Stavy patologické bolesti Úloha modulace míšního synaptického přenosu

Transkript

1 Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Katedra fyziologie živočichů Stavy patologické bolesti Úloha modulace míšního synaptického přenosu Bc. Vladimír Nerandžič Praha 2010 Školitel: MUDr. Jiří Paleček, CSc.

2 Prohlášení Prohlašuji, že jsem diplomovou práci s názvem Úloha modulace míšního synaptického přenosu vypracoval samostatně a použil k tomu informační prameny, které uvádím v seznamu přiloženém k diplomové práci. Nemám závažný důvod proti užití tohoto školního díla ve smyslu 60 Zákona č. 121/2000 Sb., o právu autorském, o právech souvisejících s právem autorským a o změně některých zákonů. Bc. Vladimír Nerandžič - 2 -

3 Poděkování Rád bych poděkoval svému školiteli MUDr. Jiřímu Palečkovi za odborné vedení, konzultace, pomoc a vstřícnost, podnětné připomínky a v neposlední řadě za jeho trpělivost. Děkuji také Mgr. Dianě Špicarové za uvedení do tajů laboratorní práce a odbornou pomoc při provádění pokusů

4 Abstrakt Modulace synaptického přenosu v zadním rohu míšním hraje klíčovou úlohu v nociceptivní signalizaci. Studie z poslední doby naznačují velký význam míšních presynaptických TRPV1 (transient receptor potential vanilloid) receptorů, které na periferii působí jako integrátory nociceptivních podnětů. Mechanismy jejich aktivace a jejich vliv na modulaci synaptického přenosu ale nejsou dosud zcela známy. Předchozí studie také ukázaly vliv řady mediátorů zánětu a cytokinů na funkci TRPV1 receptorů. Cílem naší studie bylo proto ukázat, jak se mění aktivace presynaptických TRPV1 receptorů v míše po aplikaci endogenního agonisty N- oleoyldopaminu (OLDA) u modelu periferní neuropatie, po inkubaci s cytokinemtnfα a jaký je účinek prekurzoru anandamidu N- acylfosfatidylethanolaminu (NAPE). V experimentech byly snímány miniaturní excitační postsynaptické proudy (mepsc) na neuronech akutních míšních řezů metodou patch clamp. V první sérii experimentů byla testována citlivost na aplikaci endogenního agonisty OLDA 5 dnů po navození modelu periferní neuropatie. Aplikace již nízké koncentrace OLDA (0,2 μm) výrazně zvýšila frekvenci mepsc na 250 % kontrolní hodnoty, na rozdíl od snímání u kontrolních experimentů kde je ke zvýšení potřeba vysoké koncentrace OLDA (10 μm). Inkubace řezů s TNFα ve druhé řadě pokusů u stejného modelu neuropatie vedlo mimo to také ke zvýšení základní frekvence mepsc, které bylo podmíněno aktivací TRPV1 receptorů. Tyto výsledky svědčí o možnosti nárůstu aktivace presynaptických TRPV1 receptorů endogenními agonisty za stavů periferní neuropatie. Ve třetí sérii pokusů aplikace NAPE u kontrolních řezů snížila frekvenci mepsc na 32 % základní hodnoty, pravděpodobně díky aktivaci CB1 receptorů. Tento pokus naznačil důležitost interakce mezi CB1 a TRPV1 receptory při modulaci nociceptivní signalizace na míšní úrovni. Získané výsledky demonstrují významnou úlohu presynaptických TRPV1 receptorů a jejich endogenních agonistů a modulátorů při vzniku patologických bolestivých stavů. Odhalení mechanismů funkce těchto receptorů a jejich modulace může přinést nové terapeutické přístupy při léčbě bolesti. Klíčová slova: Bolest, nocicepce, neuropatie, mícha, TRPV1, TNFα, N- oleoyldopamin, OLDA, NAPE, míšní synapse, axotomie - 4 -

5 Abstract (English) Modulation of synaptic transmission in dorsal horn of spinal cord plays a key role in nociceptive signalling. Recent studies have indicated a great importance of presynaptic TRPV1 receptors (transient receptor potential vanilloid) in spinal cord. These receptors act as molecular integrator of nociceptive stimulation on periphery. The way of their activation and the effect on modulation of the synaptic transmission are not clarified yet. Previous studies demonstrated the influence of many inflammatory mediators and cytokins on TRPV1 receptors. The aim of our research was to show changes in activation of presynaptic TRPV1 receptors in the spinal cord following the application of endogenous agonist N-oleoyl dopamine (OLDA) in a model of peripheral neuropathy, after incubation with cytokine TNFα and to show the effect of precursor of anandamide N-acylphosphatidylethanolamine (NAPE). In our experiments, we have recorded miniature excitatory postsynaptic currents (mepsc) from neurons of acute spinal cord slices by the patch-clamp method. The first series of experiments tested sensitivity to application of the endogenous agonist OLDA 5 days after evoking peripheral neuropathy. The frequency of mepsc increased significantly to 250 % of base level after applying a low concentration of OLDA (0,2 μm). It was very different from the control experiments, in which a high concentration of OLDA (10 μm) was necessary. The second series of tests, - an incubation of slices with TNFα -, in the same model of neuropathy, showed also increased responsiveness to OLDA application as well as an increase of the basic frequency of mepsc, which was partially conditioned by activation of TRPV1 receptors. These results point to important role of presynaptic TRPV1 receptors, possibly due to activation by endogenous agonists in the states of peripheral neuropathy. In the last set of experiments, NAPE was applied. It lowered the frequency of mepsc to 32 % of the basic level, probably thanks to the activation of CB1 receptors. The results of these experiments suggested the importance of interaction between CB1 and TRPV1 receptors in modulation of nociceptive signalling in the spinal cord. Our results demonstrate a significant role of presynaptic TRPV1 receptors and their endogenous agonist and modulators in a development of pathological pain conditions. The revelation of mechanisms and modulation of these receptors can bring new therapeutic approaches in pain treatment. Keywords: Pain, nociception, neuropathic pain, spinal cord, TRPV1, TNFα, N- oleoyl dopamine, OLDA, NAPE, spinal synapse, axiomy - 5 -

6 Seznam zkratek AA aminokyseliny AMPA α-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionátová kyselina AP-1 aktivační faktor-1 ASK1 apoptosis signal-regulated kinase-1 ATP adenosintrifosfát BDNF brain-derived neurotrophic factor CB1(2) kanabioidní receptor 1(2) CNS centrální nervová soustava DAG diacylglycerol DD death doména DRG dorsal root ganglion (zadní kořen míšní) DH dorsal horn (zadní roh míšní) FADD fas-associated DD protein H 2 O 2 peroxid vodíku IASP The Interational Association for Study of Pain IKK IκB kináza IL interleukin IκB inhibiční protein NF-κB JNK c-jun N-terminalní kináza MEKK mitogenem aktivovaná protein kináza/erk kináza kináza 1 MK mastné kyseliny MKK mitogenem aktivovaná protein kináza kináza NAD + nikotinamiddinukleotid NAPE N-acylfosfatidylethanolamin NF-κB jaderný faktor κb NMDA N-methyl-D- aspartát NS nervová soustava OLDA N-oleyldopamin PI 3 K fosfoinositid 3-kinasa PIP 2 fosfoinositolbifosfát PKC fosfokinasa C PLC fosfolipasa C PNS periferní nervová soustava R receptor (např. AMPA R) RIP receptor interacting protein RTX resiniferatoxin - 6 -

7 SB SODD TNFα TNFR TRADD TRAF TRP TRPV VR SB antagonista TRPV1 receptorů silencer of DD Tumor necrosis factor alpha Tumor necrosis factor alpha receptor TNF receptor-asociovaný DD protein (s) TNF-receptorem asociovaný faktor Transient receptor potential Transient receptor potential vanilloid (subfamily) vanilloidní receptor - 7 -

8 OBSAH ÚVOD... 9 LITERÁRNÍ PŘEHLED Bolest a její typy Mechanismy nociceptivní signalizace Typy senzorických vláken Šedá hmota míšní Senzorické dráhy Synapse nociceptivního systému v míše TRP kanály TRPV1 (VR1) kanál Výskyt TRPV Struktura TRPV Aktivace a modulace TRPV Mechanismy desenzitizace TRPV Funkce TRPV1 v nervové soustavě Tumor necrosis factor alpha Struktura Signalizační kaskády TNFα Funkce v nervové soustavě Geny časné odpovědi c-fos a c-jun a nocicepce Neuropatická bolest Mechanismy neuropatické bolesti Modely neuropatické bolesti CÍLE PRÁCE METODY Použité chemikálie Použité roztoky Příprava míšních řezů Elektrofyziologická měření Aparatura a příslušenství Skleněné mikroelektrody Metoda terčíkového zámku (patch clamp) Aplikace látek

9 5. Analýza dat Přetětí sedacího nervu jako model neuropatické bolesti VÝSLEDKY Vliv axotomie na frekvenci mepsc Aplikace nízké koncentrace OLDA zvýšila frekvenci mepsc 5 dní po přetětí sedacího nervu Vliv cytokinu TNFα na modulaci nociceptivního synaptického přenosu u modelu neuropatické bolesti Inkubace míšních řezů s TNFα po axotomii zvyšuje citlivost TRPV1 receptorů na aplikaci nízké koncentrace endogenního agonisty OLDA Vliv antagonisty TRPV1 SB na mepsc frekvenci na řezech po inkubaci v TNFα u modelu neuropatické bolesti Vliv endogenního agonisty CB1 a TRPV1 receptorů NAPE na mepsc v lamině I a II zadního rohu míšního DISKUSE Vliv axotomie na aktivaci TRPV1 receptorů endogenním agonistou TRPV1 receptorů N-oleoyldopaminem Modulace míšního synaptického přenosu cytokinem TNFα v modelu neuropatie Modulace míšního synaptického přenosu cytokinem TNFα v modelu neuropatie a vliv na aktivaci TRPV1 receptorů endogenním agonistou OLDA Vliv antagonisty TRPV1 receptorů (SB ) na frekvenci mepsc míšních neuronů po inkubaci v TNFα u modelu neuropatie Modulační vliv NAPE na synaptický excitační přenos ZÁVĚR LITERATURA

10 ÚVOD Bolest je neoddělitelnou součástí smyslového vnímání člověka. Vedle silných citových prožitků přináší i velmi důležitou informaci o možném poškození tkání a má tak zásadní význam pro přežití. Bolest vznikla jako součást ochranných mechanismů, přítomných v různé podobě u řady živočichů a organismů. Existuje však mnoho stavů, kdy bolest přestává plnit tento ochranný účel a přerůstá v nežádoucí příznak či dokonce samostatné onemocnění. I proto je bolest již od pradávna studována, zejména ve snaze o její potlačení. V posledních letech se při výzkumu mechanismů bolesti dostaly do centra pozornosti nově objevené TRPV1 receptory. Jejich zásadní vliv na přenos bolestivých podnětů je již poměrně dobře popsán na periferii. Hojně se však vyskytují i v zadních rozích míšních, kde mohou významně modulovat účinnost synaptického přenosu. Mechanismus aktivace TRPV1 receptorů na presynaptických zakončeních, vliv jejich aktivace a modulace za patologických podmínek na přenos nociceptivní informace ale není dosud dostatečne studován. Vzhledem k tomu, že znalost těchto mechanismů by mohlo výrazně ovlivnit vývoj nových analgetik, směřovaly i naše pokusy k jejich objasnění

11 LITERÁRNÍ PŘEHLED 1. Bolest a její typy Bolest je definována jako nepříjemná vjemová a emocionální zkušenost související se skutečným nebo potenciálním poškozením tkáně, nebo je jako takové poškození popisována. Z této definice zveřejněné mezinárodní organizací pro výzkum bolesti (IASP, 1979) vyplývá, že bolest je subjektivní. Pro úplné popsání fenoménu bolesti je potřeba do něj zahrnout čtyři pojmy: Nocicepci, bolest, utrpení a bolestivé chování (Roenn et al., 2006). Nociceptivní podnět, bolest vyvolávající, je takový, který potenciálně či skutečně způsobuje poškození tkáně (Loeser a Treede, 2008). Na druhou stranu, bolest může být přítomna i bez nocicepce viz níže. Utrpení je negativní emociální odpověď mozku (CNS), která může být vyvolána nejen bolestí, ale i stresem, strachem, úzkostí, ztrátou milovaných objektů a dalšími psychologickými stavy (Roenn et al., 2006). U lidí je možné bolest hodnotit mimo verbální komunikaci také díky sledování bolestivého chování. Toto chování zahrnuje například grimasy, sténání, ochabování svalů či kulhání, trvalé hledání lékařské péče či pracovní selhání. Bolestivé chování lze kategorizovat různými měřítky počátkem, trváním, intenzitou, frekvencí, pravidelností a druhem chování (Roenn et al., 2006). Bolest samotnou lze rozdělit dle více hledisek. Pokud budeme uvažovat o vzniku bolesti v rámci nervové soustavy, rozeznáváme bolest periferní (bolest v místě nociceptivního podnětu) a centrální (způsobená poškozením sensorických nervových drah v CNS). Dále lze vzít v potaz konkrétní místo na těle či uvnitř těla. Sem lze zařadit bolest muskuloskeletární, kožní, viscerální (vnitřních orgánů v trupu, zejména pak trávicí soustavy), bolest hlavy, zubů atd. Jedním z nejdůležitějších hledisek je však délka trvání. Dle ní dělíme bolest na akutní, která trvá v řádu sekund, subchronickou (hodiny až dny) a chronickou, jejíž trvání je delší než šest měsíců (Millan, 1999). Akutní bolest je okamžitá, probíhá při bolestivém podnětu. Má fyziologický význam, napomáhá reparaci organismu, hojení a úniku ze stresové situace vzniklé bolestivým podnětem. Subchronická bolest může být přítomna v průběhu léčení, zotavování poškozené tkáně. Chronická bolest naopak už může sama o sobě zvětšovat poškození tkáně (Millan, 1999). Chronická bolest není pouze příznakem, ale je považována za samostatné onemocnění (Ueda, 2008). Chronickou bolest často provázejí allodynie a hyperalgesie. Allodynie je stav, kdy nebolestivý podnět (např. dotyk) je vnímán bolestivě. Hyperalgesie znamená zvýšenou odpověď (větší bolest) na podnět, který je sám o sobě bolestivý (např

12 tepelný podnět). Rozlišujeme primární a sekundární hyperalgesii. Primární se objevuje v přímo v poškozené tkáni a vzniká senzitizací primárních senzorických aferentů, o nichž bude více informací níže. Sekundární hyperalgesie je naopak typická pro neporaněnou okolní tkáň a vzniká v CNS nejspíše tzv. centrální senzitizací (Campbell a Meyer, 2006). Dalším způsobem je rozdělení na bolest nociceptivní (neboli fyziologickou), neuropatickou a zánětlivou. Nociceptivní bolest je způsobena běžným nociceptivním stimulem (vysoká teplota, mechanické poškození tkáně). Neuropatická bolest, která vzniká při poškození senzorických nervů, ať už v centrální či periferní nervové soustavě, je velmi těžko zvratitelná, přestože její příčiny už byly v mnohém upřesněny (Ueda, 2008; Scholz a Woolf, 2002). Neuropatická bolest je přítomna i bez nociceptivních podnětů. Bolest zánětlivého původu provází, jak její název připomíná, zánětlivé procesy, např. při mechanickém poranění tkáně. Řada faktorů (např. TNFα, IL-1β, IL-6, bradykinin) se podílí na běžné zánětlivé reakci organismu vůči virům, bakteriím apod., ale i na facilitaci přenosu nociceptivních podnětů. Patologická chronická bolest se často projevuje symptomy zánětlivé i neuropatické bolesti najednou. Zánětem mohou být poškozeny nervy, čímž původně zánětlivá bolest získá prvky neuropatické. A naopak, při poškození nervu může dojít k rozvoji zánětu a v důsledku toho se neuropatická bolest stane zároveň zánětlivou. Vedle zásadní úlohy neuronů hrají roli v ovlivňování bolesti také gliové buňky, které vylučují celou řadu neuromodulátorů, ale také jsou samy schopny uvolňovat některé neurotransmitery či je naopak vychytávat a tím významně modulovat nociceptivní signalizaci. V následujících kapitolách budou popsány základní mechanismy přenosu a modulace bolesti se zaměřením zejména na míšní oblast, zejména ovlivňování za fyziologických a patologických bolestivých stavů, konkrétně při vzniku a trvání neuropatické bolesti. Příčina Umístění Způsob vzniku Délka trvání Nocicepce Neuropatie periferní, viscerální periferní, centrální (thalamická aj.), dysautonomní trauma (poranění), zánět, ischemie tkáně poškození periferního nervu, poškození CNS, remodelace CNS, dysfunkce vegetativního nervového systému akutní, subchronická; chronická subchronická, chronická Tabulka 1 Srovnání nociceptivní a neuropatické bolesti dle umístění, způsobu vzniku a délky trvání. Neuropatická bolest má vždy dlouhodobější charakter (subchronická, chronická) a příčinou jejího vzniku je poškození nervového systému

13 2. Mechanismy nociceptivní signalizace Typy senzorických vláken Periferní nervy jsou nezbytnou součástí senzorického systému, který zpravuje organismus o změnách ve vnějším a vnitřním prostředí. Stimulací některých typů vláken dochází k nocicepci. Za určitých patologických podmínek se však přenosu bolesti účastní i nervy běžně reagující na nebolestivé podněty, čímž přispívají k rozvoji allodynie. Axony primárních senzorických neuronů jsou dělena na Aα, Aβ, Aδ a C vlákna. Těla těchto neuronů jsou uložena ve spinálních gangliích (DRG), z nichž vychází pseudounipolární výběžek. Ten se rozvětvuje na periferní, který slouží k detekci podnětů, a centrální vedoucí do míchy. Aα vedou vzruchy ze svalových vřetének a Golgiho šlachového tělíska. Aβ přenášejí do CNS informace o změnách délky svalu, čímž podporují funkci Aα vláken, detekují nebolestivé podněty z kloubů a hlavně z kůže. Dráždění těchto periferních zakončení za běžných podmínek mírní bolest, avšak při patologických stavech, jako je neuropatická bolest, se také mohou podílet na vzniku bolestivých vjemů. Obě následující skupiny jsou polymodální nociceptory, tedy reagující na více typů podnětů. Aδ zahrnují volná nervová zakončení tlaku, chladové termoreceptory a především přenášejí rychlé bolestivé vzruchy (ostrá bolest). C vlákna přenášejí tzv. pomalou bolest (tupá, vytrvalá bolest) vyvolanou teplem, chemickými i mechanickými podněty (Julius a Basbaum, 2001). Jednotlivé typy vláken se také liší svojí myelinizací, a tím i rychlostí vedení vzruchů. Aα a Aβ jsou myelinizovaná silně a dokáží přenášet podnět rychlostí m/s, resp m/s v případě Aβ vláken. Aδ mají pouze slabou myelinovou vrstvu (rychlost přenosu 3 30 m/s) a C vlákna nejsou myelinizovaná vůbec (0,5 2 m/s). Rozdíly lze nalézt také ve velikosti těl neuronů v DRG. Buňky dávající vznik C vláknům v periferii mají nejmenší těla, Aα a Aβ největší (Julius a Basbaum, 2001) Šedá hmota míšní Mícha je místem, kde dochází k prvnímu spojení mezi CNS a periferií. Proto také synapse na neuronech v šedé hmotě míšní hrají nejdůležitější úlohu v modulaci senzorických vjemů. Z hlediska studia nocicepce je důležité rozlišit, které neurony a synapse se podílejí na přenosu nociceptivní signalizace a které nikoliv. Za patologického stavu se tato situace může měnit a synapse s nociceptivními míšními neurony mohou tvořit i aferenty běžně nezprostředkovávající tento typ podnětu

14 Šedou hmotu míšní dle Rexedova členění (1952) lze rozdělit na deset vrstev, tzv. lamin, podle rozdílů v hustotě a velikosti neuronů (viz obr. 1). Označeny jsou římskými číslicemi dorso-ventrální rovině. Lamina I, marginální zóna, obsahuje projekční neurony se synapsemi s Aδ vlákny. V lamině II, substantia gelatonisa, se vyskytují převážně interneurony, většinou menší než projekční. Lamina dvě byla v pozdějších studiích rozdělena na vnější II o ( outer ) a vnitřní II i ( inner ). Do laminy II projikují C vlákna a společně s laminou I jsou hlavní oblastí, kde jsou zakončeny primární nociceptivní aferenty. Souhrně se lamina I a II často označují jako superficiální oblast zadního rohu míšního. Laminy III a IV jsou také jinak nazývány nucleus proprius a přijímají informace z neuronů DRG převážně o lehkých taktilních podnětech (Aβ vlákna) a někdy na tepelné a bolestivé stimuly. V lamině V a VI konvergují vstupy z povrchnějších lamin, navíc do V. laminy ústí i C vlákna, tudíž tyto vrstvy se podílejí také na nocicepci. Ovšem poslední z dorzálních vrstev (VI), označovaná jako nucleus dorsalis, lze definovat pouze ve zduřeních v segmentech odstupu nervů končetin. Laminy VII IX náleží přednímu rohu míšnímu, přičemž lamina VII obsahuje autonomní motorické neurony sympatických drah, lamina VIII motorické interneurony a lamina IX motorické a sympatické neurony. Lamina X vytváří prostor okolo centrálního kanálu. V zadním rohu míšním jsou, podle cílové oblasti projekce, projekční neurony, interneurony a propriospinální neurony. Propriospinální neurony mají veškeré výběžky pouze v míše a integrují a modulují laterální a segmentální míšní signalizaci. Obrázek 1 Rexedovo laminární členění. Levá polovina obrázku znázorňuje dělení šedé hmoty míšní do jednotlivých lamin I X. V pravé jsou zobrazena jádra. Substantia gelatinosa odpovídá zhruba lamině II, nucleus proprius zasahuje do lamin III a IV. Nucleus dorsalis, neboli lamina VI se nalézá v míšních segmentech odstupu končetin. V lamině VII se nachází nucleus intermediolateralis v segmentu L3, kde dává vznik pregangliovým vláknům sympatického nervového systému. Motorické neurony jsou převážně v lamině VIII (Rexed, 1952; obr. Wikipedia, 2010). Projekční neurony přenášejí informace do vyšších center CNS a vyskytují se zejména v laminách I, V a VI. Liší se odpovědí na signalizaci primárních aferentů způsobenou řadou podnětů. Nízkoprahové projekční neurony reagují preferenčně na nebolestivý podnět (např. dotykový vedený Aβ vlákny), naproti tomu

15 vysokoprahové jsou specificky nociceptivní neurony, které odpovídají na aktivitu Aδ a C vláken. Tyto vysokoprahové projekční buňky se nacházejí především v lamině I, resp. II o, a vzácně v laminách IV VI. Posledním typem projekčního neuronu jsou tzv. s širokým dynamickým rozsahem, které mají za úkol konvergovat vstupy všech typů stimulů z kůže, svalů i útrobních orgánů od mechanických a chemických až po tepelné podněty z Aβ, Aδ i C vláken. Vyskytují se zejména ve vrstvách IV VI, řidčeji v I, II o a X (Millan, 1999). Interneurony se nejvíce vyskytují v lamině II. Mají velký význam pro modulaci nociceptivní signalizace, ať už směrem k senzitizaci či atenuaci. Jedná se o tzv. heterosynaptickou plasticitu. Interneurony jsou dvojího typu, excitační a inhibiční. Inhibiční přímo kontaktují projekční neurony i primární aferentní vlákna, čímž mohou působit tlumivě na presynaptické i postsynaptické mechanismy nocicepce. Dle přenašeče rozlišujeme inhibiční interneurony GABAergní (vylučují neurotransmiter kyselinu γ-aminomáselnou) a glycinergní (glycin). Některé však vylučují oba typy. Excitační interneurony nepřímo polysynapticky aktivují projekční neurony. Podobně jako primární nociceptivní vlákna vylučují excitačně působící glutamát a mnoho neuropeptidů jako substance P a dalších látek s neuromodulačními účinky Senzorické dráhy Senzorické dráhy vedou signály z jednotlivých částí těla do mozku. Při jejich poškození je narušena schopnost zpracovávat příslušné vjemy. Je-li poškozena nociceptivní dráha, ať už na periferii či na centrální úrovni, může se vyvinout neuropatická bolest. Senzorický systém zpravuje jak o stavu vnitřního prostředí, tak o změnách ve vnějším prostředí. Nociceptivní dráhy vedou informaci z volných nervových zakončení přes těla neuronů zadními kořeny do míchy. V míše je stimul předáván přes synapse na projekční neurony lokalizované v laminách I a V, v menším počtu IV a VI, ventrálních laminách VII a VIII a centrální lamině X. Axony spinothalamických neuronů vedou kontralaterálně, často už ve stejném segmentu jako je tělo tohoto neuronu či v sousedních míšní oblasti. Tato vlákna jsou sdružena do provazců ascendentních drah, která projikují do řady mozkových center. Z hlediska bolesti je velmi důležitá signalizace do thalamu a mozkového kmene. Dráhy se dělí na přímé, zahrnující spinothalamickou, spinomesencefalickou a spinoretikulární, a nepřímé. Spinothalamická dráha integruje vzruchy přicházející z vláken Aδ v lamině I a V zadních rohů míšních, kde je signál přenášen na projekční neurony (Patestas a Partner, 2006). Touto cestou jsou převáděny podněty do ventroposterolaterálního a ventroposteromediálního thalamu

16 Spinomesencefalická dráha projikuje do jader retikulární formace středního mozku a periakvaduktální šedi. Spinoretikulární dráha končí v jádrech retikulární formace prodloužené míchy a Varolova mostu. Nepřímé vzestupné dráhy se přepojují při signalizaci do vyšších center na sekundární neurony (neurony druhého řádu). Rozeznáváme dvě hlavní dráhy, zadní provazce míšní a spinocervikothalamickou. Zadní provazce míšní jsou součástí lemniskového systému, v němž jsou i axony přenášející nebolestivé stimuly. Společně s nimi projikují do jader prodloužené míchy, nucleus gracilis a nucleus cuneatus. Zadní provazce jsou v průběhu mediálního lemnisku převedeny na kontralaterální stranu a pokračují dále do thalamu. Smyslové informace z obličejové části je vedena drahami začínajícími v trigerminálních jádrech. Změny v kterékoliv části nociceptivních senzorických drah mohou ovlivnit celkový vjem bolesti, avšak z tohoto hlediska jsou klíčové míšní synapse primárních aferentů, jimž je věnována následující kapitola Synapse nociceptivního systému v míše Pro modulaci nociceptivního podnětu je nejdůležitější složkou synapse tohoto systému v míše. Na ní dochází k celé řadě procesů, jejichž objasnění může přispět k pochopení mechanismů bolesti a následně lepší léčbě patologických bolestivých stavů. Primární nociceptivní aferenty přivádějí svá vlákna převážně k neuronům v superficiální oblasti (lamina I a II) zadního rohu míšního, kde s nimi vytvářejí synapse. Zde dochází k nejdůležitějšímu ovlivnění intenzity signálu přicházejícímu z periferie. Dlouhodobé excitační změny na těchto synapsích vedou k tzv. centrální senzitizaci, což je jeden z nezbytných prvků pro rozvoj patologických bolestivých stavů. Na obou membránách, presynaptické i postsynaptické, je celá řada receptorů a iontových kanálů, které jsou modulovány mnoha faktory, od pravděpodobnosti otevření, přes kinetiku vazeb s aktivačními látkami, koncentrací těchto látek až po jejich odstranění ze synaptické štěrbiny. Nociceptivní aferenty působí excitačně na spinální projekční neurony díky výlevu glutamátu z jejich centrálních zakončení, které aktivují postsynapticky uložené glutamátové ionotropní receptory umožňující vtok kladně nabitých iontů (Na +, popř. Ca 2+ ). Jedná se o tzv. rychlý excitační synaptický přenos, do nějž jsou zapojeny především AMPA a kainátové receptory vyvolávající excitační postsynaptické proudy (EPSC). NMDA receptory se na rychlém přenosu také

17 podílejí, ale až po uvolnění Mg 2+, které působí jako tonický inhibitor těchto kanálů. K uvolnění hořčíkového bloku dochází až po depolarizaci membrány. Analogicky fungují rychlé inhibiční postsynaptické proudy (IPSC). Ty jsou však vyvolávány inhibičními neurotransmitery glycinem a GABA aktivujícím příslušné ionotropní receptory, což způsobuje hyperpolarizaci vtokem Cl - těmito kanály. Excitace konkrétní synapse je zaostřena aktivací inhibičních interneuronů, které uvolňují glycin a GABA (Woolf a Salter, 2000). Pomalý excitační synaptický přenos je umožněn aktivací metabotropních glutamátových receptorů (mglur) a dalších metabotropních receptorů spřažených s trimerními G-proteiny, jako je neurokininový receptor NK1 reagující na substanci P uvolněnou z presynaptické membrány (Woolf a Salter, 2000). Tím je spuštěna signální kaskáda, která může vést k dlouhotrvající (desítky sekund) depolarizaci postsynaptické membrány. Pomalá inhibice je způsobena kyselinou γ- aminomáselnou působící na metabotropní GABA B receptory, které jsou však uloženy především presynapticky. Dalšími důležitými látkami působícími v synaptickém přenosu je celá řada neuromodulátorů. Mezi ně patří růstové faktory NGF, adenosintrifosfát (ATP), produkty cyklooxygenázové reakce prostaglandiny, cytokin TNFα, oxid dusný NO schopný difundovat přes membránu, neuropeptidy CGRP a substance P, různé endokanabinoidy a peptidy jako neuropeptid Y, galanin a cholecystokinin (Millan, 1999). Všechny tyto látky mají své receptory, ať už pre- či postsynapticky. Mechanismy jejich působení se velmi liší. Tato práce se věnuje především TRPV1 receptorům, které mají zásadní vliv na modulaci nociceptivního přenosu. 3. TRP kanály Poměrně nedávno objevené TRPV1 receptory, které, jak se ukazuje, mají podstatné účinky na modulaci a přenos bolesti, patří do velké skupiny TRP receptorů, jejichž role však nespočívá pouze v nocicepci, ale i v celé řadě dalších pochodů. Pro lepší pochopení souvislostí a funkce TRPV1 receptoru je zde zařazena tato kapitola pojednávající o rodině proteinů, do níž tento receptor patří. TRP jsou neselektivní kationtové kanály, kterými prochází ionty Ca 2+, Na + a Mg 2+. Tyto kanály se skládají ze čtyř podjednotek (tetramer). Každá z podjednotek obsahuje šest transmembránových helixů, přičemž N- i C- konec se nachází na intracelulární straně membrány (viz obrázek 4). Mezi pátým a šestým helixem se nachází tzv. poor loop, hydrofobní smyčka, která vytváří pór pro průchod iontů celým tetramerem (Astorga a Bacigalupo, 2007)

18 TRP kanály lze rozdělit do dvou hlavních skupin dle topologické podobnosti (Montell, 2005). Každý člen skupiny 1 (viz obrázek 4) sdílí s ostatními členy prokazatelnou sekvenční homologii v transmembránových doménách (helixech) a obsahuje nejméně 3 ankyrinové domény u N-konce. Ankyrinová doména se skládá z 33 AA. Její funkce spočívá v protein-proteinové interakci, tedy například ukotvení proteinu v cytoskeletu, transkripci (nikoliv u TRP kanálů), přenosu signálu či iontu (Mosavi et al., 2002). Značný počet TRP receptorů ze skupiny 1 je exprimován v DRG a hraje důležitou úlohu v nocicepci. Proto je na ně v současné době zaměřen výzkum při hledání nových analgetik. Naproti tomu skupina 2 zahrnující TRPP (polycystin) a TRPML (mucolipin) je poměrně špatně charakterizována. Jejich společným znakem je extracelulární smyčka mezi prvním a druhým helixem (Astorga a Bacigalupo, 2007). Obrázek 2 TRP kanály Dvě skupiny TRP; vysvětlivky: A (zelená)) ankyrinová doména, CC (světle fialová) coiled-coil doména, TRP (tyrkysová) TRP doména; P pore loop (přizpůsobeno, Venkatachalam a Montell, 2007). Skupina 1 se dělí na pět podskupin: TRPC (canonical), TRPV (vanilloid), TRPM (melastatin), TRPA (ankyrin) a TRPN. První čtyři se hojně vyskytují u savců, TRPN byla objevena u octomilky (Drosophila melanogaster), dánia (Danio rerio, zebrafish) a háďátka (Cenorhabditis elegans). Tento mechanoreceptor je exprimován ve zrakových a sluchových orgánech (Sidi et al., 2002). Vyznačuje se větším množstvím ankyrinových domén na N-konci (Astorga a Bacigapulgo, 2007). TRPC zahrnuje devět členů, TRPC1 7 a TRPL a TRP D. melanogaster. V rámci savčího organismu se jedná o široce rozšířené kanály vyskytující se např. v mozku, srdci, varlatech, vaječnících, svalech a nadledvinkách (Clapham et al., 2001). Podílejí se mimo jiné na excitabilitě Purkyňových buněk, akrosomální reakci spermií i výlevu neurotransmiterů (Astorga a Bacigapulgo, 2007)

19 Podskupina TRPM dostala jméno po prvním objeveném proteinu, TRPM1. Exprese TRPM1 nepřímo souvisí s metastatickým potenciálem některých melanomických buněčných linií (Duncan et al, 1998). Podobně jako TRPC jsou velmi rozšířeny v různých tkáních, jako je mozek, ledviny, prostata, plíce, střeva ad. Na rozdíl od ostatních členů skupiny 1, N-konec těchto proteinů neobsahuje ankyrinové domény (viz obr. 4). Celkem je TRPM kanálů osm, z toho TRPM 5 a 8 jsou termosenzitivní, tedy aktivované i teplotou. U TRPM5 se jedná o rozmezí C, u TRPM 8, mimo jiné reagující také na menthol, to je rozsah od 23 do 28 C. Kanál TRPM 8 zprostředkovává vnímání chladu (Astorga a Bacigapulgo, 2007). Do ankyrinové podskupiny patří jeden savčí protein, dva exprimované v háďátku a daniu a čtyři v octomilce. Tato podskupina je typická větším počtem ankyrinových zbytků (cca 14) na N-konci, které ji mohou kotvit k dalším signálním proteinům (Astorga a Bacigapulgo, 2007). Savčí TRPA byl nalezen v DRG a vláskových buňkách ucha. Taktéž se řadí mezi termosenzitivní, aktivovaný nízkou teplotou (viz tabulka 2). Poslední poměrně početnou skupinou jsou vanilloidové TRP, z nichž šest exprimují tkáně jak savčí, tak tkáně bezobratlých, octomilky a háďátka. Pro savce je typická produkce v nociceptivních neuronech DRG, v mozku, močovém měchýři, slezině, játrech a dalších orgánech. TRPV kanály dostaly své jméno díky tomu, že je možné je aktivovat vaniloidními látkami (homovaniliny), mezi něž patří celá řada dráždivých extraktů z rostlin. Jedná se o kapsaicin z paprik (Capsicum) objevený už v roce 1846, piperin z pepře, resiniferatoxin ze sukulentu Euphorbia resinifera ad. Podobně jako TRPM5 a 8 jsou někteří zástupci této podskupiny termosenzitivní. Na rozdíl od melastatinových kanálů však reagují na teplotu od 39 do 43 C. Jedná se o TRPV1 4, přičemž TRPV1 může být aktivován a modulován celou řadou látek a jiných než teplotních podnětů (Astorga a Bacigapulgo, 2007). Tento kanál se významně podílí na nocicepci a jeho zvýšená aktivace může být příčinou mnoha patologických stavů souvisejících s bolestí (Jara-Oseguera et al., 2008). Proto je TRPV1 terčem mnoha výzkumů směřujících k tvorbě nových analgetických prostředků, je na něj zaměřena největší pozornost ze všech TRP kanálů a i v této práci mu bude věnována samostatná následující část. Na primárních nociceptorech se vedle něj nacházejí TRPV2 4, TRPM8 a TRPA1 receptory. Příklady aktivace jednotlivých typů kanálů shrnuje následující tabulka

20 Typ Aktivace Aktivace Aktivace Aktivace kanálu (endogenní) (exogenní) (teplotou) (jinak) Modulace TRPC1-7 DAG vyčerpání zásob Ca 2+ TRPM1 translokace membrány TRPM2 osmotický tlak, TRPM3 vyčerpání zásob TRPM4 Ca 2+, PIP 2 změnou napětí TRPM5 Ca 2+, PIP C změnou napětí translokace do TRPM6 membrány ATP, PIP 2, TRPM7 fosforylace menthol, TRPM8 icilin, PIP C canabinoidy, TRPA1 DAG bradykinin <17 C mechanicky TRPN mechanicky anandamid, OLDA, PKC, kapsaicin, TRPV1 PIP 2 olvanil, RTX >43 C mechanicky TRPV2 PI 3 K, IGF-I >52 C hypoosmoralita nenasycené TRPV3 MK + PLC C hypoosmolarita, TRPV C mechanicky nedostatek Ca2+, translokace do do (c)adpribosa, nukleotidy, Ca 2+, H2O2, NAD + inhibice Mg 2+ inhibice Mg 2+ změnou ph PIP 2, nižší ph, cytokiny, ethanol, nikotin TRPV5 membrány nedostatek Ca2+, translokace do TRPV6 membrány Tabulka 2: Příklady aktivace a modulace jednotlivých typů TRP kanálů (Clapham et al., 2001; Astorga a Bacigapulgo, 2007)

21 3. 1. TRPV1 (VR1) kanál Důležitost TRPV1 receptorů byla v mnohém objasněna v rámci periferních zakončení primárních aferentů, je však zjevné, že svoji nezastupitelnou úlohu plní i na míšních synapsích nociceptivního systému. Zde jeho modulační účinky jsou předpokládané, ne však zcela upřesněny. I proto je ústředním prvkem zájmu této práce. Vaniloidní receptor 1 byl prvním objeveným ze své podskupiny. Je typickým zástupcem TRPV. Podrobněji viz (Struktura TRPV1). Objev tohoto kanálu v roce 1997 znamenal průlom ve zkoumání molekulárních mechanismů bolesti, neboť právě TRPV1 umožňuje převod mezi nociceptivním podnětem a senzorickým signálem, který bolest vyvolává (Caterina et al., 1997). Bývá často označován jako molekulární integrátor fyzikálních a chemických nociceptivních podnětů (Caterina a Julius, 2001; Szallasi a Blumberg, 1999). Je aktivován teplotou přesahující 43 C, kapsaicinem, resiniferatoxinem a také algogenními látkami uvolňujícími se v místě poranění. Mezi ně patří například bradykinin, serotonin, prostaglandiny, substance P. TRPV1 je neselektivním kanálem pro Ca 2+, Na + a K +. S desetinásobnou preferencí propouští vápník oproti jednomocným kationům Výskyt TRPV1 TRPV1 se vyskytuje zejména na polymodálních primárních nociceptorech (Aδ a C vlákna, po celé délce). Nalezeny byly také v tělech neuronů s těmito axony ve spinálních gangliích, v menší míře na postsynaptických neuronech laminy I a II v míše, chuťových pohárcích, v mozku, epitelech, hladké svalovině. V míše je výskyt TRPV1 soustředěn především na malé a středně velké neurony s Aδ a C vlákna, která mají míšní synapse v superficiální oblasti laminy I a II. V lamině II je větší počet kapsaicin senzitivních axonů veden do její vnitřní části, II i (Valtschanoff et al., 2001). Primární aferenty s TRPV1 vytvářejí synapse častěji s míšními neurony, které exprimují NMDA a NK1 receptory než s těmi, které exprimují AMPA a NK1 receptory (Hwang et al., 2004). Taktéž byla prokázána exprese TRPV1 na primárních viscerálních vláknech a superficiálních míšních neuronech. Tyto neurony jsou glutamátergní, nikoliv inhibiční glycin- či GABAergní (Zhou et al., 2009), některé z nich navíc exprimují receptor substance P, NK1 (Doly et al., 2004a). Vedle glutamátových receptorů se na těchto neuronech vyskytují i opioidní μ receptory (Zhou et al., 2009). Naproti tomu na primárních aferentech jsou TRPV1 kolokalizovány s purinergními P 2 X 3 receptory a částečně také s NK1 receptory (Guo et al., 1999; Špicarová a Paleček, 2008). Aktivací TRPV1-21 -

22 glutamátergních neuronů může být posílen excitační synaptický přenos této oblasti. Vedle nervových buněk se tento kanál vyskytuje v lamině I a II také na astrocytech (Doly et al., 2004b). Distribuce TRPV1 však není rovnoměrná po celé míše. Největší hustota kanálů je v lumbálních segmentech, přičemž vzrůstá kaudálně v této části (Hwang a Valtschanoff, 2003). V mozku byl pomocí imunohistochemických metod TRPV1 receptor lokalizován v hipokampu, hypothalamu, kortexu, mozečku, centrální amygdale, paraventrikulárních jádrech thalamu a celé řadě dalších oblastí (Gibson et al., 2008; Li et al., 2004; Mezey et al., 2000) Struktura TRPV1 Kapsaicinový receptor je homotetramer, přičemž každá podjednotka se skládá ze šesti transmembránových segmentů s N- a C-koncem v cytosolu. Mezi S5 a S6 segmentem se nachází hydrofobní smyčka (P-loop), která v tetrameru vytváří pór pro ionty. Podjednotka obsahuje 838 AA o celkové molekulární hmotnosti kda (Caterina et al. 1997). Vytváření homotetrameru není jedinou možností tvorby kanálu. Podjednotky různých TRP kanálů mohou dohromady vytvářet kanál a dát tak vzniknout heterotetrameru (Smith et al. 2002). Hydrofilní N-konec podjednotky představuje více než polovinu proteinu (432 AA). Obsahuje oblasti bohaté na prolin a šest ankyrinových domén, které nejspíše slouží k interakci s cytoskeletem. Nachází se zde také arginin R114, který se podílí na vazbě kapsaicinu na tento protein. Důležitou funkční součást TRPV1 tvoří podstatně kratší C-konec (154 AA), který je rovněž položen intracelulárně. Podílí se na tetramerizaci, aktivaci a deaktivaci, senzitizaci či desenzitizaci receptoru. Také má vliv na citlivost kanálu vůči tepelným podnětům. Tetramerizaci receptoru umožňuje TRP box (Garcia- Martinez et al., 2004). C-konec obsahuje fosforylační místa pro proteinkinázy (PKC, c-amp závislá proteinkináza PKA, CaMK-II), která umožňují senzitizaci receptoru. Proti tomu desenzitizaci působí např. kalcineurin (fosfatáza), díky níž dochází ke konformačním změnám proteinu. Na C-koncové doméně se nachází i vazebná místa pro PIP 2 a ATP (tzv. Walker motif). Bylo také zjištěno, že zkrácení C-konce o posledních 31 aminokyselin snižuje práh teplotní aktivace. Pokud je C-konec zmenšen na polovinu, klesá citlivost vůči kapsaicinu, ph i změně membránového potenciálu (Vlachová et al., 2003)

23 Aktivace a modulace TRPV1 TRPV1 je aktivován celou řadou látek a změněných fyzikálně chemických podmínek, díky nimž se podílí na nocicepci, rozvoji bolesti při zánětu a dalších procesech. Existuje celá řada aktivátorů tohoto kanálu. Teplota ovlivňuje veškeré chemické reakce a pochody v těle. U TRPV1 kanálu bylo zjištěno, že při zvýšené teplotě (>43 C) se otevírá díky konformačním změnám tímto způsobem vyvolaných. Tato teplota také odpovídá prahu pro vnímání bolestivých tepelných podnětů. Jestliže teplota přesáhne 53 C, práh pro teplotní aktivaci TRPV1 se sníží. Je to způsobeno částečnou denaturací kanálu, zejména distální C-koncové části zodpovědné za tento způsob aktivace (Caterina et al., 1997). Citlivost kanálu vůči teplotě však může být ovlivněna i bradykininem a dalšími mediátory zánětu. Tyto látky mohou snížit práh tepelné aktivace fosforylací TRPV1 až k fyziologickým hodnotám (Sugiura et al., 2002). Se změnou teploty souvisí i citlivost kanálu vůči změně membránového potenciálu. Napěťová závislost aktivace je úzce spojena s růstem teploty. Při teplotě 17 C je hodnota napětí poloviny maximální aktivace kanálu (V 1/2 ) 150 mv. V rozmezí teplot mezi 40 a 45 C je tato hodnota již pouze -50mV, blízká klidovému membránovému potenciálu buňky (Voets et al., 2004). Existují dva modely vzájemné závislosti změny teploty a změny membránového potenciálu vůči aktivitě TRPV1 kanálu (Oseguera et al., 2008). První model vysvětluje výše uvedený vztah skrze přímý vliv teploty na napěťovou aktivaci. Malý vrátkový proud aktivuje TRPV1 kanál díky rozdílu volné Gibbsovy energie mezi zavřeným a otevřeným stavem, který je kladný u těchto kanálů (Voets et al., 2004, Nilius et al., 2005). Druhý model předpokládá existenci mnohočetných zavřených a otevřených stavů kanálu, přičemž pravděpodobnost otevření při změně teploty není ovlivněna napětím a naopak (Oseguera et al., 2008). V tomto případě vysoká citlivost receptoru vůči teplotě nevychází z malého vrátkového proudu, ale z velké změny entalpie mezi zavřeným a otevřeným stavem (Lattore et al., 2007, Brauchi et al., 2008). Je možné, že mnoho fyziologických stimulů aktivuje TRPV1 posunem V 1/2 do rozmezí napětí, které je dosažitelné poměrně malou změnou membránového potenciálu (Nilius et al., 2005). Kapsaicin a další analogické látky (např. RTX) jsou silně lipofilní látky zvané homovanilyly, které, přestože jsou exogenního původu, aktivují TRPV1 receptor z intracelulární strany. Kapsaicin (8-methyl-N-vanillyl-6-monoamid) obsahuje tři funkční oblasti, které se podílejí na vazbě na receptor. Jedná o aromatickou homovanilylovou skupinu, alifatický oktanylový řetězec a ester tvořící spojku mezi nimi. Aromatická skupina se váže jak na C-, tak na N-konec, naopak oktanylový řetězec se váže do lipofilní smyčky mezi tramsmembránovými segmenty S3 a S4-23 -

24 (Jordt a Julius, 2002). Dle jedné z hypotéz je aktivace, resp. desenzitizace, kapsaicinem závislá na přítomnosti extracelulárního Ca 2+ a Ca 2+ vážícího proteinu kalmodulinu a ATP. Na TRPV1 je totiž přítomna doména na N-konci, jež váže kalmodulin s navázaným vápníkem nebo ATP. O vazebné místo na TRPV1 receptoru tyto dvě látky kompetují. Rozhodujícím faktorem pro senzitizaci či desenzitizaci tohoto kanálu je tedy poměr koncentrací mezi ATP a kalmodulinem. Větší množství intracelulárního ATP brání desenzitizaci kanálu (buňky) v přítomnosti kapsaicinu, naopak kalmodulin ji usnadňuje (Lishko et al., 2007). Jedním z endogenních modulátorů TRPV1 je lokální zvýšení koncentrace protonů, kdy ph klesne pod 6,8. Tato acidosa je typická pro zánět, ischemii tkáně, ale i poranění. Při této hodnotě ph je zesílena aktivace TRPV1 kapsaicinem nebo jiným ligandem. Pokud se ph ještě sníží (<6,0), tak je aktivován kapsaicinový receptor přímo protony, které interagují s negativně nabitými aminokyselinovými zbytky extracelulární strany proteinu, čímž otevírají přímo iontový kanál (Tominaga et al., 1998). Konkrétní aminokyseliny (E478, E563, E600, D601, E648) byly identifikovány v práci Jordta a Julia o čtyři roky později (Jordt a Julius, 2002). TRPV1 kanál může být aktivován také endogenními lipidickými látkami, jako je například anandamid, N-oleoyldopamin (OLDA), N-arachidonoyldopamin (NADA), oleoylethanolamid (OEA), NAPE, ω-3-nenasycené mastné kyseliny ad. (Oseguera et al., 2008). Anandamid je endokanabinoidem aktivující vedle TRPV1 i kanabinoidní receptory CB1 a CB2 hojně se vyskytující v mozku i míše. Nejen anandamid, ale i NADA a OLDA vykazují určitou afinitu ke kanabinoidním receptorům, která se mění v závislosti na koncentraci látky. Anandamid v nízkých koncentracích aktivuje CB1 a CB2, ve vyšších (0,1 1 μm) naopak TRPV1 (Zygmunt et al., 1999). N-oleoyldopamin vykazuje větší specifitu vůči vaniloidnímu receptoru 1 oproti anandamidu a NADA. Je naopak pouze slabým agonistou CB1 receptorů. Schematické srovnání struktury obou látek s anandamidem a kapsaicinem naleznete na obr

25 Obrázek 3 Chemické struktury NADA, OLDA, kapsaicinu a anandamidu. Všem látkám je společná peptidická vazba (N-C=O). NADA, OLDA a kapsaicin sdílejí homovanilovou strukturu, která je odvozena z katecholu a je hydrofilní. NADA, OLDA a anandamid mají společný poměrně dlouhý nevětvený alifatický řetězec s jednou či více (v případě NADA a anandamidu) dvojnými vazbami. Kratší větvený alifatický řetězec má i kapsaicin. Tato část je lipofilní a umožňuje těmto látkám průchod přes cytosolickou membránu (Chu et al., 2003). NAPE, neboli N-acylfosfatidylethanolamin, součást enzymu NAPE-PLD, membránové fosfolipázy D (Okamoto et al., 2004), která je zodpovědná za vápníkem indukovanou syntézu anandamidu v primárních, kapsaicin senzitivních, nociceptivních neuronech (Nagy et al., 2009). NAPE je prekurzorem anandamidu. Vedle této skupiny látek sem patří i produkty štěpení kyseliny arachidonové lipooxygenasou. Tato reakce je typická pro vznik zánětu a dává vznik látkám, jako je kyselina 12- a 15-(S)-hydroperoxyeikosatetraenová (12- a 15-HPETE) a 5- a 15- hydroxyeicosatetraneová (5- a 15-HETE) (Hwang et al., 2000). Poslední lipidickou skupinou jsou již zmiňované ω-3-nenasycené mastné kyseliny - linoleová, dokosahexaenová - DHA, eikosapentaenová - EPA (Matta et al., 2007). Všechny tyto látky aktivují TRPV1 kanály, přičemž ale linoleová kyselina a EPA inhibují odpověď na vaniloidní agonisty. Proto by regulace těchto látek mohla být jednou z cest léčení bolestivých stavů (Matta et al., 2007). Do výčtu látek ovlivňující aktivitu TRPV1 kanálu je třeba zařadit ještě modulátory jeho funkce. Tyto látky působí nepřímo prostřednictvím jiných membránových receptorů, jež aktivují sekundární posly se specifickými funkcemi

26 Mezi nejdůležitější se řadí bradykinin, prostaglandiny a nervový růstový faktor (NGF), které se tvoří v průběhu zánětu. Bradykinin se váže na metabotropní receptor B2 spřažený s trimerními G-proteiny. Aktivuje tím fosfolipasu C, která vytváří fosfatidylinositolbisfosfát (PIP 2 ). PIP 2 se přímo napojuje na vazebné místo pro proteinkinasu C S800, čímž ji vyváže (viz níže). Nervový růstový faktor spouští signální kaskádu navázáním na receptor TrkA. Díky tomu tyrosinkinasa fosforyluje TRPV1, čímž je umožněno zanoření tohoto kanálu do plazmatické membrány. NGF je retrográdně transportován do těla nociceptoru, kde indukuje zvýšenou expresi TRPV1 (Zhang et al., 2005). Zvyšuje se tak počet funkčních kanálů, a tím dochází k senzitizaci primárních nociceptorů. Jedním z důsledků je například hyperalgesie (Oseguera et al., 2008). Prostaglandiny patří mezi produkty štěpení k. arachidonové. Spouští membránovou adenylylcyklasu, čímž zvyšují hladinu c-amp v cytosolu. Ta aktivuje proteinkinasu A (PKA), která fosforyluje konkrétní serinové a threoninové zbytky TRPV1. Fosforylace je nejvýznamnějším mechanismem vnitřní aktivace a senzitizace vaniloidního kanálu. Fosfátové zbytky jsou připojovány k S116 (c-amp závislá PKA), T144 (c-amp závislá PKA), Y200 (Src kinasa), T370 (c-amp závislá PKA), T704 (c-amp závislá PKA, CaMK-II), S502 (PKC, c-amp závislá PKA), S774 (c- AMP závislá PKA), S800(PKC), S820 (c-amp závislá PKA) (Jeske et al, 2009, Rathee et al., 2003). Proteinkinasy PKC, PKA, fosfatasa kalcineurin, fosfolipasa C a další intracelulární enzymy jsou k TRPV1 kanálu navázány pomocí proteinkinasu A vázajícího proteinu, zkráceně AKAP (Zhang et al., 2008). AKAP také zprostředkovává modulaci TRPV1 zánětlivými mediátory, jako jsou bradykinin a prostaglandin E2 (Zhang a McNaughton, 2008). Výčet možností aktivace není zcela jistě vyčerpávající, což vyplývá z multifunkčnosti a centrálnosti TRPV1 jakožto molekulárního integrátoru nociceptivních podnětů. Cílem této kapitoly bylo ukázat šíři a komplexnost dějů, na nichž se tento kanál podílí Mechanismy desenzitizace TRPV1 Desenzitizace znamená snižování odpovědi receptoru či kanálu za přítomnosti agonisty. Typickým příkladem je působení kapsaicinu na TRPV1. Dochází ke konformačním změnám uzavírajícím iontový kanál, čímž ztrácí dočasně či trvale funkci. Na tento proces má vliv zejména hladina Ca 2+ a defosforylace TRPV1 (Numazaki et al., 2003). Jelikož TRPV1 preferenčně propouští vápenaté

27 ionty, jejichž vysoká intracelulární koncentrace buňkám škodí, má desenzitizace ochrannou funkci. Desenzitizace TRPV1 probíhá přinejmenším dvěma způsoby. Prvním z nich je defosforylace klíčové aminokyseliny S502 fosfatázou kalcineurinem závislým na Ca 2+, čímž se snižuje aktivita kanálu (Zhang et al., 2008). Druhou variantou je vazba kalmodulinu, který se po navázání vápenatých iontů váže na C- i N-konec TRPV1. Na C-konci blokuje vazebné místo pro Src kinasu a na N-konci pro kinasy PKC a c- AMP dependentní PAK, tudíž nemůže dojít k fosforylaci a kanál je desenzitizován. Desenzitizace je stav dlouhotrvající (> 20 minut) díky konformačním změnám, které se při ní projevují (Mohapatra a Nau, 2003). Existuje celá řada látek, které podobně jako kapsaicin umožňují desenzitizaci TRPV1 receptor. Mezi ně patří syntetický analog kapsaicinu kapsazepin, piperin, syntetické vaniloidy jako olvanil a nuvanil. Vedle těchto látek mají podobný vliv také oxidační činidla, jako je například Cu(II)-phenantrolin. Ta snižují aktivitu kanálu oxidací cysteinových zbytků v oblasti P-loop, která tvoří pór TRPV1. Vznikají tím disulfidické můstky stabilizující nativní neaktivní stav proteinu. Pravděpodobnost otevření kanálu je dána poměrem mezi počtem redukovaných a oxidovaných cysteinových zbytků. Oxidační činidla působí jako nekompetitivní antagonisté (Krause et al., 2005) Funkce TRPV1 v nervové soustavě TRPV1 je exprimován především na periferních částech primárních aferentů či na jejich presynaptické membráně, nicméně vzhledem k jeho distribuci i v CNS byla zkoumána i jeho úloha v neuronech míchy a mozku. Úlohu tohoto kanálu na primárních aferentech lze rozdělit na periferní a centrální, neboť na periferním zakončení nociceptivních vláken je TRPV1 vystaven zcela jiným vlivům než na terminálách v míše, kde Aδ a C vlákna vytvářejí synapse s míšními neurony. Periferní zakončení mohou být ovlivňována bolestivou změnou teploty (nad 43 C) či mechanicky (tlakem), nefyziologicky různými exogenními látkami (např. H +, kapsaicin), ale také mediátory zánětu uvolněnými z poškozené tkáně (např. PGE 2, TNFα, H +, bradykinin). TRPV1 zde tudíž fungují jako centrální aktivátory nociceptivních zakončení. Díky jejich vlastní aktivaci (viz kapitola Aktivace a modulace TRPV1) je zvýšena intracelulární koncentrace vápníku, což způsobuje spuštění celé řady signálních kaskád a uvolnění substance P a CGRP (calcitonine-gene related peptid) ze senzorických zakončení. Tyto látky vyvolávají neurogenní zánět, který je součástí mnoha nemocí jako například astma, ekzém, psoriáza a migrény (Szallasi et al., 2007). Vedle toho se neuron depolarizuje

28 a vzniká akční potenciál putující do CNS. Avšak aktivace TRPV1 receptorů na periferních nociceptorech vysokou koncentrací kapsaicinu může vést po desenzitizaci až k degeneraci senzorických terminál a vyvolání dlouhodobé lokální anestezie (Simone et al., 1998; Pospíšilová a Paleček, 2006). Degeneraci nociceptivních vláken způsobuje dlouhodobý vtok Ca 2+ do buňky, kdy po překročení určité koncentrace dochází k apoptotickým procesům v neuronu. Na periferii umožňuje TRPV1 transdukci nociceptivního podnětu (bolestivé teplo, bolestivý mechanický podnět) do elektrického stimulu akčního potenciálu. S ním se na tom podílejí i další receptory z TRP rodiny, zejména TRPA1 (Patapoutian et al., 2009). Vaniloidní receptor 1 a TRPA1 mají výrazný vliv na periferní senzitizaci (viz obr. 5). Zmíněný vzrůst exprese (obr. 5) při periferní senzitizaci se však týká pouze zánětu nebo poranění tkáně, nikoliv však při poškození axonu (neuropatická bolest), kdy naopak na daném nociceptivním vláknu exprese TRPV1 kanálu klesá (Facer et al., 2007; Michael a Priestly, 1999). V případě neuropatického stavu dochází i k atrofii poškozeného nervového vlákna. Vedlejší, neporaněná vlákna vykazují zvýšenou expresi TRPV1, který je anterográdně transportován do periferního zakončení (Fukuoka et al., 2001). Tento jev může souviset s rozvojem a přetrváváním neuropatické bolesti, protože zvýšený počet TRPV1 receptorů je jedním z prvků s tím související hyperalgesie a allodynie (Hudson et al., 2001). Obrázek 4 Periferní senzitizace Díky vzniku zánětu (poraněním, infekcí) je produkována celá řada zánětlivých faktorů, jejichž působení na senzorické zakončení nociceptoru spouští signální kaskády vedoucí k fosforylaci TRP kanálů, jejich zabudování do membrány. Některé růstové faktory (NGF) jsou transportovány retrográdně do těla neuronu v DRG, kde zvyšují skrze MAP kinázovou a p38 dráhu expresi TRPV1 kanálu. Ten je následně transportován do periferního zakončení. Tím může dojít až ke změně chemického fenotypu buňky a výsledkem toho je snížený prahu bolesti v zanícené oblasti tkáně (Patapoutian et al., 2009)

29 Na míšních terminálách Aδ a C vláken aktivace TRPV1 kanálů stimuluje výlev glutamátu, aspartátu, substance P a CGRP z těchto presynaptických zakončení. Substance P a CGRP samy podporují výlev neurotransmiterů glutamátu a aspartátu. To umožňuje zvýšení miniaturních i spontánních EPSC, a tím TRPV1 přispívá k vyvolání vjemu bolesti v člověku (Zhou et al., 2009). Výlev glutamátu z primárních aferentů působí jednak na excitační sekundární neurony, které exprimují na postsynaptické membráně ionotropní glutamátové receptory, za druhé, nepřímo tzv. heterosynapticky, působí na inhibiční GABAergní či GABA/glycinergní neurony v lamině II, která je pro nocicepci velmi důležitá. Nepřímé působení probíhá skrze míšní interneurony, které integrují informaci nociceptivní signál z aferentů. Tyto interneurony jsou excitovány působením glutamátu ze zakončení nociceptivních vláken, čímž u nich dochází k výlevu glutamátu na synapsi s inhibičním neuronem v lamině II. Glutamát zde působí přes své metabotropní receptory (mglur ze skupiny II a III), kdy je následně snížen výlev inhibičního neurotransmiteru (GABA) (Zhou et al., 2007). Pokles inhibičním proudů může přispívat k zesílení bolestivého vjemu a rozvoji hyperalgesie a allodynie. Bylo však také prokázáno, že přímým působením kapsaicinu na synapsi s inhibičními GABAergními neurony se zvyšuje frekvence spontánních IPSC (Zhou et al., 2007). Tento efekt je závislý na přítomnosti a aktivaci NK1 receptorů (substance P), nikoliv na výlevu glutamátu, na těchto neuronech (Ferrini et al., 2007). Stimulace TRPV1 receptorů na primárních aferentech vede k výlevu dalšího inhibičního neurotransmiteru, glycinu (Zhou et al., 2008). Glycin, kromě své inhibiční funkce, také facilituje působení glutamátu na NMDA receptory, tudíž zůstává otázkou, zda zvýšená koncentrace glycinu funguje jako negativní zpětná vazba nociceptivního podnětu či jako zesilující efekt. Zhou a jeho kolegové navrhují vzhledem k získaným datům první variantu (Zhou et al., 2008). Stejně jako na periferii i na míšních synapsích primárních aferentů se zvyšuje exprese TRPV1 v průběhu chronického zánětu (Ji et al., 2002). TRPV1 se zde podílí na rozvoji mechanické allodynie oproti periferním vaniloidním kanálům, jejichž přítomnost hraje roli v tepelné hyperalgesii (Cui et al., 2006). Bylo také prokázáno excitační působení kapsaicinu na glutamátergní neurony DH v míšních řezech zbavených primárních aferentů dorzální rhizotomií či RTX léčbou. To ukazuje na expresi TRPV1 na těchto buňkách. Vaniloidní receptor 1 zde zesiluje excitační transmisi nociceptivního signálu primárních aferentů (Zhou et al., 2009). Vedle TRPV1 je na glutamátergních neuronech DH exprimován i μ opioidní

30 receptor, jehož aktivace inhibuje tyto neurony, což by mohlo vysvětlovat vysokou účinnost opioidních analgetik (Zhou et al., 2009). Vzhledem k rozšířenosti TRPV1 v mozku nelze předpokládat, že jeho úloha spočívá pouze v integraci a senzitizaci nociceptivních podnětů. Přesto, díky nedávno vyvinutým antagonistům tohoto kanálu A a A , se ukazuje, že TRPV1 i v mozku plní roli v modulaci bolesti (Cui et al., 2006). Další výzkum antagonistů TRPV1 schopných projít hematoencefalickou bariérou by mohl napomoci při léčbě bolestivých stavů, zejména chronických a neuropatických. V hipokampu, struktury zodpovědné za paměť, prostorovou orientaci a některé emoční pochody, funkce TRPV1 spočívá ve vyvolání LTD na interneuronech a LTP v zadním hipokampu (Gibson et al., 2008; Marsch et al., 2007). Jeden z navržených mechanismů je podobný inhibici GABAergních neuronů v zadním rohu míšním. TRPV1 se vyskytuje presynapticky na excitačních glutamátergních zakončeních. Po výlevu glutamátu jsou na interneuronech aktivovány metabotropní glutamátové receptory, jež stimulují cyklooxygenasu. Ta produkuje mj., 12-S-HPETE, která otevírá presynaptický TRPV1 kanál. Vtok Ca 2+ spouští signální kaskádu vedoucí k dlouhodobému snížení výlevu glutamátu, což je jedním z principů long-term deprese v hipokampu (Gibson et al., 2008). Přítomnost TRPV1 v hipokampu navíc podporuje studie neuroprotektivních účinků rimonabantu, který je zároveň antagonistou CB1 receptorů. Neuroprotektivita díky TRPV1 byla prokázána podáním kapsazepinu, který je selektivním antagonistou těchto receptorů (Pegorini et al., 2006). Behavioriální pokusy na kmenu myší s knock out genu TRPV1 ukazují vliv tohoto kanálu na úlekové reakce, kontextovou paměť související se strachem (LTP) a regulaci úzkostného chování (Marsch et al., 2007). Knock out myši vykazovaly slabší reakce na všechny typy testů než TRPV1 wild type kmen. Tyto jevy vysvětlují autoři působením CB1 receptorů, jejichž aktivace dokázala potlačit vrozenou úzkost, strach i LTP. Za běžného stavu (přítomnosti obou) jsou CB1 a TRPV1 receptory zčásti aktivovány stejnými látkami, např. anandamidem a N-arachidoyldopaminem, v závislosti na jejich koncentraci. V oblastech, kde jsou exprimovány zároveň, dochází k jejich antagonistickému působení. To je velmi důležité při hledání léků ve formě antagonistů proti těmto látkám. Periakvaduktální šeď hypothalamu také obsahuje TRPV1 receptory, zde na zakončeních míšních projekčních neuronů. Ovlivňují pouze glutamátergní neurony v této oblasti a zvyšují výlev glutamátu ze zakončení (Li et al., 2004). Dochází k aktivaci hypothalamických neuronů a následné zvýšené stimulaci sympatické dráhy, která do značné míry řídí homeostázu celého organismu. Tato studie uvádí jako teoretickou možnost aktivace TRPV1 v hypothalamu endogenními látkami

31 NADA a OLDA, podobně jako ve studiích na těchto receptorů v míše (Špicarová a Paleček, 2009; Špicarová a Paleček, 2008), avšak pokusy v ní byly prováděny pouze s kapsaicinem. Přes značnou rozšířenost TRPV1 v mozku, stále největší úsilí je věnováno zkoumání jeho funkce při bolestivých stavech, a to zejména na periferní a míšní úrovni. Nejinak tomu je i v této diplomové práci. Jeho aktivita může být modulována mnoha látkami, které jsou považovány za nedílnou součást imunitního systému. Následující kapitola se zabývá jednou z nich, TNFα, jejíž účinek na bolestivé pochody má mnohem širší dopad než jen ovlivnění TRPV1 receptorů. 4. Tumor necrosis factor alpha TNFα je neopominutelnou složkou mnoha pochodů spojených s nocicepcí a zvláště patologickými stavy bolesti, při nichž vzrůstá citlivost neuronů a glií vůči této bílkovině. Ovlivnění působení TNFα může být jednou z cest k útlumu patologické bolesti, jako je neuropatická bolest. Tumor nekrotizující faktor alfa je jedním z mnoha zánětlivých cytokinů. Poprvé byl izolován v roce 1975 Oldem a jeho kolegy (Carswell et al., 1975). Je důležitým faktorem pro modulaci imunitního systému, apoptózy, zánětech, sepsi a v neposlední řadě jako ochranný protinádorový prvek. Patří také mezi tzv. proteiny akutní fáze, které jsou vylučovány v případě poranění do krevního oběhu. TNFα se vyskytuje nejen v imunitních buňkách typu makrofágů, mastocytech, ale i v gliových a nervových buňkách, kde je produkován jako odpověď na mnoho vnějších i vnitřních stimulů (Männel, 1986). TNFα je cytotoxický pro poškozené buňky či změněné (nádorem, infekcí). Zdravé buňky může aktivovat, stimulovat k proliferaci či diferenciaci. TNFα vyvolává své odpovědi díky působení na své receptory označované jako TNFR1 (TNF receptor type 1; CD120a; p55/60) a TNFR2 (TNF receptor type 2; CD120b; P75/80). TNFR1 je exprimován ve všech tělních buňkách, TNFR2 v buňkách imunitního systému (Wajant et al., 2003). Oba receptory jsou aktivovány jak membránovou, tak solubilní formou TNFα, o nichž bude řeč v podkapitole Struktura. TNFR2 je však plně aktivován pouze membránovou formou tumor nekrotizujícího faktoru alfa (Wajant et al., 2003). Vedle toho vázají také příbuzný protein lymphotoxin-α (TNF-β) Struktura TNFα se vyskytuje ve dvou formách. První je monomerní transmembránový prekurzor o 233 aminokyselinách (26 kda) produkovaný především aktivovanými

32 makrofágy (Black et al., 1997). V membráně tvoří stabilní homotrimery. Druhá se tvoří jejich odštěpením od membrány metaloproteázou TACE (TNFα converting enzyme), (Black et al., 1997). Tyto solubilní homotrimery mají molekulovou hmotnost 51 kda. Podjednotky TNFα se skládají z antiparalelních β-listů, které dohromady vytvářejí jelly-roll (česky roláda) strukturu. Tato struktura je typická pro cytokiny, ale i pro virové kapsidové proteiny (Bazan, 1993). Obrázek 5 Struktura monomeru TNFα. Modré šipky znázorňují β-listy (Wikipedia, 2010) Signalizační kaskády TNFα TNFα signalizace spočívá ve třech hlavních směrech. Jeden vede k aktivaci jaderného faktoru κb (NF-κB) a druhý k aktivaci kaspáz a apoptóze. Třetí slouží k aktivaci transkripčního faktoru AP-1, který se skládá z proteinů c-fos a c-jun (Wajant et al., 2003). Jedná se o MAPK dráhu. Tato dráha je důležitá pro nocicepci, jak bude vysvětleno dále. Vzájemné ovlivňování všech tří kaskád je založeno na fosforylaci TNFR a je tkáňově specifické. Přesné molekulární mechanismy tohoto jevu, tzv. cross-talk, jsou stále předmětem zkoumání (Ihnatko a Kubeš, 2007). Homotrimery TNFα se váží na cystein bohaté oblasti TNFR1 (nebo R2). Dochází ke konformačním změnám receptoru a umožňuje formování intracelulárních proteinových komplexů vázaných na receptor (viz obr. 6). Nejprve se uvolňuje inhibiční protein SODD (silencer of death domain) z death domény DD (tu má pouze TNFR1, nikoliv R2), což umožňuje vazbu řadě proteinů, které spolu navíc navzájem interagují (Jiang et al., 1999). Jedná se o adaptorový protein TRADD (TNF receptor-asociovaný DD protein), jenž funguje jako lešení pro další bílkoviny RIP (receptor interacting protein), TRAF2 (TNF-receptorem asociovaný faktor) a FADD (fas-associated DD protein) v závislosti na druhu spouštěné signální kaskády. Aktivace NF-κB, resp. AP-1, je způsobena komplexem TNFα/receptor/TRADD/RIP/TRAF2. Apoptóza, resp. aktivace AP-1, naopak

33 komplexem TNFα/receptor/TRADD/FADD (Ihnatko a Kubeš, 2007). Transkripční faktor AP-1 může být tedy spouštěn jak přes TRAF2 a RIP a další proteiny (ASK1, MKK, JNK), tak pomocí FADD a kapsázové signální kaskády vedoucí k apoptóze (Wajant et al., 2003). Aktivace NF-κB začíná vazbou TRADD na TNF-R1 s TNFα. K TRADDu se připojuje kináza RIP a TRAF, který k sobě připoutává IKK (IκB kináza). RIP fosforyluje IKK, čímž ji aktivuje. IKK následně fosforyluje inhibiční protein NF-κB (IκB), který tvoří komplex s NF-κB. Tím dochází k rozpadu komplexu a odhalení translokačního jaderného místa na NF-κB. Tento transkripční faktor putuje do jádra, kde spouští transkripci mnoha proteinů umožňujících proliferaci, zánětlivou odpověď (produkce cytokinů), a produkci antiapoptotických faktorů, např. Bcl-2 (Chen a Goeddel, 2002). Kaspázová dráha vedoucí k apoptóze je často maskována antiapoptotickým efektem NF-κB kaskády. FADD aktivuje kaspázu-8, protein ze skupiny cysteinových proteáz, jejichž hlavní úloha spočívá v programové buněčné smrti, nekróze a zánětlivých procesech. Kaspáza-8 štěpením aktivuje další kaspázy. Mezi nimi kaspázu-3, která vedle funkce v apoptóze stimuluje MEKK1 (mitogenem aktivovaná protein kináza), což je jedna z klíčových bílkovin v kaskádě aktivace transkripčního faktoru AP-1 viz obrázek 6 (Wajant et al., 2003). Obrázek 6 Signalizační kaskády TNFα a TNF-R1. Šedé přerušované šipky zahrnují více kroků. Rudé tečky vyznačují jádro, lebka apoptóza. Červená šipka značí propojení proapoptotické dráhy s aktivační drahou AP-1 (upraveno, Wikipedia 2010). TNFα vyvolává silnou aktivaci MAPK dráhy vedoucí k aktivaci c-jun N- terminální kinázy (JNK), resp. transkripčního faktoru AP-1. Vedle toho evokuje i další MAPK dráhu, p38-mapk, díky níž jsou aktivovány jiné transkripční faktory p53, ELK1. Počátek těchto drah je společný (TNFα TNF-R TRADD