Reakce mikroorganismů na změny v prostředí

Transkript

1 Reakce mikroorganismů na změny v prostředí Co je adaptace? odpověď na stres Co je stres? Změna teploty (teplo nebo chlad) Výživa (nedostatek nebo toxicita) Světlo (množství/ kvalita Tlak (obvykle vodní) O 2 (přítomnost/nepřítomnost)

2 Typy extremofilů Acidofilní pod ph 3 Alkalifiní nad ph 9 Endolitní v pórech hornin Halofilní min. 0,2M NaCl Hypertermofilní o C Piezofilní odolávají zvýšenému hydrostatickému tlaku

3

4 Typy extremofilů Polyextremofilní více kategorií najednou Psychrofilní kryofilní rostou až do -15 o C Radiorezistentní Termofilní o C Xerofilní odolávají suchu Termoacidofilní o C a ph 2-3

5 Klasifikace je založena na 16/18S rrna sekvencích Hypertermofily náleží buď do řádu Bacteria nebo Archea. Jsou adaptované k aciditě, kyslíku, nizké salinitě, vysoké salinitě, nízkému redox potenciálu, podle naleziště. Extrémní acidofilové- aerobní, fakultativně anaerobní a anaerobní kokovité. Rostou mezi ph 1 až 5, s optimem 3. Sulfolobus, Metallosphaera, Acidianus, Stygiolobus Mírní acidofilové a neutrofilové většinou podmořské, nízká salinita. Většina jsou striktní anaerobové:thermoproteus, Pyrobaculum,

6 Energetika extremofilních bakterií Hypertermofilní bakterie nejsou schopné růstu při teplotě pod 60 C, nejvíce adaptované Pyrolobus fumarii, neroste pod 90 C. Typickým prostředí jsou podvodní vulkány, mořské nebo pozemní. Sirné prameny dvě vrstvy: horní silně kyselá, kyslík je přítomen, rovněž Fe. Je oranžově zabarvená. Rody: Sulfolobus, Acidianus. Spodní vrstva černomodrá Fe. Rody: Thermoproteales, Methanothermus. Podmořské systémy: mělčiny a hlubokomořské. Vysoká koncentrace soli, ph závisí na typu vulkanické činnosti.

7 Izolace aerobní i anaerobní vzorky horkých sedimentů, bahna, hornin, půdy a vod. Většina horkých biotopů je anaerobních vzhledem k přítomnosti sulfanu. Během vzorkování je nutné chránit vzorky před kyslíkem. Šokové chlazení nebo okamžitá redukce kyslíku je nutná pro zabránění inaktivace buněk. Kultura Pyrobaculum islandicum 10 8 CFU/ml odumřela po 40 min vzdušnění. Nárůst 1 den až 1 týden po inokulaci Vzhledem k teplotě, agarové půdy nejsou vhodné, polysilikáty, nebo vyředění pro zisk čisté kultury.

8 Optická mikroskopie

9 Složení prostředí pro hypertermofily Typ pozemní mořský Lokality: solfatarová pole, parou podmořské horké prohřívaná půda, bahna prameny a fumaroly hlubinné horké prameny black smokers geothermální elektrárny hlubinné zdroje ropy, oplachované mořskou vodou Teploty: povrchové do 100, až do 400 C bs hlubinné nad 100 Salinita: obvykle nízká 0,1-0,5% okolo 3% ph: 0, ,5, vzácně 3 Plyny a CO 2, CO, CH 4,H 2 CO 2, CO, CH 4,H 2, H 2 S,S0. Sirné látky H 2 S S0 S 2 O 3 2-, SO 4

10 Proteiny hypertermofilů enzymy hypertermofilů a mesofilů jsou si podobné na 40 až 85% jejich 3rozměrné struktury jsou srovnatelné mají tytéž katalytické mechanismy

11 Methanothermus fervidus

12 klonování a exprese genů z hypertermofilů v mesofilech více než 100 genů z hypertermofilů bylo exprimováno v mesofilech transkripční systém Archaei je více podobný eukaryotnímu, pro expresi v E.coli jsou nutné silné promotory většina hypertermofilních enzymů se správně skládá při 60 o C a zachovává si termostabilitu ornitinkarbamoyl transferasa z P.furiosus exprese v S.cerevisiae stabilnější než v E.coli

13 Pyrodictium abyssi

14 volná energie stabilizace ΔG stab ΔG stab = ΔH stab - TΔS stab volná energie stabilizace proteinu je rozdíl mezi volnými energiemi složeného a rozvinutého proteinu ΔH stab stabilizační enthalpie ΔS stab stabilizační entropie

15

16 termodynamické studie hypertermofilních enzymů odehrávají se mimo teplotní rozsah většiny kalorimetrů provádějí se v přítomnosti guanidin hydrochloridu nebo v ph mimo fysiologický rozsah teplota denaturací se tak stává fyzikálně měřitelná rozdíl v ΔG stab je obvykle 5-20 kcal/mol někdy jen 3-6,5 kcal/mol

17 mechanismy inaktivace proteinů unfolding proteinů lze měřit diferenciální skenovací kalorimetrií, cirkulárním dichroismem,viskositou mezofilní enzymy - irreversibilní rozpad hypertermofilní proteiny rovněž nevratná denaturace,ale jsou k tomu nutné vyšší množství energie -100kcal/mol chemické modifikace probíhají jen na denaturovaném proteinu

18 složení aminokyselin a vnitřní vlastnosti první statické porovnání mezi meso- a thermoukázalo trend k výměně Gly za Ala, a Lys za Arg. Dnes je jasné, že to není jen primární sekvence, poněkud více hydrofobních a aromatických AK nejvíce vlivu má distribuce zbytků a jejich interakce v proteinu Arg je lépe adaptován k vysokým teplotám než Lys cystein - nižší obsah (citlivost k oxidaci)

19 disulfidové můstky disulfidové můstky, stabilizují protein? vzhledem k citlivosti cysteinu a disulfidových můstků k vysoké T, 100 o C - horní limit pro stabilitu proteinu serinová proteasa Aquifex pyrophilus obsahuje 8 cysteinů, jsou však chráněné před destrukcí t 1/2 při 105 o C - 6 h, ph 9,0 t 1/2 při ph 8-1 h unfolded struktura

20 Typy acidofilních mikroorganismů

21 Alkalofilní mikroorganismy

22 Aquifex pyrophilus dělící se buňka s bičíky. Pokoveno Pt, transmisní elektronmikrografie. Úsečka - 1μm

23 Typy halofilních organismů

24 hydrofobní interakce hydrofobní interakce - stabilizační mechanismus hypertermofilních enzymů zvýšení stability o 1.3(+/- 0,5)kcal/mol vyvolá každá přidaná methylová skupina

25 aromatické interakce aromatické páry jsou definovány vzdáleností menší než 7.0 Ǻ mezi středy fenylových kruhů α-amylasa z P.furiosus o 5% více aromatických residuí než homolog z B.licheniformis Thermitasa - Thernoactinomyces vulgaris 16 aro. mesofilní homolog B.amyloliquefaciens pouze 6

26 Posttranslační modifikace glykosylace - zvyšuje termostabilitu posttranslační methylace lysinu (A-ε-monomethyllysin) nalezen u Sulfolobus stabilizace solemi - nejlépe působí K + a NH 4 + stabilizace substrátem - T.maritima dihydrofolát reduktasa je kineticky stabilizovaná substráty, NADPH 6tinásobné zvýšení t 1/2 při 80 o C

27 Thermoproteus tenax - 1 hyperthermofilní Crenarcheum Thermoproteus tenax roste chemolithoautotrofně na H 2, CO 2, a S o nebo chemoorganoheterotrofně v přítomnosti S o a různých organických substrátů pro metabolismus glukosy užívá variantu Embden- Meyerhof-Parnasovy dráhy, právě tak jako dráhu Entner- Doudoroff varianty EMP - hexokinasa bez regulačních vlastností - fosfofruktokinasa závislá na Ppi - dvě glyceraldehyd 3-fosfát dehydrogenasy (GAPDH)

28 Thermoproteus tenax- 2 2 glyceraldehyd 3 fosfát dehydrogenasa (GADPH) -Klasická fosforylační GADPH -Allosterická nefosforylační GADPH -Pyruvát kinasa PH bez allosterického potenciálu -Kontrolní bod EMP pro T.tenax je na úrovni rovnováhy mezi glyceraldehyd 3 fosfát / 3- fosfoglycerát

29 Thermoproteus tenax-3 Enzymy T.tenax podobně jako ostatní archeální pyruvát kinasy se liší od bakteriálního typu omezenou regulovatelností. Přeměna pyruvátu na PEP - PEP karboxykinasa Fosfoenolpyruvát syntasa PEPS Pyruvát + ATP + H 2 O PEP + AMP + P i Nalezena u P.furiosus cca 2.25MDa

30 Thermoproteus tenax - 3 přeměna fosfoenolpyruvátu a pyruvátu - významný klíčový bod EMP dráhy u všech bakterií a eukaryot situace u Archae méně jasná koexistence fosfoenolpyruvát syntetasy (PEPS) a pyruvát fosfát dikinasy (PPDK), které se kromě pyruvát kinasy (PK) účastní této reakce u hyperthermofilní crenarcheoty T.tenax geny pocházející z T.tenax naklonovány v E.coli enzymové a regulační vlastnosti rekombinantního produktu se testovaly

31 Thermoproteus tenax - 4 PEPS katalyzuje jednosměrnou přeměnu pyruvátu na fosfoenolpyruvát PPDK (pyruvát fosfát dikinasa) má dvousměrnou aktivitu s preferencí pro katabolickou reakci na rozdíl od pyruvát kinasy T.tenax, která je regulovaná na úrovni transkripce, ale vykazuje jen omezený regulační potenciál na úrovni proteinu, aktivity PEPS a PPDK jsou modulovány ATP a intermediáty metabolismu cukrů exprese PEPS je regulovaná na úrovni transkripce jako odpověď na nabízený zdroj uhlíku (Northern blot analysa)

32

33 Pyrrococcus horikoshii Hyperthermofilní β-1,4 endoglukanasa (EGPh) z hyperthermofilního archaeonu Pyrococcus horikoshii vykazuje silnou hydrolytickou aktivitu ke krystalické celulose. Charakteristické rysy EGPh jsou: (1) zdá se, že má disulfidické vazby, které jsou vzácné u proteinů anaerobních hypertermofilních archeonů, a (2) postrádají vazebnou doménu pro cukr, která je nezbytná pro účinnou hydrolyzu celulosy.

34 Pyrrococcus horikoshii 2 Nejprve studovali vztah mezi disulfidickými vazbami a katalytickou aktivitou pomocí různých mutant pro cystein. Aktivita mutovaných enzymů ke karboxymethyl celulose (CMC) se zvyšovala bez ztráty thermostability. Dále byly připraveny fuse tak, že thermostabilní doména k chitinu pro chitinasu z P. furiosus byla připojena C-konci EGPh a jeho variant. Tyto fuse enzymů vykázaly vyšší aktivity než divoký typ EGPh jak ke CMC a krystalické celulose (Avicel).

35 Získávání energie u hyperthermofilních chemolithoautotrofů 4H 2 + CO 2 CH 4 + 2H 2 O H 2 + S 0 H 2 S 2 H 2 + H 2 SO 4 H 2 S + 4H 2 O H 2 + HNO 3 HNO 2 + H 2 O H 2 + ½ O 2 H 2 O 2 S O 2 + 2H 2 O 2 H 2 SO 4 Methanothermus Pyrodictium Archaeoglobus Pyrobaculum Pyrobaculum Aquifex 2 FeS O 2 + 2H 2 O 2 FeSO H 2 SO 4 Acidianus

36 Typy fermentací - reakce poskytující energii u heterotrofních hyperthermofilů Pyruvát L(+)-laktát + acetát + H 2 + CO 2 Thermotoga, Thermosipho peptidy isovalerát, isobutyrát, butanol, CO 2, H 2 Pyrodictium, Hyperthermus, Thermococcus Pyruvát acetát + H 2 + CO 2 Pyrococcus

37 Reakce poskytující energii u heterotrofních hyperthermofilů respirace S 0 Thermofilum Desulfurococcus 2 [H] + S 0 H 2 S SO 4 2- (S 2 O 3 2-,SO 3 2- ) +2H + H 2 S + 4 H 2 O Sulfolobus, Metallosphaera O 2 2 [H] + 1/2O 2 H 2 O

38

39

40 Populace žijící v permafrostu

41

42 Psychrofilní mikroorganismy a proteinové inženýrství Adaptace na extrémní teploty? Specifické strukturní vlastnosti Chladově aktivní β-galaktosidasa (BgaS) izolovaná z Arthrobacter sp. Vykazuje 50% aktivity při 0 o C Podobně jako u E.coli- tetramer, monomery neaktivní BgaS je termolabilní nad 25 o C a po 10 min při 37 o C zcela ztrácí aktivitu Využitím znalostí β-galaktosidasy z E.coli specifické mutace BgaS7 2,5x vyšší aktivita při 15 o C, hydrolyzoval 80% laktosy v mléce za polovinu času než BgaS při 2,5 o C

43