přídavku a vyhodnocováno příslušnou extrapolací získaných lineárních regresí. Stanovení každého vzorku bylo provedeno desetkrát. Ukázkový voltamogram analýzy vzorku spolu s třemi standardními přídavky demonstruje obrázek č. 2 a získané výsledky jsou shrnuty v tabulce I. Výsledky jsou udávány jako hmotnost nikotinu v mg na 1 ml. Tabulka I: Obsah nikotinu ve vzorcích nikotinového spreje NicoStar. Obsah nikotinu (mg / ml) měření č.: Vzorek č. 1 Vzorek č. 2 Vzorek č ,687 0,853 0, ,621 0,735 0, ,641 0,779 0, ,641 0,798 0, ,659 0,826 0, ,717 0,724 0, ,725 0,746 0, ,682 0,707 0, ,697 0,740 0, ,714 0,741 0,733 Ø 0,678 ± 0,034 0, 765 ± 0,045 0,729 ± 0,029 Obr. 2. Ukázkový voltamogram získaný při stanovení nikotinu ve vzorku nikotinového ústního spreje metodou vícenásobného standardního přídavku. Plná čára ( ) vzorek; přerušovaná čára (---) jednotlivé standardní přídavky. Experimentální podmínky: CPE; standardní přídavky 3 0,150 mmol L -1 ; 0,05 M fosfátový pufr ph 7,5. Podmínky kondicionace: E cond = - 0,2 V; t cond = 30 s. Podmínky square wave voltametrie viz experimentální část. 199

202 Závěr Stanovení nikotinu ve vzorcích nikotinových ústních sprejů bylo provedeno pomocí uhlíkové pastové elektrody a techniky přímé square-wave voltametrie v prostředí fosfátového pufru bez nutnosti předchozí úpravy vzorku nebo modifikace povrchu pracovní elektrody. Získané výsledky jsou v současné době konzultovány s výrobcem, ale jejich hodnoty jsou v rámci deklarovaného množství uváděného na etiketě výrobku. Poděkování Tato práce vznikla s podporou MŠMT (No. CZ.1.07/2.3.00/30.002) a AIP ČR v rámci bilaterálního programu KONTAKT, ev. č. MEB Literatura 1. Alberg A. J.: Drugs Today 44, 895 (2008). 2. Yildiz D.: Toxicon 43, 619 (2004). 3. Picciotto M. R., Zoli M.: Front. Biosci. 13, 492 (2008). 4. Domino E.F., Hariharan M., VanNoord T., Demana T.: Med. Sci. Res. 20, 859 (1992). 5. Dash A. K., Wong S. T.: J. Chromatogr. A 749, 81 (1996). 6. Tambwekar K. R., Kakariya R. B., Garg S.: J. Pharm. Biomed. Anal. 32, 441(2003). 7. Page-Sharp M., Hale T.W., Hackett L.P., Kristensen J.H., Ilett K. F.: J. Chromatogr. B 796, 173 (2003). 8. Mahoney G. N., Al-Delaimy W.: J. Chromatogr. B 753, 179 (2001). 9. Beckett A. H., Triggs E. J.: Nature 211, 1415 (1996). 10. Shin H. S., Kim J. G., Shin Y. J., Jee S. H.: J. Chromatogr. B 769, 177 (2002). 11. Cai J., Liu B., Lin P., Su Q.: J. Chromatogr. A 1017, 187 (2003). 12. Man C. N., Ismail S., Harn G. L., Lajis R., Awang R.: J. Chromatogr. B 877, 339 (2009). 13. Marsh A., Clark B. J., Altria K. D.: Electrophoresis 25, 1270 (2004). 14. Liu J.-F., Feng Y.-D.: Talanta 47, 833 (1998). 15. Al-Tamrah S. A.: Anal. Chim. Acta 379, 75 (1999). 16. Zhou Y., Yu H., Zhang L., Xu H., Wu L., Sun J., Wang L.: Microchim. Acta 164,. 63 (2009). 17. Suffredini H. B., Santos M. C., De Souza D., Codognoto L., Homem-de-Mello P.,Honorio K. M., Da Silva A. B. F., Machado S. A. S., Avaca L. A.: Anal. Lett. 38, 1587 (2005). 18. Hannisdal A., Mikkelsen Q., Schrøder K.H.: Collect. Czech. Chem. Commun. 72, 1207 (2007). 19. Wu C.-T., Chen P.-Y., Chen J.-G., Suryanarayanan V., Ho K.-C.: Anal. Chim. Acta 633, 119 (2009). 20. Lin M. S., Wang J. S., Lai C. H.: Electrochim. Acta 53, 7775 (2008). 21. Wang S.-J., Liaw H.-W., Tsai Y.-C.: Electrochem. Commun. 11, 733 (2009). 200

203 Use of New Electrode Materials for Tasks of Food, Clinical and Environmental Analyzes (Využitie nových elektródových materiálov pre úlohy potravinárskych, klinických a environmentálnych analýz) Jana Svítková, Ľubomír Švorc, Miroslav Rievaj, Dušan Bustin, and Ján Labuda Slovak University of Technology, Faculty of Chemical and Food Technology, Institute of Analytical Chemistry, Radlinského 9, Bratislava, Slovak Republic, jana.svitkova@stuba.sk Abstract The aim of this contribution is to compare the electrochemical behavior of the commercially available electrodes such as graphite, glassy carbon, screen-printed carbon electrode (SPCE) with a new electrode material which belongs to the area of green analytical chemistry. The main emphasis is on characterization and analytical applications of the most perspective electrode material at present - boron-doped diamond (BDD). The comparative study was carried out by cyclic voltammetry. Key words: Carbon electrodes, Boron-doped diamond, Screen printing carbon electrode, Voltammetry. Úvod V posledných dvoch desaťročiach sa pozornosť elektrochemikov venuje novému elektródovému materiálu - bórom dopovaného diamantu (BDD). Samotný diamant sa vyznačuje mimoriadnou mechanickou aj chemickou stabilitou. Je jedným z najlepších prírodných izolátorov a na jeho elektroanalytické využitie je nutné ho dopovať atómami iných prvkov, najčastejšie atómami bóru 1,2. Publikovali sa početné štúdie zamerané na naviazania DNA pomocou uhlíkových elektród a sieťotlačených elektród. Typicky používané elektródové materiály majú niektoré nevýhody ako napr. slabú mechanickú stabilitu, obmedzený potenciálový rozsah (Hg), zložitejšiu obnoviteľnosť povrchu (Pt, C) alebo nemožnosť ďalšieho použitia po modifikácii elektródy (SPCE) 3-5. Preto sa v súčasnosti systematicky hľadajú nové elektródové materiály vykazujúce širší potenciálový rozsah, nižší šum a zvyškový prúd, použiteľné v rôznych rozpúšťadlách, odolné voči pasivácii, s dobrou chemickou stabilitou, nízkou citlivosť a dobrá odolnosť proti povrchovému znečisteniu v dôsledku slabej adsorpcie Dôležitou požiadavkou je aj ich minimálna toxicita, nízke prevádzkové náklady a ľahko obnoviteľný povrch elektródy aj po chemickej modifikácii povrchu 6,7. Výber materiálu pre DNA modifikované elektródy je úzko spätý s technikou imobilizácie DNA na povrchu elektródy, ktorý hrá veľmi dôležitú úlohu v celkovom použití elektródy ako senzora. Nie sú nám známe publikácie o štúdiu a optimalizácii podmienok pre elektrochemické sledovanie DNA na BDDE a pre jej modifikáciu s DNA. V štúdiu sa zameriavame na uplatnenie BDD elektródy ako citlivého elektrochemického senzora pre voltampérometrické stanovenie a v konkrétnej prezentovanej práci pre naviazanie DNA na povrch elektródy. Porovnáva sa a charakterizuje 4 komerčne dostupných elektród (CE, GCE, SPCE a BDDE) z hľadiska možnosti modifikácie ich povrchu karboxylovanými jednostennými uhlíkovými nanorúrkami (SWCNT-COOH) a imobilizácie DNA. Použitý chitozán je biokompatibilný biopolymér s voľnými aminoskupinami, ktoré v slabo kyslom prostredí protonizujú a zabezpečujú tak kladný náboj a iónovýmenné vlastnosti. Preto sa používa v biosenzoroch ako matrica na imobilizáciu biozložky aj ako externá ochranná vrstva biozložky pred interferentami. Uhlíkové nanorúrky patria k známym materiálom významne zlepšujúcim elektrickú vodivosť a chitozán k prostriedkom zabezpečujúcim stabilitu imobilizácie DNA 8,9. 201

204 Experiment Všetky voltampérometrické merania sa uskutočnili pomocou elektrochemického analyzátora AUTOLAB PGSTAT 302N (EcoChemie, Utrecht, Holandsko) v spojení s externým elektródovým stojanom PA-4 SMDE (Laboratorní přístroje, Praha), ktorý bol prispôsobený pre prácu s BDD elektródou. V trojelektródovom zapojení bola pracovná elektróda (4 komerčne dostupných elektród) BDD s priemerom filmu 3 mm (Windsor Scientific, Veľká Británia), CE, GCE, alebo SPCE, platinový drôtik ako pomocná elektróda, a argentochloridová Ag/AgCl/3 mol l -1 KCl ako referenčná elektróda. Všetky experimenty sa uskutočnili pri laboratórnej teplote. Jednotlivé voltampérogramy sa spracovali a vyhodnotili v softvéri NOVA 1.7. Cyklická voltampérometria (CV) a diferenciálna pulzová voltampérometria (DPV) sa realizovali bez predbežného prebublávania roztoku, pretože rozpustený kyslík nezasahoval do anodického potenciálového okna elektród. Po optimalizácii inštrumentálnych parametrov sa zaznamenávali DPV voltampérogramy. Zásobný roztok K 3 [Fe(CN) 6 ] a K 4 [Fe(CN) 6 ] v látkovom pomere 1:1 s výslednou koncentráciou mol l -1 sa doplnil na 100 ml tlmivým roztokom 0.1 mol l -1 PBS (ph=6.9). Zásobný roztok dsdna sa pripravil v koncentrácii 2 mg ml -1 v prevarenej deionizovanej vode a skladoval pri teplote 4 C. Na povrch pracovnej elektródy sa naniesli 4 μl zásobného roztoku DNA, ktorý sa nechal zaschnúť minimálne 8 hod. Pred samotným meraním sa elektróda ponorila na 2 min do PBS, aby sa uvoľnila adsorpciou neviazaná DNA. Chitozán z krevetových pancierov, nízkoviskózny (CHIT) bol od Fluka, Nemecko. Jeho 0,5% roztok bol pripravený v 1% (v/v) kyseline octovej (99.8%, Lachema, Česká republika) a preliftrovaný cez filtračný papier. Konečný roztok chitozánu mal ph=5,0. Karboxylované SWCNT (priemer 4 5 nm, dĺžka nm) boli od Sigma Aldrich, Nemecko. Roztok SWCNT s obsahom 1 mg ml 1 sa pripravil v deionizovanej vode. Zmes SWCNT-COOH a CHIT sa pripravila v pomere 1:1 (v/v). Výsledky a diskusia V prvom kroku bolo potrebné optimalizovať podmienky merania. Pre voľbu vhodného meracieho potenciálu sa robili merania v rozsahoch -0.8 V 0.8 V, -1 V 1 V, -1.5 V 1.5 V, -2 V 2 V, pomocou cyklickej voltampérometrie. Na základe experimentu pri rôznych potenciáloch sa pre ďalšie experimenty použil potenciálový rozsah -0.8 V V pre všetkých 4 komerčne zakúpených elektród (obr. 1). Obr. 1. CV záznamy mol l -1 [Fe(CN) 6 ] 3 /4 v 0.1 mol l -1 PBS (ph= 6.9) získané na nemodifikovaných elektródach, rýchlosť polarizácie 50 mv s

205 V ďalšom kroku sa modifikovali povrchy elektród nanesením malého objemu roztoku SWCNT-COOH a zaschnutím alebo nanesením malého objemu roztoku DNA, pričom sa vrstva DNA nechala schnúť počas noci a na tmavom mieste. Nakoniec sa rovnako pripravili elektródy modifikované vrstvou SWCNT-COOH a po zaschnutí aj vrstvou DNA. Získané CV záznamy sú na obr. 2. Obr. 2. CV záznamy mol l -1 [Fe(CN) 6 ] 3 /4 v 0.1 mol l -1 PBS (ph= 6.9) získané na elektródach modifikovaných s SWCNT-COOH a DNA, rýchlosť polarizácie 50 mv s -1. Na obr. 3 a obr. 4 vidieť porovnanie CV záznamov získaných na nemodifikovaných ako aj modifikovaných elektródach BDD a SPCE. Obr. 3. CV záznamy mol l -1 [Fe(CN) 6 ] 3 /4 v 0.1 mol l -1 PBS (ph= 6.9) získané na nemodifikovanej BDD a modifikovanej BDD elektróde: DNA/BDD, SWCNT-COOH/BDD, DNA/SWCNT-COOH/BDD. Kontrola: CV záznam na BDD v 0.1 mol l -1 PBS. Rýchlosť polarizácie 50 mv s

206 Obr. 4. CV záznamy mol l -1 [Fe(CN) 6 ] 3 /4 v 0.1 mol l -1 PBS (ph= 6.9) získané na nemodifikovanej SPCE a modifikovanej SPCE elektróde: DNA/SPCE, SWNT-COOH/SPCE, DNA/SWCNT-COOH/BDDE. Kontrola: CV záznam na SPCE v 0.1 mol l -1 PBS. rýchlosť polarizácie 50 mv s -1. Z CV záznamov indikátora mol l -1 [Fe(CN) 6 ] 3 /4 v 0.1 mol l -1 PBS (ph= 6.9) získaných pomocou komerčných elektród BDDE (obr. 3) a SPCE (obr. 4) vidieť, že uhlíkové nanorúrky významne zlepšujú ich elektrické vlastnosti, čo sa prejaví lepšie vyvinutým tvarom CV a hodnotou prúdu píku. Potvrdilo sa tiež, že ako holé tak aj nanorúrkami modifikované BDD a SPCE elektródy možno úspešne modifikovať aj vrstvou dsdna, čo vedie k horšiemu tvaru CV s väčšou separáciou E p ako aj s nižším prúdom píku indikátora. Tieto pozorovania potvrdili aj číselné hodnoty parametrov CV záznamov. Z CV záznamov získaných použitím všetkých študovaných komerčných elektród (CE, GCE, SPCE a BDDE) nemodifikovaných ako aj rôzne modifikovaných vrstvami SWCNT-COOH, DNA a DNA/SWCNT-COOH sa zistili hodnoty I pa (maximálny prúd anodického píku) a ΔE p (rozdiel potenciálov katodického a anodického píku), ktoré sú zhrnuté v Tabuľke 1. Z daných hodnôt vyplýva, že po modifikácií povrchu elektród s DNA sa dôsledkom jej negatívneho náboja znížil prúd negatívne nabitého indikátora a zvýšil sa rozdiel potenciálov píkov. Modifikáciou SWCNT-COOH sa redoxný systém indikátora stal reverzibilnejší oproti nemodifikovaným elektródam. Na elektródach modifikovaných kombináciou DNA/SWCNT- COOH sa vyššie opísaným spôsobom prejavili oba modifikátory, pričom CV záznamy predstavujú dobrú možnosť analytickej detekcie DNA. Tabuľka I. Znázorňuje hodnoty I pa a ΔE p pre nemodifikované a modifikované elektródy CE, GCE, SPCE, a BDDE. Modifikátor /Elektróda nemodifikovaná DNA SWCNT-COOH DNA/SWCNT-COOH I pa, μa ΔE p, V I pa, μa ΔE p, V I pa, μa ΔE p, V I pa, μa ΔE p, V CE 24,8 0, ,8 0, ,5 0, ,5 0,3565 GCE 13,1 0,1514 2,2 0, ,8 0,2295 5,7 0,6641 SPCE 23,1 0, ,9 0, ,5 0, ,9 0,3076 BDDE 9,4 0,2344 5,2 0, ,8 0, ,9 0,

207 Štúdium zároveň potvrdilo vhodnosť konštrukcie biosenzora s využitím chitozánu, keď polymérna vrstva na elektróde stabilizovala imobilizáciou vo vode inak dobre rozpustných SWCNT-COOH. Druhou úlohou pozitívne nabitého filmu chitozánu bolo elektrostaticky stabilizovať tiež imobilizáciu negatívne nabitej DNA. Záver Daný príspevok štúdia zapadá do koncepcie zelenej analytickej chémie, najmä pre šetrenie prostredia z hľadiska záťaže odpadom v prípade BDD elektród. Práca smeruje k využitiu nových elektródových materiálov na analýzu v potravinárskych, klinických a environmentálnych laboratóriách. Zaoberá sa štúdiom BDD elektródy ako citlivého a selektívneho elektrochemického senzora a možnosťou modifikácie jej povrchu pomocou SWCNT-COOH a DNA. BDD elektróda bola porovnávaná s inými uhlíkovými elektródami a sieťotlačenej uhlíkovej pastovej elektródy. Z výsledkov sa zistilo, že komerčná BDDE je nielen elektródou, ktorá samotná poskytuje reverzibilný obraz depolarizátora, ale je aj vhodná na modifikáciu s SWCNT-COOH a imobilizáciu DNA. Dáva porovnateľné výsledky ako SPCE, no modifikovaná BDDE má dlhšiu životnosť a je možné ju používať aj po nanesení DNA (stačí ju len elektrochemicky očistiť), čo v prípade SPCE nie je možné. Poďakovanie Táto práca bola podporovaná Agentúrou na podporu výskumu a vývoja na základe zmluvy č. APVV Autori ďakujú za podporu Vedeckej grantovej agentúre VEGA MŠ SR a SAV (projekt č. 1/0182/11 a 1/0051/13) a Programu na podporu mladých výskumníkov. Literatúra 1. Yosypchuk B., Barek J.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 189 (2009). 2. Granger M. C., Xu J. S., Strojek J. W., Swain G. M.: Anal. Chim. Acta 397, 145 (1999). 3. Manivannan A., Ramakrishnan L., Seehra M. S., Granite E., Buttler J. E., Tryk D. A., Fujishima A.: J. Electroanal. Chem. 577, 287 (2005). 4. Sonthalia P., Mcgaw E., Show Y., Swain G. M.: Anal. Chim. Acta 522, 35 (2004). 5. Zhang Y., Yoshibara J.: Electroanal. Chem. 573, 327 (2004) 6. Pecková K., Musilová J., Barek J.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 148 (2009). 7. Pleskov Y. V.: J. Appl. Electrochem. 38, 1275 (2002). 8. Galandová J., Ziyatdinova G., Labuda J.: Anal. Sci. 24, 711 (2008). 9. Ambrózy A., Hlavatá L., Labuda J.: Acta Chimica Slovaca, In Press. 205

208 The Influence of Labile Complexes on Cadmium Transport across Artificial Phospholipid Membrane Ivana Šestáková a, Martina Parisová a,b, Kateřina, Nováková a,c, and Tomáš Navrátil a J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of the AS CR, v.v.i., Dolejškova 3, Prague, Czech Republic, sestakov@jh-inst.cas.cz b Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry, UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Albertov 6, Prague 2, Czech Republic c University of Pardubice, Faculty of Chemical Technology, Institute of Environmental and Chemical Engineering. Studentská 573, Pardubice, Czech Republic Abstract The influence of labile cadmium complexes on transport across phospholipid membrane with A23817 ionophore the increase of the amount of transported cadmium ions - has been found when only diffusion controlled transport was applied. Lability of Cd-MA complex was demonstrated with stripping chronopotentiometry. Used experimental setup can be utilized for specifying conditions for transport of metal complexes with different stability. Key words: Cadmium, Malic acid, Phospholipid membranes, Voltammetry, Chronopotentiometry, Labile complexes, Electrochemical impedance spectroscopy. Introduction Citric and malic acids belongs to the group of low molecular organic acids, which can be found as root exudateds in rhizosphere, where they form complexes with metal ions and influence solubility and uptake by plants 1. Several studies have shown that this uptake is well correlated with the concentration of the free, uncomplexed metal ions as is described in FIAM model from aquatic toxicology. Nevertheless, some exceptions have been reported, namely for labile Cd complexes 2,3. The possibility that dissociation of labile metal complexes in the diffusive boundary layer enhances diffusion limited uptake of metals has been examined theoretically and further confirmed using technique of diffusive gradient in thin films. The observed effect of Cd complexes was assumed to be governed by the diffusional flux 4. In connection with our studies of the influence of LMWOAs on cadmium and copper transport across model phospholipid membranes 5 with ionophore A23187 some differences were observed between malic or citric acid. As potentiometric determination of stability constant suggest labile behavior of cadmium malate complex 6, additional experiments were performed, where for transport of cadmium malate complex only diffusion was important. Again, electrochemical impedance spectroscopy, voltammetry and also chronopotentiometry were involved in this study. Experimental part Apparatus The electrochemical impedance spectroscopy measurements were realized using CHI 650C Electrochemical Analyzer/Workstation, Software: CHI v 8.1 (IJ Cambria Scientific, UK) and Potentiostat No. 283 and FRA No. 1025, No (Princeton Applied Research, USA). The electrochemical impedances were determined using silver/silver chloride electrodes (silver wire, diameter 1 mm, electroplated by silver chloride). Platinum wire, diameter 1 mm, served as the auxiliary electrode. In our EIS measurement (the dependence of the imaginary part (Z ) on the real part (Z ) of impedance recorded in 0.1 M KCl) the system provided satisfactory results in the frequency range of Hz, amplitude V. But for this study, in order to maintain conditions for only diffusion in the transport, no potential has been applied after addition of cadmium ions. 206

209 The voltammetric determinations of cadmium and copper ions or its complexes were carried out by the PC-controlled voltammetric analyzer ECO-TRIBO polarograph (Polaro-Sensors, Prague, Czech Republic), equipped with POLAR.PRO software v. 5.1 and with MultiElchem v. 2.1 software (J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of the AS CR, v.v.i., Czech Republic). Pen-type electrode hanging mercury drop electrode (HMDE) was used as the working electrode, Ag/AgCl/KCl(3 mol L -1 ) electrode to which all potentials are referred to and platinum wire served as a counter electrode (both Elektrochemické Detektory, Turnov, Czech Republic). The measurements were performed at laboratory temperature. The values of ph were measured using ph-meter Jenway 3505 (Bibby Scientific Limited, UK). Electrochemical cell for measurement of metal ions transport Insert cell, was used, which was described earlier 5,7. In this arrangement, the polycarbonate membrane was glued (epoxy resin CAS (UHU, Bühl, Germany)) onto the plastic cup with a small hole in the center (0.12 cm2), prior to the application of the PL solution. This cup subsequently formed the bottom of the upper part of the polypropylene electrochemical cell. Such arrangement ensures the same areas provided for the bilayer formation. To prevent contamination in the experiments with calcimycin and cadmium ions, all the parts (cup, upper and lower part) were exchanged for the new ones prior to each experiment. The volume of the upper part of the cell with Electrolyte 1 amounted to 3 ml, the compartment with Electrolyte 2 contained 17 ml of the solutions. Reagents and Materials The 0.1 M KCl base electrolyte solutions were prepared from KCl Suprapur, purchased from Merck, Prague, Czech Republic. The p.a. solvents were obtained from Penta-Švec, Prague, Czech Republic. All the other chemicals used were of analytical grade. For all the measurements, deionized water from Milli-Q-Gradient, Millipore, Prague, Czech Republic (conductivity < 0.05 μs.cm-1) was used. The AAS standard solution of Cd 2+, Cu 2+, and Pb 2+ (1000 mg.l -1 in 2 % HNO3) were purchased from Analytica, Prague, Czech Republic and they were diluted as necessary. ph of the solutions was adjusted to desired value with NaOH (Suprapur, Merck, Czech Republic). For the preparation of SPL membranes 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (lecithin, DPPC, GPCho (16:0/16:0)) (Avanti Polar Lipids, Alabaster, USA) was used. Soya beans (Sigma- LMWOAs (CA, MA) were purchased from Sigma Aldrich, Prague, Czech Republic, and their 0.01 M standard solutions were prepared by dissolving appropriate amounts in deionized water. The used calcimycin was > 98 % (TLC) (Calcium Ionophore, Antibiotic A23187). The SPLBs were formed by self-assembling in the holes of the Isopore Membrane Filters (Millipore, USA) polycarbonate, hydrophilic 8.0 μm, and the supporting membrane thickness amounted to 7-22 µm. The area of one pore amounted to 50 µm 2, the experimentally found porosity of the membranes was about %. Voltammetric determination of cadmium ions For the determination of cadmium ions, the sample was diluted with 0.1 M KCl and acidified by addition of HNO3, Suprapur (Merck, Czech Republic), to ph 1. Differential pulse anodic stripping voltammetry (DPASV) was performed at conditions: accumulation potential (Eacc) -800 mv, accumulation time (tacc) was chosen according to the determined concentration level (from 30 to 240 s), initial potential (E in ) -700 mv, final potential (E fin ) +150 mv, scan rate 20 mv.s-1, pulse amplitude 50 mv. A new drop was used for each record; measurement has been realized in 207

210 I [na] nitrogen atmosphere. Oxygen was removed from the measured solutions by bubbling nitrogen (purity class 4.6; Messer Technogas, Prague, Czech Republic) for 10 minutes. Results and discussion As it was found by us earlier, the SPL membrane is completely formed and stabilized approximately one hour after insertion of PL solution on the porous material 5,7. Similarly as in earlier measurement, cadmium ions or Cd 2+ with MA at ph 6.5 were added to the upper part (part 1) of electrochemical cell and diffusion transport was allowed for one hour. Then the electrolyte in compartment 2 was analyzed. As there are no reducible groups in the molecule of malic or citric acid, cathodic stripping voltammetry after accumulation of their complexes is suitable method. Similarly as in case of Cd or Cu phytochelatins 8, potential of -100 mv at solution of 0.1 KCl at ph has been applied for the accumulation of complexes on HMDE scan 120 s 240 s 240 s 360 s -700 E [mv] -800 Fig. 1. DPV of CuMA on HMDE, accumulation at -100 mv: 0, 120, 240 and 360 s M Cu 2+, M malic acid, ph 6.4 Cu complex of MA or CA was employed for detection of transport of LMWOAs across phospholipid membrane with ionophore A In both cases, only metal ions were transported across phospholipid membrane 5. Severe interferences can arise from the presence of lead ions, which form complex with LMWOAs, which also accumulates and is reduced at above -400 mv. Moreover, above ph 6.5 the highly adsorbable ion PbOH + is formed 8,9. This is demonstrated on voltammogram of Cd CA complex, 208

211 dt/de [ms/mv] I [na] s s s E [mv] -700 Fig M Cd 2+ and M citric acid in 0.1 M KCl, ph 7.1 DP CSV, E acc -100 mv: t acc 0, 60, 120 s, scan 20 mv/s. Contrary to the behavior of Cd CA, For Cd MA there is no substantial peak increase with accumulation time using DC or DP voltammetry. Using chronopotentiometry with adsorptive accumulation at 100 mv and different values of reducing current, the peak of released cadmium ions could be observed s-25nA 240s-25nA 240s-10nA nA E [mv] Fig. 3. CdMA - Stripping chronopotentiometry after accumulation at -100 mv (120 or 240s). Stripping current: -25 and -10 na, M Cd 2+, M malic acid, ph

212 Enhancement of transport of cadmium ions under diffusion controlled conditions The average value for transported Cd 2+ in 0.1 KCl was 3.9 %, for CdMA complex 12.3.% of Cd 2+ was found. (The same amount of Cd 2+ = 20 µg was always applied into compartment 1 at the beginning of transport). Both values are higher than those in earlier measurement 5 : (1.6% for Cd 2+ in 0. 1 KCl and 3.1 % of Cd 2+ in case of CdMA.) This is in agreement with lability of both- cadmium chloro complexes as was described in study of plant uptake 2 and lability of CdMA complex 3, as was demonstrated also here by chronopotentiometric measurement. Conclusion The influence of labile complexes on transport across phospholipid membrane was found, using artificially prepared membrane with A23817 ionophore. Lability of Cd-MA complex was demonstrated with stripping chronopotentiometry. Used experimental setup can be utilized for distiquishing conditions for transport of metal complexes with different stability. Acknowlegements The research was supported by GA ČR (project No. P208/12/1645). References 1. Clemens S.: Biochimie 88, 1707 (2006). 2. Smolders E., McLauglin M. J.: Soil Sci. Soc. Am. J.60, 1443 (1996). 3. Degryse F., Smolders E., Merckx R.: Environ. Sci. Technol. 40, 830 (2006). 4. Van Leeuven H. P.: Electroanalysis 13, 826 (2001). 5. Parisova M., Navratil T., Sestakova I., Jaklova Dytrtova J., Marecek V.: Int. J. Electrochem. Sci.8, 27 (2013). 6. Filella M., Town R. M., Bugari M. G.: J. Chem. Eng. Data 44, 1009 (1999). 7. Navratil T., Sestakova I., Stulik K., Marecek V.: Electroanalysis 22, 2043 (2010). 8. Sestakova I., Vodickova H., Mader P.: Electroanalysis 10, 764 (1998). 9. Jaklova Dytrtová J., Sestakova I., Jakl M., Navratil T.: Electroanalysis 21, 573 (2009). 10. Jaklova Dytrtova J., Jakl M., Sestakova I., Zins E.L., Schroder D., Navratil T.: Anal. Chim. Acta 693, 100 (2011). 210

213 Enzyme-linked Electrochemical Detection of DNA Hybridization at the Surface of Pencil Graphite Electrode (Elektrochemická detekce hybridizace DNA na povrchu elektrod z tužkového grafitu využívající enzymové značky) Jan Špaček a, Ece Eksin b, Gulsah Congur b, Luděk Havran a, Petra Horáková a, Arzum Erdem b, and Miroslav Fojta a a Institute of Biophysics, AS CR, v.v.i., Královopolská 135, Brno, Czech Republic, j.h.spacek@ibp.cz b Analytical Chemistry Dept., Faculty of Pharmacy, Ege University, Izmir, Turkey Abstract Enzyme-linked electrochemical detection systems proved to be potent tools for various bioassay, including DNA hybridization assays and immunoassays. Previously we presented a simple technique using target DNA adsorbed on pyrolytic graphite electrode surface and biotinylated oligonucleotide probe to which alkaline phosphatase was attached via streptavidine linker. Here we used analogous system in combination with disposable pencil graphite electrodes. We demonstrate a facile and reproducible detection of DNA hybridization in a wide range of target concentrations using natural PCR-amplified DNA targets. Key words: DNA hybridization, Electrochemical DNA sensors, Biotin label, Streptavidin alkaline phosphatase, p53. Úvod Detekce hybridizace DNA je důležitou částí molekulárně biologických metod. Umožňuje zjištění přítomnosti cílové DNA ve vzorku, čehož lze využít v širokém spektru oborů od lékařské diagnostiky po potravinářský průmysl. Hledání nových způsobů detekce hybridizace DNA může vést k vytvoření nových druhů hybridizačních senzorů. Elektrochemickým metodám je věnována značná pozornost vzhledem k jejich výhodným vlastnostem, ať již jde o jejich relativní nenákladnost nebo o analytické parametry. Pro účely analýzy nukleotidových sekvencí se osvědčila kombinace elektrochemické detekce s aplikací vhodných značek pro hybridizační sondy, jimiž mohou být různé kovalentně připojené elektrochemicky aktivní skupiny 1 nebo enzymy uvolňující z elektrochemicky neaktivních substrátů elektrochemicky aktivní produkty. Typickým příkladem takového enzymu je alkalická fosfatáza (ALP) v kombinaci s 1-naftyl fosfátem, jehož enzymatickou přeměnou vzniká 1-naftol. ALP je komerčně dostupná ve formě konjugátu se streptavidinem, který lze snadno navázat na hybridizační sondy koncově modifikované biotinem. Elektrochemický signál odpovídající hybridizaci DNA s biotinylovanou sondou a následnému navázání ALP konjugované se streptavidinem pak má původ v oxidaci 1-naftolu. Tento systém byl využit různých modifikacích, včetně technik využívajících pro hybridizaci, navázání enzymu a provedení enzymové reakce magnetické mikročástice 2 i technik založených na provedení celé této procedury na povrchu uhlíkové elektrody 3,4. Díky biokatalytické amplifikaci signálu, tedy produkci mnoha molekul elektroaktivního indikátoru jednou molekulou enzymu (odpovídající jedné hybridizační události), má tato metoda přirozeně vyšší citlivost (nižší detekční limit) než metody využívající koncového značení DNA elektrochemicky aktivní skupinou. Experimentální část Prvotní optimalizaci metody jsme prováděli s využitím modelových oligonukleotidů odvozených z genu p53 2. V další fázi jsme prováděli experimenty na produktech PCR amplifikovaných z plazmidové DNA obsahující p53 cdna a v poslední fázi jsme využili DNA získanou amplifikací genu p53 přímo z buněčných linií. Jako kontroly jsme použili 211

214 nekomplementární stejně dlouhé oligonukleotidy, PCR produkty s absencí cílové sekvence a kmeny mutantních lidských buněk s příslušnou delecí v genu p53. Ve všech třech případech jsme jako sondy použili oligonukleotidy o délce 20 nukleotidů, značené na 5 biotinem, plně komplementární k cílové sekvenci. Vlastní procedura probíhala v následujících krocích: 1) Adsorpce cílové DNA na elektrodách z tužkového grafitu (bez jejich předchozí úpravy) 2) Blokování zbylého povrchu mléčnými proteiny (v roztoku sušeného mléka) 3) Hybridizace adsorbované cílové DNA s biotinylovanou sondou 4) Zachycení konjungovaného streptavidinu alkalické fosfatázy na biotinových značkách 5) Ponoření elektrody do základního elektrolytu (0,5 M Na 2 CO 3 and 0,5 M NaHCO 3, ph 9.5) obsahujícího 5 mm 1-naftyl fosfát, enzymatická reakce a následné měření. Obr. 1. Ukázka 4 voltamogramů z hybridizačních experimentů: Pík č. 1 je signál oxidace 1-naftolu, pík č. 2 odpovídá oxidaci mléčných bílkovin použitých pro blokování povrchu elektrody. Křivky s vyvinutým píkem 1 odpovídají hybridizaci s PCR produktem obsahujícím cílovou sekvenci, křivky, na nichž tento pík chybí, odpovídají PCR produktům, které danou cílovou sekvenci neobsahovaly. Voltametrie s lineárním skenem, rychlost polarizace 1 V/s. Konkrétní podmínky byly odvozeny z předchozí práce 4 a optimalizovány k dosažení minimálního času celé procedury potřebného pro získání dobře vyvinutého pozitivního signálu. Měření jsme prováděli metodou voltametrie s lineárním skenem pomocí potenciostatu Autolab (Metrohm-Autolab, Holandsko) na soustavě tří elektrod (pracovní elektroda z tužkového grafitu, referenční elektroda: Ag/AgCl/3M KCl, pomocná elektroda: platinový drát) v prostředí. 212

215 Výsledky a diskuze Výše popsanou metodou jsme dokázali detekovat hybridizaci se všemi typy cílových DNA, přičemž limit detekce pro produkty PCR amplifikace fragmentů přirozené DNA o délce 347 bp obsahující 1 cílovou sekvenci byl 8,7 nm. Zjistili jsme, že adsorpce, blokování a hybridizace dosahuje rovnovážného stavu (dosahuje maximální úrovně) během půl hodiny, přičemž 1 minuta u každého kroku je dostatečná doba pro citlivé stanovení proběhnutí hybridizace a odlišení komplementární (cílové) od nekomplementární (nespecifické) DNA (viz obr. 1). Celou proceduru tak bylo možno provést během cca šesti minut, což je výrazně méně, než je doba analýzy u většiny běžně využívaných hybridizačních systémů. Závěr Předloženou metodou je možné detekovat hybridizaci DNA rychle, s vysokou citlivostí a dobrou reprodukovatelností a z malého objemu vzorku (5 μl). Zjistili jsme, že komerčně dostupné pentelkové tuhy mají velice dobrou reprodukovatelnost a jejich jednorázové užití značně usnadňuje práci s nimi. Tato metoda by v mnoha parametrech mohla konkurovat současně používaným molekulárně biologickým metodám a v některých parametrech (zejm. rychlost analýzy) je i předčít. Poděkování Tato práce vznikla s podporou projektů GAČR (P206/12/2378, P206/11/P739) a mezinárodního projektu Tübitak-AV ČR č. 111T050. Literatura 1. Hocek M., Fojta M.: Chem Soc Rev 40, 5802 (2011). 2. Horakova P., Simkova E., Vychodilova Z., Brazdova M., Fojta M.: Electroanalysis 21, 1723 (2009). 3. Fojta M., Brazdilova P., Cahova K., Pecinka P.: Electroanalysis 18, 141 (2006). 4. Horakova-Brazdilova P., Fojtova M., Vytras K., Fojta M.: Sensors 8, 193 (2008). 213

216 Sensitive Electrochemical Determination of Selected Opiates Using a Boron-doped Diamond Film Electrode Ľubomír Švorc, Miroslav Rievaj, and Dušan Bustin Slovak University of Technology in Bratislava, Faculty of Chemical and Food Technology, Institute of Analytical Chemistry, Radlinského 9, Bratislava, Slovak Republic, lubomir.svorc@stuba.sk Abstract An unmodified boron-doped diamond film electrode was used for the first time as a sensitive and selective electrochemical sensor for the determination of codeine by the use of differential pulse voltammetry. Codeine provided a single well-defined oxidation peak at +1.0 V vs. Ag/AgCl in Britton-Robinson buffer solution at ph 7.0. Using the optimal differential pulse voltammetric conditions (modulation amplitude of 50 mv, modulation time of 40 ms and scan rate of 50 mv.s -1 ), the detection limit of 0.08 µm and the linear response of peak current on codeine concentration in the range from 0.1 to 60 µm (R 2 = 0.998, n = 6) were achieved. The method was successfully applied in the determination of codeine in real samples including pharmaceutical tablets and human urine with results similar to those declared by manufacturer and obtained by reference high-performance liquid chromatography method, respectively. Key words: Codeine, Boron-doped diamond film electrode, Differential pulse voltammetry, Pharmaceutical tablet, Human urine. Introduction Codeine (3-methylmorphine, COD) is an analgesic and antitussive agent which belongs to the family of opiates naturally found in the poppy plant. It has similar applications to morphine, but with much less effect. COD is widely available as a single agent or in combinations with other analgesics such as acetylsalicylic acid, ibuprofen and caffeine in some pharmaceutical tablets to reduce pain and pyrexia. Moreover, COD is extensively used in cough-cold syrup, but it would cause drug addiction, and make mental damage to patient if abused, then even give rise to many issues of social problem 1. In respect of these objectives, there is a growing need for continual development of sensitive and selective analytical methods for drug analysis in many research laboratories as well as forensic and clinical toxicology. A survey of the literature shows many studies in recent years describing various analytical methods for determination of COD and other morphine derivatives. High-performance liquid chromatography 2, gas chromatography 3, capillary electrophoresis 4 and spectrophotometry 5 have also been widely employed in the analysis of COD. However, most of these methods are prone to many drawbacks, such as expensiveness and lengthy as well as complicated sample pretreatment usually involving pre-concentration step prior to the analysis. On the other hand, electrochemical methods offer the practical advantages involving operation simplicity, low expense of instrument, suitability for real-time detection and less sensitivity to matrix effects. Recently, few papers have been devoted to the electrochemical determination of COD using modified electrodes 6,7. Boron-doped diamond film (BDDF) is a one of the novel carbon-based material, which has received much attention in last twenties years. It possesses the various desirable properties, such as high thermal conductivity, high hardness and chemical inertness, extreme electrochemical stability in both alkaline and acidic media, very low and stable background current as well as absolutely the widest working potential window In this contribution, the voltammetric determination of COD by differential pulse voltammetry using the unmodified BDDF electrode is described 11. The practical applicability 214

217 of proposed method is demonstrated in determination of COD in pharmaceutical tablets and human urine. This procedure could also find an application in routine analytical practice for quantification of COD thanks to rapidity, simplicity and sensitivity. Experimental COD standard and other compounds were obtained from Zentiva (Hlohovec, Slovak Republic) and used as received without any further purification. 1 mm stock COD standard solution was prepared by dissolving of its calculated amount in deionised water with resistivity greater than 18 MΩ cm. The voltammetric measurements were performed with an AUTOLAB PGSTAT 302N (Metrohm Autolab B.V., The Netherlands) potentiostat controlled by NOVA 1.8 electrochemical software. The three electrode system consisted of Ag/AgCl/3 M KCl and platinum wire as reference and counter electrode, respectively. BDDF electrode inserted in polyether ether ketone body with inner diameter of 3 mm and boron doping level of 1000 ppm (Windsor Scientific Ltd, UK) was used as working electrode. Cyclic voltammetry (CV) and differential pulse voltammetry (DPV) were employed for purposes of voltammetric studies and quantification of COD, respectively. The detection limit was calculated as three times the standard deviation for the blank solution divided by the slope of the calibration curve. Six tablets of commercial pharmaceutical tablets of Codeine (each with 30 mg COD) were weighted, ground into powder in achate plate and an equivalent portion of 150 mg of powdered tablet was dissolved in deionised water. The mixture was filtered through a filter paper to obtain a clear filtrate and then quantitatively transferred into 100 ml volumetric flask. To obtain final concentrations in the range of calibration curve, the sample solutions were suitably diluted with supporting electrolyte (dilution factor 1:100 v/v). Human urine samples of patients who underwent the treatment with Codeine (30 mg) were received from research laboratory of Faculty of Pharmacy of Comenius University in Bratislava. The urine samples were always collected one hour after intake of tablet and subsequently diluted with supporting electrolyte (dilution factor 1:20 v/v). Results and discussion Fig. 1 shows the CV voltammograms in the absence (curve a) and presence (curve b) of COD in BRBS at ph 7.0 on BDDF electrode. As can be seen, during the scan the single welldefined anodic peak has appeared at potential around +1.0 V vs. Ag/AgCl using without any electrochemical modification of BDDF electrode surface. On the reverse scan, no corresponding reduction peak was observed indicating that the electrode process of COD is the totally irreversible one. It is also apparent that residual current appeared to be sufficiently low at higher potentials on unmodified BDDF electrode. The applicability of DPV (with previously optimized instrumental parameters) in the determination of COD was tested by calibration curve constructed by plotting peak current against COD concentration in the linear range from 0.1 to 60 µm as depicted in Fig 2. The parameters of calibration curve are: I COD = (0.125±0.004) (0.155±0.009)c COD with R 2 = The low detection limit of 0.08 µm was obtained as a consequence of high S/N ratio and without any BDDF electrode surface modification. The repeatability of the procedure was examined with ten replicate DPV measurements at 10 µm COD concentration under the same operating conditions over the short time interval with relative standard deviation (RSD) of 0.9 %. The very low RSD value revealed the excellent repeatability of method and confirmed the minimal adsorption propensity of BDDF electrode surface to the oxidation product of COD. The method has appeared to be a suitable platform for precise detection and quantification of COD. 215

218 Fig. 1. CV voltammograms of (a) 0 μm COD, (b) 10 μm COD in BRBS at ph 7.0 on BDDF electrode with scan rate of 100 mv.s -1. Fig. 2. DP voltammograms of various COD concentrations in BRBS at ph 7.0 on BDDF electrode: (a) 0, (b) 0.1, (c) 0.25, (d) 0.5, (e) 1, (f) 2.5, (g) 5, (h) 10, (i) 20, (j) 40 and (k) 60 μm. The optimized DPV parameters: modulation amplitude of 50 mv, modulation time of 40 ms and scan rate of 50 mv.s -1. The dependences between peak current (μa) and COD concentrations (μm) appear in the inset. The standard additions method was employed for the analysis of pharmaceutical tablets of Codeine when the aliquots amount of COD standard solution was added in order to estimate the accuracy of proposed analytical method. The satisfactory recovery values (calculated as found concentration values after spiking of COD standard solution divided by expected COD concentration values multiply by hundred) between 96.2 and 102.6% were obtained (Table I). From these values it could be concluded that there are no significant matrix interferences. Thus the proposed method is accurate and suitable for quantification of COD in pharmaceutical tablets. Subsequently, in order to evaluate the validity and practical applicability of the proposed method, the human urine samples of patients treated by Codeine were directly analyzed using standard additions method. Under the optimum 216

219 experimental conditions, the representative DP voltammograms for the urine sample of patient 1 are illustrated in Fig. 3. Table I. Analysis of pharmaceutical tablets of Codeine (30 mg) spiked with COD standard solutions using proposed method. Added (mg) Expected (mg) Found* (mg) SD (mg) CI for P=95 %** (mg) Recovery (%) (29.2 ± 0.9) (55.6 ± 1.9) (77.8 ± 4.6) (123.3 ± 6.9) (220.5 ± 9.9) 96.2 * Average for six replicate measurements (n = 6): x ** Confidence interval calculated according ( x ± t n-1,α SD/n 1/2 ); from tables t 5; 0.05 = Fig. 3. DP voltammograms of urine sample of patient 1 (a) undergoing treatment with Codein (30 mg) and after spiking with (b) 4, (c) 8 and (d) 12 μm of COD standard solution in BRBS at ph 7.0 on BDDF electrode. The optimized DPV parameters: modulation amplitude of 50 mv, modulation time of 40 ms and scan rate of 50 mv.s -1. It is clearly shown that the observed peak at about 0.97 V is assigned to the COD oxidation since this peak increases while adding COD standard solution; however it occurs at slightly more positive potential. Table II presents the COD concentrations determined for six replicate measurements (expressed as confidence interval for 95% probability) in the analyzed human urine samples employing the proposed DPV method and reference HPLC method. By evaluation of these results, one can conclude that the values obtained by the proposed method agree well with those acquired by reference HPLC method. Applying the paired t-test 12 to the results obtained by both methods, the resulting t-value of 1.07 is smaller than the critical one (4.30 for α = 0.05), indicating that there is no significant difference between these results at the confidence interval for 95% probability. 217

220 Table II. Analysis of COD in patients urine samples using proposed method (n = 6). Patient Proposed method COD content* (µm) HPLC-PDA ± ± ± ± ± ± 0.03 * Confidence interval calculated according [ x ± t n-1, SD/sqrt(n)]; t 5; 0.05 = Conclusions An unmodified BDDF electrode was used in combination with DPV technique to elaborate the novel, simple and cheap alternative analytical method for determination of COD in the pharmaceutical tablets and human urine. The low detection limit of 0.08 µm was obtained; this value belongs to the lowest ones when compared with previously reported analytical methods in the literature. The determination of COD in the pharmaceutical tablets and human urine was successfully applied without complex sample pretreatment (only filtration and/or simple dilution) with the results in good agreement with those declared by manufacturer and obtained by reference HPLC method, respectively. The method is also sufficiently selective because most of species usually present in the pharmaceutical tablets and human urine do not interfere in high excess. Acknowledgments The authors thank the Scientific Grant Agency VEGA of the Slovak Republic (Project No. 1/0051/13). References 1. Fischer W., Bernhagen J., Neubert R.H.H.: Eur. J. Pharm. Sci. 41, 31 (2010). 2. Hu Z., Zou Q., Tian J., Sun L., Zhang Z.: J. Chromatogr. B 879, 3937 (2011). 3. Chen B.G., Wang S.M., Liu R.H.: J. Mass Spectrom. 42, 1012 (2007). 4. Zhang L., Wang R., Yu Y.Q., Zhang Y.R.: J. Chromatogr. B 857, 130 (2007). 5. Vidal A.D., Reyes J.F.G., Barrales P.O., Diaz A.M.: Anal. Lett. 35, 2433 (2002). 6. Pournaghi-Azar M. H., Saadatirad A.: Electroanalysis 22, 1592 (2010). 7. Pournaghi-Azar M. H., Saadatirad A.: J. Electroanal. Chem. 624, 293 (2008). 8. Švorc Ľ., Sochr J., Tomčík P., Rievaj M., Bustin D: Electrochim. Acta 68, 227 (2012). 9. Švorc Ľ., Sochr J., Rievaj M., Tomčík P., Bustin D: Bioelectrochemistry 88, 36 (2012). 10. Švorc Ľ., Tomčík P., Svítková J., Rievaj M., Bustin D: Food Chem. 135, 1198 (2012). 11. Švorc Ľ., Sochr J., Svítková J., Rievaj M., Bustin D: Electrochim. Acta 87, 503 (2013). 12. Miller J.N., Miller J.C.: Statistics and Chemometrics for Analytical Chemistry, 5th ed., Pearson Education, Edinburgh,

221 Direct Voltammetric Determination of Antioxidant Butylated Hydroxyanisol in Biodiesel (Přímé voltametrické stanovení antioxidantu 3-tert-butyl-4-hydroxyanisolu ve směsné motorové naftě) Markéta Tomášková a, Jaromíra Chýlková a, Vladimír Jehlička b, Tomáš Navrátil c, and Renáta Šelešovská a a University of Pardubice, Faculty Chemical Technology, Institute of Environmental and Chemical Engineering, Studentská 573, Pardubice, Czech Republic, marketa13.t@seznam.cz b University of Hradec Králové, Faculty of Science, Department of Informatics, Rakitanského 62, Hradec Králové III, Czech Republic c J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of ASCR, v.v.i., Dolejškova 3, Prague 8, Czech Republic Abstract Direct voltammetric determination of antioxidant butylated hydroxyanisol (BHA) in isopropanol containing 0.1 mol L -1 H 2 SO 4 using linear sweep voltammetry with gold working electrode was tested. The developed method was purposed for determination of BHA in biodiesel. There were compared the results achieved by nonlinear and linear regression of registered data. This method was applied by analysis of biodiesel samples. These analyses can be performed directly, without necessity of sample treatment or extraction. Keywords: Butylated hydroxyanisol, Voltammetry, Antioxidant, Biodiesel. Úvod Působení dopravy na životní prostředí úzce souvisí s technickým stavem dopravních prostředků. Z ekonomických důvodů jsou kladeny stále vyšší nároky na prodloužení jejich dobrého technického stavu, na zabezpečení vysoké provozní spolehlivosti, na snižování spotřeby paliv, maziv i dalších provozních hmot. Růst kvality a efektivnosti údržby pozitivně ovlivňuje využívání metod kontroly jejich jakosti, které mohou při důsledném uplatňování přinést snižování nákladů, a zároveň přispívá ke snižování škodlivých vlivů dopravy na složky životního prostředí. V současné době se velmi rychle rozvíjejí fyzikální a fyzikálněchemické instrumentální zkušební metody pro posuzování stupně opotřebení provozních kapalin. Získané analytické údaje poskytují zejména u olejů kromě diagnostické informace i informaci prognostickou, tj. dovolují předvídat případné havarijní situace a předcházet jim. Optimalizace výměny olejových náplní je velmi závažným problémem z hlediska ekonomického, provozně-bezpečnostního i environmentálního. Právě v oblasti životního prostředí nachází stále širší uplatnění tribotechnická diagnostika. Uplatňují se jak expresní diagnostiky, tak i standardní laboratorní zkoušky a náročné instrumentální metody. Oleje pro dnešní motory představují řadu problémů: Na prvním místě je to zabezpečení bezporuchového chodu motorů za provozních podmínek, ale i hospodárnost 1. Základním procesem stárnutí oleje v motoru je termooxidace. Ta je vždy doprovázena polymerací, kondenzací, termickým štěpením, odpařováním složek oleje atd. Oxidační zplodiny motorových olejů vedou k tvorbě usazenin na místech, kde je olej v klidu nebo jen v pomalém pohybu, k tvorbě lepkavých kalů a laků na stěnách válce a pístu. Oxidace tedy způsobuje podstatné zhoršení použitelnosti oleje 2-3. Pro zlepšení kvality olejů a zejména pro zvýšení jejich oxidační stability se přidávají různé antioxidanty. Antioxidanty tedy prodlužují životnost olejů. Nejčastěji používanými jsou 2,6-di-tert-butyl-4-metylfenol (BHT), 3-tertbutyl-4-hydroxyanisol (BHA), tertbutylhydrochinon (TBHQ), propyl galát (PG) and pyrogallol (PA) 4-5. Ke stanovení antioxidantů v mazacích olejích se v praxi nejvíce užívá infračervená spektroskopie, která sleduje průběh oxidačních dějů v olejové matrici na základě určení přítomnosti oxidačních produktů, obsahujících karbonylovou skupinu. Nevýhodou této 219

222 metody jsou problémy nastávající při vyhodnocování spekter. Mnoho motorových olejů obsahuje esterový základový olej, který má velmi intenzivní signál ve stejné oblasti jako oxidační produkty 3. Další možností je aplikace kapalinové chromatografie 6-9. Obě tyto metody jsou však experimentálně náročné nebo drahé a vyžadují často komplikovanou přípravu vzorku před vlastní analýzou. Elektrochemické metody představují vhodnou relativně levnou alternativu s nenáročnou instrumentací a s možností miniaturizace Vhodná metoda stanovení antioxidantů je nezbytná pro určení a kontrolu jejich obsahu v různých typech produktů, jejich vlivu na oxidační stabilitu jednotlivých výrobků a rovněž při sledování jejich úbytku v závislosti na čase, což souvisí například s určením doby životnosti mazacích olejů. Vlastní analýza je rychlá a velice citlivá. Navíc antioxidanty jsou látky, které se velmi snadno elektrochemicky oxidují 14. Tato práce je zaměřena na nalezení vhodných podmínek pro přímé stanovení BHA ve směsné motorové naftě (SMN) s využitím zlaté indikační elektrody. Experimentální část Voltametrické analýzy antioxidantu byly realizovány pomocí elektrochemického analyzátoru EP 100VA (HSC servis, Bratislava) v tříelektrodovém uspořádání. Indikační elektroda byla ve tvaru zlatého disku (AuDE, HSC servis, Bratislava). Jako referentní sloužila argentchloridová elektroda, pomocná elektroda byla z platiny. Elektrodový systém byl uchováván mezi jednotlivými analýzami v destilované vodě. Vlastní stanovení probíhalo v kyselém prostředí 0,1mol.l -1 H 2 SO 4 za přítomnosti organického rozpouštědla isoppropanolu. Elektrochemické oxidace antioxidantu byly realizovány metodou DC s lineární změnou potenciálu (Linear sweep voltametry - LSV). Indikační elektroda byla polarizována v rozmezí potenciálů 400 mv až 1200 mv při rychlosti scanu 40 mv/s. Proudový rozsah byl 4 µa. Výsledky a diskuse Voltametrické stanovení BHA bylo nejprve testováno ve třech prostředích (0,1 mol.l -1 kyselina sírová, 0,007 mol.l -1 acetátový pufr a 0,007 mol.l -1 hydroxid sodný). Jako rozpouštědlo byl zvolen isopropanol na základě předešlých informací v publikaci 12. Analýzou modelových roztoků v rozsahu koncentrací 14,9 µg.ml ,5 µg BHA/ml bylo zjištěno, že v alkalickém prostředí anodická oxidace analytu neprobíhá. Stanovení v prostředí acetátového pufru o ph 5 již poskytuje křivky anodické oxidace BHA, ale ve srovnání s kyselým prostředím se posouvají směrem k pozitivnějším potenciálům. Kyselé prostředí vyhovuje nejlépe, neboť poskytuje citlivější odezvu a dobře vyhodnotitelné píky. Navržená metoda stanovení a následného vyhodnocení BHA byla aplikována na vzorky SMN, a sice pro tři modelové roztoky obsahující BHA o koncentraci 1%; 0,5% a 0,1%. Toto složení odpovídá reálnému stavu, neboť počáteční koncentrace antioxidantů v produktech se blíží 1 % a s časem klesá. Pro zdárný průběh analýz bylo třeba nalézt vhodné množství vzorku a zjistit, zda má matrice SMN vliv na průběh a tvar křivek anodické oxidace studovaného antioxidantu BHA. Na základě celé řady stanovení (příklad je uveden na obr. 1) bylo zjištěno, že pro každou testovanou koncentraci zvyšující se dávkovaný objem SMN (bylo měněno v rozmezí 0,5 ml až 1,5 ml) vede ke snížení citlivosti stanovení a zároveň se poloha píků posunuje směrem k pozitivnějším potenciálům. Tyto změny však nejsou nijak výrazné a objem vzorku se proto může volit libovolně ve studovaném rozsahu podle očekávané koncentrace analytu. 220

223 Obr. 1. Záznam křivek anodické oxidace při voltametrickém stanovení BHA v prostředí isopropanolu obsahujícím 0,1 mol.l -1 H 2 SO 4. Exp. podmínky: LSV, E INIT : +0,4 V, E FIN = +1,2 V, rychlost nárůstu potenciálu 40 mv.s -1, koncentrační rozmezí BHA: od 14,9 µg.ml -1 do 119,5 µg.ml -1, dávka SMN: 0,5 ml. Další pozornost byla zaměřena na metodu vyhodnocení naměřených křivek. Ty byly jednak kvantitativně stanovovány za předpokladu lineární odezvy proudu na koncentraci a dále podle nelineární regrese. Dosažené výsledky jsou shrnuty v tabulce I. Z uvedených hodnot, jednoznačně vyplynulo, že navržená metoda analýzy BHA za doporučených podmínek v dané matrici vyžaduje vyhodnocení výsledků podle nelineárního modelu. Tabulka I. Výsledky analýz modelových vzorků o koncentraci: model 0,1% - 1,099 g/kg; model 0,5% - 5,281 g/kg; model 1% - 9,817 g/kg. Obsah BHA ve vzorku 1% 0,5% 0,1% Lineární regrese Nelineární regrese Objem vzorku [ml] Stanoveno Chyba Stanoveno Chyba [µg.ml -1 ] [%] [µg.ml -1 ] [%] 0,1 11,45 +16,6 10,01-1,9 0,5 13,56 +38,1 9,84 +0,2 1,0 12,75 +29,8 9,00-8,4 0,1 5,96 +12,9 4,90-7,2 0,5 6,66 +26,2 5,23-0,9 1,0 7,50 +42,1 5,35 +1,4 0,5 1,22 +11,3 1,14 +3,4 1,0 1,24 +13,2 1,08-1,5 1,5 1,36 +24,1 1,13 +2,5 221

224 Nelineární regrese byla aplikována následovně: v následujícím grafu na obrázku 2 jsou vyneseny výšky jednotlivých píků v závislosti na přídavku BHA. Prvnímu píku odpovídá nulová hodnota přídavku standardu, tedy se jedná o koncentraci neznámého vzorku. Naměřená data byla aproximována polynomy 1. až 4. stupně. Obr. 2. Závislost výšky píku anodické oxidace BHA na koncentraci tohoto antioxidantu v roztoku. Křivka 1 polynom 1.stupně; Křivka 2 polynom 2.stupně; Křivka 3 polynom 3.stupně; Křivka 4 polynom 4.stupně. Pro výpočet koncentrace vzorku je třeba správně zvolit vhodný stupeň aproximačního polynomu a příslušnou křivku posunout v argumentu tak, aby procházela počátkem souřadného systému. Z této křivky pak bude možné na základě změřené hodnoty proudu, příslušící vzorku, určit jeho koncentraci, pro niž je podstatná právě oblast, ve které dochází k extrapolaci a ke hledání průsečíku křivky s vodorovnou osou souřadného systému. Vzhledem k tomu, že oblast s extrapolovaným průběhem závislosti výšky píku na koncentraci BHA neobsahuje žádná naměřená data, nelze o správnosti zvoleného stupně aproximačního polynomu rozhodnout jinak, než na základě experimentálního proměření a vyhodnocení dostatečného množství vzorků. Celkem bylo analyzováno 25 modelových vzorků se známými koncentracemi. Průměrná chyba stanovení podle 1. stupně polynomu je 22,09%, dle 2. stupně -1,54% a 3. stupně -8,74%. Je zřejmé, že nelineární závislost velikosti píků na koncentraci je optimálně aproximována polynomem 2. stupně. Pro výpočet koncentrace analyzovaného neznámého vzorku byl tedy navržen a experimentálně odzkoušen následující algoritmus, který je součástí programu OK-nelin 15. Naměřená data jsou metodou nejmenších čtverců aproximována polynomem 2. stupně, přičemž prvnímu píku je přiřazena nulová hodnota přídavku standardu a dalším píkům jsou přiřazeny odpovídající přírůstky koncentrace. Numerickou iterační metodou pro výpočet kořenů nelineárních funkcí je vypočtena hodnota kořenu nalezeného polynomu. Jako první aproximace je brána velikost prvního píku. Hledaná koncentrace analyzovaného vzorku je číselně rovna záporné hodnotě kořenu aproximačního polynomu. Metoda stanovení BHA ve směsné motorové naftě byla ověřena při analýzách 5 vzorků reálných modelových směsí, připravených homogenizací známého množství antioxidantu a čisté matrice SMN. Dosažené výsledky představují průměr ze tří stanovení a jsou shrnuty v tabulce II. 222

225 Tabulka II. Výsledky voltametrického stanovení BHA v modelových reálných vzorcích. Vzorek č. Stanovováno Stanoveno Chyba [g/kg] [g/kg] [%] 1 4,82 4,98±0,13 +3,4 2 5,09 5,13±0,18 +0,8 3 3,08 3,09±0,18 0,0 4 2,50 2,55±0,12 +2,0 5 1,06 1,140±0,025-4,3 Na základě uvedených hodnot, lze konstatovat, že vypracovaná voltametrická metoda stanovení BHA, včetně navrženého postupu vyhodnocení, poskytuje spolehlivé výsledky i v tak složité matrici, jako je směsná motorová nafta. Závěr Z předložené práce vyplynulo, že voltmetrické stanovení syntetického antioxidantu 3-tertbutyl-4-hydroxyanisolu (BHA) lze provádět v prostředí organického rozpouštědla - isopropanolu za přítomnosti 0,1 mol.l -1 H 2 SO 4 s využitím zlaté indikační elektrody a metody linear sweep voltammetry (LSV) za doporučených podmínek přímo ve vzorcích směsné motorové nafty, za předpokladu, že následné vyhodnocení bude provedeno programem OK-nelin, z důvodu nelinearity závislosti výšky voltametrických křivek na stanovované koncentraci v přítomnosti matrice vzorku. Poděkování Tato práce vznikla s podporou projektu č. SGFChT05/2012. Literatura 1. Straka B.: Motorové oleje a tribotechnická diagnostika naftových motorů. NADAS. Praha Matějovský V.: Automobilová paliva. Grada. Praha Downloaded 5 th March Dunn O.: Fuel Process. Technol. 86, 1071 (2005) 5. Karavalakis G., Hilari D., Givalou L., Karonis D., Stournas S.: Energy 36, 369 (2011). 6. Nekvasil F.: Příručka pro nakládání s odpady. Expertízy a poradentství v oblasti odpadů a NS. Nakladatelství Kutná Hora, Saad B., Sing Y. Y., Nawi M. A., Hashim N., Ali A. S. M., Saleh M. I., Sulaiman S. F., Talib K. M., Ahmad K.: Food Chem. 105, 389 (2007). 8. Biparva P., Ehsani M., Hadjmohammadi M. R.: J. Food Comp. Anal 27, 87 (2012). 9. Wang J. Y., Wu H. L., Chen Y., Sun Y. M., Yu Y. J., Zhang X. H., Yu R. Q.: J. Chromatography A 2012, 1264, Cheek G. T., Mowery R.: Anal. Chem. 61, 1467 (1989). 11. Chýlková J., Šelešovská R., Machalíková J., Dušek L.: Cent. Eur. J. Chem. 8, 607 (2010). 12. Chýlková J., Tomášková M., Šelešovská R., Mikysek T., Jehlička J.: Electroanalysis 24, 1374 (2012). 13. Tomášková M., Chýlková J., Machalický O., Šelešovská R., Navrátil T.: J. Electrochem. Sci. 8, 1664 (2013). 14. Korotkova E. I., Korbainov Y. A., Sheychuk A. V.: J. Electroanal. Chem. 518, 56 (2002). 15. Jehlička V.: Soukromé sdělení. 223

226 A New Method of Apparent Protonation Constant Evaluation from Voltammetric Data Libuše Trnková a, b, Nuria Serrano c, and Iveta Pilařová a a Department of Chemistry, Faculty of Science, Masaryk University, Kamenice 5, Brno, Czech Republic, @mail.muni.cz; libuse@chemi.muni.cz b Central European Institute of Technology CEITEC, Brno, University of Technology, Technická 3058/10, CZ Brno, Czech Republic c Departament de Química Analítica, Facultat de Química, Universitat de Barcelona, Martí i Franquès 1-11, E Barcelona, Spain Abstract In general, the determination of apparent protonation constants of organic electroactive substances from polarographic and voltammetric data is based on the dependence of peak potential (E p ) on ph. Then the pk a value is given as an intersection of two lines characterizing a different shift E p of protonated and unprotonated particles on ph. Due to the fact that both slopes of these lines usually are not very different, the exact assessment of the intersection is problematic. Our new proposed method, which is able to determine pk a ' values from the R p (peak resistance) depending on ph, eliminates this drawback. Key words: Electrochemical determination of pka, Linear sweep voltammetry, Elimination voltammetry, Adenine. Introduction For the electrochemical study of protonation-deprotonation equilibria of organic compounds potentiometric and conductometric methods have been widely employed 1. A polarographic and voltammetric acidic scale for some weak acids was developed but the evaluation of a protonation-deprotonation equilibrium is complicated by all processes in the vicinity of the electrode 2. The acid-base balance is influenced by the loss of molecules that are reduced on the electrode. On the other hand, the decrease of protonated molecules is again complemented by the subsequent protonation of neutral molecules. It is very important how quickly the balance is established 3. Most of the protonation-deprotonation constants determined by electrochemical methods other than potentiometry and conductometry suffer from the use of irreversible redox potentials (sluggishness of the heterogeneous electron transfer or fast chemical reaction following the reversible or quasireversible electron transfer) and/or approximate evaluation of the solution bond dissociation energies 4. On the other hand, the potentiometric approach cannot be confidently extended to the determination of the acidity in the high pka region 5. Experimental Chemicals Phosphate acetate buffer as the supporting electrolyte was prepared as a mixture of acetic acid (glacial, Sigma Aldrich; ACS reagent), phosphoric acid (84%; p.a.; Penta Chrudim) and sodium hydroxide (Sigma Aldrich; 97%; p.a.). Methanol CH 3 OH (p.a.) was purchased from Penta Chrudim, Czech Republic; ethanol, NaClO 4 and adenine were purchased from Sigma Aldrich. All the solutions were prepared in distilled MILI Q water. Methods The voltammetric experiment was carried out using the electrochemical analyzer AUTOLAB PGSTAT 302N (EcoChemie-Utrecht, Metrohm, Switzerland) in connection with VA Stand 663 controlled by GPES software manager. The solution of adenine ( mol L -1 ) was measured in the electrochemical vessel equipped with three electrodes: a hanging mercury drop electrode (HMDE) as the working electrode, and Ag/AgCl/3M KCl and Pt wire as a reference and an auxiliary electrode, respectively. The phosphate-acetate buffer solutions with 224

227 different ph were used as supporting electrolytes. The ionic strength (0.1M) was adjusted by NaClO 4. The sample of adenine in water or methanol, or in ethanol (10 % v/v) was analyzed after 300 s of bubbling by argon in order to eliminate oxygen. All voltammetric experiments were carried out at room temperature (23 C). The LSV curves were measured in a potential range from -1.0 V to -1.7 V at scan rates from 100 to 800 mv/s. The conditioning time for HMDE electrode was 2s and the potential step was 2 mv. From the smoothed voltammetric curves (Savitzky-Golay filter, level 2) exported into Excel the elimination function EVLS E4 with simultaneous elimination of kinetic and charging currents and diffusion current conservation, according to the equation EVLS E : f(i) = I I 1/ I 2 was calculated. Results and discussion On a hanging mercury drop electrode (HMDE) in aqueous and aqueous-alcohol buffer solutions (10% v/v methanol or ethanol) adenine provides voltammetric peaks corresponding to the reduction of double bond in the pyrimidine ring. The reduction process is irreversible requiring the protonated form of adenine. With increasing scan rate (100, 200, 400, and 800 mv/s) and ph (from 1.63 to 6.69) the peaks are shifted to more negative potentials. Fig.1 shows not only LSV curves measured at a scan rate of 400 mv/s and at different ph in aqueous-methanol buffer solutions (Fig. 1A), but also shows the ph dependences of peak potential E p (mv) - Fig. 1B and peak resistance R p (MΩ) - Fig.1C for adenine in buffer solutions with I = 0.66 M. The R p values were calculated as the values of the peak potential divided by the peak current at the peak maximum. Both E p and R p dependences on ph are represented by two lines with different slopes. The voltammetric determination of apparent pk a is based on the intersection of these lines ; the first branch corresponds to ph < pk a and the second to ph > pk a. Compared to Figs. B and C it can be seen that the evaluation of pk a is more suitable in the case of ph dependence of R p. Moreover, the pk a value (3.97) is close to the value determined by potentiometric titration (4.10). The pk a values of adenine determined not only from LSV but also from EVLS results for aqueous buffer, aqueous-methanol and aqueousethanol buffer solutions were compared. The accuracy and correctness of pk a using both voltammetric methods (LSV and EVLS) and both evaluation approaches were discussed. The equations of lines in the range of ph < pk a and ph > pk a with the corresponding coefficients of determination are shown in Figs. 1B and 1C. These equations provide the possibility of numerically determining pka. Conclusion The example of adenine in different media served to demonstrate our new method of evaluation of apparent dissociation constants pk a 's. Instead of the dependence of the reduction peak potential (E p ) on ph, the dependence of the peak resistance (R p ) on ph was used. It was found that the crossing, from which the pka value is determined, in R p -ph dependence of protonated and unprotonated molecules is much more interpretable and not burdened with a subjective error. Acknowledgement This research was supported by (a) the CEITEC Central European Institute of Technology Project CZ.1.05/1.1.00/ , (b) MUNI/A/0992/2009 project of the Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic and (c) CTQ project of the Spanish Ministerio de Economia y Competitividad. The authors also wish to thank Metrohm Company for the possibility of presenting these results. 225

228 Ep/V Rp/MΩ I/μA A 400mV-pH mV-pH mV-pH mV-pH mV-pH mV-pH mV-pH mV-pH mV-pH mV-pH mV-pH mV-pH mV-pH mV-pH mV-pH mV-pH mV-pH mV-pH mV-pH mV-pH mV-pH E/mV y = x R² = B 7 6 C y = x R² = pk a y = x R² = ph y = x R² = ph Fig. 1. LSV curves of adenine recorded on mercury electrode in aqueous-methanol buffer solutions at different ph and their evaluation in the scale of E p and R p. References 1. Kolthoff I. M., Elving P. J.: Treatise on Analytical Chemistry. Wiley, New York, Heyrovsky J., Kůta J.: Principles of Polarography, Czechoslovak Academy of Science, Prague Kim H.-s., Chung T.D., Kim H.: J. Electroanal. Chem. 498, 209 (2001). 4. Ritchie C. D.: Solute-Solvent Interaction, Marcel Dekker, New York Matthews W. S., Bares J. E.: J. Am. Chem. Soc., 97, 7006 (1975). 6. Dracka O.: J. Electroanal. Chem. 402, 19 (1996). 7. Dracka O., Trnkova L.: J. Electroanal. Chem. 413, 123 (1996). 8. Trnkova L., Kizek R., Dracka O.: Electroanalysis, 12, 905 (2000). 9. Trnkova L.: J. Electroanal. Chem. 582, 258 (2005). 10. Trnkova L.: Application of elimination voltammetry with linear scan in bioelectrochemistry. In: Utilizing of bio-electrochemical and mathematical methods in biological research. Signpost, Kerala, Chapter 4, p. 51 (2007). 11. Serrano N., Klosova K., Trnkova L.: Electroanalysis 22, 2071 (2010). 12. Serrano N., Holubova S., Trnkova L.: Electroanalysis 23, 2217 (2011). 13. Pilarova I., Lubal P., Trnkova L.: Electroanalysis 24, 349 (2012) pk a 226

229 The Use of Large Volume Sample Stacking with Acetonitrile for Determination of Neurotransmitters by Capillary Electrophoresis with Contactless Conductivity Detection (Použití vysokého dávkování vzorku do kapiláry pro stanovení neurotrasmiterů kapilární elektroforézou s bezkontaktní vodivostní detekcí) Petr Tůma, Václav Pavlíček, Klára Málková, and Eva Samcová Charles University in Prague, Third Faculty of Medicine, Institute of Biochemistry, Cell and Molecular Biology, Ruská 87, CZ Prague 10, Czech Republic, petr.tuma@lf3.cuni.cz Abstract A new method of large volume sample stacking with acetonitrile was used for determination of γ-aminobutyric acid (GABA), glycine (Gly) a glutamate (Glu) in the microdialyzate of central nervous system by capillary electrophoresis with contactless conductivity detection. A pressure is applied to remove the interfering acetonitrile zone out of the capillary during separation. This technique enables to increase the injected sample amount up to 98% of total capillary length. Under optimized conditions LODs achieve 9, 10 and 15 nm for GABA, Gly and Glu in model sample and 29, 29 a 37 nm in microdialyzate samples. Key words: Capillary electrophoresis, Contactless conductivity detection, Large volume sample stacking, Neurotransmitters. Úvod Pro stanovení neurotransmiterů v mikrodialyzátech 1 se vysokoúčinná elektroforetická separace obvykle kombinuje s laserem indukovanou fluorescencí (LIF) 2. Toto spojení umožňuje provádět stanovení neurotransmiterů vyskytujících se mikrodialyzátech s LODs na úrovni 10-8 M. Neurogenní aminokyseliny ovšem nevykazují přirozenou fluorescenci a použití LIF je nutně spojeno s jejich derivatizací 3. Navíc spojení CE/LIF je velmi náročné po technické i finanční stránce a z těchto důvodů není široce rozšířené. Z hlediska technického provedení, nároků na přípravu vzorku a v neposlední řadě i finančních nákladů se jednodušším řešením pro stanovení aminokyselin v biologických materiálech postupně stává spojení CE s bezkontaktní vodivostní detekcí (C 4 D) 4. Univerzální C 4 D nevyžaduje provádět derivatizaci vzorku a pro nízkomolekulární organické látky běžně dosahuje LOD kolem 10-6 M. Citlivost stanovení v CE lze ovšem zvýšit až o několik řádů prováděním prekoncentrace vzorku přímo on-line v separační kapiláře 5. V této studii je ukázáno, že použitím techniky large volume sample stacking, při kterém nadávkované množství vzorku může dosáhnout až celého objemu separační kapiláry, lze i v kombinaci s C 4 D docílit LOD pro γ-aminobutyrát (GABA), glycin (Gly) a glutamát (Glu) na úrovni 10-8 M. Tato citlivost je plně srovnatelná s použitím LIF a umožňuje provádět monitorování neurotransmiterů v mikrodialyzátech CNS. Experimentální část Elektroforetická měření byla provedena na elektroforetickém přístroji HP 3D CE system (Agilent Technologies, Waldbronn Germany) vybaveným C 4 D, který je zabudován do elektroforetické kazety a termostatován na 25 C. CE separace byly provedeny v křemenné kapiláře (Composite Metal Services, UK), vnitřní průměr 60 m, vnější průměr 363 m, celková délka 43 cm, délka k C 4 D 28 cm. Elektroosmotický tok byl v kapiláře zastaven pokrytím vnitřní stěny kapiláry komerčním roztokem (INST pokrývací roztok, Biotaq, U.S.A.). Nová kapilára byla postupně promývána 0.1 M NaOH (5 min), voda (5 min), INST roztok (2 min), voda (5 min) a základní elektrolyt (BGE, 5 min). Mezi jednotlivými analýzami byla kapilára promývána BGE 1 min. Separace byly prováděny v BGE o složení 4.0 M kyselina octová (ph 1.9) při separačním napětí 25 kv. Za těchto podmínek migrují aminokyseliny jako kationty a v C 4 D poskytují 227

230 negativní píky. Zaostření aminokyselin bylo ukázáno na modelovém vzorku o složení: 10-5 M směs GABA, Gly a Glu s přídavkem 20 mm NaCl (korekce zasolení mikrodialyzátu) rozpuštěná ve směsném rozpouštědle voda/acetonitril (ACN) s 75% zastoupením ACN. Pro dávkování vzorku do kapiláry i vytlačování balastní zóny ACN z kapiláry byl použit tlak 50 mbar. Veškeré použité chemikálie dosahovaly analytického stupně čistoty a pro přípravu roztoků byla použita deionizovaná voda (Milli-Q water System, 18.2 MΩ cm, Millipore). Výsledky a diskuse Přímé dávkování neupraveného mikrodialyzátu podobně jako jiné tělesné tekutiny do separační kapiláry je nevýhodné pro prekoncentraci vzorku. Mikrodialyzát má z důvodu vysokého zastoupení NaCl vysokou elektrickou vodivost, což má za následek rozmytí zóny vzorku pod vlivem separačního pole. Vodivost mikrodialyzátu lze ovšem snadno snížit přídavkem organického rozpouštědla mísitelného s vodou (acetonitril, ACN; aceton, methanol, isopropanol) ke vzorku 6. Na zóně vzorku ošetřeného ACN je v důsledku jeho nízké vodivosti vyšší hodnota intenzity elektrického pole (E) než na okolním separačním elektrolytu o vysoké vodivosti. Pod vlivem elektrického pole ionty analytu rychle opouští zónu ACN a po vstupu do BGE se jejich rychlost zpomalí. Tímto procesem lze dlouhou nadávkovanou zónu zředěného analytu zakoncentrovat do krátkého úseku, large volume sample stacking. Po vycestování iontů z ACN se stane tato zóna málo vodivá a představuje odpor pro průchod elektrického proudu kapilárou. Je-li délka nadávkované zóny ACN krátká poklesne proud jen po dobu nutnou k promíchání zóny ACN s okolním BGE a poté se opět stoupne. V případě dlouhé zóny ACN je promíchání s BGE pomalé a vede k přerušení průchodu proudu kapilárou a zničení separace. Předchozí studie odhalila, že délka zóny vzorku mikrodialyzátu s 75% obsahem ACN nemůže překročit cca 24% z celkové délky kapiláry (pro 43 cm kapiláru to je cca 10 cm), aby nedocházelo k přerušení separace 7. I při dávkování kratší zóny ACN, kdy nedochází k přerušení proudu, způsobuje přítomnost ACN v kapiláře nežádoucí prodloužení migračního času (migrační čas glycinu kontinuálně vzrůstá z 8 min. při dávkování 3% z délky kapiláry na 14 min. při dávkování 24%, viz 7 ). Zóna ACN v kapiláře odebírá významnou část separačního napětí a v důsledku toho je na okolním BGE nízká E. Pro odstranění negativních vlivů ACN na separaci byl zaveden nový dávkovací program (Obr. 1). Po nadávkování vzorku s ACN je současně se zapnutím separačního napětí aplikován hydrodynamický tlak, kterým je zóna ACN vypuzována z kapiláry do vstupní nádobky s BGE. Za zvolených experimentálních podmínek (separační napětí 25 kv, vypuzovací tlak 50 mbar) je rychlost migrace aminokyselin v zóně ACN vyšší než rychlost, kterou je tato zóna vytlačována ven z kapiláry. Tím dojde k zakoncentrování aminokyselin do úzké zóny na rozhraní mezi BGE a ACN. Po vytlačení veškerého ACN ven z kapiláry je tlak vypnut a zakoncentrovaná zóna analytu nacházející se na počátku kapiláry se začne elektroforeticky separovat na základě rozdílné mobility. Stacking experimenty byly provedeny s modelovým vzorkem, 10-5 M směs GABA, Gly, Glu v 75% ACN s přídavkem 20 mm NaCl (vysoké zastoupení NaCl ve vzorku simuluje zředěný mikrodialyzát, současně Na + ionty mají význam vedoucího elektrolytu pro izotachoforetické zaostření aminokyselin do úzké zóny 6 ). Jako optimalizovaný BGE byla použita 4 M kyselina octová (ph 1.9), ve které nastává úplné oddělení Gly a Glu od ostatních aminokyselin v biologických materiálech 8. Z výsledků shrnutých do Tabulky I vyplývá, že výška píku analytu prakticky lineárně vzrůstá s délkou nadávkované zóny vzorku od 1.4% až do 98% z celkové délky kapiláry (experiment ukázal, že po naplnění 100% kapiláry vzorkem je vhodné na konec kapiláry nasát krátkou zónu BGE). Šířka píku analytu se s nadávkovanou délkou zóny prakticky nemění. Dále se ukázalo, že korigovaný migrační čas (skutečný migrační čas minus doba vytlačování) je vhodným parametrem pro popis elektromigrace, 228

231 protože je téměř nezávislý na dávkovaném množství. Korigovaný migrační čas dokládá, že aminokyseliny se od sebe začnou separovat až poté, co je vypuzen veškerý ACN a zaostřená zóna vzorku se nachází na počátku kapiláry (Obr. 1C). Výsledkem je zaostření zóny analytu (focusing) měřené jako podíl délky nadávkované zóny a šířky píku v detektoru dosahující při maximálním dávkování hodnot 96, 149 a 147 pro GABA, Gly a Glu. Ještě výrazněji je výhoda zavedeného prekoncentračního postupu patrna přímo při srovnání elektroferogramu směsi aminokyselin o koncentraci 10-5 M při běžném dávkování (1.4% délky kapiláry) a při vysokém dávkování rovném 98% délky kapiláry (Obr. 2). Pro dokumentaci vysoké citlivosti vyvinuté metodiky je na obrázku ukázána analýza této směsi při koncentraci 10-7 M. Dobu vytlačování ACN z kapiláry lze přesně monitorovat z časového průběhu elektrického proudu. Obr. 1 Proces zaostření vzorku: hydrodynamické dávkování (A), zaostřování vzorku elektrickým polem se současným vytlačováním ACN z kapiláry (B), finální zaostření zaostření vzorku po vytlačení ACN (C), CE separace (D). Barevné rozlišení: analyt (žlutě), ACN (červeně), BGE (modře). Tabulka I. Závislost separačních parametrů pro Gly na délce nadávkované zóny do kapiláry. Dávkování, % Korigovaný čas, s Výška píku, mv Plocha píku, mv.s Šířka píku, mm N 10-3, m -1 Zaostření zóny

232 Obr. 2. CE/C 4 D elektroferogram 10-5 M směsi GABA, Gly a Glu v 75% ACN s přídavkem 20 mm NaCl při dávkování 1.4% (A), 98% z délky kapiláry (B) a téže směsi o koncentraci 10-7 M při dávkování 98% (C). Závěr Přídavek ACN do klinických vzorků snižuje jejich vodivost a tím umožňuje provádět techniku large volume sample stacking. Na druhou stranu přítomnost ACN v kapiláře způsobuje přerušení elektrického proudu, prodlužování migračních časů a nestabilitu základní linie detektoru. V tomto příspěvku byl navržen nový postup pro ACN-stacking: po nadávkování dlouhé zóny vzorku s ACN je současně se separačním napětím aplikován hydrodynamický tlak. Výsledkem je zaostření zředěného analytu do úzké zóny a současné vytlačení balastního ACN ven z kapiláry. Navrženým postupem lze zvýšit citlivost stanovení asi o dva řády bez nežádoucího ovlivnění migrační času. Dosažené LODs pro CE/C 4 D stanovení aminokyselin se pohybují kolem 10-8 M a jsou plně srovnatelné s použitím vysoce citlivé CE/LIF, která ovšem vyžaduje derivatizaci vzorku a je pro mnohé laboratoře finančně nedostupná. Nová metodika byla úspěšně použita pro monitorování hladin neurotransmiterů v mikrodialyzátech centrálního nervového systému. Poděkování Práce vznikla za finanční podpory Grantové agentury Univerzity Karlovy (grant č ), Grantové agentury České republiky (projekt P206/10/1231) a UNCE Literatura 1. Guihen E., O'Connor W.T.: Electrophoresis 31, 55 (2010). 2. Bowser M.T., Kennedy R.T.: Electrophoresis 22, 3668 (2001). 3. Tuma P., Samcova E.: Chem. Listy 101, 200 (2007). 4. Kuban P., Hauser P.C.: Electrophoresis 34, 55 (2013). 5. Breadmore M.C., Shallan A.I., Rabanes H.R., Gstoettenmayr D., Keyon A.S.A., Gaspar A., Dawod M., Quirino J.P.: Electrophoresis 34, 29 (2013). 6. Shihabi Z.K.: Electrophoresis 23, 1612 (2002). 7. Tuma P., Soukupova M., Samcova E., Stulik K.: 30, 3436 (2009). 8. Tuma P., Malkova K., Samcova E., Stulik K.: J. Sep. Sci. 33, 2394 (2010). 230

233 Electrocatalysis in Proteins and Polyamino Acids Veronika Vargová a, Marko Zivanović a, Vlastimil Dorčák a, Veronika Ostatná a, and Emil Paleček a,b a Institute of Biophysics, AS CR, v.v.i., Královopolská 135, Brno, Czech Republic, vera.vargova@gmail.com b Masaryk Memorial Cancer Institute, Zluty kopec 7, Brno, Czech Republic Abstract Electrochemical methods are shown to be suitable for protein studies. To better understand the electrode processes, it is useful to follow protein electrochemical responses related to changes in amino acid composition, glycosylation, 3D conformation of proteins and environment. Polyamino acids (polylysine, polyarginine, and polyhistidine) as an intermediate model system between peptides and macromolecular proteins have been investigated to find how different amino acid residues contribute to the catalytic hydrogen evolution reaction at hanging mercury drop electrode. Key words: Constant current stripping, Catalytic hydrogen evolution, Proteins, Polyamino acids, Hanging mercury drop electrode. Introduction The opportunity to discover novel methods for protein study in biomedicine and proteomics is extremely challenging for existing protein analysis techniques. In electrochemical (EC) methods using small polarizable electrodes, interactions of surface-confined biomacromolecules, such as nucleic acids, proteins and carbohydrates (including mutual biomacromolecule interactions, electric field effects, etc.) can be studied. The advantages of EC applications in bioanalysis comprise simplicity, rapidity, easy miniaturization, low cost and the small amounts of protein required. In the last decades most electrochemists focused their attention to small group of redox-active center containing proteins offering fast reversible EC processes at solid electrode. Electrochemistry of the majority of proteins was thus neglected in the rapidly growing fields of biomedicine and proteomics. Already in 1930 polarographic presodium wave was discovered in J. Heyrovsky s laboratory, but this d.c. polarographic wave appeared too close to the background discharge and its shape was poorly developed and difficult to measure. Almost 15 years ago using constant-current chronopotentiometric stripping (CPS) analysis and Hg electrodes, well-developed peak of peptides and proteins was obtained in our laboratory 1. This peak, termed peak H, was due to the catalytic hydrogen evolution displaying sensitivity to local and global changes in protein structure 2-9. This peak was useful in the analysis of proteins at nanomolar and subnanomolar concentrations, including determination of metalloproteins in tissues 10, monitoring protein aggregation 5, 9 and denaturation 2, 4-7, DNA-protein interaction 1, including determination of DNA point mutations based on DNA interaction with DNA repair proteins. Excellent correlation between the structure of tumor suppressor p53 core domain, stability of oncogenic mutants and the CPS responses was observed 8. For better understanding of CPS peak H nature, including the role of individual types of amino acid (aa) residues and advantages and disadvantages of this peak in protein analysis, working with model systems is necessary. In the last years, some such studies were done but still more work with poly(aa), peptides and model proteins is required. Experimental All chemicals were purchase from Sigma-Aldrich in analytical grade. A three electrode cell was connected to a μautolab III potentiostat. The working electrode was a mercury drop (area: 0.4 mm 2 ) controlled by a VA-stand 663 (Metrohm), the counter electrode was a 231

234 platinum wire and a Ag AgCl 3 M KCl was used as the reference electrode. All experiments were carried out at room temperature open to air. In our experiments analyte was adsorbed at HMDE electrode from stirred solutions of poly(aa) at accumulation potentials, E A of -1.4 V for accumulation time, t A of 120 s in the background electrolyte (50 mm phosphate buffer, ph 6) followed by chronopotentiogram recording from initial potential, E i of -1.4 V to final potential, E f of -2.0 V at stripping current, I str of -30 µa. Results and discussion 40 μm poly(aa) (concentration related to monomer content) namely polylysine (polylys), polyarginine (polyarg) and polyhistidine (polyhis) were accumulated for accumulation time, t A 120 s at accumulation potential, E A -1.4 V 14 from 50 mm phosphate buffer, ph 6 at HMDE. Under these experimental conditions, well-defined CPS peaks H of given poly(aa) were observed. CPS polylys peak H is the most negative (peak potential, E p V) as compared to polyarg and polyhis. E p of polyarg is at V, whereby polyhis peak is by 100 mv less negative as polylys (Fig. 1). CPS peak H heights of different poly(aa) were not the same; peak H of polylys was the highest and polyarg the smallest one. A more detailed study of poly(aa)s is under way. A Fig. 1. A. CPS peak H of polyarg (dashed line), polylys (solid line) and polyhis (dotted line) in 50 mm phosphate, ph 6. B Scheme of dissociation of lysine, arginine and histidine. 232

235 Conclusion Earlier we found that, in agreement with the Brdicka s opinion 15, peptides not containing cysteine did not show any peak H at alkaline ph. Influence of cysteine in catalyses was verified in early works dealing with the peak H 11, 16, 17. Our experiments with poly(aa) showed that at ph 6.0 polylys and polyarg,trp produced peak H but polyglutamic acid did not 14. Recently, important role of Arg in catalysis of angiotensin peptides was reported; the effect of His residues appeared marginal under the given conditions 12. Our results (Fig. 1) point out that also His residues in poly(aa) behave as catalysts similar as Arg and Lys in weakly acidic or neutral environment. Further work with homo-peptides with well-defined length, without structure should be done for better understanding of the contribution of individual amino acids in the catalytic process. Acknowledgements This work was supported by the GACR S. References 1. Palecek E., Ostatna V.: Electroanalysis 19, 2383 (2007). 2. Ostatna V., Cernocka H., Palecek E.: J. Am. Chem. Soc. 132, 9408 (2010). 3. Ostatna V., Dogan B., Uslu B., Ozkan S., Palecek E.: J. Electroanal. Chem. 593, 172 (2006). 4. Ostatna V., Kuralay F., Trnkova L., Palecek E.: Electroanalysis 20, 1406 (2008). 5. Ostatna V., Palecek E.: Electrochim. Acta 53, 4014 (2008). 6. Palecek E., Ostatna V.: Chem. Commun., 1685 (2009). 7. Palecek E., Ostatna V.: Analyst 134, 2076 (2009). 8. Palecek E., Ostatna V., Cernocka H., Joerger A. C., Fersht A. R.: J. Am. Chem. Soc. 133, 7190 (2011). 9. Palecek E., Ostatna V., Masarik M., Bertoncini C. W., Jovin T. M.: Analyst 133, 76 (2008). 10. Kizek R., Trnkova L., Palecek E.: Anal. Chem. 73, 4801 (2001). 11. Doneux T., Dorcak V., Palecek E.: Langmuir 26, 1347 (2010). 12. Dorcak V., Ostatna V., Palecek E.: Electrochem. Commun. in press (2013). 13. Dorcak V., Palecek E.: Electroanalysis 19, 2405 (2007). 14. Zivanovic M., Aleksic M., Ostatna V., Doneux T., Palecek E.: Electroanalysis 22, 2064 (2010). 15. Brdicka R.: Bull. Int. Acad. Sci. Boheme 46 (1936). 16. Tomschik M., Havran L., Fojta M., Palecek E.: Electroanalysis 10, 403 (1998). 17. Dorcak V., Palecek E.: Anal. Chem. 81, 1543 (2009). 233

236 Novel Analytical Subject Matter: Cluster Compounds of Boron Radim Vespalec Institute of Biophysics, AS CR, v.v.i., Královopolská 135, Brno, Czech Republic Abstract Electron deficiency of boron allows the existence of chemical bond in which one electron pair binds three boron atoms. Such a three-center bond is electron deficient and planar in contrast to two-center bonds that are linear and electron exact or even electron rich. Due to these dissimilarities, and significance of chemical bonds for properties, capabilities and behavior of compounds, boron cluster compounds frequently differ unexpectedly and unpredictably from organic compounds. Just unique properties of boron cluster compounds underlie their practical prospects including the medical ones. Key words: Boron cluster compounds, Electron deficiency, Chirality, Analysis Introduction Fully synthetic cluster compounds of boron, cluster boranes, have been synthesized first in Their aimed use as rocked fuels made them scientifically attractive in However, cluster compounds of boron became the subject of standard scientific research only after declasification their research if their military attractivity extincted. Till now, subsequent research enriched theoretical chemistry and inorganic chemistry much more than everyday practice life of people. It may change the finding that boron cluster compounds have potential for curing HIV strains resistant to organic compounds 1. The existence preconditions There are two preconditions for existence of boron clusters, and compounds with such clusters: (i) electron deficiency of boron atoms, and (ii) tendency of boron atoms to mutual bonding. Their direct consequence is existence of the three-center two-electron bond between mutually bonded boron atoms, e.g., 2 and consequences of its differences from two-center two-electron bonds. Introduction to origins of analytically relevant properties The three-center two-electron bond (Fig. 1) is electron deficient, planar and rigid 2. Due to its planarity and rigidity, clusters with more than three boron atoms are three-dimensional. Structure of a cluster depends both on the numbers of its boron atoms and valence electrons that entered the cluster during synthesis. Various structural types of clusters exist from this reason. The lower is the number of electrons that entered a cluster during its synthesis; the more is the cluster closed and stabil. Cluster boranes are the simplest boron cluster compounds from the viewpoint of chemical composition. Their derivatives may be formally obtained either by substitution of boron atoms (endo-skeletal substitution) or by substitution of hydrogen atoms (exo-skeletal substitution). Almost any substitution deteriorates symmetry of cluster boranes 3. Absolute majority their derivatives is therefore structurally chiral. Chirality dominates among boron cluster compounds in contrast to organic compounds. In clusters, one three-center bond belongs to each boron atom. Total deficiency of valence electrons therefore increases with the number of boron atoms in general. Each cluster stabilizes by delocalization of bonding electrons present in individual bonds. Thus, these bonds extinct and clusters exist as ansambles of boron cations held together by a threedimensional cloud of electrons delocalized over the whole cluster volume. Such a delocalization cannot decrease the overall electron deficiency. For its decreasing, a boron cluster compound splits off one or two hydrogen atoms, which are bonded to its boron atoms by standard two-center bonds, as protons, and their valence electrons includes among 234

237 delocalized electrons. In this way, the compound turns to a cluster anion with sterical anionic charge. Electronegativity of hydrogen is higher than that of boron 4. Exo-skeletal hydrogen atoms therefore acquire partially hydridic nature. However, such a nature deteriorates their hydrogen bonding capability. Therefore, not only cluster boranes and their anions but their derivatives are frequently hydrophobic, too. Fig. 1. Scheme of the electron deficient three-center two-electron bond. Grey color indicates area in which bonding electrons occur in single three-center bond. Analytical research: state of the art Despite the fact that number of synthesized boron cluster compounds was estimated to 50,000 at the end of the past century, the number of purely analytical articles dealing with these compounds was below 50 at that time 3. It evidences that analytical chemistry of boron cluster compounds does not exist yet in fact. Fortunately, the number of articles containing analytically usable data is higher. For example, numerous electrochemical articles and articles containing electrochemical data published till 1984 was summarized into review 5. Majority of them presents half-wave potentials as supplementary characteristics measured for identification of newly synthesized compounds. Other electrochemically important aspects of electrode processes, e.g., reversibility and the exchanged electrons numbers, have not been investigated systematically. Due to frequent hydrophobicity of boron cluster species, polar organic solvents dominated above water in studies utilizing inert gold or platinum electrodes. The same holds for majority of electrochemical articles published later. Only low number of recent articles focuses to purely analytical tasks how the utilization of boron cluster compounds as electrochemical markers in DNA research is, e.g., 6. Conclusion The principal dissimilarity of boron cluster compounds and compounds containing only twocenter two electron bonds is caused by two causes: first, by dissimilarity of electron deficient three-center bonds, and electron exact or electron rich two-centre bonds, and, second, by the root importance of chemical bonds for all properties and behaviors of compounds. Analytical research of boron cluster compounds can be classified untouched field at present. It is opened for anyone who enjoyes dealing with novel topics attractive both scientifically and practically. 235

238 Acknowledgements This work was supported by Czech Science Foundation, grant No. P206/12/G151 and by institutional research plan AV0Z References 1. Cigler P., Kozisek M., Rezacova P., Brynda J., Otwinowski Z., Pokorna J., Plesek J., Gruner B., Doleckova-Maresova L., Masa M., Sedlacek J., Bodem J., Krausslich H. G., Kral V., Konvalinka J.: P Natl Acad Sci USA 102, (2005). 2. Williams R. E.: Chem. Rev. 92, 177, (1992). 3. Horáková H., Grüner, B. Vespalec, R.: Chirality 23, 307 (2011). 4. Linde D. R.(Ed.), Handbook of Chemistry and Physics, 77-th edition, CRC Press, Bocca Raton Morris, J.H., Gysling H. J., Reed D.: Chem. Rev. 85, 51, (1995). 6. Jelen F., Olejniczak A. B.,. Kouřilová A., Lesnikowski Z.J., Paleček E.: Anal. Chem. 81, 840 (2009). 236

239 Voltammetric Analysis of DNA Multiply Labeled with Anthraquinone and Nitro Tags (Voltametrické stanovení DNA značené antrachinonem a nitroskupinou současně) Pavlína Vidláková a, Jana Balintová b, Petra Ménová b, Luděk Havran a, Michal Hocek b, and Miroslav Fojta a a Institute of Biophysics, AS CR, v.v.i., Královopolská 135, Brno, Czech Republic, vidlakova@ibp.cz b Institute of Organic Chemistry and Biochemistry AS CR, v. v. i., Flemingovo nám. 2, Prague 6, Czech Republic Abstract Electrochemically labelled DNA can be prepared using primer extension with DNA polymerase and dntps bearing different electroactive groups. For primer extension and DNA labelling only one type of labelled dntps or a suitable combination of several types of labelled dntps simultaneously introduced in a DNA (oligonucleotide) molecule can be used. We tested the possibility of simultaneous detection of DNAs modified with the two types of electroactive tags anthraquinone and nitro group. Key words: DNA modification, Voltammetry, Anthraquinone, Nitro group. Úvod Přestože je přirozená DNA sama o sobě elektrochemicky aktivní a je možné ji stanovit na různých typech elektrod 1, je pro řadu analytických aplikací praktické použít DNA značenou elektroaktivními molekulami (například komplexy přechodných kovů 2,3, amino- nebo nitroskupinami 4,5, antrachinonem 6 apod.). Tyto látky podléhají redoxním reakcím a dávají takto modifikované DNA nové elektrochemické vlastnosti, které je možné využít pro studium struktury a interakcí nukleových kyselin a v oblasti DNA diagnostiky. Značenou DNA je možné připravit například inkorporací nukleotidů s kovalentně navázanými elektroaktivními skupinami s využitím DNA polymeráz nebo je možné využít koncové značení modifikovanými nukleotidy navázanými pomocí terminální transferázy. Experimentální část Nukleosidtrifosfáty modifikované antrachinonem a nitrofenylskupinou byly připraveny Sonogashira cross-coupling reakcí halogenovaných nukleosidtrifosfátů s N-(-2-propynyl)- antrachinoncarboamidem nebo 3-nitrofenylboronovou kyselinou. Inkorporace značených nukleosidtrifosfátů byla prováděna metodou prodlužování primeru (PEX). Pro separaci připravených oligonukleotidů byly používány magnetické mikročástice Dynabead MyOne streptavidin T1 (Invitrogen). Voltametrická měření byla prováděna metodou adsorptivní přenosové rozpouštěcí cyklické voltametrie (AdTS CV) na analyzátoru Autolab (Eco Chemie, Utrecht, The Netherlands) spojeném s VA-Stand 663 (Metrohm, Herisau, Switzerland) ve tříelektrodovém zapojení (Ag/AgCl/3 M KCl jako referentní elektroda, platinový drátek jako pomocná elektroda). Jako pracovní elektroda byla používána visící rtuťová kapková elektroda (HMDE). Měření bylo prováděno v inertní atmosféře argonu. Doba akumulace byla 60 s. Cyklická voltametrie (CV) na HMDE - základní elektrolyt 0,3 M mravenčan amonný, 0,05 M fosforečnan sodný, ph 6,9. Výsledky a diskuse Metodou PEX byly připraveny neznačené oligonukleotidy a oligonukleotidy značené antrachinonem a nitroskupinou buď samostatně, nebo jejich kombinací. Elektrochemické chování těchto oligonukleotidů bylo studováno pomocí CV na HMDE. V případě neznačených ODN jsou na voltamogramu měřeném při počátečním potenciálu 0.1 V 237

240 I/ A a potenciálu bodu obratu -1,85 V patrné dva signály odpovídající elektrochemickým reakcím bází. Jedná se o katodický pík CA při potenciálu okolo -1,5 V (příslušející ireverzibilní redukci cytosinu a adeninu) a anodický pík G při potenciálu -0,25 V (příslušející oxidaci 7,8-dihydrogenguaninu generovaného redukcí guaninu při potenciálech negativnějších než -1,6 V) 1. Na cyklickém voltamogramu měřeném s potenciálem bodu obratu -1,85 V ODN značeného antrachinonem je kromě signálů bází navíc katodický pík AQ red při potenciálu okolo -0,4 V (redukce antrachinonu na antrahydrochinon). V CV téhož ODN měřeném při potenciálu bodu obratu -1V je kromě píku AQ red i anodický pík AQH 2 ox (zpětná oxidace antrahydrochinonu) (Obr. 1). Intenzita píku AQH 2 ox závisí na potenciálu bodu obratu. Pík s nejvyšší intenzitou pozorujeme při potenciálech bodu obratu -0,6 - -1,2 V, při potenciálech zápornějších než -1,4 V výška píku prudce klesá a při potenciálech zápornějších než -1,6 V pík AQH 2 ox nepozorujeme G 0.16 AQH ox AQ red CA PEX s AQ ( E sw = V) PEX s AQ ( E sw = -1 V) neznačený PEX Obr. 1. AdTS CV oligonukleotidu značeného antrachinonem (plná čára) a neznačeného oligonukleotidu (přerušovaná čára) na HMDE, základní elektrolyt 0,3 M mravenčan amonný, 0,05 M fosforečnan sodný, ph 6,9, počáteční potenciál 0,1 V, potenciál obratu -1,85 V nebo -1,0 V. Na voltamogramu ODN značeného nitroskupinou jsou kromě píků CA a G katodický pík NO 2 red (čtyřelektronová redukce nitroskupiny na hydroxylamin) okolo -0,45 V. Na CV téhož oligonukleotidu měřeném při potenciálu bodu obratu -1 V je kromě píku NO 2 red i anodický pík NHOH ox (reverzibilní oxidace hydroxylaminu vzniklého předchozí redukcí nitroskupiny) okolo 0,0 V (Obr. 2). Stejně jako u píku AQH 2 ox je intenzita píku NHOH ox závislá na potenciálu bodu obratu a s negativnějším potenciálem klesá. Při potenciálu zápornějším než - 1,4 V pík AQH 2 ox na voltamogramu nepozorujeme. E/V 238

241 I/ A PEX s NO 2 ( E sw = -1 V) neznačený PEX PEX s NO 2 ( E sw = V) E/V Obr. 2. AdTS CV oligonukleotidu značeného nitroskupinou (plná čára) a neznačeného oligonukleotidu (přerušovaná čára) na HMDE, základní elektrolyt 0,3 M mravenčan amonný, 0,05 M fosforečnan sodný, ph 6,9, počáteční potenciál 0,1 V, potenciál obratu -1,85 V nebo -1,0 V. Metodou PEX byly připraveny i oligonukleotidy, které byly modifikovány antrachinonem i nitroskupinou současně v různém poměru. Na voltamogramech těchto oligonukleotidů je vidět, že vzhledem k velmi blízkým hodnotám redukčních potenciálů obou skupin jsou jejich katodické signály velmi obtížně rozlišitelné. Obě značky je však možno velmi snadno rozlišit díky příslušným anodickým signálům. Redukce nitroskupiny je ireverzibilní a neposkytuje tak žádný pík, který by interferoval s píkem AQH 2 ox. Produkt ireverzibilní redukce nitroskupiny navíc poskytuje oxidační signál NHOH ox, jehož potenciál se od potenciálu píku AQH 2 ox liší o cca 400 mv a tudíž se oba signály neovlivňují (Obr. 3). Intenzita píků AQH 2 ox a NHOH ox koresponduje s poměrným zastoupením antrachinonem a nitroskupinou modifikovaných bází v oligonukleotidu. Závěr V naší práci jsme studovali možnost současného stanovení nitroskupiny a antrachinonu pomocí CV na HMDE. Pro elektrochemické chování antrachinonu je charakteristická dvouelektronová redoxní přeměna chinon/hydrochinon, zatímco nitroskupina podléhá ireverzibilní čtyřelektronové redukci na hydroxylamin, který je možné následně reverzibilně oxidovat. Z našich výsledků vyplývá, že tyto značky je možné od sebe velmi dobře rozlišit. Pro současné sledování signálů obou značek i signálů odpovídajících redukci/oxidaci bází nukleových kyselin je možné použít dva následné potenciálové cykly, kdy první má potenciál bodu obratu mezi -0,7 a -1 V a druhý -1,85 V. Kombinaci obou značek je možné využít pro studium interakcí i struktury nukleových kyselin. 239

242 Obr. 3. AdTS CV oligonukleotidů značených antrachinonem a nitroskupinou v různém poměru na HMDE, základní elektrolyt 0,3 M mravenčan amonný, 0,05 M fosforečnan sodný, ph 6,9, počáteční potenciál 0,1 V, potenciál obratu -1,0 V. Poděkování Tato práce vznikla díky podpoře grantů GA ČR (P206/12/2378, P206/12/G151) a GA AV ČR (IAA ). Literatura 1. Palecek, E., Jelen, F.: In Electrochemistry of nucleic acids and proteins Towards electrochemical sensors for genomics and proteomics (Palecek, E., Scheller, F., Wang, J., ed.), pp , Elsevier, Amsterdam Fojta, M., Havran, L., Kizek, R., Billova, S., Palecek, E.: Biosens. Bioelectron. 20, 985 (2004). 3. Vrabel, M., Horakova, P., Pivonkova, H., Kalachova, L., Cernocka, H., Cahova, H., Pohl, R., Sebest, P., Havran, L., Hocek, M., Fojta, M.: Chem-Eur. J. 15, 1144 (2009). 4. Cahova H., Havran L., Brazdilová P., Pivonkova H., Pohl R., Fojta M., Hocek M.: Angew. Chem. Int. Ed. 47, 2059 (2008). 5. Horakova P., Cahova H., Pivonkova H., Spacek J., Havran L., Hocek M., Fojta M.: Org. Biomol. Chem. 9, 1366 (2011). 6. Balintova J., Pohl R., Horakova P., Vidlakova P., Havran L., Hocek M., Fojta M.: Chem- Eur. J. 17, (2011). 240

243 Electrophoretic Separation of Short Oligonucleotides from their Complexed Osmates (Elektroforetická separace krátkých oligonukleotidů od jejich komplexovaných osmátů) Lada Vítová and Radim Vespalec Institute of Biophysics, AS CR, v.v.i., Královopolská 135, Brno, Czech Republic, Abstract Capillary electrophoresis in free solution is a promising technique for separations of very short oligonucleotides. Separation potential of chosen separation system was checked by analyses of reaction mixtures in which bathophenanthrolinedisulfonic acid, neocuproine and N,N,N,N -tetramethylethylenediamine have been present as stabilizing ligands of AAAAT oligonucleotide osmate adduct. Various numbers of separated zones, and unexpected mobilities of some zones evidence that at least one supposed reaction step depends on chemical nature of the stabilizing ligand. Under the given conditions, N,N,N,N - tetramethylethylenediamine hardly acts as the osmate stabilizing ligand. Key words: Capillary electrophoresis; DNA; electroactive marker; oligonucleotide; osmate; osmium tetroxide. Úvod Elektroaktivní značky jsou účinným nástrojem studia struktury, strukturních změn, poruch i chemických modifikací nukleových kyselin i jejich fragmentů, viz např. 1. Velmi populární jsou značky získané derivatizací krátkých oligonukleotidů nebo oligodeoxynukleotidů kysličníkem osmičelým a stabilizované pro vodné prostředí aromatickými dusíkatými bázemi viz např. 2. Jejich elektroaktivním atomem je vždy osmium, někdy to však mohou být i další atomy. Vyšší stabilizační účinnost mají báze se dvěma stericky vhodně umístěnými atomy dusíku 3. Počet sloučenin zkoušených nebo navrhovaných ke stabilizaci vznikajících osmátů stále roste. Znalosti nutné pro optimalizaci přípravy značek s elektroaktivním atomem osmia i pro jejich využívání však přesto dosud nejsou vždy dostatečné. K nezbytným krokům při získávání chybějících znalostí vždy patří izolace reakčních produktů a často následovaná jejich identifikací. Očekávané reakční produkty jsou nabité. Vhodnou technikou potřebných analýz reakčních směsí je proto elektroforéza. Výběr separační techniky a separačního systému. Pro analýzy DNA a fragmentů DNA s hmotnostmi řádu desítek tisíc Daltonů a více jsou nezbytné trojrozměrné gely 4, které však nejsou schopny dělit fragmenty tvořené pouze několika málo nukleotidy. Tím méně jsou schopné oddělit takové fragmenty od jejich derivátů, které byly získány navázáním funkčních skupin a malých molekul. Pro elektroforetická dělení takových směsí je třeba použít separace ve volném roztoku. Jejich optimální variantou jsou separace v kapilárách 4. Separačním systémem kapilární elektroforézy ve volném roztoku je vždy křemenná kapilára naplněná základním elektrolytem. Pro vyloučení experimentálních obtíží a omezení, které působí kationtový elektroosmotický tok při separacích aniontů, byla zvolena kapilára, jejíž vnitřní povrch byl pokryt chemicky vázaným polyakrylamidem 5. Chemický charakter vzorků vyžaduje jako rozpouštědlo základního elektrolytu vodu. Pufrující složka základního elektrolytu, kyselina morfolinpropansulfonová (MOPS), byla nastavena na pracovní ph 7 morfolinem. Kationty morfolinu konkurují coulombické interakci kladně nabitých nukleových bází v oligonukleotidech s negativními náboji disociovaných silanolových skupin, které zůstávají na vnitřním povrchu křemenné kapiláry i po jejím pokrytí polyakrylamidem. Při ph 7 takovou interakci prakticky eliminují již při analytické koncentraci kyseliny 40 mm. 241

244 Experimentální část Hlavní součástí použité laboratorní sestavy byl spektrofotometrický detektor pro kapalinovou chromatografii Jasco 875 UV VIS (Jasco, Tokio, Japonsko) upravený pro práci s radiálně prosvěcovanými kapilárami, které jsou termostatovány kapalinou. Separované zóny byly detekovány při vlnové délce 260 nm. Odezvu detektoru monitorovala chromatografická stanice CSW 1,7 (Data Apex, Praha, Česká Republika). Vysokonapěťový zdroj Spellman CZE 1000R (Plainview, New York, USA) poskytoval napětí vkládané na separační kapiláru. MOPS a morfolin použité pro přípravu základního elektrolytu byly od firmy Sigma-Aldrich (Praha, Česká Republika). Dodané vzorky AAAAT i reakční směsi tohoto oligonukleotidu byly analyzovány bez předběžných úprav. Výsledky a diskuze Ve zvoleném separačním systému (křemenná kapilára světlosti 75 µm a separační délky 26 cm s vnitřním povrchem pokrytým chemicky vázaným lineárním polyakrylamidem 5, základní elektrolyt 40 mm MOPS nastavený morfolinem na ph 7) a při zvolených experimentálních podmínkách (kapilára termostatovaná kapalinou na 25 C, vkládané napětí 20 kv) rozlišení zóny oligodeoxynukleotidu AAAAT od zóny jeho pomaleji migrujícího osmátu, který je komplexován 2,2 bipyridinem, výrazně překračuje rozlišení nutné pro dokonalé oddělení dvou zón (záznam analýzy neuveden). Toto rozlišení, dosažené s kapilárou jejíž separační délka je pouhých pouhých 26 cm, je důsledkem vysoké selektivity separace způsobené především větším objemem komplexovaného derivátu ve srovnání s objemem výchozího oligonukleotidu. Obdobnou změnu velikosti reakčních produktů je možno očekávat při komplexaci osmátu AAAAT s jinými nízkomolekulárními sloučeninami. K ověření tohoto předpokladu sloužily tři sloučeniny považované za perspektivní ligandy: kyselina bathofenantrolindisulfonová, neokuproin and N,N,N,N -tetrametyletylendiamin. V reakčních směsích byly přítomny v koncentracích 0,2 mm, 0,5 mm nebo 1 mm. V těchže koncentracích byl do nich přidáván také kysličník osmičelý. Výsledky elektroforetických analýz reakčních směsí (obr. 1) tento předpoklad potvrzují. Výsledky analýz blízké očekávání byly získány při všech počátečních koncentracích kyseliny bathofenantrolindisulfonové (obr. 1a, záznamy č. 2, 3, a 4) a při nejvyšší koncentraci neokuproinu (obr. 1b, záznam 4). Záznam 1 je předběžnou analýzou výchozího oligonukleotidu AAAAT, který byl v reakční směsi vždy přítomen v koncentraci 0,08 mm. Mobility a tvary oddělených zón zobrazených při zmenšeném měřítku časové osy v analýzách 2, 3 a 4 v obr. 1a i 1b ukázaly, že počet reakčních produktů byl vždy vyšší než počet úplně oddělených zón. Tento počet závisel nejen na identitě ligandu, ale i na jeho počáteční koncentraci v reakční směsi, která rostla od záznamu 2 k záznamu 4. Současně zvyšovaná koncentrace kysličníku osmičelého nedovoluje připsat nalezené skutečnosti pouze vlivu ligandu. Výsledky analýz reakčních směsí s tetrametyletylendiaminem (obr. 1c) ukazují, že v těchto případech AAAAT není derivatizován očekávaným způsobem 3,4. Tuto sloučeninu nelze proto považovat za perspektivní ligand. 242

245 Obr. 1. Analýzy reakčních směsí. Detaily jsou uvedeny v textu. Závěr Separační systém navržený pro vzájemné separace oligodeoxynukleotidu AAAAT a jeho derivátu s kyselinou osmičelou, který je stabilizován komplexací s 2,2 bipyridinem, je vysoce selektivní. Je proto perspektivní pro separace zkoušeného typu a typů obdobných i pro dělení krátkých a velmi krátkých oligonukleotidů i deoxynukleotidů. Poděkování Práce vznikla s podporou centra excelence č. GAP 206/12/G151. Literatura 1. Fojta M.: V Electrochemistry of Nucleic Acids and Proteins. Towards Electrochemical Sensors for Genomics and Proteomics (Paleček E., Scheller F., Wang J., Eds.); Elsevier,. Amsterdam, 2005, p Fojta M., Kostečka P., Pivoňková H., Horáková P., Havran L.: Current Anal. Chem. 7, 35 (2011). 3. Criege R., Marchand B., Wannowius H.: Ann. der Chemie, 550, 8 (1941). 4. Khaledi M.G., High Performance Capillary Electrophoresis, Wiley, M. Vespalcová, D. Gregorová, J. Sep. Sci. 26, 729 (2003). 243

246 Deterministic and Stochastic Analysis of Organic Semiconductor Doping (Deterministická a fluktuační studie dopování organických polovodičů) Ryan M. West, Mira Josowicz, and Jiří Janata School of Chemistry and Biochemistry, Georgia Institute of Technology, Atlanta, GA , USA, jiri.janata@chemistry.gatech.edu Abstract Deterministic and stochastic evaluation of signal from insulated gate field-effect transistor with polyaniline gate is reported. It is shown that combination of these two modes of measurement offers deep insight into the mechanism of doping. The space-charge region of an organic semiconductor - insulator interface is probed and a model is proposed for local work function variations and spontaneous charge-carrier fluctuations within polyaniline films, with consequences for organic electronics using organic semiconductors, including solid state gas sensors. Key Words: Fluctuation analysis, Organic semiconductor, Field-effect transistors, Work function, Doping. Introduction Any variable describing a system at equilibrium contains two parts: its mean value and the fluctuating component. The former provides deterministic information while the dynamic information, i.e. kinetics can be obtained from the latter. Work function of an electronic material is its fundamental property. It is a key parameter in devices belonging to the category of organic electronics, including solid-state chemical sensors for gases. An absolute mean value of WF of a material cannot be measured, similar to the mean value of a single electrode potential. Only the difference of the two WFs is experimentally accessible. It corresponds to the energy required to remove a test charge, typically an electron, from the bulk of the electronic phase and place it outside the electrostatic field of the solid phase, in vacuum reference level. Unlike its electrochemical counterpart, the value of WF depends on the path through which the test charge has been removed, i.e. on the surface dipole as well as on the bulk affinity of the material. In this paper we focus on WF of the organic semiconductor polyaniline (PANI) and show that its mean value WF can be directly linked to the analytical concentration of the doping gas while the fluctuating part F(t) can provide insight into the actual mechanism of doping. WF(t) =WF +F(t) (1) Information from Deterministic Value of Work Function Vibrating capacitor, the Kelvin probe, is the most common instrument for measuring the experimental mean value of WF. Besides the material under study, it requires a reference plate against which the work function difference WF is measured 1. Thus the final value contains the contribution from the bulk affinity of the sample and of the reference plate as well as from the dipoles at both surfaces. An assumption needs to be made about the constancy of the reference plate contribution. Although it has been demonstrated for measurement of partial pressure of gases it is somewhat awkward to use Kelvin probe as a chemical sensor. On the other hand an insulated gate field-effect transistor (IGFET) is almost an ideal sensor 2. Bulk semiconductor from which the transistor is made, typically silicon, represents the reference plate. Its WF contribution is constant and the value of WF thus obtained relates only to the gate material. The functional relationship between the partial pressure of the doping gas P G and the transistor gate response V G is 244

247 * kt VG VG ln( PG Ki Pi ) (2) 2 G i The WF of the sensing material is included in the V G term. The product K i P i represents the contribution of interfering doping gases (K i is selectivity coefficient and P i is the partial pressure) and is the partial charge shared between the gate material and the dopant gas 3. Fig. 1. (A) Analytical (deterministic) response of the work function PANI-IGFET to ammonia in air. Different curves correspond to different content of ionic liquid forming the PANI gel4. (B) Fluctuation analysis of the PANI IGFET showing power spectral density (right) and smeared Lorentzian spectrum (left) of the fluctuating portion of the work function F(t). The corner frequency "f " and the broadness exponent c define the position and shape of the peak, respectively 7. Stochastic Evaluation of Fluctuating Value of Work Function The fluctuation-dissipation theorem states that a fluctuating variable D(t) equals the product of dissipative force M, absolute temperature T and the Boltzmann constant k D(t) MkT (3) Thus, a dynamic (fluctuating) variable at equilibrium can yield kinetic information about the system without external stimulation. This fundamental relationship of statistical mechanics has been used to study phenomena as diverse as critical opalescence, light scattering, the Nyquist noise in resistors, etc. In this work the equilibrium fluctuating value of drain current of silicon-based transistor with Polyaniline (PANI) gate has been studied. The transistor itself is a mere low noise, moderate gain amplifier that makes such measurement possible. Experimental Transistors with dual PANI gate and a chip housing eight PANI gate IGFETs were used for deterministic as well as for stochastic analysis. Experimental set-up for equilibrium deterministic 4 and fluctuation 5 analysis is described here only in the outline. The details can be found in the full papers. In order to minimize the extraneous noise, all stochastic experiments were done in a welded Faraday cage consisting of 3 mm thick walls with battery powered instruments. Such precautions were not necessary for the deterministic measurements. The gas doping was done by exposing the transistor with PANI gate to donor/acceptor gases of interest, in an enclosed compartment. The proton doping was done by controlled photolysis of phosphonium triflate salt. 245

248 Fig. 2. Effect of the threshold voltage V on (A) the corner frequency "f " and (B) on the broadness exponent "c" in the Lorentzian spectrum7. The shift of the threshold voltage is caused by the different concentration of the selected dopant: ammonia (NH3), dimethylamine (DMA) and proton generated photochemically from phosphonium triflate (PhT) 6. Results and Discussion An example of analytical (deterministic) response of PANI gate to ammonia gas (electron donor) according to Eq. 2 is shown in Fig. 1a. It is a typical reversible up-down response obtained from the mean value of the gate voltage 4. From such measurement a value of can be evaluated. No external perturbation is needed to record the stationary fluctuating variable F(t). Because the "noise" is additive, it is possible to dissect the source of fluctuations, layer by layer, into individual contributions, until the fluctuations from the sample are isolated. Therefore, the external radiofrequency noise and the background noise from auxiliary instrumentation and from the operation of the transistor of identical geometry are all factored out. The fluctuations of interest, the "excess noise F(t)", is then analyzed for its frequency content. An example of acquired fluctuation data is shown in Fig. 1b. There a 100 ms sample of fluctuating drain current is shown. Five thousand such segments are collected, examined for ergodicity and, through Fourier algorithm, the set is transformed to power spectrum and averaged (left curve) 7. By multiplication with frequency, the shape of the Lorentzian is obvious (right curve). L( f ) A f / f f S( f ) 1 ( f / f ) 2 The Lorentzian L(f) is product of frequency f and power spectral density S(f). It conveniently shows the corner frequency f, Lorentzian amplitude A, the 1/f noise amplitude B and the "broadness exponent" c. The latter is a fitting parameter allowing description of processes involving larger number of distributed frequencies. For a pure Lorentzian the c = 1. The peak frequency corresponds to the time constant of the slowest process causing the fluctuation, while the exponent c of the peak is related to the dispersion of dynamic processes involved in the fluctuation of F(t). Obviously, in order to gain further insight other experimental variables must be systematically changed. These were: (1). applied gate voltage that determines the depth of the space charge c B (4) 246

249 at the interface, (2). temperature, which confirms that the fluctuations are caused by the activated process, with an activating energy approximately 0.35 ev. The chemical doping with protons (primary doping) and doping with selected donor/acceptor gases (secondary doping) show the effect of chemical modulation of WF according to Eq. 2. The polarity of the dopant is clearly demonstrated (Fig. 2). Because the doping level relates to the probing depth, it is possible to conclude from these results that higher frequency sites involved in the n- doping (i.e. NH 3 and DMA) are localized farther away from the interface while the opposite is true for the p-doping (i.e. PhT). Such interactions are the underlying principle of WF-based chemical sensors for gases. Conclusions From these experiments it is possible to propose a model of dynamics modulation of WF in field-effect transistors with PANI gate (Fig. 3). It is very likely that such model applies to other organic semiconductors and their interaction with dopants as well 7. The concentration dependence of the mean value of WF extends over several decades of partial pressure, according to Eq. 2. It is therefore assumed that the majority of the deterministic signal originates in the bulk of the material. On the other hand the fluctuations of work function F(t) seem to have their origin in the space charge region of the insulator/pani interface and are dependent on the donacity of the dopant. They seem to be related to the stochastic filling charge traps near the interface as shown in Fig. 3 Fig. 3. The proposed model of random charge trapping in PANI IGFET, leading to fluctuations of work function. The silicon part of the transistor is shown on the left of the insulator while the PANI gate is shown on the right. In this diagram the transistor is shown on the left of the insulator while the PANI gate is shown on the right. In this diagram the transistor is shown in arbitrarily chosen state of zero electric field in the insulator (flat-band condition). Acknowledgment Support of this project from Georgia Research Alliance is greatly appreciated. References 1. Janata J. Josowicz M.: Anal.Chem. 69, 293A (1997). 2. Janata J.: Principles of Chemical Sensors, Springer, New York Janata J., Josowicz M.: J. Solid State Electrochem. 13, 41 (2009). 4. Saheb A., Josowicz M., Janata J.: Anal.Chem. 80, 4214 (2008). 5. West R.M., Watts C., Josowicz M., Janata J.: Coll.Czech.Chem.Commun. 76, 843 (2011). 6. Potje-Kamloth K., Polk B.J, Josowicz M., Janata J.: Chem. Materials 14, 2782 (2002). 7. West R.M, Josowicz M. Janata J., Phys. Chem. Chem. Phys. (2013), submitted. 247

250 The Use of the Conductometric Method for Indication of Damage Plant Tissues by Cadmium (Využití konduktometrické metody pro indikaci poškození rostlinných pletiv kadmiem) Brigita Zámečníková, Hana Vodičková, Daniela Miholová, Zorka Kotíková, and Jaromír Lachman Czech University of Life Science Prague, Department of Chemistry, Kamýcká 129, Prague 6, , Czech Republic, Abstract Conductometric determination of electrolyte leakage from plant parts was used in the experiment with young barley plants subjected to increasing doses of cadmium. Plants were grown hydroponically for three weeks, and then cadmium solution (CdCl 2 ), at concentrations of 10-5, 10-3, 10-2 mol/l, was added into root medium. After three days the effect of cadmium was observed as tissue damage by measuring of the electrical conductivity of the leakage electrolyte. It was found that at the concentration of 10-5 mol/l there was no significant damage of the membrane. At higher concentrations, however, the most damaged were roots, then the oldest leaves. The lowest damage was found for youngest leafs with not yet completed growth. Damaged parts of plants were affected by cadmium accumulation in different organs. Key words: Electrolyte leakage, Heavy metal, Barley. Úvod Rostliny jsou úzce vázány na okolní prostředí. Negativní působení toxických kovů na rostliny způsobuje stres. Stresové vlivy obecně působící na nízké úrovni způsobují vratné změny nebo na vyšší úrovni nevratné změny ve fyziologických pochodech 1, například nedostatek vody způsobí uzavírání průduchů, nízká teplota zpomaluje biochemické pochody. Nízká hladina toxických kovů, například kadmia, rovněž zpomaluje růst a ovlivňuje biochemické pochody. Síla stresu a doba působení může také vyvolat změny trvalého charakteru 1,2. Změny na membránách rostlinných buněk kromě působení toxických kovů nejvíce ovlivňuje vodní stres, změny teplot a mráz. Toxické působení kovů, například kadmia, může působit jeho kumulaci v pletivech, což ovlivní metabolismus rostliny, zejména fotosyntetický aparát 3. S vysokou hladinou stresu dochází až k poškození membrány. Porušení membrány při sledované koncentraci kadmia pak lze detekovat prostým výtokem obsahu buněk 4. Měření výtoku iontů je základem pro konduktometrickou metodu, kterou lze používat pro detekci poškození toxickými ionty, ale i při suchu a mrazu 5,6,7. Metodika Rostliny ječmene jarního byly naklíčeny na klíčidlech po dobu 5 dnů při 19 C a pak přesazeny a kultivovány v hydroponické kultuře s použitím modifikovaného Knopova živného roztoku. Třetí den po přesazení byly aplikovány dávky CdCl 2. 2,5 H 2 O v koncentraci 10-5 mol/l, devátý den po přesazení byly aplikovány dávky CdCl 2. 2,5 H 2 O v koncentraci 10-4 a 10-3 mol/l. Dvanáctý den bylo provedení měření výtoku elektrolytu z pletiv pomocí vodivostní elektrody a měřicího přístroje Conductometer Skála (Skála, Česká republika). U rostlin, které byly ve stádiu růstu třetího listu byly odebrány 100 mm dlouhé části kořenů ze střední části kořenového systému, u nejstaršího listu (1. list) a nejmladšího listu (3. list) byly odebrány vždy dva segmenty 100 mm dlouhé ve více opakováních. Tyto segmenty byly vloženy do zkumavek se 3 ml destilované vody, třepány horizontálně 150 cyklů za minutu při laboratorní teplotě 24 C po 30, 60 a po 90 minutách, kdy došlo k ustálení hodnot měřené vodivosti a následně po varu byla změřena opět vodivost roztoků. Vzhledem k tomu, že na řezných plochách listů i kořenů dochází k výtoku elektrolytu i u kontrolní varianty, je nutné 248

251 konečný výpočet pro index poškození (I t ) upravit dle Flinta 8, Prášila a Zámečníka 7 jako relativní vodivost a relativní poškození. I t = (R t - R 0 ) /(Rm-R 0 ), (1) kde I t = index poškození po působení kadmia; R 0 = relativní výtok elektrolytu kontrolní varianty bez působení kadmia vztažený k hodnotám po varu; R t = relativní výtok elektrolytu po působení kadmia vztažený k hodnotám po varu; R m = relativní výtok elektrolytu po působení maximální koncentrace kadmia vztažený k hodnotám po varu. V případě, že se hodnoty výtoku elektrolytu po působení vyšší koncentrace kadmia blíží hodnotám po varu, lze předpokládat, že R m = 1. I t (%)=(R t R 0 )/(1 R 0 ) (2) Výsledky a diskuse Již z našich předchozích pokusů (Obr. 1) lze vysledovat, že kumulace kadmia probíhá při nižší koncentraci méně intenzivně než při vyšší koncentraci. Zároveň je vidět, že více kadmia se kumuluje v kořenové části než v listové části. Hodnoty obsahu kadmia v listové části se zvyšují se zvyšováním kadmia přidaného do živného roztoku. Obr. 1. Stanovené obsahy kadmia v pletivech po kultivaci v kontrolním roztoku a v roztoku s CdCl 2. 2,5 H 2 O 10-5 a 10-4 mol/l. 249

252 Obr. 2. Relativní vodivost u jednotlivých variant po kultivaci v roztoku kontrolní a v roztoku s CdCl 2. 2,5 H 2 O, kontrola, 10-5, 10-3 a 10-2 mol/l. Obr. 3. Relativní index poškození u jednotlivých variant po kultivaci v roztoku kontrolní a v roztoku s CdCl 2. 2,5H 2 O, kontrola, 10-5, 10-3 a 10-2 mol/l. Sledujeme-li míru poškození při výtoku elektrolytu (obr. 2) a použijeme relativních hodnot pro konečné vyhodnocení (obr. 3), je vidět, že u nízké koncentrace 10-5 mol/l je tendence k poškození kořene, avšak neprůkazná statisticky, u vyšších koncentrací je pak průkazné poškození nejvyšší nejdříve u kořenů, pak u prvního listu a nejnižší poškození u třetího nebo druhého listu. V původní práci 8 je popsáno použití metody měření výtoku iontů z rostlinných pletiv, kde byla metoda vyzkoušena na více rostlinných druzích, a bylo zjištěno, že detekuje poškození membránového systému. Často je touto metodou hodnoceno působení mrazu 7 u obilovin, 250

253 autoři vyzkoušeli různou velikost, tvar a počet terčíků aby metodu optimalizovali pro pšenici. Dále pak řešili interpretaci výsledků jako vyjádření intenzity poškození vycházející z výpočtu relativních vodivostí. Jiná autorka 5 se pak zabývá poškozením membrán v podmínkách vodního stresu vyvolaném pomocí PEG (polyethylenglycol), podrobnější studií přechodu iontů ze symplastu do apoplastu a poté do vnějšího roztoku u ječmene, kde prokazuje vhodnost využití této metody. V další práci 3 je popsán účinek sníženého RWC na poškození membrány. Z hodnot indexu poškození pro kontrolní variantu (Obr. 2) vyplývá, že ionty mohou procházet i přes nepoškozenou membránu. Bylo zjištěno, že propustnost membrán souvisí také s antioxidační aktivitou daného pletiva. Pokud dojde k poškození membrán, jedná se o poškození především bílkovinných složek enzymů 9, může však docházet i k poškození a změnám strukturylipidů 10. Závěr Ověřili jsme vhodnost metody výtoku elektrolytu a konduktometrického měření z buněk pro hodnocení indexu poškození membrán u kořenů a listů mladých rostlin ječmene jarního kultivovaného v podmínkách stupňující se koncentrace kadmia. Se zvyšováním obsahu kadmia v rostlinách, roste také míra poškození membrán. Nejvíce jsou poškozeny kořeny, pak nejstarší listy a nejméně nejmladší listy. Z této práce je patrné, že metoda výtoku iontů je vhodná pro sledování poškození membrán. V návaznosti na získané výsledky, hodnoty indexu poškození po působení toxických kovů bude možné dát do korelace s parametry metabolických změn důležitých látek v rostlinném organismu, zejména dusíkatých sloučenin. Acknowledgment This research was supported by the Grant Agency of the Czech Republic GAČR (Project No.P208/12/1645). Přehled literatury 1. Selye H.:The stress of life. New York, McGraw-Hill Levit J.: Responses of plants to environmental stresses. AcademicPress, New York Kocheva K., Lambrev P., Georgiev G., Goltsev V., Karabaliev M.: Bioelectrochemistry 63,121(2004). 4. Dexter S. T., Tottingham W. E.,Graber. L.F.: Plant Physiol. 5, 215 (1930). 5. Kocheva K. V., Georgieva G. V., Kocheva V. K.:Physiol. Plant. 125, 1 (2005). 6. Bajji M., Kinet J. M., Lutts S.:Plant Growth Regul. 36, 61 (2001). 7. Prášil I., Zámečník J.:Environ. Exp. Bot. 40, 1 (1998). 8. Flint H. L., Boyce B. R., Beattie D. J.:Can. J. Plant Sci. 47, 229 (1967). 9. Azevedo H., Pinto C. G., Santos C.: J. Plant Nutr. 28, 2233 (2005). 10. Belkhadi A., Hediji H., Abbes Z., Nouairi I., Barhounmi Z., Zarrouk M., Chaibi W., Djebali W.: Environ. Safe. 73, 1004 (2010). 251

254 tel.: tel./fax: DETEKČNÍ SYSTÉM ÚNIKU ROPNÝCH LÁTEK AS-DETECTOIL Detekční zařízení určené ke zjišťování a monitorování přítomnosti ropných látek, olejů, apod. na hladině vody. Zařízení je certifikováno. Zařízení je využitelné zejm. v průmyslu (energetika, čističky odpadních vod, ap.), v odlučovačích ropných látek, v životním prostředí aj. jako kontrolní a bezpečnostní systém. POPIS ZAŘÍZENÍ Systém sestává ze sondy o rozměrech 70 x 70 x 30 mm, z vyhodnocovacího přístroje o rozměrech 220 x 50 x 150 mm (napájeného napětím 12 V akumulátor, trafo) a z výstupu pro instalaci signalizačního zařízení (zvonek, světlo) či pro napojení regulačního, záznamového a jiného systému. Zařízení umožňuje dlouhodobý, spolehlivý a bezúdržbový provoz, i v prostředí s nebezpečím výbuchu. Díky rozměrům sondy lze detektor instalovat např. i do vrtů nebo na odbočky z potrubí. TECHNICKÉ ÚDAJE připojením na síť 220/50 Hz; 3,5 ma; akumulátor nebo trafo; váha 1,9 kg 252

255 Potřebujete výkonnou a certifikovanou pracovní stanici? Potřebujete kompletní vybavení učeben? Potřebujete vybavit serverovnu? Nabízíme: desktopové jedno a dvouprocesorové certifikované pracovní stanice kvalitní LCD monitory s technologií IPS mobilní certifikované pracovní stanice servery a kompletní vybavení serveroven návrh a realizace poslucháren včetně veškerého vybavení kvalitní počítačové sítě od návrhu po realizaci projekční a interaktivní technologie velkoformátová tisková řešení Kontaktujte nás: CSF s.r.o., Střelecká 672, Hradec Králové, Tel , csf@csf.cz Preferred GOLD Partner HP Workstation Specialist Nejlepší TOSHIBA servis ve Střední Evropě 253

256 tel.: tel./fax: Osvědčený analyzátor do každé laboratoře, provozu i terénu, výzkumu i škol moderní, citlivý a široce využitelný s vlastními originálními US patenty, certifikovaný přístroj PC ECO - TRIBO voltametrický/polarografický analyzátor Metody Elektrody vysoká citlivost snadná automatizace ideální pro speciaci stolní nebo přenosná verze (připojení na stolní PC, laptop či notebook) verze pro DOS, Win 3.x, 9x, Me, 2000, XP DC a diferenční pulzní voltametrie (DCV a DPV), Cyklická voltametrie, DP a Tast polarografie Chronopotenciometrie s konstantním proudem Možnost návrhu vlastních metod podle potřeby uživatele Miniaturní tužková rtuťová Zlatá, uhlíková (pastová i filmová), stříbrná, měděná Pevné amalgamové stříbrná, zlatá, měděná (menisková, leštěná, filmová) Použití Pro ekoanalýzu (polarografii a voltametrii) ve vodách, v roztocích a v různých materiálech (podle ČSN, DIN apod.), v běžných podmínkách pro vysoké obsahy i pro stopové koncentrace až mol/l stanovení kovů (Pb, Cd, Zn, Cu, Fe, Ni, Al, Cr, Hg, As, Mn, Mo, Be), resp. většiny prvků Mendělejevovy tabulky stanovení aniontů (dusičnanů, dusitanů, Cl -, CN -, Br -, J -, SO 2-4, PO 3-4, S 2- ) sledování velkého množství org. látek a škodlivin (saponátů, herbicidů, pesticidů, insekticidů, nitrolátek, barviv, biologicky aktivních látek, surfaktantů atd.). Hodnocení stavu a stupně opotřebení motorů, ropných olejů a maziv v běžných podmínkách, bez demontáže Oblasti aplikací - dosud nejširší laboratorní, provozní, dílenská i terénní praxe vodohospodářství, ekologie, hygiena, zemědělství a potravinářství, medicína, farmacie, geologie, hutnictví, chemické a jiné průmyslové závody, výzkum, školství atd. Analýza všech druhů vod a vodných roztoků; odpadních vod, vod z galvanizoven, průsaků, skládek odpadů, výluhů půd; geologických vzorků; rud; popílků a prachu; zemědělských, chemických a farmaceutických vzorků; pokrytí ČSN a vyhl. na vody z asi 80 % atd. Samozřejmostí je bezplatná konzultace a předvedení systému. Poskytujeme komplexní, odborný i pogaranční servis, odbornou pomoc a vývoj analytických metodik. Celý systém je, pro svou jednoduchou obsluhu, vhodný pro výukové účely. 254

257 255

258 ISE sponsored Meeting 256