Bioimaging rostlinných buněk, CV.2

Transkript

1 Bioimaging rostlinných buněk, CV.2 Konstrukce mikroskopu (optika, fyzikální principy...) Rozlišení - kontrast Live cell microscopy Modulace kontrastu (Phase contrast, DIC) Videomikroskopia

2 Nízký kontrast biologických objektů

3 Nízký kontrast biologických objektů Metodika přípravy objektů: objekt musí být prosvítitelný je třeba zvýšit kontrast je třeba využit různé difrakční indexy

4 A. Pozorovat můžeme: celý objekt - protoplasty, pyl, krevní buňky... clearing

5 A. Pozorovat můžeme: roztlak, roztěr

6 B. Zvýšení kontrastu barvení

7 C. Řezání objektu fyzické řezy

8 C. Řezání objektu optické rezy

9 Metody modulace kontrastu ve světelné mikroskopii Pozorování ve světlém poli Pozorování ve tmavém poli Fázový kontrast Polarizační mikroskopie Diferenciální interferenční kontrast

10 Zvyšování kontrastu biologických objektů: tmavé pole

11 Zvyšování kontrastu biologických objektů: tmavé pole

12 Zvyšování kontrastu biologických objektů: tmavé pole

13 Zvyšování kontrastu biologických objektů: fázový kontrast Mikroskop zobrazuje objekty na základě změny amplitudy světla. Ta se mění díky kontrastním rozdílům ve vzorku. Když jsou biologické vzorky průsvitné a málo kontrastní, nejsou vidět. Obsahují ale struktury, které se liší svým indexem lomu, na nichž dochází k fázovým posunům. Fázový kontrast mění rozdíly ve fázi světla v rozdíly v amplitudě.

14 Zvyšování kontrastu biologických objektů: fázový kontrast

15 Zvyšování kontrastu biologických objektů: fázový kontrast Teorie difrakčního gradientu (Abbe teorie): Na zadní fokální rovině objektivu je rozptýlené (diffracted, scattered) světlo prostorově separované od nerozptýleného (undiffracted, 0th order)

16 Zvyšování kontrastu biologických objektů: fázový kontrast Fazovy kontrast změna amplitudy procházejícího světla cez preparát dva kroužky, u kterých nastává při přechodu světla posun fáze světelné vlny Fázová maska mění fázi procházejícího záření o úhel α Při fázovém kontrastu se intenzita světla v obrazu objektu mění lineárně se změnou fáze světla procházejícího objektem. S fázovou maskou měnící fázi o -π /2 se silnější části objektu jeví tmavší, tzv. pozitivní fázový kontrast. Při změně fáze o π /2 je tomu naopak, tzv. negativní fázový kontrast. V obrazové ohniskové rovině objektivu se nachází fázová destička, opět ve tvaru mezikruží, jež posunuje fázi o + /2 nebo - /2, tj. o čtvrtinu vlnové délky. Tato destička propouští paprsky, které nezměnily svůj směr na fázových objektech. Ostatní paprsky destičku minou a jejich fáze se nezmění.

17 Zvyšování kontrastu biologických objektů: fázový kontrast - fázová destička v přední ohniskové rovině kondenzoru - fázová destička v obrazové ohniskové rovině objektivu, která posunuje fázi o + π/2 nebo - π/2), tj. o čtvrtinu vlnové délky (λ/4) - výsledný posun fázy difraktovaného svetla k nedifraktovanému je λ/2 (180 ) - obraz se vytváří interferencí fázově posunutých a neposunutých paprsků

18 Zvyšování kontrastu biologických objektů: fázový kontrast

19 Zvyšování kontrastu biologických objektů: fázový kontrast

20 Zvyšování kontrastu biologických objektů: fázový kontrast

21 Zvyšování kontrastu biologických objektů: fázový kontrast

22 Zvyšování kontrastu biologických objektů: fázový kontrast

23 Zvyšování kontrastu biologických objektů: fázový kontrast

24 Zvyšování kontrastu biologických objektů: DIC

25 Zvyšování kontrastu biologických objektů: DIC

26 Zvyšování kontrastu biologických objektů: DIC

27 Zvyšování kontrastu biologických objektů: DIC

28 Zvyšování kontrastu biologických objektů: DIC

29 Zvyšování kontrastu biologických objektů: DIC

30 Zvyšování kontrastu biologických objektů: DIC

31 Zvyšování kontrastu biologických objektů: DIC

32 Zvyšování kontrastu biologických objektů: DIC

33 Zvyšování kontrastu biologických objektů: DIC

34 Porovnání kontrastu při fázovém kontrastu a DIC

35 Porovnání kontrastu při fázovém kontrastu a DIC

36 Porovnání kontrastu při fázovém kontrastu a DIC

37

38 Porovnání kontrastu při fázovém kontrastu a DIC bright field phase contrast DIC

39 Důvody proč studovat živé buňky neinvazivními metodami chemická a fyzikální fixace může způsobovat artefakty procesy jako růst a pohyb organel jsou velice dynamické možnost aktuálního sledování exprese reportérových genů a distribuce modifikovaných proteinů ve fyziologických podmínkách

40 Metody mikroskopie živých buněk videomicroscopy contrast enhanced microscopy ultraviolet microscopy low-light intensity fluorescence microscopy CLSM (confocal laser scanning microscopy)

41 Optimalizace podmínek k live cell imaging - teplota - přísun kyslíku - vlhkost - osmolarita - ph, pufrování média - fototoxicita - fotopoškození - microscope focus drift - intenzita signálu - rozlišení -

42 Videomokroskopie - využívá video-umocněný kontrast, t.j. digitální zesílení relativně malých lokálních rozdílů v intenzitě světla - pracuje s odečtem pozadí zahrnující všechny nežádoucí odrazy a rozptyl světla v optické soustavě mikroskopu, včetně neostrých obrazů mimo ohniskovou rovinu - možnost zesílit signál za podmínek, kdy není dost fotonů na to, aby vytvořily obraz bez šumu - možnost změny poměru signál/šum integrací několika po sobě jdoucích obrazů

43 Videomokroskopie Způsoby snímání: - real-time microscopy recording - time-lapse image sequence acquisition (repeated imaging of a cell at defined time points) Dimensions: - 2-D - sequential capture of single focal planes (x-y in widefield microscopy and x- y, x-z, and y-z in confocal microscopy) - 3-D - optical stacks from multiple focal planes in a variety of dimensional formats with thick specimens - 4-D - time-lapse imaging, a single focal point in the lateral plane (x and y) is combined with z-stack imaging as a function of time - 5-D - imaging with adding of different wavelengths - 6-D - time-lapse imaging adds either multiple wavelengths or multiple lateral regions

44 Arabidopsis thaliana vývin kořenových vlásků jako developmentální model

45 morfologická a fyziologická změna polarity vývin kořenových vlásků jako developmentální model

46 základní způsoby růstu rostlinných buněk

47 příprava viabilního objektu pro live cell mikroskopii cílem je pozorování vrcholového růstu kořenových vlásků 0 min 5 min 10 min 15 min

48 videomikroskopie rostoucích kořenových vlásků

49 videomikroskopie rostoucích kořenových vlásků

50 vizualizace vezikul v apexu kořenového vlásku elektronovou mikroskopií

51 vizualizace vezikul v apexu pylové láčky elektronovou mikroskopií

52 porovnání klasické světelné (DIC) a elektronové mikroskopie

53 vysoké rozlišení elektronické světelné mikroskopie electronic light microscopy video-enhanced contrast light microscopy

54 kombinace videomikroskopie a kontrast-enhancement

55 0.00s 0.12s 0.24s 0.36s 0.48s 1.00s 1.12s 1.24s 1.36s 1.48s 2.00s

56 dají se studovat chemické inhibice pohybu organel