2 Teoretická část. 2.1 Fytochemie a fytochemikálie

Transkript

1 Obsah 1 Úvod Teoretická část Fytochemie a fytochemikálie Studované fytochemikálie a kyselina hippurová Vysokoúčinná kapalinová chromatografie Systém reverzních fází Systém normálních fází Chromatografie s hydrofilními interakcemi (HILIC) Experimentální část Chemikálie Přístroje a vybavení Kapalinový chromatograf Hmotnostní spektrometr Ostatní laboratorní příslušenství Příprava směsí standardů Příprava mobilní fáze a optimalizace retence Systém reverzních fází Systém normálních fází Chromatografie s hydrofilními interakcemi (HILIC) Výsledky a diskuse Systém reverzních fází Kinetex C Gemini C Systém normálních fází Pinnacle DB Silica Chromatografie s hydrofilními interakcemi (HILIC) LUNA HILIC TSKgel Amide Porovnání LUNA HILIC a TSKgel Amide Závěr Použitá literatura... 46

2 1 Úvod Kapalinová chromatografie je v analytických laboratořích běžně používanou technikou pro analýzu většiny netěkavých organických látek. Nejčastěji se pracuje v systému reverzních fází, které poskytují účinné, robustní a reprodukovatelné analýzy. V případě špatné rozpustnosti analytů ve vodě či z důvodu jejich vysoké polarity (a tedy i malé retence v systému reverzních fází) bývá zvykem analýzu provádět v systému normálních fází, tedy v nevodných prostředích. Velký nárůst zájmu a aplikací zažívají kolony s hydrofilními interakcemi (HILIC). Jejich výhodou je možnost separace polárních a hydrofilních látek v mobilních fázích, jež se používají v systému reverzních fází (obsahují vodu a organická rozpouštědla - acetonitril, methanol atd.). Tato rozpouštědla jsou výhodná jak pro UV/VIS, tak i hmotnostní detekci. O blahodárných účincích některých rostlin se ví již po mnoho staletí. Navzdory masivnímu výzkumu podporovanému nejen vědeckými motivy, ale i zájmem farmaceuticky zaměřených komerčních subjektů, není ve velké řadě případů objasněno, které složky rostlin jsou za léčebné účinky odpovědny. Velmi často za těmito vlastnostmi stojí fytochemikálie (sekundární metabolity). Vývoj analytických technik, dovolujících věrohodnou analýzu těchto látek ve velkém rozsahu koncentrací a v různě komplikovaných matricích, patří mezi velmi žádané oblasti výzkumu. Vzhledem ke komplexnosti rostlinného materiálu (a/nebo materiálu vznikajícího při interakci složek rostliny s živočišnou buňkou) bude nezbytné pracovat na vývoji vysoce selektivních analytických nástrojů. Zde nesporně bude významnou technikou kapalinová chromatografie. Cílem této práce je studium selektivity polárních stacionárních fází pro chromatografickou separaci směsi vybraných fytochemikálií a kyseliny hippurové a porovnání výsledků se separací na reverzních fázích. Sledované polární fáze zahrnují nemodifikovaný silikagel v systému normálních fází a HILIC systému a silikagel s navázanou karbamoylovou skupinou v systému HILIC. Analýzy v systému reverzních fází byly provedeny na koloně Kinetex C18, které jsou naplněny povrchově porézním sorbentem druhé generace. Pro srovnání účinnosti a reprodukovatelnosti analýz byla použita kolona Gemini C18 s plně porézním sorbentem. 1

3 2 Teoretická část 2.1 Fytochemie a fytochemikálie Interdisciplinární obor zabývající se studiem fytochemikálií se nazývá fytochemie. Tato věda studuje rostliny z pohledu chemie, biosyntézy, metabolismu a jejich vlivu na fyziologii a patologii živočichů. V užším slova smyslu se fytochemie zabývá studiem širokého spektra sekundárních metabolitů, především pro jejich protektivní účinky například vůči hmyzu nebo nemocem. Tyto protektivní účinky jsou často využívány v humánní medicíně. Rozdělení metabolitů na primární a sekundární odlišuje látky vznikající běžně u všech rostlin (bílkoviny, sacharidy, lipidy, chlorofyl atd.) od těch, které jsou vlastní jen určitým (vývojem určeným) čeledím nebo druhům, a které mají konkrétnější metabolický význam (terpeny, glykosidy, alkaloidy atd.). Do primárního metabolismu zahrnujeme základní metabolické dráhy a jejich funkce, jež jsou společné pro všechny organismy. Jedná se o glykolýzu, pentosový cyklus a cyklus trikarboxylových kyselin. Od tohoto primárního metabolismu se odvíjí biosyntéza a degradace látek zahrnovaných do tzv. sekundárního metabolismu (Obr. 1). K významným vlastnostem sekundárních metabolitů patří ochrana před hmyzem a zvířaty, houbovými či bakteriálními patogeny, vábení opylovačů a roznašečů semen nebo mohou mít funkci fytohormonů. Hraniční linie mezi primárním a sekundárním metabolismem není ostrá, protože existují některé aminokyseliny (AMK), jež jsou již sekundárními metabolity. Naproti tomu se však vyskytuje i řada sterolů, které mají esenciální úlohu ve většině organismů, a tudíž je řadíme mezi primární metabolity. Za startovní body sekundárního metabolismu jsou považovány 3 látky: kyselina šikimová (prekurzor aromatických látek), aminokyseliny (zdroj alkaloidů a peptidových antibiotik) a kyselina octová (prekurzor polyacetylenů, polyfenolů, steroidů, karotenoidů a isoprenoidních terpenů) 1. Již primitivní lidé užívali přírodních látek pro dosažení úlevy při bolestech a nemocech, jako loveckých jedů, narkotik a halucinogenů, stimulantů, koření, ochucovadel a vonných látek. Postupem času přibývala využití přírodních látek i v medicíně. Například již v 16. století francouzský chirurg Ambrosie Paré léčil střelné rány směsí heřmánku, levandule, rozmarýnu, šalvěje, komonice a extraktu červených růží svařenou v bílém víně. V 17. století Thomas Sydenham léčil malárii směsí drcené kůry chinovníku a hřebíčkového sirupu. V roce 1804 objevil německý lékárník Friedrich W. A. Sertürner morfin a jako první jej i izoloval. Doposud nebyla vyřešena totální syntéza morfinu, známá je jen enzymatická 2

4 cesta, proto je stále tento alkaloid izolován z rostlin. V roce 1828 byl německými chemiky Posseltem a Reimannem izolován z rostlin tabáku nikotin a až v roce 1893 byl prvně syntetizován Piketem a Crepieuxem. Nikotin je silný nervový jed, který byl a stále je častou složkou insekticidů. Součástí těchto insekticidů může být nikotin samotný, soli nikotinu ale i jeho deriváty. Nikotin sulfát se z listů tabáku extrahuje horkou vodou po dobu 24 hodin. Příkladem používaného derivátu je 1-[(6-chloro-3-pyridinyl)methyl]-N-nitroimidazolidinimin, který je součástí přípravku Imidacloprid 2. Obr. 1: Biosyntetické vztahy mezi metabolity 1. O výhodách diet bohatých na ovoce nebo zeleninu bylo napsáno nepřeberné množství literatury, ale o tom, které fytochemikálie jsou odpovědny za ony pozitivní účinky, je relevantních informací nepoměrně méně. Sekundární metabolity mohou mít rozličnou 3

5 chemickou strukturu jako jsou: steroidy, aminy, neproteinogenní AMK, karotenoidy, ω-3-mastné kyseliny, chinony, kumariny, alkaloidy, glukosináty, polyketidy, polyacetyleny, terpeny, fenoly a flavonoidy. Takto široká paleta chemických struktur naznačuje, jak složitý problém bude představovat analytické sledování jejich přítomnosti a osudu v biosféře 3. Další možností, jak dělit přírodní látky je podle jejich funkce, která se samozřejmě odvíjí od jejich struktury. Látky různé struktury mohou mít stejnou funkci a účinky na živý organismus. Například přírodními barvivy mohou být flavonoidy, anthokyaniny, anthrachinonová barviva, betalainy a nebo indigoidní barviva. Přírodní látky slouží také jako vonné a chuťové látky, komunikační látky hmyzu, bioluminiscenční látky a další 1. Za nejvýznamnější účinek přírodních látek považujeme jejich příznivé, často i léčivé působení na lidský organismus. Přírodní léčiva a produkty z nich odvozené jsou široce užívaná terapeutika v mnoha zemích a jejich význam v posledních desetiletích roste. Většina přírodních léčiv se připravuje ze surových rostlinných extraktů, které se skládají z komplexní směsi různých rostlinných sekundárních metabolitů. V této směsi se mohou vyskytovat tisíce aktivních sloučenin, jejichž chemická povaha bude naprosto odlišná, a navíc se jejich obsah může měnit v závislosti na období sklizně, původu rostliny, sušícím procesu a mnoha dalších faktorech. S tímto souvisí obtížnost kontroly kvality přírodních léčiv. Přehledně jsou aspekty fytochemické analýzy přírodních léčiv rozebrány například v článku 4. V minulém století byly přírodní produkty aplikovány především jako antibiotika, v současné době jsou používána také jako imunosupresiva, látky snižující hladinu cholesterolu, léky tlumící migrénu, inhibitory enzymů, přípravky proti parazitům, ale také jako bioinsekticidy. V neposlední řadě patří přírodní produkty mezi důležité zdroje látek působící protektivně proti vzniku maligního nádorového bujení 4 a také proti chronickým onemocněním jako jsou kardiovaskulární nemoci 5. Bylo prokázáno, že důležitou roli při chronických zdravotních potížích hrají volné radikály a reaktivní kyslíkové částice (ROS), jako jsou superoxidový anion (O 2 ), hydroxylový radikál (OH ) či peroxidový radikál (ROO ) 6. Tyto částice mohou zapříčinit vznik rakoviny, autoimunitních chorob, diabetu, vaskulárních chorob, hypertenze či mozkové disfunkce. Konzumace čerstvého ovoce, zeleniny a bylin má protektivní účinky vůči těmto chorobám. Vedle vitaminů C a E jsou pro ochranu vůči ROS nezbytné antioxidanty typu fenolických kyselin a flavonoidů. Diety bohaté na ovoce a zeleninu jednoznačně zvyšují antioxidační kapacitu krevní plazmy. Antioxidační aktivita flavonoidů je převážně dána jejich strukturou, která umožňuje delokalizaci elektronu na aromatickém jádře. Tento stav je stabilizován rezonančním efektem aromatického jádra, který zabraňuje dalšímu pokračování 4

6 volného radikálu v reakčním řetězci. Nejdůležitějšími antioxidanty vyskytující se v rostlinách jsou karotenoidy a polyfenolické sloučeniny Studované fytochemikálie a kyselina hippurová Studovaná modelová směs se skládala z vybraných fenolických kyselin, polyfenolických látek a kyseliny hippurové, jako významného metabolitu jejich přeměny živočišnou buňkou. Obecně, fenolické látky jsou předmětem zájmu obzvláště z důvodů jejich antioxidační aktivity, velkého množství různých prokázaných pozitivních efektů na lidské zdraví a hojného výskytu téměř v jakékoliv zelenině, ovoci a v jakékoliv části rostliny (ale v proměnlivém množství) 3. Zpracováním těchto surovin se mohou následně vyskytovat také v potravinách a pochutinách, jako jsou vína, čokolády, ovocné šťávy a podobně. Kyselina 4-hydroxybenzoová je hydroxyderivátem kyseliny benzoové se strukturním vzorcem uvedeným na obrázku 2. Je to bílá krystalická látka, částečně rozpustná ve vodě a chloroformu, více je rozpustná v polárních organických rozpouštědlech (alkoholy, aceton). Kyselina 4-hydroxybenzoová je prekurzorem koenzymu Q, jehož funkcí je přenos elektronu v mitochondriích a hraje důležitou roli jako antioxidant 7. Kyselina vanilová (4-hydroxy-3-methoxybenzoová kyselina, Obr. 2) je methoxyhydroxyderivátem kyseliny benzoové a také oxidovanou formou vanilinu. Je to bílá, jemně krystalická látka. Spolu s ostatními fenolickými kyselinami se vyskytuje například v oříšcích, v různých druzích ovoce a zeleniny, bobulích, obilninách, olejninách 8. Kyselina galová (3,4,5-trihydroxybezoová kyselina, Obr. 2) je fenolická kyselina běžně se vyskytující v rostlinách, oříšcích a čajových lístcích ve volné formě i jako vázaná v taninech. Polyfenoly obsahující epigalokatechin galát inhibují podněty k apoptóze (buněčné smrti) a zvyšují přežití nervových buněk 9, 10. V potravinářství je užívaná jako antioxidační přísada. Kyselina kávová je dihydroxyderivátem kyseliny skořicové (3-(3,4-dihydroxyfenyl)-2- propenová kyselina, Obr. 2). Hydroxyderiváty kyseliny skořicové byly nalezeny téměř ve všech druzích jídla, přičemž jejich obsah převažuje v obilninách, olejninách, ovoci a zelenině. Oplývají antioxidační aktivitou tím, že vychytávají hydroxylový radikál, superoxidový radikál, peroxidový radikál a další vysoce reaktivní částice. Kyselina kávová má z hydroxyderivátů kyseliny skořicové antioxidační aktivitu nejvyšší. Mezi další pozitivní účinky na lidské zdraví patří ochrana před rakovinovým bujením, antibakteriální a antiproliferativní účinky. Hydroxyderiváty kyseliny skořicové se mohou vyskytovat v cis a trans formě, avšak v přírodě je běžná pouze trans forma 11. Katechin (Obr. 2) patří k jedněm z nejznámějších polyfenolických látek. Tato látka je řazena mezi prokyanidiny (flavan-3-oly), které se nacházejí například v čokoládových 5

7 bobech, jablcích, mandlích, grepech, chmelu, vinné révě a jahodách. Rostliny obsahují jak monomerní jednotky (katechin, epikatechin), tak i odpovídající oligo- a polymery, které se tvoří během růstu. Chuť ovoce závisí na složení směsi prokyanidinů, jichž vzájemný poměr určuje míru trpkosti a hořkosti. Vyváženost těchto chutí silně závisí na jejich molekulové hmostnosti 12. Pozitivních účinků, které prokyanidiny mají, je několik: antioxidační, antimikrobiální, antibakteriální a hepatoprotektivní aktivita, antidiabetický a kardioprotektivní efekt a další 13. Kvercetin (Obr. 2) patří do skupiny flavonoidů a má vysokou antioxidační aktivitu. Hojně se vyskytuje v potravinách a pochutinách (ovoce, zelenina, čaj a víno), které mají díky němu pozitivní účinky na lidské zdraví. Jedná se o ochranu proti mnohým nemocem, například: osteoporóze, některým formám rakoviny, kardiovaskulárním nemocem, ale i proti stárnutí. Kvercetin má důležitou schopnost vychytávat vysoce reaktivní částice (např. peroxynitril, hydroxylový radikál) 14. Rutin je glykosidem kvercetinu (3-β-rutinosid) a jeho struktura je znázorněna na obrázku 2. Jelikož spadá také do skupiny flavonoidů a strukturou z kvercetinu vychází, i mnohé jejich vlastnosti jsou obdobné 14. V rostlinných extraktech bývá často přítomen kvercetin i jeho glykosidy ve směsi. Kyselina hippurová (N-benzoylglycin, Obr. 2) je fyziologickou součástí krevního séra a je tvořena v játrech z kyseliny benzoové a glycinu. Kyselina benzoová vzniká při zpracování potravy živočišnou buňkou (ovoce, zelenina), konkrétně při mitochondiální β-oxidaci fenolických mastných kyselin a při oxidativním odbourání fenylalaninu bakteriemi ve střevech 15. Hippurová kyselina patří mezi dominantní metabolity při konzumaci potravin bohatých na polyfenoly. OH O OH HO HO O OH O O HO H O CH 3 OH (A) (B) (C) OH O OH HO O OH HO O OH OH HN O HO OH (D) (E) (F) 6

8 OH HO O OH HO O OH OH OH HO H H H H H OH OH O OH OH H OH (G) (H) Obr. 2: Struktury kyseliny 4-hydroxybenzoové (A), vanilové (B), galové (C), kávové (D), katechinu (E), kyseliny hippurové (F), kvercetinu (G) a rutinu (H). H O O HO OH O H O O 2.2 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie Kapalinová chromatografie je separační technika, která využívá dělení složek mezi dvěma fázemi, z nichž jedna je mobilní (kapalina) a druhá stacionární. Při dělení dochází k opakovanému transportu molekul složek do stacionární fáze a zpět do fáze mobilní. Tento děj se natolik přiblíží rovnováze, že je možné distribuci složky A mezi dvě fáze popsat distribuční (rozdělovací) konstantou 16 K D( A) uvedenou v rovnici 1, K [ A] S ( na ) S VM [ A] M ( na ) M VS = (1) D( A) = kde [A] S a [A] M jsou rovnovážné koncentrace složky A ve stacionární a v mobilní fázi; (n A ) S a (n A ) M jsou látková množství složky A ve stacionární a mobilní fázi; V S a V M jsou objemy stacionární a mobilní fáze v chromatografickém systému. Základy chromatografie položil ruský botanik M. S. Cvět počátkem 20. století. Ten jako první rozdělil na sloupci sorbentu (CaCO 3 ) listová barviva. Zpočátku kapalinová chromatografie stála poněkud v pozadí za ostatními chromatografickými metodami, ale již koncem šedesátých let došlo k prudkému vývoji této techniky v moderní a vysokoúčinnou formu. O tyto pokroky se postarali badatelé Horvath, Kirkland a Huber. Vedle technického pokroku umožnily rozvoj HPLC i poznatky z plynové chromatografie, které objasnily podstatu pochodů v koloně a jejich souvislost s účinností chromatografického procesu. Za tyto poznatky vděčíme především Martinovi a Syngemu, kteří za své práce dostali v roce

9 Nobelovu cenu. Velice významným průlomem bylo zavedení náplní kolon s chemicky vázanými fázemi, které umožňují vysoce selektivní separace s dobrou reprodukovatelností. Kapalinový chromatograf se skládá z následujících částí (Obr. 3): zásobníky mobilní fáze (a), programování gradientu (b), směšovač mobilní fáze (c), vysokotlaké čerpadlo (d), dávkovací zařízení (e), chromatografická kolona (f), detektor (g), počítač (h), nádoba na odpad (i) 16. Dalším vybavením může být odplyňovač MF (j), filtr (k), předkolonka (l), termostat kolon (m), frakční kolektor (n). Obr. 3: Schematické znázornění HPLC systému. Vysokoúčinná kapalinová chromatografie zahrnuje soubor metod, založených na různém mechanismu separace, jejichž společným pojítkem je použití kapalné mobilní fáze, vysokotlaké techniky a účinných kolon pro rychlou analýzu. Mechanismus separace je dán interakcemi mezi analyty, složkami mobilní fáze a fází stacionární. Hlavními principy chromatografického dělení jsou adsorpce, rozdělování, chemisorpce a sítový efekt 16. Všechny interakce mezi stacionární fází a analyty jsou významně ovlivňovány složením mobilní fáze. Adsorpce je proces, ke kterému dochází na povrchu stacionární fáze. Pro její efektivní využití v chromatografii je nezbytné zajistit dostatečný počet aktivních míst dostupných pro analyt(y). Rozdělování mezi dvě nemísitelné kapalné fáze je významným a v moderní HPLC patrně převládajícím separačním procesem. Při tomto procesu difundují analyty z jedné fáze do druhé tak, aby byl zachován určitý poměr jeho množství v obou fázích. Tento poměr je pro daný systém a fyzikálněchemické podmínky charakteristický 16. Určení přesné hranice mezi adsorpční a rozdělovací chromatografií je komplikované, protože oba mechanismy se mohou uplatňovat současně. Na principu chemisorpce je založena iontově výměnná chromatografie. Při iontové výměně difundují ionty z okolního roztoku do měniče přítomného ve stacionární fázi a vytěsňují ekvivalentní množství jiných iontů, chemisorbovaných účinnými výměnnými skupinami. Sítový efekt je uplatňován u gelové 8

10 permeační chromatografie. Dělení látek souvisí s pórovitou strukturou gelu. Rozměry pórů a velikost solvatovaných molekul analytů potom určují retenci. Menší molekuly difundují hlouběji do kvazistacionární fáze v póru, a tudíž jsou více zadržovány. Naopak velké molekuly zůstávají při povrchu fáze a největší molekuly (jejich průměr je větší než průměr pórů) nepronikají do pórů vůbec a dochází k totální exkluzi. Charakter vzorku a zejména charakter mobilní fáze pak rozhodne, který z mechanismů více či méně převládá. Příkladem je silikagel deaktivovaný vodou, který můžeme považovat za adsorbent či za nosič se zakotvenou stacionární fází (rozdělování analytu mezi mobilní fázi a vrstvu vody adsorbovanou na povrchu silikagelu). Naopak náplně s chemicky vázanými fázemi můžeme považovat za nosiče s imobilizovanou kapalnou stacionární fází či za adsorbenty s chemicky modifikovaným povrchem 17. Tyto interakce budou dále diskutovány podrobněji. Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) je v současné době běžná analytická metoda využívající kolony plněné malými částicemi (s vnitřním průměrem 3-5 µm), které zaručují většinou dostatečně účinné analýzy. Prozatím nejvyšší účinnosti v oboru kapalinové chromatografie bylo dosaženo použitím částic s velikostí pod 2 µm, což je samozřejmě spojeno s nárůstem pracovních tlaků, a tudíž i nezbytností vývoje instrumentace umožňující práci při těchto tlacích. Tyto systémy nazýváme UHPLC nebo UPLC. HPLC je všestranná a rychlá analytická metoda používaná pro analýzy léčiv, biomolekul, polymerů a mnoha organických a iontových sloučenin. Pomocí této metody lze řešit v zásadě tyto hlavní úkoly: dělení a identifikace látek ve směsích; kontrola čistoty preparátů; kvantitativní analýza látek ve směsi; kontrola výroby (kontrola surovin, meziproduktů a finálních výrobků); kontrola životního prostředí; analýza v klinické praxi (analýza komponent v tělních tekutinách); kontrola technologie výroby a finální kvality potravin (čistota výrobků, množství vitamínů, ); biochemické analýzy; analytická kontrola v různých průmyslových odvětvích, zemědělství, stavebnictví a elektrotechnice. Kromě výše uvedených analýz může být použita k čištění a izolaci složek směsí (preparativní chromatografie) Systém reverzních fází Chromatografie v systému reverzních fází (RP) je první volbou pro separaci většiny běžných vzorků. RP-HPLC je běžnější a robustnější než ostatní formy LC a častěji vede k uspokojující konečné separaci. Práce na kolonách s RP vedou k účinné, stabilní a reprodukovatelné analýze. V systému RP se používají nepolární stacionární fáze a polární 9

11 fáze mobilní. Náplněmi kolon jsou nejčastěji nepolární fáze chemicky vázané na silikagelu jako nosiči 16. Tyto náplně se nejčastěji připravují chemickými reakcemi silikagelu s chlorodimethylsilanem příslušné skupiny, která má tvořit hydrofobní povrch. Takovými skupinami mohou být C18, C8, fenyl atd. Pro minimalizaci nechtěných interakcí s nezreagovanými silanolovými skupinami se nejčastěji používá proces zvaný endcapping. Jedná se o zreagování zbývajících Si-OH skupin, například s trimethylchlorosilanem, způsobující dokonalejší pokrytí povrchu silikagelu. Jako mobilní fáze se používá voda s příměsí organického rozpouštědla (methanol, acetonitril, ethanol, tetrahydrofuran, dioxin). Detekce je v tomto systému často jednodušší, obzvláště UV detekce, díky používaným rozpouštědlům 18. Separace v systému RP je přirovnávána k extrakci sloučenin z vody do organického rozpouštědla jako je oktanol. Hydrofobnější (méně polární) sloučeniny se extrahují do nepolární oktanolové fáze lépe než sloučeniny polární (Obr. 4). Proto se zvyšováním lipofility (snižováním polarity) analytu dochází ke zvyšování jeho retence. Hydrofilní (polární) sloučeniny jsou tedy méně zadržovány a eluují jako první z kolony, látky střední polarity eluují následně a jako poslední z kolony eluují velmi hydrofobní látky. (a) Obr. 4: Schéma (a) rozdělování 18 a (b) retence látek v systému RP 19. (b) Retence sloučenin v RP-HPLC je určována jejich polaritou a experimentálními podmínkami: složením MF, typem reverzní fáze a teplotou. Snižování polarity mobilní fáze (zvyšování obsahu organického rozpouštědla v mobilní fázi) vede ke snižování retence analytu. Polarita rozpouštědla je popisována indexem polarity P, který je pro mnoho látek tabelován. Eluční síla mobilní fáze závisí jak typu organického rozpouštědla (polaritě), tak i na jeho obsahu v MF. Důkaz tohoto tvrzení byl experimentálně prokázán na směsích 3 nejhojněji používaných organických rozpouštědlech s vodou: stejných hodnot kapacitních 10

12 poměrů (k) a retenčních časů jako v 40% acetonitrilu můžeme dosáhnout v 50% methanolu a 30% tetrahydrofuranu (THF) 18. Pomocí výsledků z experimentálních studií 20, 21 je možné vytvořit škálu organických rozpouštědel od nejslabšího po nejsilnější: voda methanol acetonitril ethanol THF propanol methylenchlorid. Poněvadž je methylenchlorid nejsilnějším rozpouštědlem v systému RP a není mísitelný s vodou, používá se především pro čištění kolon s RP. První volbou při výběru organického rozpouštědla bývá acetonitril, díky tomu, že jeho směs s vodou umožňuje detekci při nízkých vlnových délkách ( nm) a nízká viskozita těchto směsí umožňuje práci za nízkých zpětných tlaků. Změna selektivity je často dosažena náhradou acetonitrilu methanolem, který ovšem tvoří s vodou viskóznější směsi, což vede k nárůstu pracovních tlaků. Větší eluční sílu než výše uvedená rozpouštědla má THF, jehož nevýhodami je vyšší UV absorbance, reaktivita s kyslíkem a pomalejší ekvilibrace kolony při změně MF. Problematičtější, než separace neutrálních vzorků, je separace analytů nesoucích v molekule ionizovatelnou skupinu. Jak již bylo výše uvedeno, retence vzorku v systému RP roste spolu s rostoucí hydrofobicitou sloučenin. Kyseliny nebo zásady jsou patřičnou změnou ph ionizovány, stávají se méně hydrofobní (hydrofilnější) a jejich retence se snižuje. Jak vyplývá z předchozího textu, ph mobilní fáze významně ovlivňuje retenci kyselin a zásad. Pokud se ph roztoku kyseliny či báze bude rovnat hodnotě pk sloučeniny, je tato sloučenina jen z poloviny ionizována (koncentrace neutrální a ionizované formy jsou stejné). Největší změny retence se uskutečňují, když se ph mobilní fáze pohybuje v intervalu pk ± 1,5. Jinými slovy, v této oblasti dochází malou změnou ph k výrazné změně retenčních časů (horší reprodukovatelnost retence) v porovnání s oblastí ph, kde jsou analyty plně ionizovány nebo naopak ve své neutrální formě. Na druhou stranu, u látek s velmi podobnou strukturou, lze prací v oblasti pk analytů dosáhnout jemného nastavení selektivity (Obr. 5). Obr. 5: Idealizovaný průběh závislosti mezi hodnotou ph mobilní fáze a retencí

13 Stabilita retenčních časů slabých elektrolytů souvisí rovněž se schopností mobilní fáze tlumit výkyvy ph dané analyty. V chromatografické praxi jsou tedy často používány jako složky mobilní fáze pufry. Koncentrace pufru v MF bývá obvykle od 10 do 50 mmol/l, jelikož vyšší koncentrace již mohou být nerozpustné ve vysokém obsahu organického rozpouštědla (především u gradientové eluce) či způsobovat korozi konstrukce chromatografu. Dalšími vlastnostmi složek mobilní fáze, které je třeba uvažovat, je absorpce UV záření (rozsah použití UV detekce) či rozpustnost a stabilita analytů 18. Vzhledem k velkému množství různých typů komerčně dostupných kolon s reverzními fázemi, je často možné dosáhnout zlepšení separace i právě výměnou kolony. Je to ale samozřejmě dražší metoda než pouhá úprava mobilní fáze. Výjimkou je separace velmi hydrofobních látek, které jsou příliš zadržovány na silné koloně (C18) a není možná jejich eluce bez použití velmi silných rozpouštědel (jako je THF). U tohoto případu je jediným řešením použití slabší kolony (C8) 18. V posledních desetiletích jsme svědky bouřlivého rozvoje různých technologií přípravy vysokoúčinných kolon. Přes pestrost v literatuře se objevujících technických řešení lze úspěšné trendy rozdělit do tří skupin: 1. postupy vedoucí k dalšímu zmenšování průměru částic sorbentu ( sub 2 µm ) 2. příprava povrchově porézních materiálů (velikost částic od 3 do 1,7 µm) 3. příprava monolitických materiálů (chromatografické lože je tvořeno jednou porézní částicí ) V této práci bude pozornost věnována možnostem povrchově porézních sorbentů. V roce 2007 Kirkland získal povrchově porézní částici Halo-C 18, která byla připravena z pevného křemenného jádra (1,7 µm) pokrytého porézní vrstvou (0,5 µm). U tohoto sorbentu bylo dosaženo výšky teoretického patra 1,5 µm pro nízkomolekulární látky, kdežto pro běžně používané celoporézní sorbenty se výška teoretického patra pohybuje okolo 2,0 µm. Použití povrchově porézních částic vede ke snížení odporu proti převodu hmoty ve stacionární fázi 22. Kinetex C18 je novým typem kolony od firmy Phenomenex. Tato kolona je naplněna druhou generací povrchově porézních částic. Výhodou těchto částic je velice úzká distribuce jejich velikosti vedoucí ke snížení vířivé difúze Oproti koloně Halo-C 18 jsou zde částečky téměř kulovité a mají jednotnou tloušťku porézní vrstvy kolem pevného jádra 22. Výrobce Kinetex C18 slibuje vysokou účinnost analýz, zpětné pracovní tlaky pod 300 bar, zkrácení 12

14 analýz ve srovnání s tradičními kolonami (částice 3 µm), zlepšení rozlišení a selektivity a kompatibilitu těchto kolon s běžným kapalinovým chromatografem Systém normálních fází V systému normálních fází (NP) je stacionární fáze polárnější než fáze mobilní. Klasickými příklady normální stacionární fáze jsou nemodifikovaný silikagel, oxid hlinitý či silikagel s chemicky vázanými diolovými, aminovými či kyanidovými skupinami. V této kapitole bude s ohledem na zaměření práce blíže probírán pouze nemodifikovaný silikagel. Vzhledem k povaze stacionární fáze, je mobilní fáze tvořena nejčastěji směsí nepolárního (hexan, oktan, dichlormethan) a polárního rozpouštědla (methanol, ethanol či propanol). Zvýšení obsahu polární složky vede ke zvýšení eluční síly mobilní fáze (snížení retence). Při práci v systému normálních fází je klíčová kontrola obsahu vody v rozpouštědlech tvořících mobilní fáze. Přítomnost vody způsobuje změny v retenčním mechanismu a obvykle jej komplikuje. I poměrně malé změny v obsahu vody v průběhu analýz často vedou k výrazným změnám retence, a tím k nereprodukovatelným změnám retenčních časů. Proto v klasické chromatografii v systému NP je dávána přednost práci s bezvodými rozpouštědly. Zejména kritická je vlhkost při práci s nemodifikovaným silikagelem. U modifikovaného silikagelu není kontrola obsahu vody tak kritická. Pro analýzu iontových (a snadno ionizovatelných) analytů může být přídavek vody do mobilní fáze nezbytný, s ohledem na jejich rozpustnost a akceptovatelnou retenci. Polární stacionární fáze s inkorporovanou vrstvičkou vody řadíme mezi tzv. HILIC systémy. Mechanismus retence je odlišný od mechanismu na normální fázi a bude popsán v kapitole Retence separovaných látek v systému normálních fází je zapříčiněna adsorpcí. Separace je dána rozdílnou adsorpcí molekul analytů v aktivních místech stacionární fáze (u nemodifik. silikagelu jsou aktivními místy Si-OH skupiny). Přednostně dochází k pokrytí povrchu adsorbentu vrstvou molekul mobilní fáze (M). Retence molekul vzorku (A) vyžaduje přemístění molekul (M), aby mohlo dojít k adsorpci molekul (A). Během separace se tedy uplatňuje vzájemné soutěžení molekul vzorku a mobilní fáze o aktivní centra na povrchu adsorbentu (Obr. 6)

15 Obr. 6: Schéma mechanismu adsorpce v systému NP 18. Snyder zevrubně prostudoval a popsal proces adsorpční chromatografie a navrhl výpočet distribuční konstanty podle rovnice 16 (2), log K D = logv + α( S A ε ) (2) a S kde α kvantitativně vyjadřuje aktivitu adsorbentu; A S je plocha, kterou zaujímá adsorbovaná molekula na povrchu adsorbentu; V a je povrchový objem adsorbentu (objem monomolekulární vrstvy rozpouštědla adsorbovaného hmotnostní jednotkou adsorbentu); S vyjadřuje volnou energii adsorpce látky na adsorbentu o aktivitě α =1 a ε je eluční síla mobilní fáze. Ze vztahu vyplývá, že velikost adsorpce roste s rostoucí aktivitou a specifickým povrchem adsorbentu a klesá s rostoucí eluční silou (polaritou) mobilní fáze a s rostoucí plochou adsorbentu potřebnou k adsorpci jedné molekuly analytu. Rozmístění adsorpčních center je neměnné, a proto interakce funkčních skupin analytů s adsorbentem závisejí na geometrickém rozmístění funkčních skupin v těchto molekulách. K nejsilnější interakci dochází, pokud rozmístění funkčních skupin odpovídá poloze adsorpčních center. Výsledkem jsou značné rozdíly adsorpčních energií různých izomerů, a tudíž lepší selektivita pro dělení izomerů než v systému RP. Síla polárních interakcí s adsorbentem, a tudíž i velikost retence v systému NP, je určena počtem a polaritou funkčních skupin analytů (Obr. 7). Spolu s rostoucí polaritou funkční skupiny roste i retence látek v přibližném pořadí: alifatické uhlovodíky aromáty halogensloučeniny ethery terciární aminy nitrosloučeniny ketony primární aminy alkoholy fenoly karboxylové kyseliny

16 Obr. 7: Schématické znázornění retence polární a nepolární látky na povrchu porézní silikagelové částice 19. Oproti systému RP systém NP dovoluje více ovládat selektivitu změnou rozpouštědla či kolony. Záměna jednoho rozpouštědla ve směsi může znamenat velmi výraznou změnu v selektivitě. Tato změna souvisí s rozdílnou sílou vazby molekul analytu a rozpouštědla na aktivní centra sorbentu. Molekuly rozpouštědla, které jsou vázány silněji, soutěží o místo s molekulami analytu, a tudíž snižují jejich retenci. Velikost vlivu rozpouštědla klesá spolu se snižující se velikostí vazby, jakou jsou molekuly analytu vázány. Sílu různých rozpouštědel a směsí rozpouštědel určuje relativní síla rozpouštědla ε, která může být experimentálně změřena. Hodnoty ε vybraných běžně používaných rozpouštědel pro silikagel jsou uvedeny v tabulce 1. Pro ostatní kolony systému NP mají hodnoty ε obdobný trend jako u silikagelu. 24, 25 Tab. 1: Hodnoty relativní síly rozpouštědla (ε ) Rozpouštědlo ε Vazba na aktivní centrum Hexan, heptan, oktan 0,00 Ne Chloroform 0,26 Ne Methylenchlorid 0,30 Ne Methyl-t-butylether 0,48 Ano Ethylacetát 0,48 Ano Dioxan 0,51 Ano Acetonitril 0,52 Ano THF 0,53 Ano Propanol 0,60 Ano Methanol 0,70 Ano V systému RP selektivitu ovlivňuje především zásaditost, kyselost a polarita MF, kdežto v systému NP se jedná o schopnost vázat se na aktivní centra sorbentu. Proto lze při změně rozpouštědla, které tuto schopnost nemá (např. methylenchlorid), za rozpouštědlo 15

17 vázající se na sorbent (např. acetonitril), očekávat rapidní změnu v selektivitě (často výraznější než je tomu u RP) 18. V současné době není chromatografie v systému NP příliš používána z důvodu vyšších nákladů na vysoce čistá a bezvodá organická rozpouštědla. Nevýhodou práce v systému NP je rovněž nižší účinnost kolon oproti systému RP, větší náchylnost tvorbě bublinek v MF (vzhledem k nízké teplotě varu rozpouštědel), nestálost retenčních časů (souvislost s nekontrolovaným obsahem vody) a obtížné provedení gradientové eluce. I přes to má chromatografie v systému NP určité výhody a v některých případech není možné dosáhnout separace jiným způsobem, než použitím systému NP. Navíc tento systém je užitečný při analýzách sloučenin, které jsou ve vodném prostředí nestabilní. Nespornou výhodu práce v systému NP, co se týče používaných rozpouštědel tvořících MF, jsou nižší pracovní tlaky (související s jejich malou viskozitou) a jejich snadné odpaření, což je využitelné pro preparativní chromatografii Chromatografie s hydrofilními interakcemi (HILIC) Příliš hydrofilní vzorky nemusí být v systému RP zadržovány, kdežto v systému NP mohou být velmi dobře zadržovány. Naneštěstí, velmi hydrofilní vzorky mohou být špatně rozpustné v nevodných rozpouštědlech, typicky používaných v systému NP. Řešením tohoto problému může být použití speciálních kolon, na kterých je možné pracovat s MF obsahující vodu. Například sacharidy jsou běžně separovány na amino-koloně s MF obsahující 60% až 80% acetonitrilu s vodou. Chromatografie v systému NP s mobilní fází obsahující vodu byla definována jako chromatografie s hydrofilními interakcemi (HILIC). Pro tento typ separací byly navrženy speciální HILIC kolony. Tyto kolony jsou obvykle používány s gradientem, kde se snižuje obsah organického rozpouštědla či se zvyšuje obsah soli. Eluční pořadí analytů je od nejméně polárních po nejvíce polární 18. Zjednodušeně lze říci, že tato metoda vznikla spojením NP-HPLC a RP-HPLC, přičemž je zde separace zaměřena na polární a ve vodě dobře rozpustné látky. Stacionární fáze vycházejí ze systému NP, jedná se tedy například o nemodifikovaný silikagel, modifikovaný silikagel s navázanými nejrůznějšími skupinami (diolové, kyanopropylové, karbamoylové, amidové, kyanové, zwitterionové atd.). Mobilní fáze obsahuje vodu s vysokým podílem organického rozpouštědla (>60%). Stacionární fáze je polárnější než mobilní, a tudíž je možné s vysokým rozlišením dělit polární analyty. Aby docházelo výhradně k hydrofilním interakcím, je nutné pracovat s mobilními fázemi, které mají vysoký obsah organického rozpouštědla. Pokud by však byl obsah vody jen stopový, docházelo by ke změně 16

18 separačního mechanismu (zvyšující se vliv adsorpce) a jednalo by se spíše o systém NP nebo systém na pomezí NP a HILIC 26. HILIC materiály obsahující chemicky modifikované stacionární fáze (např. karbamoylové skupiny kovalentně vázané na nosič alkylovým řetězcem) se mohou při použití malého množství organického rozpouštědla v mobilní fázi naopak chovat podobně jako reverzní fáze 27 (Obr. 8). Typické HILIC chování znamená snížení retence se zvyšováním obsahu vody. Pokud je retenční chování jiné, jedná se s největší pravděpodobností o příspěvek dalších interakcí, například o iontově-výměnné reakce mezi analytem (např. kyseliny) a stacionární fází (silikagel s navázanou aminoskupinou) 28. Obr. 8: Silikagel s navázanou karbamoylovou skupinou (kolona TSKgel Amide-80) 27. Mechanismus retence v HILIC systému není stejně jako v případě systému RP doposud detailně objasněn. Podle původní práce A. Alperta 29 je mechanismem separace rozdělování, oproti tomu v souhrnné práci P. Hemströma 30 jsou prezentovány výsledky svědčící spíše ve prospěch adsorpčního modelu 26. V ideálním případě je separace řízena hydrofilními interakcemi (dipól-dipól interakce a vodíkové vazby) mezi analytem a polární stacionární fází 27. Mohou se uplatňovat i další interakce, žádoucí je ovšem převaha interakcí hydrofilních. Předpokladem pro hydrofilní interakci je vznik hydratované vrstvy na povrchu sorbentu (inkorporovaná vrstva vody; angl. water-rich layer ). Schematické znázornění HILIC stacionární fáze s hydratovanou vrstvou je na obrázku 9 a schéma rozdělovacího mechanismu v HILIC systému na obrázku 10. Obr. 9: Schéma dioly modifikované stacionární fáze

19 (a) (b) Obr. 10: Znázornění rozdělovacího mechanismu v systému HILIC (a) na silikagelu 31, (b) na silikagelu s navázanou karbamoylovou skupinou 27. Bylo již zmíněno, že při určitých podmínkách separace na HILIC fázích, může k retenci přispívat i iontová výměna. K tomuto ději dochází obzvláště na nemodifikovaném silikagelu. Přítomnost vody usnadní disociaci silanolových skupin. Negativně nabitý povrch přitahuje kationty, ale zároveň snižuje retenci negativně nabitých analytů elektrostatickou repulzí. Přídavek elektrolytu (pufru) umožní kontrolu smíšeného módu separace 30. Podobně jako v systému RP má hodnota ph mobilní fáze zásadní vliv na retenci a selektivitu tím, že ovlivní ionizaci analytu v MF. Stejně jako v systému RP je doporučeno 18

20 (pro větší reprodukovatelnost) nejprve upravit ph vodného roztoku, a až poté přidat organické rozpouštědlo 28. Navíc elektrostatické odpuzování (druhotné interakce) separovaných složek a negativně nabité stacionární fáze (na bázi silikagelu) je možné minimalizovat právě přídavkem amonných solí organických kyselin (např. mravenčan či octan amonný). Při volbě vhodné amonné soli je třeba brát v úvahu její rozpustnost v mobilní fázi a případnou prospěšnost pro další aplikace, jako může být zvýšení ionizace při spojení s MS detekcí 26. Bylo prokázáno, že se zvyšujícím se obsahem soli se zvyšuje retence analytů na 4 různých typech sorbentů v systému HILIC. Tyto experimenty potvrzují, že nárůst retence může souviset spíše s hydrofilními interakcemi (rozdělování), než se specifickými interakcemi s funkčními skupinami sorbentu. Vzhledem k vysokému obsahu organického rozpouštědla v MF se sůl z mobilní fáze koncentruje v inkorporované vrstvě vody na povrchu sorbentu, kde vznikají hydratované ionty soli. Tato skutečnost vede ke zvýšení hydrofilnosti vodné vrstvy, a tudíž k větší retenci polárních analytů 28. Retence může být dále ovlivněna teplotou, aciditou MF a koncentrací použité soli v MF. Současným trendem je využití HILIC pro separaci aminokyselin a peptidů 32. Své uplatnění HILIC nalézá i v separaci oligonukleotidů, složek nukleových kyselin, cukrů (oligoa polysacharidy), glykanů, toxinů. V tomto systému je možné separovat jak nízkomolekulární organické látky, tak i ve vodě dobře rozpustné biopolymery. Mezi obory, pro které HILIC fáze nabývají na významu, patří proteomika 33, metabolomika 30, 34 a farmacie. Obrovskou výhodou HILIC systému je možnost snadného spojení s hmotnostním spektrometrem (typicky pro ionizaci elektrosprejem). 19

21 3 Experimentální část 3.1 Chemikálie Standardy fytochemikálií (kyselina 4-hydroxybenzoová, vanilová, kávová, galová, katechin, kvercetin a rutin) a kyseliny hippurová byly zakoupeny od firmy FLUKA (p.a., Buchs, Švýcarsko). Standardy na ověření kvality kolony (anisol, methyl- a ethylester kyseliny benzoové) byly dodány firmou LACHEMA (p.a., Neratovice, ČR). Pro přípravu mobilních fází a roztoků standardů byla použita následující rozpouštědla a chemikálie: deionizovaná voda získaná z dvoustupňové deionizační stanice Elga (Bucks, Velká Británie) (18 MΩ/cm), acetonitril čistoty gradient grade (SIGMA-ALDRICH; St. Louis, USA), methanol čistoty gradient grade (BIOSOLVE; Valkensward, Nizozemí), kyselina mravenčí 99,7% čistoty p.a. (LACHEMA), hexan pro stopovou organickou analýzu (FLUKA), ethylacetát čistoty p.a. (LACHEMA), 2-propanol pro UV spektrometrii (SIGMA-ALDRICH), kyselina trifluoroctová (TFA) > 99% p.a. (FLUKA), kyselina octová 99,8% a octan amonný p.a. (SIGMA-ALDRICH). 3.2 Přístroje a vybavení Kapalinový chromatograf Analýzy byly realizovány na kapalinovém chromatografu Knauer Smartline s detektorem diodového pole (Obr. 11), který je vybavený nízkotlakým kvartérním gradientem a vestavěným průtokovým odplyňovačem. Ve vysokotlaké části kapalinového chromatografu je instalován dynamický mixér. Dávkování vzorku je realizováno šesticestným vysokotlakým ventilem s dávkovací smyčkou o objemu 20 µl. Po dobu analýz byla snímána UV/VIS spektra v rozmezí nm. Pro sledování většiny analýz postačily 2 vlnové délky a to 210 a 280 nm, dodatečně byl pro hodnocení výsledků v systému NP extrahován chromatogram při 325 nm. Směšování komponent mobilní fáze u všech gradientových elucí je řízeno manažerem kapalinového chromatografu. Retence složek modelové směsi byla studována na pěti kolonách: Pinnacle DB Silica, 3 µm (150 x 4,6 mm, Restek, USA), LUNA 3u HILIC 200 A (150 x 2,0 mm, Phenomenex, USA), TSKgel Amide-80, 3 µm (150 x 2,0 mm, TOSOH Bioscience, Japonsko), Kinetex 2,6u C18 100A (100 x 2,1 mm, Phenomenex, USA), Gemini 5u C18 110A (150 x 2,0 mm, Phenomenex, USA) Hmotnostní spektrometr Pro studium LC/MS kompatibility a jednoznačnou identifikaci byl k detekci využit hmotnostní spektrometr Q-TOF Premier od firmy Waters vybavený hybridním analyzátorem 20

22 založeným na kombinaci kvadrupólu a průletového analyzátoru a ionizací elektrosprejem (Zsprej) (Obr. 11). Jelikož analyty obsahují karboxylové skupiny, byly k ionizaci použity záporné potenciály. Teplota kapiláry byla nastavena na 120 C a napětí na kapiláře bylo -3,2 kv. Detekce hmotnostním spektrometrem byla prováděna skenováním hodnot m/z v rozsahu hmotnostních jednotek a pro identifikaci analytů byly rekonstruovány chromatogramy pro konkrétní hodnoty m/z (Tab. 2). Tab. 2: Sledované hodnoty m/z látek modelové směsi analyt m/z analyt m/z kys. 4-hydroxybenzoová 137,1207 kys. kávová 179,0423 kys. vanilová 167,1467 katechin 289,0790 kys. galová 169,0215 kvercetin 301,0427 kys. hippurová 178,1727 rutin 609,1534 Obr. 11: Kapalinový chromatograf Knauer a hmotnostní spektrometr Q-TOF Premier Ostatní laboratorní příslušenství Pro navážení standardů byly použity analytické váhy Sartorius (Sartorius AG, Goettingen, Německo). Na měření ph roztoků byl použit ph metr InoLab (WTW, Praha, ČR). Při přípravě mobilní fáze byla pro dodatečné odplynění použita ultrazvuková lázeň Elma, S 40 H, Elmasonic (Elma Hans Schmidbauer, Singen, Německo). 3.3 Příprava směsí standardů Zásobní roztoky standardů pro práci v systému reverzních fází byly připraveny rozpuštěním 1 mg standardu v 1 ml okyselené deionizované vody. Modelová směs byla připravena naředěním zásobních roztoků na konečnou koncentraci každého standardu 50 mg/l. Jako standardy byly u tohoto systému zvoleny kyselina 4-hydroxybenzoová, vanilová, galová, kávová a hippurová, katechin a kvercetin. Katechin, anisol, methyl- a ethylester kyseliny benzoové byly pro studii v systému normálních fází rozpuštěny i ředěny do mobilní fáze (MF) hexan-methanol (96:4, v/v) a jejich konečná koncentrace byla 70 mg/l každé látky. Dále byl připraven roztok katechinu ve 2-21

23 propanolu o koncentraci 1 mg/ml a následně naředěn příslušnou MF na konečnou koncentraci 100 mg/l. V okyselených mobilních fázích obsahujících 2-propanol a hexan byl připraven roztok katechinu o koncentraci 1 mg/ml v příslušné MF a toutéž byl následně naředěn na koncentraci 100 mg/l. Analyzovanými standardy v mobilní fázi hexan-methanol-ethylacetát (systém NP) byly kyselina 4-hydroxybenzoová, vanilová, galová, kávová a hippurová, katechin a rutin. Koncentrace standardů u prvních analýz (původní analýzy s MF okyselenou TFA) se pohybovala od 10 do 100 mg/l, u opakovaných analýz po jednom roce byla koncentrace všech analytů sjednocena na 50 mg/l. Všechny zásobní roztoky i roztoky modelových směsí byly rozpuštěny v příslušné mobilní fázi, v případě gradientu byly rozpuštěny v mobilní fázi s menší eluční silou (hexan:methanol:ethylacetát 8:1:1 + 0,5% TFA, v/v). V HILIC systému fází byly zásobní roztoky standardů a modelová směs připraveny rozpuštěním a ředěním v příslušné mobilní fázi (koncentrace každé látky 50 mg/l), v případě gradientu byla směs rozpuštěna v mobilní fázi s menší eluční silou (95% acetonitril obsahující acetátový pufr, ph 6). Jako standardy byly u tohoto systému použity kyselina 4-hydroxybenzoová, vanilová, galová, kávová a hippurová, katechin a kvercetin. 3.4 Příprava mobilní fáze a optimalizace retence Systém reverzních fází Složky mobilní fáze gradientu byly připraveny okyselením deionizované vody (složka A) a acetonitrilu či methanolu (složka B) kyselinou mravenčí na celkovou koncentraci kyseliny 0,1% (v/v). Pro analýzu modelové směsi u kolony Kinetex C18 byly zvoleny následující podmínky s průtokem MF 0,25 ml/min (složka B = okys. acetonitril). Grad.1: 0-5 min 100% A; 5-8 min 100% - 95% A; 8-20 min 95% - 10% A; min 10% A; min 10% - 100% A. Dále byl u obou kolon použit gradient (grad.2) s průtokem mobilní fáze 0,25 ml/min (složka B = okys. methanol). Grad.2: 0-5 min 100% A; 5-20 min 100% - 55% A; min 55% - 10% A; min 10% A; min (F = 0,2 ml/min) 10% - 100% A. U kolony Gemini C18 byla modelová směs analyzována také pomocí dalšího gradientu (grad.3) s průtokem mobilní fáze 0,4 ml/min (složka B = okyselený methanol). Grad.3: 0-3 min 100% A; 3-23 min 100% - 10% A; min 10% A; min 10% - 100% A. Nastřikované množství směsi bylo 5 µl Systém normálních fází Pro vývoj metody analýzy bylo potřeba otestovat několik mobilních fází a jejich modifikací. První testovaná mobilní fáze se skládala ze směsi hexanu a methanolu (96:4, 22

24 v/v). Průtok izokratické eluce s předmíchanou mobilní fází byl 0,5 ml/min. Tato metoda byla převzata z certifikátu o analýze na koloně Pinnacle DB Silica. Pro ověření kvality a parametrů této kolony byla zvolena směs standardů (anisol, methyl- a ethylester kyseliny benzoové). Dále v tomto systému byla zjišťována retence katechinu. Nastřikované množství katechinu či směsi bylo 20 µl. Další MF byl 2-propanol a 2-propanol s příměsí hexanu (v různých poměrech (v/v): 50:50, 25:75, 80:20) (průtok 0,5 ml/min). První modifikací MF bylo okyselení 2-propanolu kyselinou octovou (2% v/v). Testovány byly MF s různým množstvím okyseleného 2- propanolu a hexanu (v/v): 25:75, 40:60, 45:55, 50:50, 80:20. Směšování komponent mobilní fáze izokratické eluce bylo zajištěno manažerem kapalinového chromatografu. Mobilní fáze s nejvhodnějším poměrem komponent (tj. 40:60, resp. 30:70 2-propanol:hexan) byla předmíchána a okyselena na konečnou koncentraci kyseliny octové 2% (v/v). U optimálního složení MF 2-propanol-hexan = 35:65 byl testován vliv obsahu kyseliny octové (4% a 6%, v/v) na retenci katechinu (100 mg/l). Nastřikované množství roztoku katechinu bylo 20 µl. Posledním testovaným typem MF byla směs obsahující hexan, methanol a ethylacetát (průtok 1 ml/min). Byl testován i vliv okyselení (v/v, 2% kys. octová) u MF hexan:methanol:ethylacetát 2:3:1 a 8:3:1 (v/v). U MF hexan:methanol:ethylacetát 8:3:1 byl vedle toho testován i vliv obsahu kyseliny trifluoroctové (0,12%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5% a 0,6% TFA; v/v). Nejlepší separace bylo dosaženo s 0,5% TFA, proto s tímto obsahem TFA byly testovány i MF o složení hexan:methanol:ethylacetát 8:2:1 a 8:1:1. Na základě těchto výsledků byla navržena gradientová eluce (grad.4) s průtokem MF 1 ml/min, kde složkou A je hexan:methanol:ethylacetát 8:1:1 s 0,5% TFA (v/v) a složkou B hexan:methanol:ethylacetát 8:3:1 s 0,5% TFA (v/v). Grad.4: 0-3 min 100% A; 3-3,5 min 100% - 0% A; 3,5-16 min 0% A; min 0% - 100% A. Nastřikované množství směsi bylo 20 µl Chromatografie s hydrofilními interakcemi (HILIC) Při vývoji metod analýzy na těchto kolonách jsem provedla nejprve izokratickou eluci směsí 80%, 90%, 95% a 98% (v/v) acetonitrilu s vodou. Mobilní fáze byla připravena navážením komponent dle hodnot uvedených v tabulce 3 (hustota vody ρ V = 0,998 g/cm -3, hustota acetonitrilu ρ A = 0,782 g/cm -3 ). Komponenty byly smíchány a mobilní fáze odplyněna na ultrazvukové lázni. 23

25 Tab. 3: Vypočtené obsahy acetonitrilu a vody pro přípravu 100 ml MF obsah acetonitrilu (%) obsah acetonitrilu (g) obsah vody (g) 98 76, , , ,6 20 V další fázi vývoje metody byla testována izokratická eluce mobilních fází pufrovaných octanem amonným na ph = 6 či 7 (80%-, 90%- a 95%-ní acetonitril). Konečná celková koncentrace octanu amonného v objemu mobilní fáze byla zvolena na 12,5 mmol/l. Jelikož ph má být upravováno ve vodném roztoku (bez přídavku acetonitrilu), bylo potřeba pro každé složení mobilní fáze připravit vodné roztoky pufrů o různých koncentracích (Tab. 4) tak, aby konečná koncentrace pufru po přidání acetonitrilu byla konstantní v MF, a tudíž i výsledky porovnatelné. Pro úpravu ph pufru byla použita koncentrovaná kyselina octová. Postup při přípravě pufrovaných mobilních fází byl následující: 1) příprava roztoku octanu amonného a úprava ph, 2) navážení komponent dle Tab. 3 (hustota pufru ρ P ρ V = 0,998 g/cm -3 ), 3) smíchání komponent a odplynění na ultrazvukové lázni. Tab. 4: Vypočtené obsahy octanu amonného v příslušné pufrované mobilní fázi vodná fáze (%) obsah pufru obsah pufru ve vodě (mmol/l) ve vodě (g/100 ml) 20 62,5 0, , ,9250 Nejlepších podmínek separace bylo dosaženo použitím gradientové eluce jak pro kolonu LUNA HILIC (grad.5), tak i pro kolonu TSKgel Amide-80 (grad.6), kde složkou A je 95% acetonitril obsahující pufr a složkou B je 80% acetonitril obsahující pufr. Profil gradientu 5: 0-10 min 100% A; min 100% - 0% A; min 0% A; min 0% - 100% A. Profil gradientu 6: 0-9 min 90% A; 9-11 min 90% - 0% A; min 0% A; min 0% - 100% A. Nastřikované množství směsi bylo 5 µl. Všechny přípravné i chromatografické experimenty byly prováděny při laboratorní teplotě. 24