Vývoj folikulárních vln u říjících klisen Bakalářská práce

Transkript

1 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat Vývoj folikulárních vln u říjících klisen Bakalářská práce Vedoucí práce: doc. Ing. Petr Řezáč, CSc Vypracovala: Veronika Holeksová Brno

2 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Vývoj folikulárních vln u říjících klisen vypracovala samostatně a použila jen parametrů, které cituji a uvádím v příloze seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne.. podpis studenta.. 2

3 PODĚKOVÁNÍ Ráda bych především poděkovala svému školiteli doc. Řezáčovi, za odborné rady, trpělivost a připomínky a také za vedení mé bakalářské práce. 3

4 ABSTRAKT Bakalářská práce shrnuje poznatky o vývoji folikulů během estrálního cyklu klisen. Vývoj antrální folikulů klisen se vyznačuje pravidelným růstem folikulárních vln, které zahrnují výběr dominantního folikulu. Regulace folikulárních vln a folikulární výběr zahrnuje souhru mezi cirkulací gonadotropinů, ovariálních steroidů a folikulárních faktorů, které zajistí, že folikuly jsou správně stimulovány k růstu v jakémkoli stadiu vývoje růstové vlny folikulů. K vývoji folikulárních vln dochází během většiny postnatální život u koní. Znalost cyklických změn na vaječnících klisny je důležitá pro řízení reprodukce. ABSTRACT Bachelor thesis summarized the knowledge on the development of follicles during the estrous cycle in mares. Development of antral follicles in mares is characterized by the periodic growth of follicular waves which involve the selection of a dominant follicle. Regulation of follicular wave and follicle selection involves an interplay between circulating gonadotropins, ovarian steroids and follicular factors that ensures that follicles are properly stimulated to grow at any stage of follicular wave development. The development of follicular waves occurs during most of post-natal life in horses. The knowledge of cyclic changes on ovaries is important for the management of mare reproduction. 4

5 OBSAH 1 ÚVOD CÍL PRÁCE LITERÁRNÍ PŘEHLED Vývoj antrálních folikulů a folikulární vlny Charakteristika folikulárních vln Selekce folikulů Typy folikulárních vln Společná růstová fáze folikulů Regulace vývoje folikulárních vln Endokrinní regulace vývoje folikulárních vln Lokální regulace vývoje folikulárních vln IGF Systém Vliv různých fyziologických podmínek na vývoj ovariálních folikulů klisen Vliv sezony Hormony ovlivňující vliv sezóny Vliv stárnutí na folikulární aktivitu Srovnání koncentrace hormonů v krevním oběhu v průběhu vývoje folikulárních vln u klisen a žen ZÁVĚR SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY

6 1 ÚVOD Vztah člověka a koně je znám již od pradávna. Koně spoluvytvářeli dějiny světa a podíleli se na vývoji lidské společnosti. Nejstarším civilizacím poskytoval kůň potravu a suroviny, dokladem jsou kosterní nálezy a malby v jeskyních. Domestikace se uskutečnila čtyři až pět tisíc let před naším letopočtem u kočovných pasteveckých kmenů na území dnešní Ukrajiny, ve stepích kolem Černého a Kaspického moře a ve Střední Asii. Příčinou domestikace a později i jejím důsledkem bylo poznání člověka, že lze využít pohybových schopností koně. Kůň se stal posléze pro člověka užitečným a nepostradatelným pomocníkem v několika směrech. Nejprve byl zvířetem tažným a později se začal využívat jako jezdecký a soumarský (nošení nákladů). Základem jeho využití bylo jeho poskytování energie k vykonávání práce, čímž se lišil od chovu ostatních hospodářských zvířat. Význam chovu koní prošel mnoha historickými fázemi. Od využití ve vojenství a válečnictví přes použití v dopravě nákladů a osob nebo jako pracovní síly v zemědělství. Samotný vzhled a typ koně se postupně velmi měnil. Od těžkých, velkých a mohutných rytířských koní po lehké jezdecké. Jezdectví bylo považováno za záležitost bohatých a šlechty. Zasáhlo všechny generace. Pracovní koně nahradila technika, a proto se dnes koní chová o poznání méně. V současnosti využíváme koně pro relaxaci, hypoterapii nebo sport. Chov stále udržuje chovatelské tradice. Tohoto by však nebylo bez rození nových, zdravých hříbat a zvládnuté reprodukce jak klisen tak hřebců. Plodností samic se rozumí pravidelnost v oplození po předchozím páření a pravidelnost v porodech dobře vyvinutých a životaschopných mláďat v normálním počtu až do vysokého věku. Pokud budeme mít dost informací o reprodukčním cyklu a vývoji folikulů můžeme tento faktor chovu ovlivnit a přizpůsobit ho svým potřebám. U chovných klisen plnokrevníku kde je připouštění velmi drahou záležitostí, je obzvlášť důležité, aby klisna zabřezla hned po prvním připuštění nebo inseminaci. Přesným vyšetřením určíme dobu ovulace. U klisny po porodu nastává první říje asi do týdne. Hříbata se potom budou rodit brzo na jaře, tak jak to chovatel potřebuje. Rozmnožování a reprodukce je základem jakéhokoliv chovu a šlechtění. Při rozmnožování koní hrají hlavní roli změny na vaječnících. Tyto změny byly do roku 1920 neznámé. Hovořilo se pouze o měkkých folikulech na vaječnících. Dříve šlo zkoumat folikuly jen palpačně přes rektum nebo pitvou. K významnému posunu 6

7 ve výzkumu vývoje a růstu folikulů došlo až o 50 let později, kdy byl objeven ultrazvuk. V roce 1980 se ultrasonografie dostala do rukou i vědcům pracujícím s koňmi a došlo k markantnímu pokroku ve studiu změn na vaječnících. Hlavním přínosem byla možnost pozorovat aktuální stav a velikost folikulů. Koně mají poměrně velké folikuly, a proto se také používají jako modelová zvířata pro výzkum jiných druhů zvířat. V souvislosti s tímto se klisna stala i užitečným modelem pro studium pohlavních procesů u lidí. 7

8 2 CÍL PRÁCE Cílem bakalářské práce bylo shrnout formou literárního přehledu dosavadní poznatky o růstových vlnách ovariálních folikulů a jejich hormonální regulaci. 8

9 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Vývoj antrálních folikulů a folikulární vlny Ovariální folikuly vyvíjející se na vaječníku koní začínají tvořit dutinu, když dosáhnou velikosti přibližně 0,3 mm (Dirancourt et al., 1982). Podobně jako o preantrálních vývojových fázích, je jen málo známo o vývoji antrálních folikulů, než vyrostou na velikost cca 2 mm, tj. nejmenšího průměru, který může být detekován transrektální ultrasonografií. Bylo zaznamenáno, že růst folikulů koní v rozmezí od 0,1 do 1 mm trvá přibližně dva říjové cykly (Driancourt, 1979) a že během atrézie je tento jev vzácný (Ginther, 1992). Stejně jako u jiných druhů hospodářských zvířat a člověka, vývoj antrálních folikulů koní se vyznačuje periodickým růstem folikulů neboli folikulárními vlnami (Sirois et al. 1989; Bergfeld a Ginther, 1993). Folikulární vlny lze sledovat identifikací vývoje jednotlivých folikulů prostřednictvím denního vyšetření vaječníků ultrazvukem (Bergfeld a Ginther, 1993; Gastal et al., 1997) a použitím statistických metod, které nevyžadují, aby byla zachována identita jednotlivých folikulů při sériovém ultrazvukovém vyšetření (Bergfeld a Ginther, 1992; Donadeau a Ginther 2002b). Folikulární vlny u koní mohou být identifikovány u folikulů od velikosti 2 mm a větších. Dosud není známo, zda dřívější antrální a pre-antrální fáze probíhají také formou folikulárních vln. To je problém, který také nebyl vyjasněn i u jiných živočišných druhů (Mizunama at al., 1999; McGee a Hsueh, 2000) Charakteristika folikulárních vln Začátek vývoje folikulárních vln byl pro pokusné účely definován jako fáze, při které největší folikul v závislosti na studii dosáhne velikosti 6 nebo 13 mm (Ginter et al., 2003a). Identifikace začátku folikulární vlny obvykle vyžaduje denní vyšetření vaječníků ultrazvukem zpravidla po odsátí všech folikulů z předchozích vln. Folikulárních vln se zpočátku týká simultánní růst z proměnlivého počtu folikulů na běžnou rychlost 2 až 3 mm za den. Nedávná studie zahrnující odstranění všech folikulů v polovině říjového cyklu klisen ponyho ukázala, že do růstové vlny vstupuje v průměru asi 12 folikulů (Gastal et al., 2004). Zhruba dva folikuly se vynoří každý den během prvních 4 dnů po nástupu růstové vlny folikulů a potom se počet nově 9

10 vyvíjejících se folikulů výrazně snižuje. Přesný počet folikulů vznikajících v rámci vlny je ovlivněn vlivy jako je např. sezona (Donadeau a Ginther, 2003). Po počáteční fázi společného růstu folikulů následuje výběr jednoho folikulu (někdy i dvou folikulů), který se projeví jako odchylka velikosti dvou největších folikulů, kdy největší folikul dosáhne přibližně 22 mm (Ginter at al., 2003a). Tato odchylka je pozorovatelná v průměru od 7 dnů před ovulací a je charakterizována trvalým růstem (při nezměněné rychlosti) největšího folikulu označovaného jako dominantní folikul a současně zastavením růstu a následným zánikem menších, podřízených folikulů. Jakmile dosáhne velikosti přibližně mm, dominantní folikul buď ovuluje nebo přestane růst a začne zanikat, v závislosti na tom, zda dojde k preovulačnímu nárůstu luteinizačního hormonu (LH). Ustanovení dominance je zprostředkováno rozdílným zvýšením trofické podpory největšího folikulu. To vede k výrazným změnám ve funkci folikulárních buněk, které jsou nezbytné pro případné plné dozrání folikulů do stádia schopného ovulace a které se promítají do dramatických změn globální genové exprese, tedy změn, které byly charakterizovány u jiných druhů a to nejvíce u skotu (Sisco et al., 2003; Fayet et al., 2004; Mihm et al., 2008). Nezdá se, že je předem stanovena dominance mezi folikuly rostoucími ve folikulární vlně, protože studie, ve kterých byla prováděna ablace folikulů, prokázaly, že všechny folikuly mají podobnou schopnost stát se dominantními. Tato schopnost u podřízených folikulů zanikne přibližně 48 hodin po selekci dominantního folikulu (Gastal et al., 2004). Tyto studie také ukázaly, že přibližně u 61% růstových vln, folikul, který první dosáhne velikosti 6 mm, udržuje svou velikostní výhodu nad menšími folikuly po celou růstovou fázi a stává se dominantním. Pravděpodobnost, že se největší folikul stane dominantním, se zvětšuje s tím, jak se přibližuje očekávané velikosti na začátku selekce dominantního folikulu (Gastal et al., 2004). V málo případech se vývoj největšího folikulu zastaví nebo zpomalí během společné růstové fáze a je nahrazen druhým největším folikulem (někdy dokonce menším folikulem), který se pak stává dominantním folikulem Selekce folikulů Selekce folikulů u monoovulárních druhů je proces, kdy se pouze jeden folikul z folikulární vlny dále vyvíjí, pokračuje v růstu a ovuluje. Významný ultrazvukem identifikovatelný jev v průběhu folikulární vlny je pokračující růst a rozvoj 10

11 dominantního folikulu a omezený rozvoj ostatních (podřízených) folikulů (Ginther et al., 1997). Tomu předchází několik dnů společné růstové fáze. Během ní folikuly rostou v přibližně stejně rychle a každý folikul má schopnost pro budoucí dominanci (Gastal et al., 2004). Během společné růstové fáze žádný folikul nepůsobí dominantně, a to i přesto, že největší folikul většinou dosáhne kritické vývojové etapy a jako první se stává dominantním. V tomto ohledu se největší folikul v první folikulární vlně stal u koní z 60% dominantním (Gastal et al., 2004). Budoucí největší dominantní folikul se objeví dříve než v pořadí druhý největší folikul. U jalovice se průměry obou folikulů zvýší souběžně 16 hodin před koncem společné růstové fáze a menší folikuly rostou pomaleji (Ginther et al. 2001b). U klisniček má mnoho rostoucích folikulů schopnost stát se dominantním folikulem. Při zkoumání potenciálu jednotlivých folikulů stát se dominantním bylo v období odchylky rychlosti růstu dvou největších folikulů prokázáno, že tyto folikuly podléhají zániku podle jejich velikosti (Ginther et al., 2001b). Dominantní postavení bylo prokázáno u největšího folikulu po tomto období. Druhý největší folikul si uchovává schopnost dominance i pro další den po začátku odchylky. U klisen nejsou k dispozici důležité informace pro dominanci mezi folikuly na začátku odchylky. Ve studiích, které byly dosud provedeny, byly použity dva folikulární modely. Když byl největší folikul na začátku odchylky odstraněn, potom druhý největší folikul pokračoval v růstu bez přerušení (Gastal et al., 1999) a stal se dominantním a ovuloval u většiny klisen. Ve studii (Ginther et al., 2004) v níž všechny folikuly z poslední vlny byly zachovány byl největší folikul odstraněn 24 hodin po začátku odchylky a druhý největší folikul se obvykle nestal dominantním Typy folikulárních vln Folikulární vlny byly klasifikovány jako velké nebo malé vlny a to v závislosti na tom, zda zahrnují vývoj snadno identifikovatelného dominantního folikulu nebo pouze vývoj menších folikulů (Ginther, 1993; Donadeau a Ginther, 2002b). Počet folikulárních vln se během říjového cyklu liší mezi jednotlivými živočišnými druhy. U koní, podobně jako u lidí, se během cyklu vyvíjí jen jedna nebo dvě hlavní folikulární vlny (Ginther et al., 2004c). Hlavní folikulární vlna (pojmenovaná jako primární vlna) se vždy objeví v polovině říjového cyklu a tvoří ovulační folikul. Přibližně 11

12 25% interovulačních intervalů zahrnuje další velkou vlnu (sekundární vlnu), která se vyvíjí v průběhu první poloviny říjového cyklu (Sirois et al., 1989; Bergfeld a Ginter, 1993). Výskyt sekundárních vln je výrazně větší u některých plemen jako např. u plnokrevníků a některé z těchto vln mohou vést k ovulaci. Schopnost ovulovat v přítomnosti vysokých hladin progesteronu v diestru se zdá být charakteristická pro koně (Ginther, 1992). Malé vlny (folikuly jsou menší než 30 mm) byly identifikovány v různých fázích říjového cyklu a jejich výskyt byl uváděn jako nízký, 25% a méně říjových cyklů (Bergfeld a Ginther, 1993; Ginther, 1993) Společná růstová fáze folikulů Ovulační vlna u klisen vzniká uprostřed interovulačního intervalu den. Po jejím vzniku, se folikuly v rámci této vlny po několik dnů vyvíjejí ve společné růstové fázi (Ginther et al. 2001a, 2003). Společná růstová fáze začíná výraznou změnou v růstu folikulů, přičemž rozvíjející se dominantní folikul udržuje tempo růstu a zbývající folikuly (folikuly podřízené) rostou se sníženou intenzitou růstu a zanikají. Tento proces se nazývá odchylka a začíná, když dva největší folikuly dosáhnou průměru 22,5 a 19 mm. Budoucí dominantní folikul se v průměru objeví dříve než největší podřízený folikul. U jalovic se průměry dvou největších váčků zvětšily během 16 hodin před koncem společné růstové fáze a menší folikuly rostou pomaleji (Ginther et al. 2001b). U klisen byla vzájemným folikulárním vztahům během společné růstové fáze věnována malá pozornost. Dostupné informace jsou založeny na modelu dvou folikulů, kdy dva folikuly byly zachovány a další folikuly z dané vlny byly odstraněny (Gastal et al., 1997). Dva folikuly rostly souběžně, ale jejich interakce s menšími folikuly byly vyloučeny. U jalovic má mnoho folikulů z jedné vlny schopnost stát se dominantním folikulem. Potenciál jednotlivých folikulů stát se dominantním byl prokázán odstraněním různých folikulů podle velikosti (Ginther et al. 2001b). Hiearchická pozice byla prokázána u největšího ponechaného folikulu ve favorizované poloze pro dominanci. Kromě toho si druhý největší folikul zachovává schopnost pro dominanci asi do dalšího dne po začátku odchylky. U klisen informace o potenciálu pro dominanci mezi folikuly nejsou k dispozici. Ve studiích, které byly provedeny, bylo použito dvou folikulárních modelů. Když byl největší folikul odstraněn na očekávaném začátku 12

13 odchylky, druhý největší folikul pokračoval v růstu bez přerušení (Gastal et al. 1999) a stal se dominantním a ovuloval u většiny klisen. Ve studii (Ginther et al. 2004), v níž všechny folikuly byly zachovány, byl největší folikul odstraněn 24 hodin po začátku odchylky a druhý největší folikul se nestal dominantním. Nicméně, u druhého největšího folikulu došlo k injekčnímu odběru vzorku, což je postup, který může negativně ovlivnit jeho schopnost stát se dominantním. 3.2 Regulace vývoje folikulárních vln Zahájení folikulární vlny a následný výběr dominatního folikulu je pod precizně vyladěnou regulací prostřednictvím endokrinních mechanismů zahrnujících změny hladin gonadotropinů a místních mechanismů, které zahrnují změny hladin folikulárních faktorů Endokrinní regulace vývoje folikulárních vln Na rozdíl od preantrálních folikulů se antrální folikuly nemohou vyvíjet bez adekvátní gonadotropinové stimulace, což bylo experimentálně ověřeno u klisen (Pedersen et al., 2002; Imboden et al., 2006). Folikulární vlny u klisny stejně jako u jiných druhů jsou časově předcházeny stimulačním nárůstem FSH (Ginter et al., 2003a). Akutní závislost folikulárních vln na FSH byla prokázána u klisen, u nichž folikuly nad 15 mm nebyly schopny růst po potlačení hladiny FSH podáním folikulární tekutiny (Bergfeld a Ginther, 1985). Úzké vztahy mezi nárůstem FSH a folikulárními vlnami zahrnují nejen pozitivní vlivy FSH na folikuly, ale i negativní účinky folikulů na FSH. S folikulárními vlnami související vlna FSH dosahuje vrcholu, když má největší folikul průměr asi 13 mm (Gastal et al., 1997, Donadeau a Ginter, 2001). Následný pokles FSH vyplývá z nárůstu hladiny inhibinu a to pravděpodobně inhibinu-a (Watson a Al-ziabi. 2002), tvořeného především třemi největšími folikuly dané vlny, jak rostou nad 13 mm (Donadeau a Ginter 2001). Klesající koncentrace FSH i nadále podporuje růst folikulů z této vlny až největší (budoucí dominantní) folikul dosáhne očekávaného průměru na začátku selekce dominantního folikulu (přibližně 22 mm). V této době hladina cirkulujícího FSH dosáhne příliš nízkou úroveň pro udržení růstu folikulů dané folikulární vlny. Nízký FSH nicméně neomezuje růst budoucího dominantního folikulu, který do té doby získal schopnost efektivněji využívat kolující gonadotropiny pro svůj růst (Ginter et al., 13

14 2003a). Odlišná odezva největších a menších folikulů dané vlny ke gonadotropinům vede k výskytu odchylky průměrné velikosti folikulů. Průběžné potlačení FSH během odchylky vývoje folikulů zajišťuje morfologický a funkční zánik podřízených folikulů a odpovídá za produkci vysoké hladiny inhibinu a estradiolu dominantními folikuly (Gastal et al., 1999, Donadeau a Ginther, 2001). Klíčová úloha nízké hladiny FSH v mechanismu spojeném s odchylkou ve vývoji folikulů u klisen ilustruje přerušení mechanismu spojeného s touto odchylkou po podání FSH (Squires, 2006) či imunizace vůči inhibinu (McCue et al., 1992), což vede k vývoji vícečetných preovulačních folikulů. Zatímco FSH je zvláště důležitý pro růst folikulů před odchylkou ve vývoji folikulů, LH se stává kritickým v průběhu odchylky. To bylo demonstrováno ve studiích, které ukazují, že experimentální potlačení LH u cyklujících klisen vede k regresi dominantního folikulu v rané fázi jeho vývoje (Bergfelt et al., 2001) a je to v souladu s nárůstem LH v krevním oběhu před začátkem odchylky vývoje folikulů (Bergfelt at al., 2001). Studie o vzájemných vztazích LH a folikulů během anovulační sezóny odhalila přímý časový vztah mezi zvýšenou hladinou LH, ale ne FSH, a vývojem velkých vln, také indikuje, že zvýšení LH hraje hlavní roli při stimulaci vývoje dominantních folikulů (Donadeu a Watson, 2007). Další závěr byl, že cirkulující koncentrace LH nad výši požadovanou pro růst dominantního folikulu je potřebná pro vývoj ovulační způsobilosti, tj. aby dominantní folikul se stal zcela citlivým k LH vlně (Donadeu a Watson, 2007). Studie u skotu ukázaly, že exprese LH receptorů se odlišně zvyšuje v buňkách granulózy a thecy na začátku vývoje dominantního folikulu (Boa a Garverix, 1998, Beg a Ginther, 2006). Tato zjištění jsou v souladu s těmi u ostatních živočišných druhů (Richards, 2001). I když nebyla přesně zkoumána v souvislosti s počátkem odchylky vývoje folikulů, vyšší hladina LH receptorů byla uváděna u folikulů s dominantní velikosti, než u menších folikulů koně (Fay a Douglas, 1987; Gouder et al., 1999). Celkem vzato jsou u klisen zjištění o hladinách LH a expresi LH receptorů během folikulární vlny v souladu se závěrem, že odchylka ve vývoji folikulů zahrnuje kritické zvýšení závislosti dominantního folikulu na LH. Existují pouze omezené údaje o účasti jiných látek než gonadotropinů v endokrinní regulaci antrálních folikulů klisen. Na základě zjištěných přímých účinků na růst folikulů nebo na přítomnost specifických receptorů na vaječnících koní, byla 14

15 navržena pozitivní role cirkulujících hladin látek včetně růstového hormonu na růst folikulů (Cochran et al., 1999), dopaminu (King et al., 2005) a prolaktinu (Thompson et al., 1997). Ačkoliv u klisen folikulární inzulinu podobný růstový faktor-1 (IGF-1) z velké části pochází z krevního oběhu, je jeho bioaktivita regulována většinou přes místní mechanismy (Watson et al., 2004) Lokální regulace vývoje folikulárních vln Lokální regulace vývoje folikulů u druhů, u nichž ovuluje jeden folikul, byla intenzivně studována v souvislosti s výběrem folikulů (Fortune et al., 2004; Beg a Ginther, 2006; Kniha a Glister, 2006). Jsou do ní zapojeny různé proteiny a steroidní faktory včetně členů IGF rodiny, estradiol, inhibiny, aktiviny, folistatin a vaskulární endotelový růstový faktor (VEGF). Obecně platí, že tyto faktory působí často parakriním způsobem, aby buď zvýšily nebo snížily trofické účinky gonadotropinů na folikulární buňky prostřednictvím různých mechanismů. Odlišné změny hladiny specifických faktorů mezi folikuly tedy zajistí průběžný vývoj dominantního folikulu a regresi podřízených folikulů během odchylky ve vývoji folikulů. Skot a koně mají podobné folikulární vlastnosti během folikulární ovulační vlny, navzdory přibližně 2,5 krát většímu průměru folikulů u koní (Ginther et al., 2003). Na začátku výběru dominantního folikulu měří největší folikul u skotu 8,5 mm a u koní 22 mm a druhý největší folikul měří u skotu 7,2 mm a u koní 19 mm. Den před ovulací měří folikul u skotu asi 16 mm a u koní asi 40 mm. Relativní velikost folikulů celé ovulační vlny je podobná mezi klisnami a ženami (Ginther et al., 2004). Systémová endokrinní regulace folikulogeneze zahrnuje gonadotropiny ale i různé místně produkované hormony a růstové faktory podílející se na regulaci folikulogeneze (Fortune et al., 2004). Před začátkem výběru dominantního folikulu, intrafolikulární biochemické procesy zajistí budoucí dominanci vybraného folikulu. Mechanismus, který spouští biochemické děje není známý, ale nastává během postupného poklesu koncentrace cirkulujícího FSH a na začátku nárůstu luteinizačního hormonu (LH) (Ginther at al., 2003a, 2004b). Mezi intrafolikulárními faktory, které jsou kandidáty pro aktivaci výběru dominantního folikulu, patří inzulínu podobný růstový faktor (IGF), steroidy, inhibin-a, 15

16 aktivin-a, gonadotropinové receptory, angiogenní faktory a několik dalších intrafolikulárních faktorů (Armstrong a Webb, 1997; Berisha et al., 2003, Irsko et al., 2004). Nicméně jediné faktory, které se dočasně nebo funkčně podílí na výběru dominantního folikulu jsou IGF-1, estradiol a LH receptory. Rozdílné zvýšení hladiny estradiolu, IGF-1, aktivinu-a a inhibinu-a v budoucím dominantním folikulu bylo spojováno s počátkem odchylky ve vývoji folikulů klisen, zatímco rozdílné zvýšení hladiny progesteronu a inhibinu-b se vyskytlo později během vývoje dominantního folikulu (Donadeau a Ginther, 2002a). Studie zahrnující ošetření klisen nitrofolikulárním faktorem poskytla náhled na složité vztahy mezi těmito faktory v období odchylky ve vývoji folikulů (Ginther et al., 2005). Dospělo se k závěru, že ačkoli všechny tyto faktory jsou pravděpodobně zapojeny do vývoje dominantního folikulu po zahájení odchylky ve vývoji folikulů, pouze IGF-1 se podílí na zahájení odchylky ve vývoji folikulů mezi jinými aktivitami regulujícími hladiny dalších růstových faktorů u dominantního folikulu (Beg a Ginther, 2006). To je v souladu s obzvláště důležitou rolí IGF-1 při výběru folikulů u dalších živočisných druhů (Mazerbourg at al., 2003). Výsledky ze série in vitro experimentů přesvědčivě potvrdily klíčovou úlohu IGF v selekci folikulů u klisen. Injekce IGF-1 do druhého největšího nebo menšího folikulu na začátku odchylky ve vývoji folikulů změnila osud folikulu z podřízeného na současně dominantní, což vedlo k vývoji více preovulačních folikulů (Ginter et al., 2004a, b, Gastal et al., 2007). Naopak, injekce vazné bílkoviny pro IGF inzulínu podobny růstový faktor spojovací protein (IGFBP)-3 největšího folikulu na začátku odchylky ve vývoji folikulů měly za následek regresi folikulu a byly nahrazeny druhým největším folikulem, která se stal dominantním (Ginter et al., 2004a). Ve folikulech koní byly zjištěny nejméně čtyři typy IGFBP (IGFBP-2,3,4 a 5), které negativně ovlivňují aktivitu IGF a koncentrace tří z nich (IGFBP-2,4 a 5), negativně korelují s koncentrací IGF-1 během vývoje folikulů (Gepard a Monget, 1998, Bridges et al., 2002). V souladu se stimulační rolí IGF-1 ve vývoji ovulačních folikulů a sníženou hladinou bioaktivního IGF-1 se lze domnívat, že je zapojen do vývojové nedostatečnosti dominantních folikulů během jarního přechodného období, které jim brání v získání schopnosti ovulovat (Acosta et al., 2004, Watson et al., 2004). Další faktor, který se začal zkoumat ve vztahu k selekci folikulů u koní, je VEGF (vaskulární endotelový růstový faktor). Tento angiogenní faktor se ukázal jako nezbytný pro vývoj folikulů u jiných druhů (Fraser a Wulff, 2001). Hladina VEGF 16

17 se rozdílně zvyšuje v dominantním folikulu koní (Ginther et al., 2004b) a tento nárůst může být zprostředkován, alespoň částečně, pomocí IGF-1. VEGF je pravděpodobně zapojen do zvětšení vaskularizace budoucího dominantního folikulu před začátkem odchylky ve vývoji folikulů (Acoste el al., 2004), která pravděpodobně zvyšuje dostupnost cirkulujících gonadotropinů pro folikuly. Snížená hladina folikulárního VEGF a malá vaskularizace stěny dominantních folikulů během jarního přechodného období (Watson a Al-ziabi, 2002) zdůrazňuje zásadní roli VEGF ve vývoji ovulačních folikulů u koní IGF Systém Systém IGF obsahuje IGF-I a-ii, IGFBPs a IGFBP proteázy (Spicer, 2004). IGF- I stimuluje granulózní buňky, gonadotropiny slouží k podpoře diferenciace folikulárních buněk (Spicer a Echternkamp, 1995). In vitro účinky IGF-I u skotu zvýšily dělení granulozních buněk a produkci estradiolu (Glister et al., 2001) a lepší citlivost granulozních buněk k FSH (Monget a Monniaux, 1995, Spices a Echternkamp, 1995), zvýšenou sekreci inhibinu-a, aktivinu-a a folistatinu z granulozních buněk (Glister et al., 2001) a zvýšenou syntézu androgenů (Steward et al., 1995). Výsledky mnoha studií jsou kompatibilní s úlohou IGF systému při výběru dominantního folikulu, ale zdá se alespoň částečně nejasná z následujících důvodů: (1) referenční bod nesouvisel se začátkem výběru dominantního folikulu (Mihn et al., 1997, Spiecer et al., 1995); (2) rozdíl změn mezi prvním největším folikulem a druhým největším folikulem začal na začátku výběru dominantního folikulu, spíše než před jeho začátkem (Beg et al., 2001, Ginther et al., 2003a). U skotu se v největším folikulu koncentrace volného IGF-1 nezvyšuje ve fázi výběru dominantního folikulu, ale začne klesat před tímto obdobím ve druhém největším folikulu (Beg et al., 2002). To znamená, že do diferenciace mezi objemy folikuly je zapojeno snížení koncentrace IGF-1 ve druhém největším folikulu. Lze předpokládat, že snížení koncentrace IGF-1 ve druhém největším folikulu způsobuje dominanci největšího folikulu. Zvýšení volného IGF-1 v největším folikulu v tomto období bylo pozorováno i v další studii (Riviera a Fortune, 2003). U koní koncentrace volného IGF-1 roste v budoucím dominantním folikulu před začátkem odchylky (Donadeau a Ginther, 2002). 17

18 3.3 Vliv různých fyziologických podmínek na vývoj ovariálních folikulů klisen Vliv sezony Klisny jsou sezóně polyestrické, s maximální ovulační aktivitou během dlouhých dnů (ovulační sezóna) a minimální aktivitou během krátkých dnů (anovulační sezóna). Uprostřed anovulační sezóny, mohou být přítomny pouze malé folikuly (>15 mm průměru). Folikuly rostou během posledních 2 až 3 měsíců v anovulačním období nebo přechodném období. Jejich vývoj kulminuje v rozvoji ovulačních folikulů (Ginther, 1992). U klisen v přechodném období se může někdy rozvíjet několik velkých (>30mm) anovulačních folikulů, které pravděpodobně předchází vývoji ovulačního folikulu (Ginther 1990, Watson et al., 2002). Účinky sezóny na folikulární aktivitu byly u klisen studovány velmi podrobně. K důležitým změnám ve folikulární aktivitě nedochází jen mezi ovulačním a anovulačním obdobím, ale také mezi různými obdobími v rámci každého ročního období. Studie na klisnách poníků používající ablaci folikulů s cílem usnadnit identifikaci jednotlivých folikulárních vln odhalila, že podobně jako v průběhu ovulační sezóny, se folikulární vlny periodicky vyskytují i v průběhu anovulační sezóny a to i přes to, že je snížena hladina vývoje folikulů (Donadeau a Ginther, 2002b, Ginther et al., 2003b). Pouze menší vlny (největší folikul je menší než 21 mm) se vyskytly uprostřed anovulační sezóny nebo hlubokého anestru, zatímco hlavní vlny byly často zjištěny během prvních dvou měsíců podzimního přechodného období a během posledních dvou měsíců jarního přechodného období (Ginther, 1990, Watson et al., 2002). Počátek jarního přechodného období zahrnoval prudký nárůst folikulární aktivity v porovnání s nízkou aktivitou typickou pro hluboký anestrus, což se odráželo v rozdílném zvětšení průměru folikulů a nejvýrazněji čtyřnásobným zvýšením počtu folikulů větších než 12 mm v rámci folikulárních vln (v průměru 3,2 až 11,5 folikulu ve folikulárních vlnách vyvíjejících se v období hlubokého anestru a na začátku jarního přechodového období). Ačkoli dominantní folikuly během přechodového období nemohou růst do průměru typického pro ovulační folikul, folikulární vlny v přechodovém období produkovaly více folikulů než vlny během ovulačního období (v průměru 11,5 a 6 folikulů větších než 12 mm) potvrzuje vysokou úroveň folikulární 18

19 aktivity dokonce i při absenci ovulace v přechodném období (Donadeau a Ginther 2003). Na základě shodných časových vztahů mezi folikuly a hormony cirkulujícími v krevním oběhu byl učiněn závěr, že rozdíly ve vývoji folikulů v různých obdobích anovulační sezóny, jakož i nedostatečný vývoj dominantních folikulů v průběhu jarního přechodného období nebyly přisuzovány k nedostatečné hladině cirkulujícího FSH, ale spíše ke změnám hladiny LH, a případně rozdílů v citlivosti folikulů na gonadotropiny (Donadeau a Watson, 2007). Se sezónou spojené vlivy na folikulární aktivitu byly také hlášeny mezi oběmi polovinami ovulačního období, s vyšší úrovní aktivity v průběhu první poloviny ovulační sezóny kvůli vyššímu výskytu sekundárních a malých vln spojených s vyšší hladinou gonadotropinů (Ginther, 1992, 1993) Hormony ovlivňující vliv sezóny Klisna je sezóně polyestrická, v přírozené plemenitbě trvá sezóna od května do října (Ginther 1974). Rozdíly v podílu a typu hypofizálního gonadotropinu byly popsány mezi ovulujícími a neovulujícími klisnami (Eagle and Tortonese, 2000). Nicméně hypofifální koncentrace FSH se neliší mezi ovulační a anovulační sezónou (Silvia et al., 1986). Průměrné FSH koncentrace (Freedman et al., 1979; Turner et al., 1979; Hines et al., 1991) a pulzy amplitudy (Hines et al., 1991) byly vysoké v polovině anovulačního období a snížené během posledních 60 dnů sezóny s výraznějším poklesem během posledních 20 dnů sezóny (Freedman et al., 1979). Během posledních 60 dnů poklesu v průměrné FSH koncentraci, folikuly rostly na stále větší střední průměr (Freedman et al., 1979). Rázy FSH jsou spojeny se vznikem folikulární vlny během ovulačního období (Ginther and Bergfelt, 1993) a byly zjištěny v průběhu ranného vývoje velkých (>30 mm) anovulačních folikulů během konce přechodu (Ginther, 1992; Watson et al., 2002). Ve studii ve které byly vzorky odebírány každých 6 hodin, průměrné denní koncentrace FSH byly kvalitativně ale ne kvantitativně podobné mezi posledními říjovými cykly a srovnatelné období po poslední ovulaci sezóny (Irvine et al., 2000); rozdíl mezi maximální a největší hodnotou byl snížen po poslední ovulaci. Plazmatické koncentrace FSH a počty folikulů se výrazně nelišily 31 dnů periody po předposlední ovulaci a stejného období po poslední ovulaci (Snyder 19

20 et al., 1979). Bylo zjištěno, že počet folikulů a koncentrace FSH se pravděpodobně nepodílely na ukončení ovulační sezóny. Během zimního anestru je osa hypothalamus-hypofýza v podstatě nefunkční. GnRH sekrece je výrazně snížená možná přes dopaminergní inhibici (Besognet et al., 1996) a hypofýza nedokáže uvolnit potřebné množství gonadotropinu (Hart et al., 1984). V hypofýze je obsah LH nízký, ale FSH obsah se nemění. V reakci na nízkou koncentraci cirkulujících gonadotropinů během zimního anestru mají klisny malé, tvrdé vaječníky. V jarním přechodu folikuly zpočátku rostou a vracejí se do původního stavu, ale nemají více jak 35 mm v průměru (Ginther, 1990). U mnoha klisen vývoj vln anovulačních folikulů může pokračovat charakteristickým sériovým růstem a regresí velkých (nad 38 mm) dominantních folikulů. Pokud se ve vaječnících vyvíjí dominantní estrogenní folikul, vysoká koncentrace cirkulujícího estradiolu vyvolává zvýšenou syntézu a sekreci GnRH (Sharp et al., 2001). To má za následek spuštění LH v dostatečném množství k vyvolání ovulace (Sharp et al., 1991). Inhibin je důležitý při sekreci FSH a folikulárním růstu u klisen (McCue et al., 1992, Nambo et al., 1998). Mnoho studií uvádí cirkulující koncentraci imunoreaktivního inhibinu v cyklu klisny (Bergfeld et al., 1991, Nagamine et al., 1998). Tyto testy nerozlišují mezi biologicky aktivní formou inhibinu a volnou monomerní dílčí jednotkou, u kterého se lze domnívat, že není biologicky aktivní a může bránit působení FSH na granulozní buňky vyblokováním jeho vazby na FSH receptory (Schneyer et al., 1991). Časové vztahy mezi deními změnami v koncentraci cirkulujícího inhibinu a koncentrací FSH a folikulárním průměrem byly hlášeny u ovulačního období (Donadeu and Ginther, 2001; Bergfelt et al., 2001) ale né v různých fázích anovulační sezóny. V dané studii (Watson et al., 2002), průměrné plazmatické koncentrace inhibinu A a inhibinové izoformy obsahující pro-a-ac byla vyší v průběhu rozvoje velkých přechpodných folikulů (25-40mm), než během zimy, kdy byly přítomny pouze malé folikuly. U hřebce byly koncentrace inhibinu v zimě nižší a nejvyší v letním období (Roser et al., 1994; Nagata et al., 1998). Přes rozdíly ve folikulární činnosti mezi anovulačním obdobím a přechodným obdobím před první ovulací, hladina FSH spojená s folikulární vlnou se v tomto období nelišila koncentrací FSH (Donadeu and Ginther, 2002, 2003). Tyto výsledky ukazují, že jiné faktory než vlastní hladina FSH jsou důvodem pro zvýšení folikulární odpovědi při přechodu do ovulačního období na jaře. Zdá se, že neexistují žádná studie o vlně a fenoménu 20

21 odchylky a související s hladinou FSH během přechodu do anovulační sezóny na podzim. Na rozdíl od FSH, znamenají hypofizální (Silvia et al., 1986) a cirkulující (Oxender et al., 1977; Freedman et al., 1979; Fitzgerald et al., 1987; Alexander and Irvine, 1991) koncentrace LH jsou minimální po většinu roku anovulační sezony a zvláště před první ovulací roku. Zvýšení frekvence pulzačního vylučování LH a pokles amplitudy pulsu LH probíhá po celé období transformace do ovulačního období (Fitzgerald et al., 1987). Nedostatečný preovulační nárůst LH a finální růst preovulačních folikulů je důvodem pro absenci ovulace u nástupu anovulační sezóny (Snyderet al.,1979). Podobně v další studii byla neschopnost ovulovat na podzim spojena s nedostatečným nebo chybějícím množstvím LH (Irvine et al., 2000; Nequin et al., 2000) Vliv stárnutí na folikulární aktivitu Mnoho změn souvisejících s věkem ve folikulární aktivitě koní připomínají ty, které se vyskytují u člověka (Carnevale, 2008). Folikulární vlny, vyznačující se současným vznikem a růstem skupiny folikulů byly prokázány u klisen během ovulačního období a březosti (Bergfelt and Ginther, 1992, 1993) a během poslední fáze anovulační sezóny (Donadeu and Ginther, 2002, 2003). Folikulární aktivita během říjových cyklů začíná klesat u klisen ve věku 20 let a starších a dokonce vede i k zastavení aktivity vaječníků (Carnevale et al., 1993, 1994). Interovulační intervaly se nejprve u těchto klisen prodlužují kvůli delší folikulární fázi spojené s primární folikulární vlnou, která se objevuje později a obsahuje méně folikulů. Kromě toho je u starších klisen preovulační vlna LH méně výrazná a je vyšší výskyt atypických ovulací charakteristických centrální hypoechogenní oblastí v ovulačním místě při ultrazvukovém vyšetření. Snížení folikulární aktivity a frekvence ovulací u klisen nad 20 let spojena s celkovým zvýšením koncentrací FSH a LH v průběhu folikulární fáze, což je jev, který se vyskytuje v období kolem menopauzy žen. To je možná spojeno s přetrvávající ovariální nečinností folikulů menších než 5 mm neovulujících v přítomnosti trvale zvýšené hladiny FSH a LH. Údajně přibližně 40 % koní ve věku 24 let nebo starších neprojevuje ovariální aktivitu (Vanderwall, 1990). Rovněž 50 % poníků ve věku 20 let a starších neovuluje nebo má nepravidelnou ovulaci (Carnevale et 21

22 al., 1994). Bylo navrženo, že s věkem spojená vyšší koncentrace FSH může urychlit vyčerpání zásoby primordiálních folikulů u starších klisen, podobně jak se toto vyskytuje u žen (Carbevale, 2008). Rozdíly folikulární aktivity související s věkem byly zjištěny také u klisen v jarním přechodném období, během něhož se postupně snižoval průměr a počet folikulů nalezený u klisen ve věku 3-7 let, let a nad 20 let (Carnevale et al., 1997). 3.4 Srovnání koncentrace hormonů v krevním oběhu v průběhu vývoje folikulárních vln u klisen a žen Koně (Ginther et al., 2004c) a lidé (Berwald et al., 2003, Ginther et al., 2004c) mají k dispozici účinný folikulární výběrový mechanismus, takže obvykle pouze jeden folikul z folikulární vlny se stává dominantním a ovuluje. Anovulační folikulární vlny probíhají také u obou druhů a jsou definovány jako hlavní vlny, když se vyvíjí dominantní folikul a minoritní (sekundární) vlny, když se dominantní folikul nevyvíjí. K významnému výběru během hlavní vlny dochází na konci běžné růstové fáze a je charakterizován odchylkou nebo změnou v růstu mezi vyvíjejícím se dominantním folikulem a zbývajícími (podřízenými) folikuly ( Ginther at al., 2004c). Průměrný dominantní folikul se objeví (u klisny, 13,0 mm, ženy, 6,0 mm) a požadovaný minimální průměr k posouzení folikulu (klisna, 17,0 mm, ženy 8,0 mm), byly vybrány aby stimulovaly poměr mezi těmito dvěma druhy ve vykázaném středním průměru budoucího dominantního folikulu na začátku odchylky (klisny 22,0 mm, ženy 10,5 mm). V rámci každého druhu budoucí největší podřízený folikul se objeví po budoucím dominantním folikulu a tento růst budoucího největšího dominantního folikulu a budoucího největšího podřízeného folikulu byl podobný v průběhu společné růstové fáze. Délka intervalu mezi vznikem těchto dvou folikulů, délka intervalu od vzniku folikulů do odchylky (3 dny) a rychlost růstu za den byly obdobné u obou druhů. Proporcionalita mezi jednotlivými druhy směrem k od odchylky (2,2 krát větší pro klisny než u ženy) a na minimální neovulační průměr (2,1 krát větší, 44,8 mm oproti 21,8 mm) uvádí, že relativní růst budoucího dominantního folikulu po odchylce byl také podobný mezi oběma druhy. Výskytu hlavní anovulační vlny přechází ovulační vlna, která se neliší mezi oběma druhy. Podobná folikulární dynamika mezi klisnami a 22

23 ženami dokazuje, že klisna může být užitečný experimentální model folikulogeneze u žen. Dostupné informace o vztazích cirkulujících gonadotropinů během folikulární vlny byly prozkoumány u klisen (Ginther et al., 2004) a žen (Železník, 2001, Fauser a van Heusden, 1997). U klisen vlny stimuluje folikuly stimulující hormon (FSH), jehož hladina dosahuje maximální koncentrace při průměru největšího folikulu 13 mm. Odchylka rychlosti růstu dvou největších folikulů začíná v době, kdy koncentrace FSH klesá. Pokles FSH je nezbytný pro vyvolání odchylky rychlosti růstu dvou největších folikulů, jak je indikováno v rozvoji několika dominantních folikulů po podání FSH nebo anti-inhibinu. Mezi vrcholem nárůstu FSH a začátkem odchylky všechny folikulární vlny přispívají k FSH poklesu. Koncentrace FSH nadále klesá po odchylce a nezačne se zvyšovat až do dne ovulace. U žen časová asociace mezi odchylkou rychlosti růstu dvou největších folikulů a cirkulující koncentrací hormonů nebyla dobře definována, protože chyběl dostatek informací souvisejících s folikulárním průměrem. Ve studii (Berwalda et al., 2003) se koncentrace FSH začala zvyšovat 2 až 3 dny před folikulární vlnou. Ačkoli to u žen není dostatečně prozkoumáno, dostupné informace naznačují, že nárůst FSH je dočasně spojen se stimulací folikulárních vln a k odchylce dochází při poklesu nárůstu FSH. Podobné časové vztahy mezi vývojem folikulů a hladinou FSH se vyskytují i u skotu (Ginther et al., 2003a). Koncentrace estradiolu a LH se začne zvyšovat u klisen 1 až 2 dny před odchylkou u experimentálně vyvolané růstové vlny folikulů (Ginther at al., 2004a). U skotu se LH a estradiol začne zvyšovat před a na začátku odchylky rychlosti růstu dvou největších folikulů (Ginther et al., 2003a). U žen nebyl přímo zkoumán vztah mezi koncentrací estradiolu a LH. V jedné studii (van Santbrik et al., 1995), při zvýšení koncentrace estradiolu první den byl dominantní folikul rozeznatelný. U žen (Baerwald et al., 2003), ke zvýšení koncentrace estradiolu dochází během luteální fáze, začínající po preovulační vlně. Dlouhodobé zvýšení estradiolu je z luteální produkce, ale luteální fáze folikulární vlny je potenciálně další zdroj, který nebyl zkoumán. U klisny koncentrace preovulačního LH se začne zvyšovat v průběhu poklesu FSH, dosáhne maximální koncentrace den po ovulaci a pak klesá několik dní (Ginther 1992). Tak LH a FSH jsou odděleny během preovulačního období. Na rozdíl u ženy FSH a LH dosáhnou vrcholu současně v jeden den před ovulací (Reddi et al., 1990). 23

24 K podobným vztahům mezi FSH a LH dochází den před ovulací také u skotu (Haughiam et al., 2004). Preovulační vrchol estradiolu nastane 1 až 2 dny před ovulací, u klisen 2 nebo 3 dny před vrcholem vlny LH (Ginther, 1992). U žen vrchol estradiolu nastane 2 dny před ovulací nebo jeden den před LH vrcholem (Reddi et al., 1990). Koncentrace progesteronu se začne zvyšovat v blízkosti ovulace u klisen (Ginther 1992) i žen (Reddi et al., 1990). Během 14 dnů po ovulaci se jeho koncentrace sníží na bazální úroveň u žen a začíná pokles u klisen. Celkově ve vztahu mezi FSH a LH během preovulačního období jsou výrazné odlišnosti mezi oběma druhy, ale folikulární charakteristiky předchozí folikulární vlny jsou podobné. 24

25 4 ZÁVĚR Klisna je vynikající model pro studium vývoje a růstu antrálních folikulů. Navíc sezónní povaha aktivity vaječníků u klisen nabízí jedinečný model pro studium faktorů přirozeně upravující vývoj folikulů u monoovulárních druhů. Stejně jako u ostatních monoovularních druhů se vývoj antrální folikulů u koní vyznačuje periodickým vývojem růstových vln folikulů a výběrem obvykle jednoho dominantního folikulu. Vznik folikulárních vln a výběr dominantního folikulu je řízen folikuly stimulujícím hormonem a luteinizačním hormonem. Vznik folikulárních vln je řízen folikuly stimulujícím hormonem a výběr folikulů luteinizačním hormonem. Folikulární vlny se vyvíjí během postnatálního života koní až do doby, kdy folikuly nevratně přestanou růst asi ve věku 20 let. Úroveň folikulární aktivity ovlivňují faktory jako sezóna, gravidita, věk, plemeno a individualita. To má za následek změny ovulačních vln a ovulační způsobilosti. Přesto je ještě mnoho práce potřebné pro lepší pochopení mechanismů, které regulují folikulární vývoj během různých fyziologických podmínek u klisen. 25

26 5 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY ACOSTA T.J., GEEG M.A., GINTHER O.J.,2004: Aberrant blood flow area and plasma gonadotropin concentrations during the development of dominant-sized transitional anovulatory follicles in mares. Biol Reprod 71: ALEXANDER S.L., IRVINE C.H.G., 1991: Control of onset of the breeding season in the mare and its artificial regulation by progesterone treatment. J Reprod Fertil Suppl 44: ARTORIATI A., DUCHAMP G., GERART N., 2003: In vivo effect of epidermal growth factor, interleukin-1{beta}, and interleukin- 1RA on equine preovulatory follicles. Biol Reprod 68: BAO B., GARVERICK H.A., : Aberrant blood flow area and plasma gonadotropin concentrations during the development of dominant-sized transitional anovulatory follicles in mares. Biol Reprod 71: BEG M.A., GINTHER O.J., Follicle selection in cattle and horses: role of intrafollicular factors. Reproduction 132: BERGFELT D.R., GINTHER O.J.,1992: Delayed follicular development and ovulation following inhibition of FSH with equine follicular fluid in the mare. Theriogenology 24: BERGFELT D.R., GINTHER O.J., 1993: Relationships between FSH surges and follicular waves during the estrous cycle in mares. Theriogenology 39: BERGFELT D.R., GASTAL E.L., GINTHER O.J., 2001: Response of estradiol and inhibin to experimentally reduced luteinizing hormone during follicle deviation in mares. Biol Reprod 65: BERGWALD A.R., ADAMS G.P., PIERSON R.A., 2003: Characterization of ovarian follicular wave dynamics in women. Biol Reprod 69: BOERBOOM D., SIROIS J., Equine P450 cholesterol side-chain cleavage and 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase delta(5)- delta(4) isomerase: molecular cloning and regulation of thein messenger ribonucleic acids in equine follicles during the ovulatory process. Biol Reprod 64: BRITGES T.S.,DAVIDSON T.R., CHAMBERLAIN C.S., GREISERT R.D., SPIECER L.J., 2002: Changes in follicular fluid steroids, insulinlike growth factors (IGF) and IGF-binding protein concentration, and proteolytic activity during equine follicular development. J Anim Sci 80:

27 CARNEVALE E.M., 2008: The mare model for follicular maturation and reproductive aging in the woman. Theriogenology 69: CARNEVALE E.M., BERGFELT D.R., GINTHER O.J., 1993: Aging effects on follicular activity and concentrations of FSH, LH, and progesterone in mares. Anim Reprod Sci 31: CARNEVALE E.M., BERGFELT M.J., GINTHER O.J., 1994: Follicular activity and concentrations of FSH and LH associated with senescence in mares. Reprod Fertil Dev. 35: CARNEVALE E.M., HERMENET M.J., GINTHER O.J., 1997: Age and pasture effects on vernal transition in mares. Theriogenology 47: COCHRAN R.A., LEONARDI-CATTOLICA A.A., SULLIVAN M.R., KINCAID L.A., LEISE B.S., THOMPSON D.L. Jr, GODKE R.A., 1999: The effects of equine somatotropin (est) on follicular development and circulating plasma hormone profiles in cyclic mares treated during different stages of the estrous cycle. Domest Anim Endocrinol 16: DEANESLY R., 1975: Germ cell development and the mestic prophase in the fetal horse ovary. J Reprod Fertil Suppl 23: DONADEU F.X., GINTHER O.J., 2001: Effect of number and diameter of follicles on plasma concentrations of inhibic and FSH in mares. Reproduction 121: DONADEU F.X., GINTHER O.J., 2002a: Changes in Concentrations of follicular fluid factors during follicle selection in mares. Biol Reprod 66: DONADEU F.X., GINTHER O.J., 2000b: Follicular waves and circulating concentrations of gonadotrophins, inhibin and oestradiol during the anovulatory season in mares. Reproduction 124: DONADEU F.X., GINTHER O.J., 2003: Interactions of follicular factors and season in the regulation of circulating concentrations of gonadotrophins in mares. Reproduction 125: DONADEU F.X., WATSON E.D., 2007: Seasonal changes in ovarian activity: lessons learnt from the horse. Anim Reprod Sci 100: DRIANCOURT M.A., Follicular kinetics in the mare ovary. Reprod Nutr Dev 19:

28 DRIANCOURT M.A., PARIS A., ROUX C., MARIANA J.C., PALMER E., 1982: Ovarian follicular populations in pony and saddletype mares. Reprod Nutr Dev 22: DRIANCOURT M.A., PRUIER A., PALMER E., MARIANA J., 1983: Seasonal effects on ovarian follicular development in pony mares. Reprod Nutr Dev 23: FAUSER B.C.J.M., VAN HEUSDEN A.M., 1997: Manipulation of human ovarian funcrtion: physiological concepts and clinical consequences. Endocrine Reviews 18: FAY J.E., DOUGLAS R.H.,,1987: Changes in thecal and granulosa cell LH and FSH receptor content associated with follicular fluid and peripheral plasma gonadotrophin and steroid hormone concentrations in preovulatory follicles of mares. J Reprod Fertil Suppl 35: FAYAD T., LEVESQUE V., SIROIS J., SILVERSIDES D.W., LUSSIER J.G., 2004: Gene expression profiling of differentially expressed genes in granulosa cells of bovine dominant follicles using suppression subtractive hybridization. Biol Reprod 70: FITZGERARD B.P., AFFLECK K.J., BARROWA W.L., BARKER K.B., LOY R.G., 1987: Changes in LH pulse frequency and amplitude in intact mares during the transition into the breeding season. J Reprod Fertil 79: FREEDMAN L.J., GARCIA M.C., GINTHER O.L., 1979: Influence of fotoperiod and ovaries on seasonal reproductive activity in mares.biol Reprod 20: FORTUNE J.E., RIVERA G.M., YANG M.Y., Follicular development: the role of the follicular microenvironment in selection of the dominant follicle. Anim Reprod Sci 82 83: FRASER H.M., WULFF C., 2001: Angiogenesis in the primate ovary. Reprod Fertil Dev 13: GASTAL E.L., GASTAL M.O., BERGFELT D.R., GINTHER O.J., 1997: Role of diameter differences among follicles in selection of a future dominant follicle in mares. Biol Reprod 57: GASTAL E.L., DONADEU F.X., GASTAL M.O., 1999: Echotextural changes in the follicular wall during follicle deviation in mares. Theriogenology 52: