Výzkumný ústav rostlinné výroby Praha Ruzyně. Metodika byla vypracována jako výstup výzkumného záměru MZe č Autor: Ing.

Transkript

1 Výzkumný ústav rostlinné výroby Praha Ruzyně Optimalizovaná metodika SDS-PAGE pro analýzu LMW podjednotek gluteninů pšenice Metodika byla vypracována jako výstup výzkumného záměru MZe č Autor: Ing. Jana Bradová Prosinec 2006

2 OPTIMALIZOVANÁ METODIKA SDS-PAGE PRO ANALÝZU LMW-PODJEDNOTEK GLUTENINŮ PŠENICE Metodika byla vypracována jako výstup výzkumného záměru MZe č Ing. Jana Bradová Vydal: Výzkumný ústav rostlinné výroby, Praha Text: 2006 J. Bradová Foto: 2006 J. Bradová, S. Sýkorová Grafická úprava: 2006 M. Sýkora Vydáno bez jazykové úpravy ISBN

3 OPTIMALIZOVANÁ METODIKA SDS-PAGE PRO ANALÝZU LMW PODJEDNOTEK GLUTENINŮ PŠENICE Obsah: 1. Úvod Metodika Technické vybavení Chemikálie Roztoky Pracovní postup Vyhodnocení experimentálních dat Literatura. 12 J. Bradová VÚRV Praha

4 1. Úvod Podjednotky gluteninů s nízkou molekulovou hmotností (LMW-GS) zaujímají asi jednu třetinu celkového semenného proteinu pšenice a představují po gliadinech druhou největší skupinu zásobních bílkovin. LMW gluteniny podobně jako gliadiny a HMWgluteniny tvoří alelické kombinace, na jejichž základě mohou být charakterizovány. Z literatury je známo, že LMW- gluteniny mohou hrát důležitou roli v určování některých významných vlastností pšeničné mouky. HMW- gluteniny jsou velmi dobře prostudovány. Důvodem je velká molekulová hmotnost, která je příčinou jejich nižší elektroforetické pohyblivosti ve srovnání s ostatními endospermálními proteiny. Naproti tomu LMW - gluteniny mají stejnou pohyblivost jako některé těžší gliadiny, a proto získání čistých gluteninových preparátů (např. gelovou filtrací), které by neobsahovaly interferující proteiny, je poněkud složitější. Proto je kladen tak velký důraz na výběr a pečlivost provedení extrakčního postupu LMW-GS, který je sestaven tak, aby byla pokud možno bezezbytku odstraněna gliadinová frakce. 2. Metodika 2.1. Technické vybavení Přístroje a zařízení Přístroj pro vertikální elektroforézu, zajišťující udržování konstantní teploty gelů (doporučená tloušťka gelu maximálně 1,5 mm) Zdroj stejnosměrného proudu (možnost nastavení jak konstantního proudu, tak i konstantního napětí) Chladicí termostat Laboratorní centrifuga Prosvětlovací panel Analytické váhy Laboratorní předvážky Třepačka Vortex Vodní lázeň Ultrazvuková lázeň Laboratorní digestoř Sklo, laboratorní pomůcky Běžné laboratorní sklo, nádoby na fixaci a barvení gelu, plastové centrifugační kyvety 2 ml, injekční stříkačka s jehlou, přesná syringe Hamilton, automatické pipety, osobní ochranné pracovní prostředky - rouška, rukavice! J. Bradová VÚRV Praha 4

5 2.2. Chemikálie Všechny chemikálie stupně analytical reagent (p.a.) nebo lepší Chemikálie pro extrakci proteinů Ethanol 2-Propanol Tris(hydroxymethyl) aminomethan (TRIS) Kyselina chlorovodíková (HCl) Dodecylsulfát sodný (SDS) Glycerol Bromfenolová modř 2-merkaptoethanol 1,4-dithiothreitol (DTT) 4-vinylpyridin(VP) Chemikálie pro elektroforézu Akrylamid (AA) Bisakrylamid (BIS) Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris) Kyselina chlorovodíková (HCl) Bromfenolová modř Dodecylsulfát sodný (SDS) Persíran amonný (APS) TEMED (NNN'N' - tetramethylethylendiamin) Glycin Chemikálie pro fixaci, barvení a sušení gelů Kyselina trichloroctová (TCA) Ledová kyselina octová Glycerol Methanol Coomassie Brilliant Blue R-250 J. Bradová VÚRV Praha 5

6 2.3. Roztoky Extrakční roztoky č. Roztok Složky Množství poznámka Roztok A (60% Ethanol) 96% Ethanol 60ml 36ml lze skladovat Roztok B: 50% 2-Propanol v 0,08M Tris-HCl ph 8,0 2-Propanol 0,08M Tris-HCl (ph 8,0) viz ml 50ml lze skladovat ,08M Tris-HCl ph 8,0 Tris Vzorkový pufr SDS Glycerol Bromfenolová modř 2-Merkaptoetanol 0,08M Tris-HCl (ph 8,0) Roztok B + DTT DTT Roztok B Roztok B + VP VP Roztok B Zásobní roztoky pro elektroforézu 4,844g do 500ml 2g 40ml 0,02g 1ml do 100ml 40mg 4ml 60µl 4ml -upravit ph na 8,0 přidáním HCl -lze skladovat lze skladovat používat vždy čerstvý používat vždy čerstvý č. Roztok Složky Množství poznámka Gelový pufr 8,8: 0,75 M Tris-HCl ph 8,8 Tris 45,5 g Tris do 500ml -upravit ph na 8,8 přidáním HCl -skladovat Gelový pufr 6,8: 0,25M Tris-HCl ph 6,8 Tris Bromfenolová modř AA a BIS Akrylamid Bisakrylamid % roztok SDS SDS % roztok APS APS Zásobní elektrodový pufr: 0,25M Tris; 1,92M glycin ph 8,3 Tris Glycin SDS Provozní pufr Zásobní elektrodový pufr 6,1 g špetka do 200ml 150 g 4 g do 500ml 5g do 50 ml 0,5g do 5 ml 30,3 g 144 g 10 g do 1000ml 100ml 9000ml -upravit ph na 6,8 přidáním HCl -skladovat skladovat za lab. teploty skladovat za lab. teploty připravovat vždy čerstvý skladovat za lab. teploty připravovat vždy čerstvý J. Bradová VÚRV Praha 6

7 Roztoky pro fixaci, barvení a sušení gelů č. Roztok Složky Množství poznámka Fixační činidlo: 20 % TCA TCA 200 g do 1000 ml skladovat za lab. teploty Směsný roztok Methanol Kyselina octová 250 ml 100 ml 650 ml skladovat za lab. teploty Barvicí roztok Commassie Brilliant Blue R 250 Směsný roztok % roztok glycerolu Glycerol 0,25 g do 500 ml 20ml do 1000 ml skladovat za lab. teploty skladovat 2.4. Pracovní postup Příprava vzorků - extrakce(n.k. Singh at al.,1991) První den: 1) Jednotlivá zrna roztlouci pečlivě kladívkem a převést do centrifugačních kyvet (2ml) 2) přidat 0,5 ml extrakčního roztoku A (3.1.1.) 3) zamíchat na vortexu 4) nechat stát ve tmě přes noc Druhý den: 5) vložit na 10min do ultrazvukové lázně 6) 30min inkubovat ve vodní lázni při 65 C 7) 5min centrifugovat ( ot/min) 8) supernatant odstranit 9) k pevnému zbytku (peletě) přidat 0,5 ml extrakčního roztoku A (3.1.1.) 10) peletu dobře promíchat jehlou 11) krátce zamíchat na vortexu 12) vložit na 10min do ultrazvukové lázně 13) 30min inkubovat ve vodní lázni při 65 C 14) 5min centrifugovat ( ot/min) 15) supernatant odstranit 16) k pevnému zbytku (peletě) přidat 0,5 ml extrakčního roztoku A (3.1.1.) 17) peletu dobře promíchat jehlou 18) krátce zamíchat na vortexu 19) vložit na 10min do ultrazvukové lázně 20) 30min inkubovat ve vodní lázni při 65 C 21) 5min centrifugovat ( ot/min) 22) supernatant úplně odebrat a odstranit 23) přidat 100 µl roztoku B + DTT (3.1.5) 24) peletu dobře promíchat jehlou 25) krátce zamíchat na vortexu 26) vložit na 10min do ultrazvukové lázně 27) 30min inkubovat ve vodní lázni při 65 C 28) přidat 100 µl roztoku B + VP (3.1.6) J. Bradová VÚRV Praha 7

8 29) krátce zamíchat na vortexu 30) 15min inkubovat ve vodní lázni při 65 C 31) 3min centrifugovat ( ot/min) 32) 100 µl supernatantu přenést do nové centrifugační kyvety 33) přidat100 µl vzorkového pufru 34) 15min inkubovat ve vodní lázni při 65 C 35) 3min centrifugovat ( ot/min) Takto připravené extrakty lze skladovat několik týdnů Příprava gelu - Sestavit suché a čisté gelové kazety (dle typu přístroje) - Každý gel se skládá z dělicího a zaostřovacího gelu Příprava 10% dělicího gelu Za pomalého míchání jsou přidávány jednotlivé složky (množství dle typu přístroje a velikosti desek) Uvedená množství - pro přístroj OWL Pinguin 14x16 42 ml (AA a BIS) 63 ml (gelový pufr 8,8) 1,26 ml (SDS) 21 ml vody Polymerace se nastartuje přidáním: 75 µl TEMEDu 1,26 ml (APS) Gel se pečlivě nalije mezi skla tak, aby se netvořily vzduchové bublinky. Gelové kazety se naplní 30 mm pod okraj (prostor pro 30 mm vrstvu zaostřovacího gelu). Povrch gelu se převrství opatrně vodou (injekční stříkačkou), nechá se cca 30 minut polymerovat. Po skončení polymerace se voda slije, povrch gelu se osuší filtračním papírem a kazety se až po okraj naplní zaostřovacím gelem. Příprava 4,6 % zaostřovacího gelu: Za pomalého míchání jsou přidávány jednotlivé složky (množství dle typu přístroje a velikosti desek) 6 ml (AA a BIS) 20 ml (gelový pufr 6,8) 0,4 ml (SDS) 21 ml vody Polymerace se nastartuje přidáním: 16 µl TEMEDu 0,4 ml (APS) Gel se pečlivě nalije na spodní gel tak, aby se netvořily vzduchové bublinky, vloží se hřebeny pro tvorbu jamek. Polymerace probíhá cca 30 minut. Potom se hřebeny opatrně J. Bradová VÚRV Praha 8

9 vyjmou a jamky v gelu se promyjí a naplní elektrodovým pufrem Doporučuje se připravit si gely den předem před vlastní elektroforézou a skladovat je Nanášení vzorků Do každé jamky se nanáší 15µl extraktu (Postup dle 4.1.) Elektroforéza Podmínky SDS PAGE pro LMW-GS Elektrodový pufr Proud 0,2 ma/ mm 2 gelu (1gel- 14 cm šířka;1mm tloušťka = 28mA) Napětí max. 300 V Teplota 8 C Směr migrace od katody (-) k anodě (+) Doba dělení: Čelo markerovací barvy se nechá dojít na konec gelu a doba dělení se prodlouží cca o 30 minut Fixace, barvení, odbarvení, sušení Fixace: Barvení: Skleněné desky s gelem se vyjmou z přístroje, gel se sejme a ponechá cca 30 minut ve fixačním roztoku Roztok se slije a gel se přelije roztokem a ponechá se cca 30 minut. Slít roztok a přelít barvicím roztokem Ponechá se barvit přes noc (bez třepání). Odbarvení: Sušení Slít roztok a přelít roztokem , ponechat cca 30 minut. Slít roztok (odbarvit jej aktivním uhlím a lze jej znovu použít) a nakonec přelít gely destilovanou vodou. Připraví se skleněná deska (rozměry desky musí být větší než velikost výsledného PAGE gelu). Dále je nutno připravit dva obdélníky z celofánu (rozměry 1. obdélníku se rovnají rozměrům skleněné desky; (strany 2. obdélníku jsou cca o 2cm delší než strany skleněné desky). Takto připravený celofán a PAGE gel se ponoří do (cca 2 hodiny). Poté se 1. celofánový obdélník položí na skleněnou desku, na něj se umístí PAGE gel a přikryje se 2. celofánovým obdélníkem. Okraje celofánu se přehnou pod skleněnou desku a plocha se J. Bradová VÚRV Praha 9

10 eventuelně vyhladí plastovým válečkem (odstranění vzduchových bublin). Ponechá se sušit při laboratorní teplotě v dostatečné vzdálenosti od zdrojů tepla a světla Vyhodnocení experimentálních dat Na výsledném gelu lze současně identifikovat jak LMW-GS, tak HMW-GS alely Obrázek 1: Schématické znázornění elektroforetických mobilit jednotlivých LMW-GS alel kodovaných lokusem Glu-3(SDS PAGE), (Branlard et al. 2003) Glu - A3 Glu B3 Glu D4 Obrázek 2: Schématické znázornění elektroforetických mobilit jednotlivých HMW-GS alel kodovaných lokusem Glu-3 (Payne,Lawrence;1983) Glu - A1 Glu - A1 Glu - A1 Obrázek 3: Příklad výsledku SDS PAGE LMW GS a HMW GS J. Bradová VÚRV Praha 10

11 Optimalizovaná metodika SDS-PAGE pro analýzu LMW podjednotek gluteninů pšenice 1.Chinese Spring, 2.Clarus, 3.Gabo, 4. Ebi, 5.Jabiru, 6.Orca, 7.Clarus, 8.Kite, 9.Ebi, 10.Jufy Tabulka I: Alely HMW-GS a LMW-GS odrůd pšenice publikované Singhem et al. (1991) Alela Odrůda Chinese Spring Gabo Jabiru Orca Kite Jufy I Glu-1A c (0) b (2*) a (1) c (0) b (2*) c (0) HMW-GS Glu-1B b (7+8) i (17+18)? a (7) i (17+18) d (6+8) Glu-1D a (2+12) a (2+12) d (5+10) a (2+12) a (2+12) d (5+10) Glu-3A a b c d e e LMW-GS Glu-3B a b c d b i Glu-3D a b c e b d TabulkaII: Alely HMW-GS a LMW-GS odrůd pšenice registrovaných v ČR Alela Odrůda Clarus Ebi Glu-1A c (0) c (0) HMW-GS Glu-1B d (6+8) b (7+8) Glu-1D a (2+12) d (5+10) Glu-3A d d J. Bradová VÚRV Praha LMW-GS Glu-3B a f Glu-3D c c 11

12 3. Literatura G. Branlard, M. Dardevet, N. Amiour, G. Igrejas: Allelic Diversity of HMW and LMW Glutenin Subunits and Omega-Gliadins in French Bread Wheat (Triticum aestivum L.) Genetic Resources and Crop Evolution 50, 2003: P. I. Payne, G.J.Lawrence: Catalogue of A1leles for the Complex Gene Loci, Glu-A1, Glu-Bl, and Glu-D1, which code for High-Molecular-Weight Subunits of Glutenin in hexaploid Wheat. Cereal. Res. Commun.,11,1983: N.K. Singh, K.W. Shepherd, G.B. Cornish: A simplified SDS.PAGE Procedure for Separating LMW Subunits of Glutenin. Journal of Cereal Science 14,1991: J. Bradová VÚRV Praha 12