Výzkumný ústav rostlinné výroby Praha Ruzyně

Rozměr: px
Začít zobrazení ze stránky:

Download "Výzkumný ústav rostlinné výroby Praha Ruzyně"

Transkript

1 Výzkumný ústav rostlinné výroby Praha Ruzyně METODIKA VYUŽITÍ ELEKTROFORÉZY HLÍZOVÝCH PROTEINŮ PRO IDENTIFIKACI ODRŮD BRAMBOR (SOLANUM TUBEROSUM) Vypracovaná jako výstup projektu NAZV QF 3050: Vývoj metod objektivní identifikace odrůd zemědělských plodin Autoři: Mgr. Světlana Sýkorová, CSc., Ing. Jana Bradová, Ing. Josef Fér,CSc. Říjen 2005

2 METODIKA VYUŽITÍ ELEKTROFORÉZY HLÍZOVÝCH PROTEINŮ PRO IDENTIFIKACI ODRŮD BRAMBOR (SOLANUM TUBEROSUM) Vypracovaná jako výstup projektu NAZV QF 3050: Vývoj metod objektivní identifikace odrůd zemědělských plodin Světlana Sýkorová a kol. sykorova@vurv.vz Vydal: Výzkumný ústav rostlinné výroby, Praha Text: 2005 S. Sýkorová, J. Bradová, J. Fér Foto: 2005 S. Sýkorová, J. Bradová Grafická úprava: 2005 M. Sýkora, L. Štočková Vydáno bez jazykové úpravy ISBN:

3 Obsah: I. Úvod... 4 II. Schéma postupu při určení odrůdy brambor pomocí hlízových proteinů 5 III. IV. Metodika elektroforézy proteinů a enzymů hlíz brambor podle Bundessortenamt (1996) postup používaný v SRN a přijatý UPOV (přeloženo z německého originálu a modifikováno podle podmínek laboratoře VÚRV) 6 Polyakrylamidová gelová elektroforéza pro analýzu esteráz, peroxidáz a patatinů v bramborách podle Bundessortenamt (2002) postup používaný v SRN a přijatý UPOV (přeloženo z německého originálu a modifikováno podle podmínek laboratoře VÚRV) zahrnuje i modifikaci metody UPOV (1996). 10 V. Příklady získaných elektroforetických spekter hlízových proteinů. 26 VI. Příklad postupu při odrůdové identifikaci odrůdy ze vzorků konzumních brambor VII. Použitá literatura... 31

4 I. Úvod Odrůdy rostlin jsou jedním z nejvýznamnějších faktorů rozvoje zemědělství. Stále zvyšovanou výnosovou schopností, odolností k chorobám a škůdcům a zvyšovanou hodnotou pro pěstování i zpracování umožňují zemědělcům i zpracovatelům dosahovat lepších hospodářských výsledků. Ochrana práv šlechtitelů k odrůdám je v České republice zajišťována podle zákona č.132/1989 Sb., o ochraně práv k novým odrůdám rostlin a plemenům zvířat, který upravuje práva a povinnosti vznikající z vytvoření nových odrůd a z jejich obchodního využívání. Systém ochrany odrůd formulovaný tímto zákonem odpovídá principům Mezinárodní úmluvy na ochranu nových odrůd rostlin z roku 1961 podle UPOV (Union Internationale pour la Protection des Obtentios Vegetales), ve znění jejích revizí z roku 1972 a 1978 (Souček, 1997). Brambory jsou velmi důležitou a v lidské výživě nenahraditelnou plodinou a potravinou, kde význam odrůdy jako nositele kvality je nesporný. Brambory se stávají potravinou v okamžiku, kdy jsou uváděny do oběhu k přímému prodeji spotřebiteli a vztahuje se na ně ustanovení Zákona o potravinách ( Zákon č.110/97 Sb.). U konzumních brambor pozdních musí být uveden varný typ, odrůda, a při dovozu země původu. U konzumních brambor raných též barva dužniny, tvar hlíz a popř. označení drobné (Pivoňková, 1997). Ve světle těchto skutečností je zcela jasná nutnost identifikace, verifikace a možnosti kontroly pravosti odrůdy u brambor. Metoda identifikace odrůd založená na morfologických znacích rostlin a hlíz není příliš objektivní pro jejich závislost na podmínkách prostředí. Za nejvhodnější pro identifikaci odrůdy jsou pokládány stabilní znaky hlíz, z nichž byly již v 60.letech úspěšně využity jako genetické markery rozpustné proteiny, enzymy, případně jejich kombinace. Elektroforéza v polyakrylamidovém nebo škrobovém gelu v alkalickém i kyselém prostředí je vhodnou a účinnou metodou pro separaci těchto proteinů. Elektroforetické spektrum proteinů se neměnilo v hlízách skladovaných po několik měsíců v chladu ani v bramborách pěstovaných na různých lokalitách a v různých ročnících (Desborough,1983). V 60. a 70.letech byly intenzivně studovány možnosti identifikace odrůd brambor pomocí elektroforetických spekter proteinů a enzymů, např. Šašek (1974a,b) charakterizoval řadu československých i zahraničních odrůd brambor na základě polymorfismu proteinů po elektroforéze ve škrobovém gelu postupem (Paulik,1957). Mezi odrůdami byly zjištěny charakteristické rozdíly, avšak teplota skladování ani různé dávky gama záření neměly na bílkovinný komplex brambor podstatnější vliv. Katalog evropských odrůd brambor založený na variabilitě elektroforetických spekter proteinů a esteráz vypracovali Stegemann a Loeschcke (1977). Důležitost hlízových proteinů pro objektivní identifikaci odrůd brambor je nesporná, elektroforetická spektra těchto proteinů a enzymů jsou značně odrůdově specifická a geneticky podmíněná, nezávislá na ročníku ani lokalitě pěstování a nemění se ani po několik měsíců v dormantních hlízách skladovaných v chladu. Metody identifikace a verifikace odrůd brambor se mohou velmi vhodně uplatnit jak ve šlechtění, tak i v kontrole odrůdové pravosti,např. při obchodování s konzumními bramborami (Sýkorová, 1999). Předkládaná metodika identifikace odrůd brambor vychází z postupů používaných k tomuto účelu v SRN a přijatých jako oficiální metody UPOV. Jedná se o dva postupy (UPOV 1996 a UPOV 2002). V řadě případů jsme ověřili a částečně modifikovali oba postupy a získané poznatky uvádíme v předkládané metodice. I. Úvod 4

5 II. Schéma postupu při určení odrůdy brambor pomocí hlízových proteinů Pro konkrétní uplatnění metody elektroforézy hlízových proteinů brambor k identifikaci odrůdy, případně ke kontrole odrůdové deklarace v obchodní síti je možno použít již v praxi ověřený metodický postup (byl vypracován SZPI pro konkrétní kontrolní akci v roce 2001 a 2002). Metodický pokyn obsahoval následující části: cíl kontrolní akce, objekt kontrolní akce, termín (kdy bude uskutečněna), rozsah (počet kontrolovaných vzorků a jejich zajištění), velikost vzorku a metoda odběru, pověření laboratoře, která provede elektroforetické analýzy, postup při předávání vzorku do pověřené laboratoře, určení předpisu pro hodnocení (např. zjištění právní kvalifikace klamavého označení odrůdy, vzorec pro rozhodovací kriterium, zda vzorek vyhovuje nebo nevyhovuje, způsob předávání výsledku zadavateli (formulář protokolu o analýze), využití výsledků analýz (sankce, aj.). Dále uvádíme schéma konkrétního postupu. Do laboratoře byly denně inspektory SZPI dodány 4 vzorky po 15 hlízách s předávacími protokoly. Všechny vzorky měly odrůdovou deklaraci. Hlízy byly jednotlivě zváženy a jejich hmotnost zaznamenána. V tomto případě byla aplikována metoda elektroforézy hlízových proteinů podle UPOV (1996) viz kapitola III. Laboratoř provedla následující den elektroforetické analýzy dodaných 60 hlíz (spolu s etalonovými vzorky příslušných odrůd) a po barvení gelů přes noc byla v následujícím dnu spektra vizuálně vyhodnocena porovnáním s etalonovým spektrem příslušné odrůdy, zjištěn počet vyhovujících a nevyhovujících hlíz (odpovídajících či neodpovídajících odrůdové deklaraci), vypočtena hodnota koeficientu Q podle vzorce Q = (n+1). m CO / (n+1). m CO + (99-n). m DO, kde n je počet hlíz cizí odrůdy, m CO - průměrná hmotnost hlíz cizí odrůdy, m DO - průměrná hmotnost hlíz deklarované odrůdy. Vzorek byl označen za nevyhovující, když Q > 0,02 a závěr zněl: Ve vzorku byla zjištěna přítomnost cizích odrůd větší než 2% hmotnosti Současně byla uvedena hodnota koeficientu Q. V případě, kdy u vzorku, ve kterém byla určena směs odrůd, nebylo možné určit deklarovanou odrůdu, byla za deklarovanou odrůdu považována odrůda s nejvyšším % zastoupením. Vzorek byl označen za vyhovující, když Q 0,02 a závěr zněl: (v případě, že referenční odrůda byla k dispozici): Ve vzorku byla zjištěna přítomnost cizích odrůd menší nebo rovna 2% hmotnosti a v případě že referenční odrůda nebyla k dispozici: Byla zjištěna odrůdová jednotnost analyzovaného vzorku (množství cizích odrůd bylo menší nebo rovno 2% hmotnosti), majoritní odrůdu nebylo možno identifikovat vzhledem k chybějící referenční odrůdě. (Posledně uvedený případ nastával při kontrole odrůdové jednotnosti raných brambor z dovozu, kdy se velmi často jednalo o odrůdy, které nebyly v ČR registrovány.) Další návaznost využití výsledků (sankce, informace pro veřejnost, atd. ) kontrolní akce již byly zcela v kompetenci SZPI. II. Schéma postupu 5

6 III. Metodika elektroforézy proteinů a enzymů hlíz brambor podle Bundessortenamt (1996) postup používaný v SRN a přijatý UPOV (přeloženo z německého originálu a modifikováno podle podmínek laboratoře VÚRV) 1. Extrakce proteinů hlíz 1.1. Extrakční roztoky Roztok Složky Navážka na 100 ml vodného roztoku Roztok Siřičitan sodný (Na 2 SO 3 5,00 g K1 Dvojsiřičitan sodný ( Na 2 S 2 O 5 ) 3,75 g Roztok Sacharoza 50,00 g K2 Amidočerň 10B extra 0,03 g Poznámka denně čerstvý denně čerstvý 1.2. Příprava extraktů proteinů Hlízy brambor necháme při 20 C dobře promrazit (minimálně 16 hod.) a při pokojové teplotě roztát. Do 6,5 ml centrifugačních zkumavek dáme 0,1 ml roztoku K1. Hlízy omyjeme pod tekoucí vodou, osušíme a rozkrojíme. Hlízovou vodu (4-5 ml) tlakem vymačkáme do centrifugačních zkumavek a promícháme skleněnou tyčinkou s roztokem K1. Centrifugujeme 15 minut při ot. min. -1 při 10 C, odebereme 4 ml čirého supernatantu, který přeneseme do další zkumavky s 1,0 ml roztoku K2 a opět skleněnou tyčinkou promícháme. Extrakt potom rozdělíme do tří 1,5 ml kyvet se šroubovacím uzávěrem a zmrazíme. K elektroforéze použijeme buď čerstvý nebo rozmrazený extrakt, který pro snadnější nanášení napipetujeme do mikrotitrační destičky (vždy po 1 aliquotu µl do jamky). 2. Elektroforéza hlízových proteinů 2.1. Pufry Pufr Složky Podíl na 1 l vodného Poznámka roztoku Pufr 1 TRIS 30,26 g skladovatelný Kys. boritá 36,60 g Pufr 2 Pufr 1 125,00 ml denně čerstvý Pufr 3 Pufr 1 158,00 ml denně čerstvý III. Metodika elektroforézy (1996) 6

7 2.2. Gelové roztoky Zásobní roztoky Zásobní roztok 40% AA 2 %BIS 2 % Pers. Složky Množství Poznámka Akrylamid 400 g Destilovaná voda do 1000 ml velmi toxický!! Methylen BIS Akrylamid 20,0 g Destilovaná voda do 1000 ml velmi toxický!! Persíran amonný 0,2 g (Ammonium Persulfate) denně čerstvý Destilovaná voda do 10 ml Rozpis složek pro různé objemy gelu Složky Objem gelu 40 ml 80 ml 100 ml 120 ml 150 ml 200 ml pufr 3 30,32 ml 60,64 ml 75,8 ml 90,96 ml 113,7 ml 151,6 ml AA 40% 4,68 ml 9,36 ml 11,7 ml 14,04 ml 17,55 ml 23,4 ml BIS 2% 4,96 ml 9,92 ml 12,4 ml 14,88 ml 18,6 ml 24,8 ml siřičitan sodný 0,0165 g 0,033 g 0,042 g 0,05 g 0,063 g 0,084 g DMAPN* 0,2 ml 0,4 ml 0,5 ml 0,6 ml 0,75 ml 1,0 ml pers. 2% 0,76 ml 1,52 ml 1,9 ml 2,28 ml 2,85 ml 3,8 ml * 3 (Dimethylamino) propionitril 2.3. Barvicí roztoky Barvicí roztoky Složky Množství Barvicí roztok 1 Coomassie Blue G 250 Coomassie Blue R 250 Dest. voda 250 mg 750 mg 100 ml Barvicí roztok 2 Barvicí roztok 3 Barvicí roztok 4 Kyselina trichloroctová Kyselina octová Dest. voda Methanol Barvicí roztok 1 Na 2 HPO 4 x 12 H 2 O Dest. voda Na H 2 PO 4 x 1 H 2 O Dest. voda 120 g 140 ml 1600 ml 300 ml 50 ml 53,7 g do 1 l 20,7 g do 1 l III. Metodika elektroforézy (1996) 7

8 2.4. PAGE hlízových proteinů Přístroje Vertikální elektroforetický přístroj (např. OWL Scientific, USA) pro 2 gely nebo jiný přístroj na vertikální elektroforézu v polyakrylamidovém gelu. Zdroj stejnosměrného proudu nejméně na 400 V a 150 ma Kryostat (chladicí termostat ) Kývací třepačka Chlazená odstředivka Mraznička Analytické váhy Příprava gelu - 2 plotny (60x110x1 mm) Připravit 80 ml gelu podle rozpisu v kapitole 2.2. (složky přidávat v pořadí uvedeném v tabulce). Roztok ihned plynule nalít do kyvet a gely opatřit vzorkovými hřebeny. Polymerace trvá 3-4 minuty. Gely před použitím necháme ještě nejméně 30 minut dále polymerovat Nanášení vzorků Nanášíme pomocí dávkovače Hamilton (50 µl) 6 µl extraktu (viz 1.2.) do každé kapsy v gelu Podmínky dělení pro 2 paralelní gely Elektrodový pufr: Pufr 2 Teplota: 7-10 C v elfo prostoru (zajistí se pomocí kryostatu) Proud: zpočátku 78 ma (10 minut), potom nastavit 140 ma, ustaví se podmínky cca 90 ma a 400 V (30 minut) Napětí: ohraničit na max.400 V Výkon: ohraničit na max. 100 W Směr dělení: od katody (-) k anodě (+) Označení čela: pruh amidočerni Doba dělení: cca min., po těchto 40 minutách ukončit dělení Barvení proteinů Na 2 gely: 350 ml barvicího roztoku 2; 2 hodiny kývat a potom nechat stát přes noc. K odbarvení promýt 2 x 30 minut ve vodě a 1x 30 minut v 2% glycerinu. Gely vysušit na vzduchu mezi 2 vrstvami celofánu (zvlhčeném 2% glycerinem) Hodnocení výsledku elektroforézy Vizuální Získaná elektroforetická spektra hlízových proteinů lze již v nevysušeném stavu vyhodnotit vizuálně porovnáním s etalonovým spektrem deklarované odrůdy. Při tomto způsobu hodnocení můžeme rozhodnout, které hlízy odpovídají a které neodpovídají odrůdové III. Metodika elektroforézy (1996) 8

9 deklaraci. U neodpovídajících hlíz však nemůžeme určit, které odrůdě náležejí. Uschované usušené gely lze archivovat pro případnou kontrolu správnosti vizuálního vyhodnocení, případně je vyhodnotit pomocí softwaru Sortbest Hodnocení pomocí počítačového programu Sortbest V rámci výzkumného projektu je postupně vytvářen registr denzitogramů registrovaných odrůd brambor. Po vložení denzitogramu neznámé odrůdy program porovnáváním s již uloženými údaji vybírá nejpodobnější denzitogram, podle hodnoty koeficientu podobnosti lze potom s určitou pravděpodobností přiřadit neznámému vzorku odrůdovou deklaraci. Příklady identifikace neznámé odrůdy pomocí záznamů uložených v počítačové knihovně programu Sortbes. III. Metodika elektroforézy (1996) 9

10 IV. Polyakrylamidová gelová elektroforéza pro analýzu esteráz, peroxidáz a patatinů v bramborách podle Bundessortenamt (2002) postup používaný v SRN a přijatý UPOV (přeloženo z německého originálu a modifikováno podle podmínek laboratoře VÚRV) zahrnuje i modifikaci metody UPOV (1996) 1. Počet hlíz na test: - pro DUS ( odlišnost, uniformitu a stálost) : 10 hlíz - pro kontrolu identity: 4 hlízy Hlízy musí být zralé, sklizené ihned po zaschnutí listů, při skladování v rozmezí teplot 4 až 10 C mohou být použity nezávisle na sezóně, dokud nezačnou klíčit. 2. Přístroje a zařízení: mrazák (minimálně na -20 C) chlazená centrifuga kryostat třepačka (kývačka) na ploché gely vertikální elektroforetický přístroj pro 2 gely* zdroj stejnosměrného proudu alespoň na 400 V a 150 ma** běžné laboratorní vybavení (analytické váhy, lednice, automatické pipety, dávkovače Hamilton), aj. *Může být použit jakýkoli vhodný přístroj pro elfo, jestliže umožňuje udržování konstantní teploty gelů. Tloušťka gelu by neměla být vyšší než 1,5 mm. ** Zdroj proudu by měl umožnit nastavení konstantního proudu nebo konstantního napětí. 3. Chemikálie: Všechny chemikálie stupně analytical reagent (p.a.) nebo lepší 3.1. Chemikálie pro extrakci proteinů Amidočerň 10 B Siřičitan sodný Na 2 SO 3 Disiřičitan sodný Na 2 S 2 O 5 Sacharóza 3.2. Chemikálie pro elektroforézu 40% Akrylamid roztok (AA) (velmi toxický!!) (AA) Persíran amonný (APS) 2% Methylen Bis - akrylamid roztok (BIS) (velmi toxický!!) Kyselina boritá Bromfenolová modř (BPB) 3- (Dimethylamino) propionitril (DMAPN) Ethanol IV. Metodika elektroforézy (2002) 10

11 Glycin Kyselina chlorovodíková Sacharóza N,N,N N - Tetramethylethylenediamine (TEMED) Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS) 3.3. Chemikálie pro barvení proteinů Aceton Coomassie Blue G 250 Coomassie Blue R 250 Dianisidin-2HCl (extrémně toxický!!) Hydrogenfosforečnan dvojsodný dodekahydrát (Na 2 HPO H 2 O) Fast Blue RR Salt Ledová kyselina octová Glycerol 30% Peroxid vodíku Methanol 1-Naftylacetát Dihydrogenfosforečnan sodný monohydrát (NaH 2 PO 4. 1 H 2 O) Kyselina trichloroctová (TCA) 4. Roztoky 4.1.Extrakční roztoky č. Roztok Složky Množství Poznámka Extrakční roztok A Siřičitan sodný Na 2 SO 3 Disiřičitan sodný Na 2 S 2 O 5 Deionizovaná voda 5,00 g 3,75 g do 100 ml Extrakční roztok B Extrakční roztok C Sacharóza Amidočerň 10B Deionizovaná voda Extrakční roztok A Extrakční roztok B 500 g 0,3 g do 1000 ml 10 ml 100 ml lze skladovat při 6 C lze skladovat při 6 C denně čerstvý IV. Metodika elektroforézy (2002) 11

12 4.2. Pufry a gelové roztoky č. Roztok Složky Množství Poznámka TRIS 30,26 g Gelový pufr Kys.boritá 36,6 g zásobní Deionizovaná voda do 1000 ml % roztok AA % roztok BIS % roztok APS Elektrodový pufr AA Deionizovaná voda BIS Deionizovaná voda APS Deionizovaná voda Pufr Deionizovaná voda 40 g do 100 ml 2 g do 100 ml 1 g do 50 ml 125 ml 875 ml Pro bezpečnost by měl být používán komerční roztok Pro bezpečnost by měl být používán komerční roztok Denně čerstvý Denně čerstvý Pufry a roztoky pro PAGE ph 8,9 pro patatiny a (peroxidázy) č. Roztok Složky Množství Poznámka TRIS 75,4 g Upravit ph na Pufr na dělicí Deionizovaná voda do 1000 ml 8,9 přidáním (spodní) gel Pufr na zaostřovací (horní) gel Zaostřovací gel TRIS Bromfenolová modř Deionizovaná voda Pufr % AA 2 % BIS Deionizovaná voda 16 g 100 mg do 1000 ml 280 ml 45 ml 73 ml 150 ml 80 g HCl Upravit ph na 6,7 přidáním HCl Sacharóza % AA viz komerční rozt % BIS viz komerční rozt % APS viz denně čerstvý % ethanol Zásobní el. pufr Elektrodový pufr ethanol Deionizovaná voda TRIS Glycin Deionizovaná voda Pufr Deionizovaná voda 10 ml do 100 ml 5,2 g 3,5 g do 1000 ml 50 ml do 1000 ml denně čerstvý IV. Metodika elektroforézy (2002) 12

13 4.3. Barvicí roztoky pro patatiny, peroxidázy a esterázy č. Roztok Složky Množství Poznámka Zásobní roztok Coomassie Br. Blue G 250 Coomassie Br. Blue R 250 deionizovaná voda 0,25 g 0,75 g do 100 ml Barvicí roztok pro patatiny Barvicí pufr A pro esterázy Barvicí pufr B pro esterázy Barvicí pufr pro peroxidázy Dianisidinový roztok % glycerin TCA Ledová kys. octová vodovodní voda methanol roztok Na 2 HPO 4 x 12 H 2 O deionizovaná voda NaH 2 PO 4 x 1 H 2 O deionizovaná voda Dianisidin-2HCl deionizovaná voda Glycerol deionizovaná voda 240g 280 ml ml 600 ml 100 ml 53,7 g do 1000 ml 20,7 g do 1000 ml 1 g do 100 ml 20 g do 1000 ml míchat alespoň 1 hodinu důkladně; protřepat před použitím může být skladován při 6 C 1 týden 5. Pracovní postup 5.1.Příprava vzorků Hlízy zmrazit na -20 C ( minimálně 16 hod.) a pak nechat rozmrazit při pokojové teplotě. Pro analýzu každé hlízy je potřebná 2 ml centrifugační kyveta obsahující 0,4 ml extrakčního roztoku C (4.1.3). Rozmrzlé hlízy se rozříznou a vymáčknou. 1,5 ml šťávy se zachytí do výše uvedené kyvety a promíchá s extrakčním roztokem C (míchání). Dále se centrifuguje 15 minut při ot.min -1 a 10 C. Supernatanty se přenesou do nové prázdné centrifugační kyvety a zmrazí se pro pozdější provedení elfo. Před začátkem elfo se extrakty rozmrazí a alikvoty (150 µl) se přenesou do jamek mikrotitrační destičky. IV. Metodika elektroforézy (2002) 13

14 5.2. Příprava gelů Příprava gelů pro PAGE ph 7,9 pro esterázy (patatiny rychleji) Rozpis složek pro různé objemy gelu Složky Objem gelu 40 ml 80 ml 100 ml 120 ml 150 ml 200 ml pufr 3 30,32 ml 60,64 ml 75,8 ml 90,96 ml 113,7 ml 151,6 ml AA 40% 4,68 ml 9,36 ml 11,7 ml 14,04 ml 17,55 ml 23,4 ml BIS 2% 4,96 ml 9,92 ml 12,4 ml 14,88 ml 18,6 ml 24,8 ml siřičitan sodný 0,0165 g 0,033 g 0,042 g 0,05 g 0,063 g 0,084 g DMAPN* 0,2 ml 0,4 ml 0,5 ml 0,6 ml 0,75 ml 1,0 ml pers. 2% 0,76 ml 1,52 ml 1,9 ml 2,28 ml 2,85 ml 3,8 ml - Sestavit suché a čisté gelové kazety - Připravit cca 100 ml gel. roztoku (T: 4,9%; C: 4,7%): - Po pečlivém rozpuštění a rozmíchání 108 mg siřičitanu sodného v 55 ml deionizované vody se přidají následující roztoky: 30 ml (zásobní gel. pufr) 30 ml ( 40% AA) 30 ml (2% BIS) Polymerace se nastartuje přidáním: 1,2 ml DMAPN 4,5 ml (2% APS) - Po zamíchání se gely pečlivě nalijí, aby se zabránilo tvorbě bublinek vzduchu. Hřebeny pro vytvoření kapes v gelu se vloží do kapalného gelu a polymerace probíhá při pokojové teplotě alespoň 15 minut. Hřebeny se potom vyjmou. Vzniklé kapsy se promyjí a naplní elektrodovým pufrem ( ) Příprava gelů pro PAGE ph 8,9 pro peroxidázy a patatiny - Sestavit suché a čisté gelové kazety - Každý gel se skládá z dělicího a zaostřovacího gelu - Příprava cca 100 ml dělicího gelu (T: 5,5%; C: 4,4%) - Následující jednotlivé složky jsou přidávány za pomalého míchání: 60 ml gel. pufru ml deionizované vody 14 ml (40 % AA) 13 ml (2% BIS) Polymerace se nastartuje přidáním: 100 μl TEMED 6 ml (2% APS) IV. Metodika elektroforézy (2002) 14

15 - Gely se pečlivě nalijí tak, aby se netvořily bublinky vzduchu a polymerace probíhá alespoň 15 minut při pokojové teplotě. Gelové kazety by neměly být zcela naplněny, aby byl prostor pro 14 mm vrstvu zaostřovacího gelu. Povrch gelu se pečlivě opatrně převrství 10% ethanolem ( ) pomocí injekční stříkačky. Po skončení polymerace (po cca 30 minutách) se povrch gelu omyje deionizovanou vodou a osuší filtračním papírem. - Příprava zaostřovacího gelu: Přidávat a pomalu míchat: 15 ml roztoku (obsahuje , 40% AA, 2% BIS,. deion. voda, sacharoza) 60 μl TEMED 375 μl (2% APS) - Gely se pečlivě nalijí tak, aby se nevytvořily vzduchové bublinky, vloží se hřebeny pro tvorbu jamek a polymerace probíhá alespoň 15 minut. Potom se hřebeny opatrně vyjmou a jamky v gelu se promyjí a naplní elektrodovým pufrem Nanášení vzorků - Pro elektroforézu esteráz a peroxidáz je nanášeno do každé jamky 6 12 μl extraktu z mikrotitrační destičky ( v závislosti na velikosti jamek). - Pro elektroforézu patatinů je nanášeno do každé jamky 3-6 μl extraktu z mikrotitrační destičky ( v závislosti na velikosti jamek) Elektroforéza Podmínky PAGE ph 7,9 pro esterázy Elektrodový pufr Proud /2 gely (11 cm šířka, 1 mm tloušťka) 10 minut 78 ma, 30 minut 100 ma* Napětí max. 400 V Teplota 5 15 C Směr migrace do katody (-) k anodě (+) Migrační vzdálenost dráha za 40 minut * hodnoty 100 ma není dosaženo, protože napětí je limitováno na 400 V Podmínky pro PAGE ph 8,9 pro patatiny (a peroxidázy) Elektrodový pufr Proud /2 gely (11 cm šířka, 1 mm tloušťka) 80 ma (průchod horním gelem), potom 160 ma** Napětí max. 300 V Teplota 5 15 C Směr migrace do katody (-) k anodě (+) Migrační vzdálenost 6 cm bromfenolová modř (čelo) od rozhraní gelů ** hodnoty 160 ma není dosaženo, protože napětí je limitováno na 300 V IV. Metodika elektroforézy (2002) 15

16 5.5. Barvení: Barvení esteráz: Gely z PAGE ph 7,9 se označí, např. odříznutím růžku gelu. Potom se gely přenesou do barvicí misky se směsí 120 ml barvicího pufru A (4.3.3.) a 80 ml barvicího pufru B (4.3.4.) a inkubují se na kývací třepačce.50 mg 1-naftylacetátu se rozpustí ve 3 kapkách acetonu a ředí se deionizovanou vodou, dokud se roztok nezakalí. Roztok se přidá k pufrům a gelu. 100 mg Fast Blue RR se suspenduje v 5 ml acetonu a zředí 5 ml deionizované vody. Tento roztok se přidá ihned k pufrovým roztokům a gelu. Doba barvení se pohybuje mezi 15 a 40 minutami. Potom jsou gely inkubovány na třepačce 2 x 30 minut s deionizovanou vodou a dále se gely inkubují na třepačce v 2% roztoku glycerolu (4.3.6.) po dobu 30 minut. Po této inkubaci se gely usuší mezi dvěma vrstvami celofánu, namočeného v 2% glycerolu Barvení peroxidáz: Gely z PAGE ph 8,9 se označí, např. odříznutím růžku gelu. Potom se gely přenesou do barvicí misky naplněné 200 ml barvicího pufru (4.3.4.) a inkubují se na kývací třepačce. Přidá se 10 ml roztoku dianisidinu (4.3.5.). Po 30 sec se reakce nastartuje přidáním 260 μl 30% H 2 O 2. Doba barvení se pohybuje mezi 10 a 20 minutami. Pro odbarvení se gely inkubují na třepačce 2 x 30 minut s deionizovanou vodou a dále se inkubují na třepačce v 2% roztoku glycerolu (4.3.6.) po dobu 30 minut. Po této inkubaci se gely usuší mezi dvěma vrstvami celofánu, namočeného v 2% glycerolu Barvení patatinů: Gely z PAGE ph 8,9 se označí, např. odříznutím růžku gelu. Potom se gely přenesou do barvicí misky naplněné 300 ml barvicího pufru (4.3.2.) a inkubují se na kývací třepačce 3 hodiny. Gely se ponechají v barvicí lázni přes noc bez třepání. Pro odbarvení se gely inkubují na třepačce 2 x 30 minut s vodovodní vodou a dále se inkubují na třepačce v 2% roztoku glycerolu (4.3.6.) po dobu 30 minut. Po této inkubaci se gely usuší mezi dvěma vrstvami celofánu, namočeného v 2% glycerolu. 6. Identifikace proteinových alel Identifikace alel esterázových isoenzymů Pozice jednotlivých esterázových isoenzymů jsou kalibrovány odrůdou Sieglinde. Odrůda Sieglinde vykazuje 3 pruhy s vysokou enzymatickou aktivitou v následujících pozicích: Esterázové ieoenzymy bramborových hlíz jsou vysoce polymorfní. Pro jasnou interpretaci byly zymogramy rozděleny do čtyř bloků pruhů. Bloky pruhů Est 1 a Est 4 mají jen nízkou enzymatickou aktivitu. Bloky pruhů Est 2 a Est 3 mají naopak vysokou enzymatickou aktivitu. Pro stanovení odlišnosti, jednotnosti a stálosti (DUS) jsou používány pouze bloky Est 2 a Est 3. IV. Metodika elektroforézy (2002) 16

17 Obrázek IV.1.: Esterázy odrůdy Sieglinde a přehled bloků Est 1, Est 2, Est 3 a Est 4 Brambory jsou vegetativně množený tetraploidní druh. Proto je třeba očekávat mnoho heterozygotních genotypů. Jednotlivé genotypy mohou být rozlišeny pouze podle genové dávky. Takové genotypy se často nacházejí v Est 2 a Est 3. Kombinace mezi null- alelou a aktivními alelami a genotypy majícími plnou dávku genu vykazují identické pruhy. Proto jsou vyhodnoceny jako identické. Est Est Př. Zn. Es Est Př. odrůdy Zn. Est Est Př. Zn. 2 3 odrůdy t odrůdy a o Desirée 4 b o Cleopatra 18 c o Obelix 22 d o Achat 5 d b Vital 23 d c Krometa 19 e o Sibu 20 f o Wali 12 g b Premiere 26 h o Jetta 6 i o Renate 8 i b Selma 7 i c Karakter 15 j o Hansa 1 j b Ute 9 j c Karolin 3 k o Belita 13 k d Junior 17 l o Roxy 16 l c Sieglinde 2 o o Ulla 11 IV. Metodika elektroforézy (2002) 17

18 Schemata genotypů v rámci lokusu Est 2 Obrázek IV.2.: Schematické znázornění alel v rámci lokusu Est 2 V Est 2 vykazuje většina genotypů 2 pruhy (označené a-1). Byly detekovány genotypy s více než 2 pruhy. Tyto typy mohou být interpretovány jako kombinace dvou genotypů obsahujících dva pruhy. Genotyp Genotyp Př. odrůdy Pozn. Est 2 Est 3 dl o Leyla nerozlišitelný od genotypu Est 2:d + Est 3: o dl c Aiko nerozlišitelný od genotypu Est 2:d + Est 3: c jf o Protea Existuje překrytí genových produktů 75 a 77 náležejícím genotypu Est 2: l s genovým produktem náležejícím genotypu Est 1. Proto není možné získat jasnou separaci mezi hybridy typu Est2: l x d a genotypy Est 2:d. Proto genotyp dl a genotyp l nebudou vyhodnoceny jako rozdílné Schemata genotypů v rámci lokusu Est 3 Obrázek IV.3.: Schematické znázornění alel v rámci lokusu Est 3 IV. Metodika elektroforézy (2002) 18

19 (6.2. Identifikace alel peroxidázových isoenzymů) je zde uvedena jen pro úplnost (viz text) Elektroforéza a identifikace peroxidázových isoenzymů nebyla prováděna vzhledem k vysoké toxicitě substrátu pro identifikaci o dianisidinu, který je klasifikován např. podle Katalogu Sigma Biochemikálie a Reagencie na str. 628 jako probably carcinogenic. Peroxidázové isoenzymy hlíz brambor jsou monomerické enzymy. Pozice jednotlivých isoenzymů jsou kalibrovány odrůdou Amigo. Odrůda Amigo vykazuje dva pruhy Obrázek IV.4.: Isoenzymy peroxidáz odrůdy Amigo Genotyp Příklad Znač. Genotyp Příklad Znač. a Hansa 1 f Diana 7 b Corine 2 g Thomana 6 c Tomensa 3 h Kanjer 8 d Amigo 4 j 1 e Jetta 5 Obrázek IV.5.: Schematické znázornění alel v rámci peroxidázového lokusu Genotypy označené hvězdičkou vykazují snižující se genovou dávku v jednotlivých peroxidázách. Mohou být interpretovány jako kombinace mezi aktivními alelami a nullalelou. Takové genotypy jsou považovány za genotypy s plnou genovou dávkou. Genotyp j IV. Metodika elektroforézy (2002) 19

20 dává zymogramy blízké ke genotypu a; takže genotypy a a j nejsou označeny jako rozdílné. Oba genotypy mají tutéž značku :1 6.3.Identifikace alel patatinů Patatiny jsou monomerické peptidové řetězce Tabulka alel patatinů a označení s příklady odrůd Genotyp Příklad odrůdy Genotyp Příklad odrůdy Genotyp Příklad odrůdy 1.01 Secura 4.08 Sommergold 7.08 Adletta 2.01 Erntestolz 4.09 Wali 7.09 Ukama 2.02 Desiree 4.10 Juliver 8.01 Berolina 2.03 Pompadur 4.11 Pepo 8.02 Escort 2.04 Delia 4.12 Saturna 8.03 Darwina 3.01 Quarta Shepody 3.02 Irmgard 4.14 Aiko 8.05 Kardal 3.03 Ulla 4.15 Amigo 8.06 Padea 3.04 Fasan Elles 3.05 Karolin 4.17 Oktan 8.08 Solara 3.06 Gloria 5.01 Belita 8.09 Thomana 3.07 Junior 5.02 Solina 8.10 Karida 3.08 Danva 6.01 Artana 8.11 Vebeca 3.09 Combi 6.02 Quinta 8.12 Arnika 4.01 Indira 7.01 Fausta 8.13 Krometa 4.02 Christa Sirius 4.03 Pia 7.03 Pallina 8.15 Alba 4.04 Rubin 7.04 Grata 8.16 Feska 4.05 Cleopatra 7.05 Atica 9.01 Calla 4.06 Felsina 7.06 Karnico Liu 4.07 Cinja 7.07 Franca Kranich IV. Metodika elektroforézy (2002) 20

21 6.3.1.Grupování elfo spekter Patatiny jsou definovány jejich elektroforetickou mobilitou (REM hodnota). Pozice jednotlivých patatinů jsou ilustrovány na příkladu odrůdy Hansa. Obrázek IV.6.: Patatiny odrůdy Hansa Patatiny jsou extrémně polymorfní proteiny. Počet alelických kombinací je vyšší než 80. Proto je grupování patatinových spekter nutné. Patatiny s vysokou mobilitou (REM mezi 33 a 60) jsou použity pro grupování. Tyto patatiny jsou identické s A-, B-, C- a D pruhy podle Stegemanna a Löschke (1976). Tvoří 8 skupin: skupinu 1 skupinu 8. Navíc existují dvě speciální skupiny: skupina 10 je definována přítomností pruhu 36 a skupina 9 je definována absencí B-pruhu. Obrázek IV.7: Schémata jednotlivých skupinových spekter patatinů IV. Metodika elektroforézy (2002) 21

22 Tabulka: Hodnoty REM v jednotlivých skupinách Hansa Skupina patatinů A B C D Analýza intenzit pruhů Rozdíly v intenzitách pruhů mohou být způsobeny rozdílnou genovou dávkou. Jsou pozorovány v pozicích 15, 21, 26, 31, 33 a 34. Vyskytují se např. v typu Obrázek IV.8.: Příklady rozdílů v intezitách pruhů v rámci podskupiny patatinů 5.01 Spektra se liší pouze v intenzitách pruhů hodnocených jako identické. IV. Metodika elektroforézy (2002) 22

23 6.3.3.Schemata skupin a podskupin spekter Obrázek IV.9.a: Schematické znázornění podskupin patatinů v rámci skupin 1 3 Obrázek IV.9.b: Schematické znázornění podskupin patatinů v rámci skupiny 4 Obrázek IV.9.c: Schematické znázornění podskupin patatinů v rámci skupin 5 7 IV. Metodika elektroforézy (2002) 23

24 Obrázek IV.9.d: Schematické znázornění podskupin patatinů v rámci skupiny 8 Obrázek IV.9.e: Schematické znázornění podskupin patatinů v rámci skupin 9,10 Poznámka ke skupinám 5 8 Pruh 33 je mimořádně intenzivní a překrývá pruh 31; proto pruh 31 není v přítomnosti pruhu 33 vůbec patrný. Platí to i v případě snížené intenzity pruhu 33. IV. Metodika elektroforézy (2002) 24

25 IV. Metodika elektroforézy (2002) 25

26 V. Příklady získaných elektroforetických spekter hlízových proteinů Pro ilustraci uvádíme fotografie získaných elektroforetických spekter níže uvedených registrovaných odrůd brambor a některých etalonových odrůd používaných pro kalibraci spektra. Na první pohled je patrné, že mezi jednotlivými odrůdami jsou dobře rozlišitelné rozdíly. S 112 Sirius Etalony: Ha - Hansa S 113 Symfonia Si - Sieglinde S 114 Tábor Ob - Obelix S 115 Tara S 116 Ukama S 117 Van Gogh S 118 Vilma S Vladan V. Příklady získaných elektroforetických spekter hlízových proteinů 26

27 Získaná elektroforetická spektra jsou na gelech proměřena, vypočteny hodnoty REM, sestavena tabulka hodnot REM a jejich grafické znázornění (schemata). Tímto způsobem je vytvářen celý katalog elektroforetických spekter hlízových proteinů (patatinů) všech registrovaných odrůd brambor. Pro ilustraci uvádíme několik ukázek získaných schemat. S SIRIUS REM S SYMFONIA REM S TÁBOR REM S TARA REM S UKAMA REM V. Příklady získaných elektroforetických spekter hlízových proteinů 27

28 S117 - VAN GOGH REM S VILMA REM S VLADAN REM V. Příklady získaných elektroforetických spekter hlízových proteinů 28

29 VI. Příklad postupu při odrůdové identifikaci odrůdy ze vzorků konzumních brambor V srpnu 2005 byly v supermarketu Delvita zakoupeny balené konzumní brambory rané s odrůdovou deklarací (Marabel a Vivaldi) (obr. 1,2 identifikační štítky na obalových siťkách). Z každé síťky bylo náhodně odebráno po 5 hlízách (metodika UPOV předepisuje analýzu 4 hlíz pro odrůdovou identifikaci). Postupem uvedeným v kapitole IV. byly připraveny extrakty hlízových proteinů a provedena elektroforéza patatinů. Na gel byly společně s testovanými extrakty naneseny i extrakty z etalonů odrůd Marabel a Vivaldi a provedeno vizuální porovnání s testovanými hlízami. Dále byly usušené gely vyhodnoceny pomocí programu Sortbest s cílem identifikovat odrůdu. Získaná elektroforetická spektra jsou zobrazena na obr. 3 a 4. Bylo zjištěno, že v obou případech byla získaná elektroforetická spektra testovaných hlíz zcela shodná s etalonovými spektry příslušných odrůd (Marabel, Vivaldi). Současně bylo zjištěno, že všech 5 testovaných hlíz od každé odrůdy vykázalo rovněž navzájem shodná elektroforetická spektra patatinů, že tedy vzorky byly odrůdově homogenní a odpovídaly odrůdové deklaraci. VI. Příklad postupu při identifikaci odrůdy ze vzorku konzumních brambor 29

30 Obrázky VI.3 a VI. 4.: Elektroforetické spektrum vzorků zakoupených konzumních brambor s odrůdovou deklarací Vivaldi a Marabel a spektrum etalonových odrůd Vivaldi (S 42) a Marabel (S9) VI. Příklad postupu při identifikaci odrůdy ze vzorku konzumních brambor 30

31 VII. Použitá literatura Desborough,S.L.: Potato (Solanum Tuberosum L.). S.D.Tanksley,T.J.Orton(Eds.) Isozymes in Plant genetics and breeding, Part B. Elsevier Science Publishers B.V.,Amsterdam: 1983, s Paulik,M.D.:. Starch gel electrophoresis in a discontinuous system of buffers. Nature. 180, 1957, s Pivoňková,V.: Změny v obchodování s konzumními bramborami v souvislosti s platností Zákona o potravinách a tabákových výrobcích. Bramborářství, 1997, 6. Souček, J.: Ochrana odrůd brambor v ČR a uplatňování licenčních poplatků při prodeji certifikované sadby brambor. Bramborářství, 1997, 6. Stegemann, H.- Loeschke,V.: Index of European Potato Varieties. Identification by electrophoretic spectra, National registers, Appraisal of Characteristics, Genetic Data. Mitt.Biol.Bundesanst. Berlin-Dahlem, Heft 168,1976 Stegemann, H.- Loeschke,V.: Das europäische Kartoffelsortiment und seine Indexierung. Potato Res.20, 1977, s Sýkorová,S. : Identifikace odrůd brambor (Solanum tuberosum L.) pomocí elektroforézy proteinů a enzymů. Rostl. Výroba,45, 1999: Šašek,A.: Elektroforetické rozdíly ve složení bílkovinných komplexů domácích a zahraničních odrůd brambor. Gen. a Šlecht. 10 (3), 1974 b, s Šašek,A.: Vliv ozáření a teploty skladování na frakční složení bílkovin brambor. Gen. a Šlecht.10 (3), 1974 a, s UPOV TWA 31/6 Bundessortenamt (Rio de Janeiro 2002) Draft test guedelines for potato UPOV, Bundessortenamt, 1996, Draft test guedelines for potato VII. Použitá literatura 31

Výzkumný ústav rostlinné výroby Praha Ruzyně

Výzkumný ústav rostlinné výroby Praha Ruzyně Výzkumný ústav rostlinné výroby Praha Ruzyně Optimalizovaná metodika PAGE pro analýzu esteráz v hlízách brambor (Solanum tuberosum L.) Vypracovaná jako výstup projektu 1B 44011 VÝVOJ A TESTOVÁNÍ SYSTÉMU

Více

Výzkumný ústav rostlinné výroby Praha Ruzyně

Výzkumný ústav rostlinné výroby Praha Ruzyně Výzkumný ústav rostlinné výroby Praha Ruzyně Optimalizovaná metodika PAGE pro analýzu peroxidáz v hlízách brambor (Solanum tuberosum L.) Vypracovaná jako výstup projektu 1B 44011 VÝVOJ A TESTOVÁNÍ SYSTÉMU

Více

MOŽNOST VYUŽITÍ ELEKTROFORÉZY HLÍZOVÝCH PROTEINŮ A ESTERÁZ K CHARAKTERIZACI REGISTROVANÝCH ODRŮD BRAMBOR

MOŽNOST VYUŽITÍ ELEKTROFORÉZY HLÍZOVÝCH PROTEINŮ A ESTERÁZ K CHARAKTERIZACI REGISTROVANÝCH ODRŮD BRAMBOR MOŽNOST VYUŽITÍ ELEKTROFORÉZY HLÍZOVÝCH PROTEINŮ A ESTERÁZ K CHARAKTERIZACI REGISTROVANÝCH ODRŮD BRAMBOR The Possibility of Use of Tuber Protein and Esterase Electrophoresis for the Characterization of

Více

Výzkumný ústav rostlinné výroby Praha Ruzyně. Metodika byla vypracována jako výstup výzkumného záměru MZe č. 0002700602. Autor: Ing.

Výzkumný ústav rostlinné výroby Praha Ruzyně. Metodika byla vypracována jako výstup výzkumného záměru MZe č. 0002700602. Autor: Ing. Výzkumný ústav rostlinné výroby Praha Ruzyně Optimalizovaná metodika SDS-PAGE pro analýzu LMW podjednotek gluteninů pšenice Metodika byla vypracována jako výstup výzkumného záměru MZe č. 0002700602 Autor:

Více

SDS-PAGE elektroforéza

SDS-PAGE elektroforéza SDS-PAGE elektroforéza Příprava gelu... 1 Recept na 0.75 mm gel (1 gel/2 gely)... 2 Recept na 1.5 mm gel (1 gel/2 gely)... 2 Příprava vzorku... 3 Elektroforéza... 3 Barvení gelů Blue Silver... 4 Chemikálie

Více

Obsah Protein Gel Electrophoresis Kitu a jeho skladování

Obsah Protein Gel Electrophoresis Kitu a jeho skladování Obsah Protein Gel Electrophoresis Kitu a jeho skladování Protein Gel Electrophoresis Kit obsahuje veškerý potřebný materiál provádění vertikální polyakrilamidové gelové elektroforézy. Experiment provádějí

Více

SDS polyakrylamidová gelová elektroforéza (SDS PAGE)

SDS polyakrylamidová gelová elektroforéza (SDS PAGE) SDS polyakrylamidová gelová elektroforéza (SDS PAGE) Princip SDS polyakrylamidová gelová elektroforéza slouží k separaci proteinů na základě jejich velikosti (molekulové hmotnosti). Zahřátím vzorku za

Více

Elektroforéza v přítomnosti SDS SDS PAGE

Elektroforéza v přítomnosti SDS SDS PAGE Elektroforéza v přítomnosti SDS SDS PAGE Elektroforéza v přítomnosti SDS SDS PAGE je jednoduchá, rychlá a reprodukovatelná metoda pro kvalifikovanou charakterizaci a srovnání bílkovin.tato metoda separuje

Více

PROTOKOL WESTERN BLOT

PROTOKOL WESTERN BLOT WESTERN BLOT 1. PŘÍPRAVA ELEKTROFORETICKÉ APARATURY Saponátem a vodou se důkladně umyjí skla, plastové vložky a hřebínek, poté se důkladně opláchnou deionizovanou/destilovanou vodou a etanolem a nechají

Více

PROTEINOVÁ DENATURUJÍCÍ ELEKTROFORÉZA (SDS PAGE)

PROTEINOVÁ DENATURUJÍCÍ ELEKTROFORÉZA (SDS PAGE) PROTEINOVÁ DENATURUJÍCÍ ELEKTROFORÉZA (SDS PAGE) Denaturující proteinová elektroforéza (SDS PAGE - SDS Protein Acrylamide Gel Electrophoresis) je metoda, která se používá k separaci proteinů podle velikosti,

Více

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MYKOTOXINŮ METODOU LC-MS - FUMONISIN B 1 A B 2

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MYKOTOXINŮ METODOU LC-MS - FUMONISIN B 1 A B 2 Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU MYKOTOXINŮ METODOU LC-MS - FUMONISIN B 1 A B 2 1 Rozsah a účel Metoda je vhodná pro stanovení fumonisinů B 1 a B 2 v krmivech. 2 Princip Fumonisiny

Více

CHARAKTERIZACE GENOTYPŮ OVSA S VYUŽITÍM ELEKTROFORÉZY AVENINŮ V POLYAKRYLAMIDOVÉM GELU (A-PAGE)

CHARAKTERIZACE GENOTYPŮ OVSA S VYUŽITÍM ELEKTROFORÉZY AVENINŮ V POLYAKRYLAMIDOVÉM GELU (A-PAGE) Zemědělský výzkumný ústav Kroměříž, s.r.o. Agrotest fyto, s.r.o. CHARAKTERIZACE GENOTYPŮ OVSA S VYUŽITÍM ELEKTROFORÉZY AVENINŮ V POLYAKRYLAMIDOVÉM GELU (A-PAGE) Metodika Kroměříž, 2010 I. Polišenská, L.

Více

Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti ELEKTROMIGRAČNÍ METODY

Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti ELEKTROMIGRAČNÍ METODY Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti ELEKTROMIGRAČNÍ METODY ELEKTROFORÉZA K čemu to je? kritérium čistoty preparátu stanovení molekulové hmotnosti makromolekul stanovení izoelektrického

Více

ELEKTROFORETICKÉ METODY

ELEKTROFORETICKÉ METODY ELEKTROFORETICKÉ METODY ELEKTROFORETICKÁ SEPARACE AMINOKYSELIN NA PAPÍROVÉM NOSIČI Aminokyseliny lze rozdělit elektroforézou na papíře. Protože molekulová hmotnost jednotlivých aminokyselin není příliš

Více

(Triticum aestivum L.)

(Triticum aestivum L.) Výzkumný ústav rostlinné výroby Praha Ruzyně Optimalizace metod elektroforézy proteinů pro identifikaci odrůd pšenice (Triticum aestivum L.) Metodika vypracována jako výstup projektu NAZV QF 3050: Vývoj

Více

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU SEMDURAMICINU METODOU HPLC

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU SEMDURAMICINU METODOU HPLC Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU SEMDURAMICINU METODOU HPLC 1 Rozsah a účel Postup specifikuje podmínky pro stanovení obsahu semduramicinu v krmivech metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) v koncentračním

Více

TECHNICKÁ SPECIFIKACE Vybavení genetické laboratoře pro projekt EXTEMIT-K část B

TECHNICKÁ SPECIFIKACE Vybavení genetické laboratoře pro projekt EXTEMIT-K část B TECHNICKÁ SPECIFIKACE Vybavení genetické laboratoře pro projekt EXTEMIT-K část B OBSAH Sestava pro vertikální elektroforézu... 2 Jednotka pro elektroforézu... 3 Termocykler... 4 Elektrický zdroj pro elektroforézu...

Více

Inkubace enzymů se substráty

Inkubace enzymů se substráty Inkubace enzymů se substráty Inkubace redukčních enzymů... 1 Inkubace oxidačních enzymů... 2 Extrakce látek z inkubační směsi... 2 Příprava vzorků k HPLC/UHPLC detekci... 3 Chemikálie a roztoky... 4 Substráty...

Více

Výzkumný ústav rostlinné výroby Praha Ruzyně

Výzkumný ústav rostlinné výroby Praha Ruzyně Výzkumný ústav rostlinné výroby Praha Ruzyně Optimalizace metod elektroforézy proteinů pro identifikaci odrůd ječmene (Hordeum vulgare L.) Metodika vypracována jako výstup projektu NAZV QF 3050: Vývoj

Více

Western blotting. 10% APS 20,28 µl 40,56 µl 81,12 µl 20,28 µl 40,56 µl 81,12 µl

Western blotting. 10% APS 20,28 µl 40,56 µl 81,12 µl 20,28 µl 40,56 µl 81,12 µl Western blotting 1. Příprava gelu složení aparatury hustotu gelu volit podle velikosti proteinů příprava rozdělovacího gelu: 10% 12% počet gelů 1 2 4 1 2 4 objem 6 ml 12 ml 24 ml 6 ml 12 ml 24 ml 40% akrylamid

Více

ANALYTICKÉ ZKUŠEBNICTVÍ

ANALYTICKÉ ZKUŠEBNICTVÍ Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský ANALYTICKÉ ZKUŠEBNICTVÍ DEN ZEMĚDĚLSKÉHO ZKUŠEBNICTVÍ, LÍPA, 12.7.2012 Základní legislativa Zákon č. 147/2002 Sb. ze dne 20. března 2002 o Ústředním kontrolním

Více

Inovace bakalářského studijního oboru Aplikovaná chemie CZ.1.07/2.2.00/

Inovace bakalářského studijního oboru Aplikovaná chemie CZ.1.07/2.2.00/ Dělení bílkovin pomocí diskontinuální elektroforézy v polyakrylamidovém gelu (PAGE) Při elektroforéze dochází k pohybu (migraci) iontů v elektrickém poli. Elektroforetické metody se tedy používají k separaci

Více

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU 5-VINYL - 2-THIOOXAZOLIDONU (GOITRINU) METODOU GC

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU 5-VINYL - 2-THIOOXAZOLIDONU (GOITRINU) METODOU GC Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU 5-VINYL - 2-THIOOXAZOLIDONU (GOITRINU) METODOU GC 1 Rozsah a účel Metoda specifikuje podmínky pro stanovení vinylthiooxazolidonu (dále VOT) v krmivech.

Více

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ AKTIVITY FYTÁZY

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ AKTIVITY FYTÁZY Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ AKTIVITY FYTÁZY 1 Rozsah a účel Postup specifikuje stanovení fytázové aktivity ve vzorcích krmiva. Tímto postupem se nestanoví rozdíl mezi fytázou přidanou

Více

Hmotnostní detekce biologicky významných sloučenin pro biotechnologie část 3 - Provedení štěpení proteinů a následné analýzy,

Hmotnostní detekce biologicky významných sloučenin pro biotechnologie část 3 - Provedení štěpení proteinů a následné analýzy, Laboratoř Metalomiky a Nanotechnologií Hmotnostní detekce biologicky významných sloučenin pro biotechnologie část 3 - Provedení štěpení proteinů a následné analýzy, vyhodnocení výsledků, diskuse Anotace

Více

1. Metodika. Protokol č. F1-4 Metodika: Srovnávací analýza efektivity přípravy rekombinantního proteinu ve fermentoru

1. Metodika. Protokol č. F1-4 Metodika: Srovnávací analýza efektivity přípravy rekombinantního proteinu ve fermentoru Protokol č.: F1-4 Datum: 20.12.2010 Metodika: analýza efektivity přípravy výběr z výsledků ze zkušebních provozů výroby antigenů. Vypracoval: Ing. Václav Filištein, Mgr. Tereza Chrudimská, Spolupracující

Více

HbA1c. Axis - Shield. Společnost je zapsána v obchodním rejstříku Městského soudu v Praze, odd. C vložka 1299

HbA1c. Axis - Shield. Společnost je zapsána v obchodním rejstříku Městského soudu v Praze, odd. C vložka 1299 Lékařská technika a speciální zdravotní materiál Společnost je zapsána v obchodním rejstříku Městského soudu v Praze, odd. C vložka 1299 Obchodní 110, 251 70 Praha Čestlice Tel. +420 296 328 300 Fax. +420

Více

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU DEKOCHINÁTU METODOU HPLC

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU DEKOCHINÁTU METODOU HPLC Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU DEKOCHINÁTU METODOU HPLC 1 Rozsah a účel Tato metoda specifikuje podmínky pro stanovení dekochinátu metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie

Více

2) Připravte si 3 sady po šesti zkumavkách. Do všech zkumavek pipetujte 0.2 ml roztoku BAPNA o různé koncentraci podle tabulky.

2) Připravte si 3 sady po šesti zkumavkách. Do všech zkumavek pipetujte 0.2 ml roztoku BAPNA o různé koncentraci podle tabulky. CVIČENÍ Z ENZYMOLOGIE 1) Stanovení Michaelisovy konstanty trypsinu pomocí chromogenního substrátu. Aktivita trypsinu se určí změřením rychlosti hydrolýzy chromogenního substrátu BAPNA (Nα-benzoyl-L-arginin-p-nitroanilid)

Více

Proteinový fingerprinting vaječného bílku

Proteinový fingerprinting vaječného bílku Proteinový fingerprinting vaječného bílku Proteinový fingerprinting je technika studia populací organizmů založená na izoelektrické fokuzaci (IEF). IEF spočívá v elektroforetickém dělení proteinů podle

Více

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MYKOTOXINŮ METODOU LC-MS - aflatoxin B1, B2, G1 a G2

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MYKOTOXINŮ METODOU LC-MS - aflatoxin B1, B2, G1 a G2 Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU MYKOTOXINŮ METODOU LC-MS - aflatoxin B1, B2, G1 a G2 1 Rozsah a účel Metoda je vhodná pro stanovení aflatoxinů B1, B2, G1 a G2 v krmivech. 2 Princip

Více

S filtračními papíry a membránou je nutno manipulovat pinzetou s tupým koncem.

S filtračními papíry a membránou je nutno manipulovat pinzetou s tupým koncem. Western Blotting Příprava blotovacího sendviče... 1 Blotování... 2 Kontrola přenesení proteinů na membránu... 2 Blokování membrány... 2 Aplikace protilátek... 2 Vizualizace... 3 Vyvolání filmu... 4 Chemikálie

Více

VYUŽITÍ METOD ELEKTROFORÉZY ZÁSOBNÍCH A ENZYMATICKÝCH BÍLKOVIN K ROZLIŠENÍ REGISTROVANÝCH ODRŮD JARNÍHO JEČMENE A JEJICH UPLATNĚNÍ V SEMENÁŘSTVÍ

VYUŽITÍ METOD ELEKTROFORÉZY ZÁSOBNÍCH A ENZYMATICKÝCH BÍLKOVIN K ROZLIŠENÍ REGISTROVANÝCH ODRŮD JARNÍHO JEČMENE A JEJICH UPLATNĚNÍ V SEMENÁŘSTVÍ VYUŽITÍ METOD ELEKTROFORÉZY ZÁSOBNÍCH A ENZYMATICKÝCH BÍLKOVIN K ROZLIŠENÍ REGISTROVANÝCH ODRŮD JARNÍHO JEČMENE A JEJICH UPLATNĚNÍ V SEMENÁŘSTVÍ Use of Storage Protein and Esterase Electrophoresis for

Více

Úloha č. 1 Odměřování objemů, ředění roztoků Strana 1. Úkol 1. Ředění roztoků. Teoretický úvod - viz návod

Úloha č. 1 Odměřování objemů, ředění roztoků Strana 1. Úkol 1. Ředění roztoků. Teoretický úvod - viz návod Úloha č. 1 Odměřování objemů, ředění roztoků Strana 1 Teoretický úvod Uveďte vzorec pro: výpočet směrodatné odchylky výpočet relativní chyby měření [%] Použitý materiál, pomůcky a přístroje Úkol 1. Ředění

Více

CLP ANALYSIS OF MOLECULAR MARKERS DIGITAL IMAGE ANALYSIS OF ELECTROPHOEROGRAMS CZECH VERSION

CLP ANALYSIS OF MOLECULAR MARKERS DIGITAL IMAGE ANALYSIS OF ELECTROPHOEROGRAMS CZECH VERSION CLP ANALYSIS OF MOLECULAR MARKERS DIGITAL IMAGE ANALYSIS OF ELECTROPHOEROGRAMS CZECH VERSION DIGITÁLNÍ OBRAZOVÁ ANALÝZA ELEKTROFORETICKÝCH GELŮ *** Vyhodnocování získaných elektroforeogramů: Pro vyhodnocování

Více

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU KOBALTU METODOU ICP-MS

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU KOBALTU METODOU ICP-MS Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU KOBALTU METODOU ICP-MS 1 Rozsah a účel Metoda specifikuje podmínky pro stanovení celkového obsahu kobaltu v krmivech metodou hmotnostní spektrometrie

Více

Polymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP)

Polymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP) ÚSTAV LÉKAŘSKÉ BIOCHEMIE A LABORATORNÍ DIAGNOSTIKY 1. LF UK Polymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP) Praktické cvičení z lékařské biochemie Všeobecné lékařství Martin Vejražka 2017/18 Obsah POLYMORFISMUS

Více

Protokoly Transformace plasmidu do elektrokompetentních buněk BL21 Pracovní postup:

Protokoly Transformace plasmidu do elektrokompetentních buněk BL21 Pracovní postup: Protokoly Pracovní potřeby, pufry a chemikálie jsou uvedeny na konci protokolu. Pracovní postupy jsou odvozeny od těchto kitů: Champion pet160 Directional TOPO Expression Kit with Lumio Technology (Invitrogen)

Více

Spektrofotometrické stanovení fosforečnanů ve vodách

Spektrofotometrické stanovení fosforečnanů ve vodách Spektrofotometrické stanovení fosforečnanů ve vodách Úkol: Spektrofotometricky stanovte obsah fosforečnanů ve vodě Chemikálie: 0,07165 g dihydrogenfosforečnan draselný KH 2 PO 4 75 ml kyselina sírová H

Více

Projekt Pospolu. Stanovení jílovitých podílů podle ČSN EN A1 Zkouška s methylenovou modří

Projekt Pospolu. Stanovení jílovitých podílů podle ČSN EN A1 Zkouška s methylenovou modří Projekt Pospolu Stanovení jílovitých podílů podle ČSN EN 933-9+A1 Zkouška s methylenovou modří Autorem materiálu a všech jeho částí, není-li uvedeno jinak, je Tomáš Táborský. Jako jedna z hlavních složek

Více

Bakteriální bioluminiscenční test. Stanovení účinnosti čištění odpadních vod pomocí bakteriálního bioluminiscenčního testu

Bakteriální bioluminiscenční test. Stanovení účinnosti čištění odpadních vod pomocí bakteriálního bioluminiscenčního testu Bakteriální bioluminiscenční test Stanovení účinnosti čištění odpadních vod pomocí bakteriálního bioluminiscenčního testu BBTT Cíl: Stanovit účinek odpadních vod na bakterie Vibrio fischeri. Principem

Více

CLP ANALYSIS OF MOLECULAR MARKERS GEL ELECTROPHORESIS OF ISOZYMES AND PROTEINS CZECH VERSION

CLP ANALYSIS OF MOLECULAR MARKERS GEL ELECTROPHORESIS OF ISOZYMES AND PROTEINS CZECH VERSION CLP ANALYSIS OF MOLECULAR MARKERS GEL ELECTROPHORESIS OF ISOZYMES AND PROTEINS CZECH VERSION ANALÝZA BIOCHEMICKÝCH MARKERŮ GELOVÁ ELEKTROFORÉZA ISOENZYMŮ A PROTEINŮ *** Extrakce proteinů pro SDS elektroforézu:,

Více

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU PROBIOTICKÝCH BAKTERIÍ RODU ENTEROCOCCUS

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU PROBIOTICKÝCH BAKTERIÍ RODU ENTEROCOCCUS Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU PROBIOTICKÝCH BAKTERIÍ RODU ENTEROCOCCUS 1 Rozsah a účel Postup slouží ke stanovení počtu probiotických bakterií v doplňkových látkách, premixech

Více

Sraz studentů v 8:00 před laboratoří A5/108, s sebou plášť a přezutí PRINCIP. Polyakrylamidová gelová elektroforéza v přítomnosti SDS (SDS-PAGE)

Sraz studentů v 8:00 před laboratoří A5/108, s sebou plášť a přezutí PRINCIP. Polyakrylamidová gelová elektroforéza v přítomnosti SDS (SDS-PAGE) PRINCIP Sraz studentů v 8:00 před laboratoří A5/108, s sebou plášť a přezutí Polyakrylamidová gelová elektroforéza v přítomnosti SDS (SDS-PAGE) SDS-PAGE slouží k separaci proteinů na základě jejich molekulové

Více

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MADURAMICINU A SEMDURAMICINU METODOU HPLC

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MADURAMICINU A SEMDURAMICINU METODOU HPLC Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU MADURAMICINU A SEMDURAMICINU METODOU HPLC 1 Rozsah a účel Metoda specifikuje podmínky pro stanovení maduramicinu a semduramicinu v krmivech a premixech.

Více

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MYKOTOXINŮ METODOU HPLC - OCHRATOXIN A

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MYKOTOXINŮ METODOU HPLC - OCHRATOXIN A Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU MYKOTOXINŮ METODOU HPLC - OCHRATOXIN A 1 Rozsah a účel Metoda specifikuje podmínky pro stanovení ochratoxinu A v krmivech. 1 Ochratoxin A patří mezi

Více

Metodika stanovení kyselinové neutralizační kapacity v pevných odpadech

Metodika stanovení kyselinové neutralizační kapacity v pevných odpadech Metodika stanovení kyselinové neutralizační kapacity v pevných odpadech 1 Princip Principem zkoušky je stanovení vodného výluhu při různých přídavcích kyseliny dusičné nebo hydroxidu sodného a následné

Více

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU VÁPNÍKU MANGANOMETRICKY

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU VÁPNÍKU MANGANOMETRICKY Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU VÁPNÍKU MANGANOMETRICKY 1 Rozsah a účel Tato metoda specifikuje podmínky pro stanovení celkového obsahu vápníku v krmivech, krmných směsích a premixech.

Více

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MELAMINU A KYSELINY KYANUROVÉ METODOU LC-MS

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MELAMINU A KYSELINY KYANUROVÉ METODOU LC-MS Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU MELAMINU A KYSELINY KYANUROVÉ METODOU LC-MS 1 Rozsah a účel Postup je určen pro stanovení obsahu melaminu a kyseliny kyanurové v krmivech. 2 Princip

Více

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU VITAMÍNU D METODOU LC/MS

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU VITAMÍNU D METODOU LC/MS Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU VITAMÍNU D METODOU LC/MS 1 Účel a rozsah Tento postup specifikuje podmínky pro stanovení vitamínu D3 v krmivech metodou LC/MS. 2 Princip Zkušební

Více

L 54/116 CS Úřední věstník Evropské unie

L 54/116 CS Úřední věstník Evropské unie L 54/116 CS Úřední věstník Evropské unie 26.2.2009 8. Výsledky kruhových testů V rámci ES byly provedeny kruhové testy, při nichž až 13 laboratoří zkoušelo čtyři vzorky krmiva pro selata, včetně jednoho

Více

I N V E S T I C E D O R O Z V O J E V Z D Ě L Á V Á N Í

I N V E S T I C E D O R O Z V O J E V Z D Ě L Á V Á N Í I N V E S T I C E D O R O Z V O J E V Z D Ě L Á V Á N Í TENTO PROJEKT JE SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM A STÁTNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY Laboratorní práce č. 8 Sacharidy Pro potřeby projektu

Více

laktoferin BSA α S2 -CN α S1 -CN Popis: BSA bovinní sérový albumin, CN kasein, LG- laktoglobulin, LA- laktalbumin

laktoferin BSA α S2 -CN α S1 -CN Popis: BSA bovinní sérový albumin, CN kasein, LG- laktoglobulin, LA- laktalbumin Aktivita KA 2340/4-8up Stanovení bílkovin v mléce pomocí SDS PAGE (elektroforéza na polyakrylamidovém gelu s přídavkem dodecyl sulfátu sodného) vypracovala: MVDr. Michaela Králová, Ph.D. Princip: Metoda

Více

2) Připravte si 7 sad po pěti zkumavkách. Do všech zkumavek pipetujte 0.2 ml roztoku BAPNA o různé koncentraci podle tabulky.

2) Připravte si 7 sad po pěti zkumavkách. Do všech zkumavek pipetujte 0.2 ml roztoku BAPNA o různé koncentraci podle tabulky. CVIČENÍ Z ENZYMOLOGIE 1) Stanovení Michaelisovy konstanty trypsinu pomocí chromogenního substrátu. Aktivita trypsinu se určí změřením rychlosti hydrolýzy chromogenního substrátu BAPNA (Nα-benzoyl-L-arginin-p-nitroanilid)

Více

Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský. Národní referenční laboratoř. Bulletin 2006. Ročník X, číslo 2/ 2006

Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský. Národní referenční laboratoř. Bulletin 2006. Ročník X, číslo 2/ 2006 Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský Národní referenční laboratoř Bulletin 2006 Ročník X, číslo 2/ 2006 Brno 2006 Obsah 1. Optimalizace elektroforetické metody pro charakterizaci bramborových

Více

Protokol 04. pšeničná bílkovina. masné výrobky. zkrácená verze

Protokol 04. pšeničná bílkovina. masné výrobky. zkrácená verze 1 Popis vzorku Podle protokolu č. 04 lze vyšetřit vzorky různých druhů masných výrobků na přítomnost pšeničné bílkoviny. 2 Detekční limit vyšetření Přítomnost pšeničné bílkoviny lze spolehlivě prokázat,

Více

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU NEUTRÁLNĚ DETERGENTNÍ VLÁKNINY (NDF) A NEUTRÁLNĚ DETERGENTNÍ VLÁKNINY PO ÚPRAVĚ VZORKU AMYLÁZOU (andf) 1 Rozsah a účel Tato metoda specifikuje podmínky

Více

CS Úřední věstník Evropské unie L 54/89

CS Úřední věstník Evropské unie L 54/89 26.2.2009 CS Úřední věstník Evropské unie L 54/89 c) při vlnové délce mezi 230 a 320 nm se nesmí spektrum vzestupné části, vrcholu a sestupné části píku zkoušeného vzorku lišit od ostatních částí spektra

Více

1. Příloha 1 Návod úlohy pro Pokročilé praktikum z biochemie I

1. Příloha 1 Návod úlohy pro Pokročilé praktikum z biochemie I 1. Příloha 1 Návod úlohy pro Pokročilé praktikum z biochemie I Vazba bromfenolové modři na sérový albumin Princip úlohy Albumin má unikátní vlastnost vázat menší molekuly mnoha typů. Díky struktuře, tvořené

Více

Laboratoře oboru (N352014) 1. ročník Mgr. 2011/2012, letní semestr

Laboratoře oboru (N352014) 1. ročník Mgr. 2011/2012, letní semestr Laboratoře oboru (N352014) 1. ročník Mgr. 2011/2012, letní semestr Práce č. 2: Kontrola jakosti jedlých mlýnských výrobků Náplň práce: 1. Stanovení vlhkosti mouky 2. Stanovení čísla poklesu 3. Stanovení

Více

N217019 - Laboratoř hydrobiologie a mikrobiologie

N217019 - Laboratoř hydrobiologie a mikrobiologie ÚSTAV TECHNOLOGIE VODY A PROSTŘEDÍ N217019 - Laboratoř hydrobiologie a mikrobiologie Název úlohy: Hydrobiologie: Stanovení koncentrace chlorofylu-a Vypracováno v rámci projektu: Inovace a restrukturalizace

Více

Určení koncentrace proteinu fluorescenční metodou v mikrotitračních destičkách

Určení koncentrace proteinu fluorescenční metodou v mikrotitračních destičkách Určení koncentrace proteinu fluorescenční metodou v mikrotitračních destičkách Teorie Stanovení celkových proteinů Celkové množství proteinů lze stanovit pomocí několika metod; například: Hartree-Lowryho

Více

KATALOG ALEL PATANINŮ, ESTERÁZ A PEROXIDÁZ V ČR REGISTROVANÝCH ODRŮD BRAMBOR

KATALOG ALEL PATANINŮ, ESTERÁZ A PEROXIDÁZ V ČR REGISTROVANÝCH ODRŮD BRAMBOR Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i Praha - Ruzyně KATALOG ALEL PATANINŮ, ESTERÁZ A PEROXIDÁZ V ČR REGISTROVANÝCH ODRŮD BRAMBOR ZPRACOVANÝ JAKO VÝSTUP PROJEKTU NAZV 1B44011 VÝVOJ A TESTOVÁNÍ SYSTÉMU

Více

ANALYTICKÝ SYSTÉM PHOTOCHEM

ANALYTICKÝ SYSTÉM PHOTOCHEM ANALYTICKÝ SYSTÉM PHOTOCHEM Analytický systém Photochem (firmy Analytik Jena, Německo) je vhodný pro stanovení celkové antioxidační kapacity (tj. celkové schopnosti vzorku vychytávat volné radikály) různých

Více

Návody pro praktikum Analýza struktury chromatinu Petra Procházková Schrumpfová, Miloslava Fojtová

Návody pro praktikum Analýza struktury chromatinu Petra Procházková Schrumpfová, Miloslava Fojtová Návody pro praktikum Analýza struktury chromatinu Petra Procházková Schrumpfová, Miloslava Fojtová 1. Izolace buněčných jader z rostlinných tkání Před začátkem práce je nutno si připravit: Pracovní roztoky

Více

Použití v laboratorních podmínkách

Použití v laboratorních podmínkách Použití v laboratorních podmínkách Obsah Velcorin použití v laboratorních podmínkách Strana 3 5 Úvod Strana 3 Bezpečnostní opatření Strana 3 Pracovní postup (senzoricky) Strana 4 Pracovní postup (mikrobiologicky)

Více

Obr. 1. Schematické znázornění 2D-PAGE (převzato z Lodish, H. a kol.: Molecular Cell Biology, 3. vyd., Freeman 1996)

Obr. 1. Schematické znázornění 2D-PAGE (převzato z Lodish, H. a kol.: Molecular Cell Biology, 3. vyd., Freeman 1996) Dvourozměrná elektroforéza (2D-PAGE) 2D-PAGE je vysoce efektivní separační metodou umožňující rozdělení komplikovaných směsí stovek různých bílkovin a představuje základní nástroj v novém rozvíjejícím

Více

Návod a protokol k praktickým cvičením z lékařské biochemie

Návod a protokol k praktickým cvičením z lékařské biochemie Datum... Jméno... Kroužek... Návod a protokol k praktickým cvičením z lékařské biochemie Téma: Vybrané imunochemické metody 1. Úloha Imunoprecipitační křivka lidského albuminu a stanovení Princip: koncentrace

Více

Postup ke stanovení báze metamfetaminu metodou GC-FID

Postup ke stanovení báze metamfetaminu metodou GC-FID Postup ke stanovení báze metamfetaminu metodou GC-FID Důvodem pro vypracování postup je nutnost přesného a striktního definování podmínek pro kvantitativní stanovení obsahu báze metamfetaminu v pevných

Více

Odrůdové zkušebnictví ÚKZÚZ Lípa,

Odrůdové zkušebnictví ÚKZÚZ Lípa, Odrůdové zkušebnictví ÚKZÚZ Lípa, 12.7.2012 Daniel Jurečka Radmila Šafaříková a kol. > 600.000 41.565 85.000 Odrůd v registru genových zdrojů (PGRFA) Odrůd v katalozích EU Počet zkušebních parcel ÚKZÚZ

Více

Příprava půd pro diskovou difuzní metodu EUCAST a pro vyšetření hodnot MIC bujonovou mikrodiluční metodou. Změny proti předchozí verzi (v. 4.

Příprava půd pro diskovou difuzní metodu EUCAST a pro vyšetření hodnot MIC bujonovou mikrodiluční metodou. Změny proti předchozí verzi (v. 4. Version 5.0 January 2017 Příprava půd pro diskovou difuzní metodu EUCAST a pro vyšetření hodnot MIC bujonovou mikrodiluční metodou. Změny proti předchozí verzi (v. 4.0) A. Půdy pro diskovou difuzní metodu

Více

STANOVENÍ MYKOTOXINŮ V OBILOVINÁCH METODOU ELISA

STANOVENÍ MYKOTOXINŮ V OBILOVINÁCH METODOU ELISA Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ MYKOTOXINŮ V OBILOVINÁCH METODOU ELISA 1 Účel a rozsah Metoda specifikuje podmínky pro stanovení přítomnosti, případně obsahu jednotlivých mykotoxinů metodou

Více

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv Stanovení obsahu celkového a volného tryptofanu metodou HPLC

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv Stanovení obsahu celkového a volného tryptofanu metodou HPLC Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU CELKOVÉHO A VOLNÉHO TRYPTOFANU METODOU HPLC 1 Rozsah a účel Metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu celkového a volného tryptofanu v krmivech metodou vysokoúčinné kapalinové

Více

Laboratorní cvičení z kinetiky chemických reakcí

Laboratorní cvičení z kinetiky chemických reakcí Laboratorní cvičení z kinetiky chemických reakcí LABORATORNÍ CVIČENÍ 1. Téma: Ovlivňování průběhu reakce změnou koncentrace látek. podmínek průběhu reakce. Jednou z nich je změna koncentrace výchozích

Více

Aplikace elektromigračních technik Laboratorní úlohy

Aplikace elektromigračních technik Laboratorní úlohy Laboratorní úlohy Výukový materiál vznikl za finanční podpory Fondu rozvoje vysokých škol v rámci řešení projektu č. 1377/2013 Vytvoření demonstračních úloh sloužících k inovaci předmětu Aplikace elektromigračních

Více

Písemná zpráva zadavatele

Písemná zpráva zadavatele Písemná zpráva zadavatele veřejné zakázky zadávané dle zákona č. 137/2006 Sb., o veřejných zakázkách, ve znění účinném ke dni zahájení zadávacího řízení (dále jen ZVZ ). Veřejná zakázka Název: Ostatní

Více

LABORATOŘE OBORU. Znaky kompozitní mouky na bázi pšenično-ječné kompozitní mouky

LABORATOŘE OBORU. Znaky kompozitní mouky na bázi pšenično-ječné kompozitní mouky LABORATOŘE OBORU Znaky kompozitní mouky na bázi pšenično-ječné kompozitní mouky Příprava kompozitní směsi s netradiční plodinou (tef, chia, fonio, konopí, kaštan, nopál, žalud, lupina) Stanovení vlhkosti

Více

Vzorkování potravin a surovin na průkaz genetické modifikace

Vzorkování potravin a surovin na průkaz genetické modifikace Vzorkování potravin a surovin na průkaz genetické modifikace Odběr vzorků ke stanovení přítomnosti GMO bude proveden v souladu s doporučením EK 2004/787/ES o technických pokynech pro odběr vzorků a detekci

Více

Polymorfismus délky restrikčních fragmentů

Polymorfismus délky restrikčních fragmentů Polymorfismus délky restrikčních fragmentů Princip: Chemikálie: PCR produkt z předchozího praktického cvičení Endonukleáza KpnI 10 U μl -1 Pufr pro KpnI 10 koncentrovaný (Tris-HCl 100 mmol l -1 ph 7,5,

Více

Uznávání množitelských porostů

Uznávání množitelských porostů Uznávání Kapitola 3. Stránka 8 V této kapitole najdete Zásady uznávání Legislativní základ Hlavní zásady přihlašování Termíny podání žádosti Místa podání žádosti Sled předplodin Struktura čísla Závazné

Více

ELEKTROFORETICKÁ SEPARACE NUKLEOVÝCH KYSELIN

ELEKTROFORETICKÁ SEPARACE NUKLEOVÝCH KYSELIN ELEKTROFORETICKÁ SEPARACE NUKLEOVÝCH KYSELIN Fragmenty nukleových kyselin lze dle jejich velikosti rozdělit elektroforézou. Elektroforéza využívá rozdílné pohyblivosti jednotlivých fragmentů, danou právě

Více

Gelová elektroforéza - úvod, demonstrační sada pro učitele Kat. číslo

Gelová elektroforéza - úvod, demonstrační sada pro učitele Kat. číslo Gelová elektroforéza - úvod, demonstrační sada pro učitele Kat. číslo 108.6411 PŘÍRUČKA PRO UČITELE S NÁVODEM PRO STUDENTY Strana 1 ze 18 Příručka pro učitele Úvod do gelové elektroforézy Shrnutí Cíle

Více

IZOLACE DNA (KIT DNeasy Plant Mini)

IZOLACE DNA (KIT DNeasy Plant Mini) 17.1 Izolace DNA (kit DNeasy Plant Mini) Strana 1 IZOLACE DNA (KIT DNeasy Plant Mini) 1 Účel a rozsah Postup slouží k získání deoxyribonukleové kyseliny (DNA) ze vzorku pomocí komerčního kitu DNeasy Plant

Více

Tkáňový homogenizátor MagNA Lyser od společnosti Roche

Tkáňový homogenizátor MagNA Lyser od společnosti Roche Izolace RNA Pracovní postup Homogenizace: Pozn. Postup homogenizace platí pouze pro izolaci RNA z nativní tkáně, v případě izolace z buněčné suspenze je tento krok vynechán a začíná se přídavkem homogenizačního

Více

Vybraná vyšetření u pacientů s diabetes mellitus

Vybraná vyšetření u pacientů s diabetes mellitus ÚSTAV LÉKAŘSKÉ BIOCHEMIE A LABORATORNÍ DIAGNOSTIKY 1. LF UK Vybraná vyšetření u pacientů s diabetes mellitus Praktické cvičení z lékařské biochemie Všeobecné lékařství Martin Vejražka 2018/19 Obsah 1.

Více

CLP ANALYSIS OF MOLECULAR MARKERS ISOZYME AND PROTEIN MARKERS CZECH VERSION

CLP ANALYSIS OF MOLECULAR MARKERS ISOZYME AND PROTEIN MARKERS CZECH VERSION CLP ANALYSIS OF MOLECULAR MARKERS ISOZYME AND PROTEIN MARKERS CZECH VERSION ANALÝZA BIOCHEMICKÝCH MARKERŮ GELOVÁ ELEKTROFORÉZA ISOENZYMŮ A PROTEINŮ *** Extrakce proteinů pro SDS elektroforézu:, Při extrakci

Více

Jazykové gymnázium Pavla Tigrida, Ostrava-Poruba Název projektu: Podpora rozvoje praktické výchovy ve fyzice a chemii

Jazykové gymnázium Pavla Tigrida, Ostrava-Poruba Název projektu: Podpora rozvoje praktické výchovy ve fyzice a chemii Datum: Jazykové gymnázium Pavla Tigrida, Ostrava-Poruba Název projektu: Podpora rozvoje praktické výchovy ve fyzice a chemii Laboratorní cvičení č. Tlak vzduchu: Teplota vzduchu: Vitamíny Vlhkost vzduchu

Více

Dovednosti/Schopnosti. - orientuje se v ČL, který vychází z Evropského lékopisu;

Dovednosti/Schopnosti. - orientuje se v ČL, který vychází z Evropského lékopisu; Jednotka učení 4a: Stanovení obsahu Ibuprofenu 1. diferencování pracovního úkolu Handlungswissen Charakteristika pracovní činnosti Pracovní postup 2. HINTERFRAGEN 3. PŘIŘAZENÍ... Sachwissen Charakteristika

Více

13/sv. 8 (85/503/EHS) Tato směrnice je určena členským státům.

13/sv. 8 (85/503/EHS) Tato směrnice je určena členským státům. 62 31985L0503 L 308/12 ÚŘEDNÍ VĚSTNÍK EVROPSKÝCH SPOLEČENSTVÍ 20.11.1985 PRVNÍ SMĚRNICE KOMISE ze dne 25. října 1985 o metodách pro analýzu potravinářských kaseinů a kaseinátů (85/503/EHS) KOMISE EVROPSKÝCH

Více

Vizualizace DNA ETHIDIUM BROMID. fluorescenční barva interkalační činidlo. do gelu do pufru barvení po elfu SYBR GREEN

Vizualizace DNA ETHIDIUM BROMID. fluorescenční barva interkalační činidlo. do gelu do pufru barvení po elfu SYBR GREEN ETHIDIUM BROMID fluorescenční barva interkalační činidlo do gelu do pufru barvení po elfu Vizualizace DNA SYBR GREEN Barvení proteinů Coommassie Brilliant Blue Coomassie Blue x barvení stříbrem Porovnání

Více

Komplement fixační antigen Influenza A (KF Ag Influenza A)

Komplement fixační antigen Influenza A (KF Ag Influenza A) Komplement fixační antigen Influenza A (KF Ag Influenza A) OD - 109 Návod k použití soupravy VÝROBCE : VIDIA spol. s r.o., Nad Safinou II/365, Vestec, 252 42 Jesenice u Prahy, tel.: 261090565 www.vidia.cz

Více

Zápis o rozboru. E skleněné ISE závislé na ph roztoku, lze pomocí kombinované skleněné ISE sestrojit závislost ph na přidávaném

Zápis o rozboru. E skleněné ISE závislé na ph roztoku, lze pomocí kombinované skleněné ISE sestrojit závislost ph na přidávaném 1 Princip metody Zápis o rozboru Tato laboratorní práce byla rozdělena na tři části.v první bylo úkolem stanovit s pomocí potenciometrické titrace hmotnost kyseliny fosforečné a dihydrogenfosforečnanu

Více

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU SELENU METODOU ICP-OES

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU SELENU METODOU ICP-OES Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU SELENU METODOU ICP-OES 1 Rozsah a účel Postup specifikuje podmínky pro stanovení celkového obsahu selenu v minerálních krmivech a premixech metodou optické emisní spektrometrie

Více

Návod k laboratornímu cvičení. Vitamíny

Návod k laboratornímu cvičení. Vitamíny Úkol č. 1: Přítomnost vitaminu C v ovoci a zelenině Návod k laboratornímu cvičení Vitamíny Pomůcky: třecí miska s tloučkem, filtrační kruh, nálevka, filtrační papír, zkumavky, stojan na zkumavky Chemikálie:

Více

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv Národní referenční laboratoř Strana KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ GENETICKÝCH MODIFIKACÍ METODOU qpcr POMOCÍ ROTOR-GENE PROBE PCR KITU Účel a rozsah Postup slouží ke kvantitativnímu stanovení genetických modifikací

Více

Výsledky podporované programem DELTA

Výsledky podporované programem DELTA Výsledky podporované programem DELTA Č. j.: TACR/4872/2015 Výňatek z dokumentu Metodika hodnocení výsledků výzkumných organizací a hodnocení výsledků ukončených programů (platná pro léta 2013 až 2015)

Více

Výroba osiva požadavky na kvalitu osiva a sadby, úřední zkoušky, uznávání osiva. Ing. Barbora Dobiášová ÚKZÚZ, odbor osiv a sadby

Výroba osiva požadavky na kvalitu osiva a sadby, úřední zkoušky, uznávání osiva. Ing. Barbora Dobiášová ÚKZÚZ, odbor osiv a sadby Výroba osiva požadavky na kvalitu osiva a sadby, úřední zkoušky, uznávání osiva Ing. Barbora Dobiášová ÚKZÚZ, odbor osiv a sadby Přehled současné legislativy Zákon č. 219/2003 Sb., o oběhu osiva a sadby,

Více

Písemná zpráva zadavatele

Písemná zpráva zadavatele Písemná zpráva zadavatele veřejné zakázky zadávané dle zákona č. 137/2006 Sb., o veřejných zakázkách, ve znění účinném ke dni zahájení zadávacího řízení (dále jen ZVZ ). Veřejná zakázka Název: Ostatní

Více