Zdrojem je mrna. mrna. zpětná transkriptáza. jednořetězcová DNA. DNA polymeráza. cdna

Transkript

1

2 Obsah přednášky 1) Klonování složených eukaryotických genů 2) Úprava rekombinantních genů 3) Produkce rekombinantních proteinů v expresních systémech 4) Promotory 5) Vektory 6) Reportérové geny

3 Zdrojem je mrna mrna zpětná transkriptáza jednořetězcová DNA DNA polymeráza cdna příprava sond pro vyhledávání v genové knihovně klonování do expresního vektoru

4 Zpětná transkripce I gen mrna polya cdna PCR oligo dt 5 5 reverse primer 3 gen mrna polya cdna

5 Zpětná transkripce II hexanukleotidy 5 3 gen mrna polya cdna cdna

6 Southern blotting fragmenty DNA na elfo gelu denaturace NaOH filtrační papír membrána gel pufr přenos DNA z gelu na membránu otisk DNA na membráně inkubace se značenou cdna vyvolání RTG filmu

7 Podívejte se na Southern blotting na této stránce tes/dl/free/ /120078/bio_g.swf::southern%2 0Blot

8 Nerozumíte, co je to cdna? Podívejte se na tuto stránku tes/dl/free/ /120078/bio_h.swf::cdna

9 Pěkná animace se skrývá za záclonkou _englishbiomol.htm

10 Úprava rekombinantních genů nahodilá mutageneze cílená mutageneze specifická záměna báze v genu, který kóduje příslušný enzym, což má za následek výměnu určité aminokyseliny v polypeptidovém řetězci za jinou dle našeho uvážení

11 Smysl cílené mutageneze Změna ve struktuře proteinu zavedení nových disulfidových můstků zvýšení počtu vodíkových vazeb změna terciární struktury změna stability enzymu změna dalších vlastností - zvýšení katalytické aktivity a afinity k substrátu - modifikace substrátové specificity - rozšíření ph-optima - zvýšení odolnosti proti oxidačním činidlům a těžkým kovům - zvýšení rezistence vůči proteázám - stabilita v nevodném prostředí

12 Průběh cílené mutageneze 1) Vložení genu do jednořetězcového vektoru, např. M13 2) Cílená mutageneze 3) Vrácení genu do expresního vektoru

13 Schéma cílené mutageneze téměř komplementární syntetický oligonukleotid mutace hybridizace a komplementární doplnění celé molekuly ssdna genu daného enzymu fágový vektor M13 DNA-polymeráza DNA-ligáza transformace do buněk E. coli buňky obsahující zmutovanou DNA replikace buňky obsahující původní DNA

14 Schéma cílené mutageneze téměř komplementární syntetický oligonukleotid mutace hybridizace a komplementární doplnění celé molekuly ssdna genu daného enzymu fágový vektor M13 DNA-polymeráza DNA-ligáza transformace do buněk E. coli buňky obsahující zmutovanou DNA replikace buňky obsahující původní DNA

15 Produkce rekombinantních proteinů Rekombinantní proteiny jsou takové, které vznikají expresí umělých genů připravených metodami genového inženýrství Za expresní systémy pak považujeme takové buňky nebo jejich části, které jsou používány k produkci rekombinantních proteinů

16 Expresní systémy prokaryotické buňky Escherichia coli a Bacillus subtilis Streptomyces, Mycobacterium smegmatis kvasinky houby pseudomonády hmyzí buňky baculoviry savčí buňky adenoviry a buňky viru polyedrie in vitro expresní systémy založené na extraktech buněk savčích nebo rostlinných

17 Pravidla pro expresní systémy proměnlivé výhody a nevýhody různé individuální faktory empirický proces i po letech zkušeností neexistují pevná a spolehlivá pravidla Zpravidla má nový rekombinantní protein takové vlastnosti, že jeho exprese je výjimkou z jakýchkoli definovaných pravidel

18 Kvalita Základní kritéria pro výběr Velikost proteinu Požadovaná čistota % kontaminance LPS expresního systému Postranslační modifikace Rozpustnost Kvantita Množství biomasy vedoucí k získání dostatečného množství proteinů odpovídající kvality

19 Expresní systém vs. velikost proteinu <8kDa Fúzní proteiny >8kDa Intracelulární proteiny 8-50kDa Secernované proteiny >50kDa Secernované a povrchové proteiny E.coli Kvasinky +++ Savčí buňky Hmyzí buňky

20 Sacharomyces cerevisiae Produkční strategie Výtěžek (g/litr biomasy) Exprese (% celkových buněčných proteinů) Sekrece < 0.25 < 1% poznámky hypermannosylace Intracelulární produkce rozpustné proteiny Intracelulární produkce inkluzní tělíska % % Proteiny, jež jsou produkovány v E.coli do inkluzních tělisek mohou být rozpustné Velmi častý případ

21 Pichia pastoris Produkční strategie Výtěžek (g/litr biomasy) Exprese (% celkových buněčných proteinů) Sekrece 0,2-4 0,5-10% poznámky g mokré biomasy/litr média Intracelulární produkce rozpustné proteiny 0, % Vysoké výtěžky, glykosylace podobné lidským lze upravit genovou manipulací humanizovat

22 Hmyzí buňky-drosophila melanogaster Produkční strategie Výtěžek (g/litr biomasy) Exprese (% celkových buněčných proteinů) Bakulovirus 0,001-0,5 <30% poznámky Rychlý přístup, jak získat stovky mg proteinu v eukaryontním systému, posttranslační modifikace mohou být limitovány

23 Savčí buňky např. CHO Produkční strategie Výtěžek (g/litr biomasy) Exprese (% celkových buněčných proteinů) sekrece 0,001-0,1 <0,5% Intracelulární produkce rozpustné proteiny 0,001 <0,1% poznámky Nízká produktivita, nicméně komplex různých posttranslačních modifikací Použitelné pro proteiny ER nebo membránové proteiny.

24 Escherichia coli I Expresní systém nevhodný pro produkci glykosylovaných proteinů Produkční strategie Výtěžek (g/litr biomasy) Exprese (% celkových buněčných proteinů) sekrece < 0,5 0,3-4% Intracelulární produkce rozpustné proteiny Intracelulární produkce inkluzní tělíska 0, % 0, % poznámky Akumulace rozpustného/agregova ného proteinu v periplasmě Menší část proteinů hromaděná jako cytosolické rozpustné produkty Velmi častý případ

25 Escherichia coli II Expresní systém nevhodný pro produkci glykosylovaných proteinů Produkční strategie Výtěžek (g/litr biomasy) Exprese (% celkových buněčných proteinů) Fúzní proteiny 1-3% 5-15% Membrány <1% <5% poznámky Zvýšená stabilita produktu exprese, produkce rozpustných proteinů v cytosolu Produkce eukaryotických membránových proteinů

26

27 Promotory promotor genu pro β-galaktozidázu trp promotor (médium bez tryptofanu) promotor P L bakteriofága λ (termolabilní ci represor, indukce změnou teploty) T3, T7, SP6 promotory bakteriofágů promotor fága T7 není rozpoznáván RNA polymerázou E. coli vhodné, pokud je produkt klonovaného genu toxický toxické produkty jsou striktně regulované

28 Transkripční fůzní vektor klonovací místo promotor inzert s translačními signály promotor RBS a AUG AUG mrna protein

29 Vektor pgemex E. coli infikované fágem T7 E. coli s genem pro T7 polymerázu - je pod kontrolou induktoru - tepelně indukovatelného - lac promotoru

30 Translační fůzní vektor klonovací místo promotor, RBS, AUG inzert bez translačních signálů promotor, RBS, AUG AUG mrna pro tein

31 Vektory pet

32 Vektory pet Klonovací místo Selekční gen pro rezistenci k antibiotiku promotor Zesilovač translace Ribozom-vazebné místo Fúzní/purifikační Značka/kotva (6xHis tag)

33 Vektor λgt11 EcoR I promotor β-galaktozidáza inzert promotor β-galaktozidáza inzert AUG mrna fůzní protein

34 Příprava fůzních proteinů mají zajištěný počátek translace lepší stabilita malých proteinů vysoká pravděpodobnost exprese vysoká rozpustnost produktu

35 Funkce fůzního partnera 1) N-koncové fůze 2) C-koncové fůze 3) Slouží jako selekční znak při imunodetekci 4) Použitelný při purifikaci imunodoména protein purifikační doména

36 Partnerské části fůzních proteinů lacz MBP - maltose binding protein glutathion S-transferáza thioredoxin oligopeptidy - hexahistidin

37 HisTag Reportérové geny Chloramfenikolacetyltransferáza (CAT) Luciferáza (luc gen světlušky Photinus pyralis) β galaktozidáza thioredoxin S-glutathio-transferáza secernovaná alkalická fosfatáza β glukuronidáza zeleně fluoreskující protein (GFP)

38 GFP Green fluorescent protein (GFP) je protein, který je příčinou světélkování medůzy Aequorea victoria

39 GFP Gen pro GFP je možné začlenit za promotor genu jiného organismu. RNA polymeráza se váže k tomuto promotoru a zahajuje transkripci. Je-li gen pro GFP začleněn správně, může být exprimován i v jiném organismu, než je medůza. GFP

40 Fluoreskující proteiny Zelený fluoreskující protein z medůzy (GFP) Červený fluoreskující protein z korálu (RFP) Bakteriální proteiny fluoreskující v infraoblasti (IFP) z Deinococcus radiodurans

41 Shrnutí přednášky 1) Klonování složených eukaryotických genů 2) Úprava rekombinantních genů 3) Produkce rekombinantních proteinů v expresních systémech 4) Promotory 5) Vektory 6) Reportérové geny