Biologie buněk neurální lišty ve vztahu ke kraniofaciální diversitě obratlovců

Transkript

1 UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA Katedra zoologie Biologie buněk neurální lišty ve vztahu ke kraniofaciální diversitě obratlovců BAKALÁŘSKÁ PRÁCE Jan Štundl Vedoucí práce: Mgr. Robert Černý, Ph.D. Praha 2011

2 Prohlášení Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracoval samostatně pod vedením Mgr. Roberta Černého, Ph.D. a s použitím citované literatury. V Praze dne

3 Poděkování Na tom místě bych rád poděkoval mému školiteli, Mgr. Robertovi Černému, Ph.D., za věnovaný čas, cenné postřehy a podporu, kterou mi poskytl během zpracování bakalářské práce. Mé díky patří kolegům a mým nejbližším za podnětné připomínky. Velké díky patří rodičům, kteří mě podporovali po celou dobu mého studia.

4 Absrakt Abstrakt Neurální lišta je extenzivně migrující populace buněk, která vzniká během raného vývoje embrya obratlovců v průběhu neurulace. Poskytuje obrovskou škálu různých buněčných typů, které vytvářejí nové tkáně, jenž se vyskytují pouze u obratlovců. Buňky neurální lišty se spolu s mesodermem podílejí (mj.) na tvorbě hlavy obratlovců, která je chápána jako jedna z nejdůležitějších inovací v evoluci obratlovců. Neurální lišta je často viděna jako klíčový faktor zapříčiňující obrovskou kraniofaciální diversitu. Hlavním cílem této práce bylo seznámit se s populací buněk neurální lišty a porozumět její důležitosti v evoluci obratlovců a především při tvorbě kraniofaciální diversity. Klíčová slova: evoluce, kraniofaciální diversita, neurální lišta, obratlovci Abstract Neural crest is an extensively migrating population of cells that arise during early development of vertebrate embryos. It provides a huge variety of different cell types that generate new tissues which occur only in vertebrates. Neural crest cells together with the mesoderm participate on the formation of the head of vertebrates, which is viewed as one of the most important innovations in the evolution of vertebrates. Thanks to their skeletogenic potencial neural crest cells are percieved as a key factor causing massive craniofacial diversity. The aim of this thesis was to get acquainted with the population of neural crest cells and try to understand its importance for the evolution of vertebrates and especially for generating craniofacial diversity. Keywords: evolution, craniofacial diversity, neural crest, vertebrates

5 Obsah Obsah Abstrakt...4 Obsah Úvod Buňky neurální lišty Historie aneb první zmínka o neurální liště Embryonální vznik buněk neurální lišty Migrace buněk neurální lišty Příspěvky neurální lišty Lebka (Cranium) Historický přehled o evoluci lebky Chondrokranium Splanchnokranium (viscerokranium) Dermatokranium Neurokranium Buňky neurální lišty jako hlavní faktor kraniofaciální diversity obratlovců Darwinovy pěnkavy diversita způsobená heterometrií Evoluce čelistí důležitý faktor diversity obratlovců Plasticita buněk neurální lišty Seznam použité literatury Přímé citace Nepřímé citace

6 Úvod 1. Úvod Neurální lišta je vysoce migrující populace buněk s obrovskou schopností diferenciace. Neurální lišta byla schopna modifikovat embryologický vývoj triblastických živočichů a zřejmě díky tomu mohli vzniknout obratlovci. Buňky neurální lišty hrají klíčovou roli v evoluci obratlovců, díky svým schopnostem diferencovat se do různých buněčných typů. Právě schopnost diferenciace napomohla obratlovcům vytvořit si tak početný aparát specializovaných buněk, které se podílejí na tvorbě nových tkání, které nás obratlovce odlišují od ostatních skupin. Už od svého objevení v 19. století buňky neurální lišty přitahovaly pozornost biologů. Studium buněk neurální lišty je nezbytné pro pochopení kraniofaciální morfogeneze a k porozumnění kraniofaciální diversity obratlovců. Obratlovčí hlava je tvořena ze dvou typů mesenchymů mesodermálním mesenchymem a především neurální lištou, která se podílí na tvorbě tzv. nové hlavy, která je chápána jako klíčová inovace v evoluci obratlovců. Další výzkum buněk neurální lišty snad jednou pomůže lékařům s léčbou malformačních defektů, jako jsou např. rozštěpy patra a mohlo by se tak předejít chirurgickým zákrokům. Hlavní úlohou této práce bylo seznámit se s neurální lištou a snažit se popsat a především pochopit její důležitost při tvorbě kraniofaciální diversity. Nejprve se snažím popsat buňky neurální lišty, poté popisuji morfologii lebky a uvádím zde stručný historický přehled o evoluci lebky. V závěru této práce se zaměřuji na důležitou roli buněk neurální lišty při utváření druhové bohatosti obratlovců, kterou naše planeta má.. 6

7 Buňky neurální lišty 2. Buňky neurální lišty Na vývoji triblastického živočišného organismu se během embryonálního vývoje podílí tři zárodečné listy, ektoderm, mesoderm a entoderm. Z tohoto obecného schématu se nápadně odlišuje kmen Chordata, konkrétně zástupci skupiny Vertebrata. Na tvorbě obratlovčího těla se totiž podílí nejen ektoderm, mesoderm a entoderm, ale též speciální populace buněk neurální lišty, která se v tomto kontextu chová jako čtvrtá zárodečná vrstva (Hall, 2000). Podíváme-li se na počty buněčných typů zjistíme, že v těle obratlovců je jejich počet nápadně vyšší než v kterémkoli jiném živočišném kmenu triblastičtí živočichové mají obecně okolo 50 buněčných typů, zatímco kvadroblastičtí jich mají 411 (Vickaryous a Hall, 2006). Tento rozdíl je připisován právě buňkám neurální lišty, které tvorbu specializovaných buněčných typů zajišťují. Nevyskytují se nikde jinde v živočišné říši a zřejmě stojí za relativní úspěšností obratlovců: kmen Chordata je čtvrtým nejpočetnějším kmenem mezi živočichy (Gaisler a Zima, 2007). V posledních letech je neurální lišta pokládána za nejdůležitější apomorfní (evoluční novinku) znak obratlovců (Gans a Northcutt, 1983, Donoghue et al., 2008). Z fenotypového pohledu se jeví nejnápadnější vlastností obratlovců nové skeletální tkáně, především lebka, se kterou souvisí další důležitý evoluční znak - vznik čelisti, který přispěl k obrovské diversitě obratlovců. U pláštěnců byla nalezena tkáň podobná neurální liště, ze které však vznikají pouze pigmentové buňky (Jeffery et al., 2004). Pro biology zabývající se studieum neurální lišty je současný výzkum této buněčné populace soustředěn několika pohledy. Většina výzkumů se však orientuje především na hlavu obratlovců právě proto, že neurální lišta přispívá do většiny skeletálních elementů (chrupavčité a kostěné elementy) hlavy obratlovců. Modifikace těchto skeletálních elementů má obrovský vliv na výsledný fenotyp. Komparativními studiemi vývojových mechanismů lze získat částečnou představu o tom, jak k těmto modifikacím docházelo. Tento pohled je základní myšlenkou nově se rozvíjejícího biologického oboru evolučně-vývojové biologie (evo-devo). 7

8 Buňky neurální lišty 2.1. Historie aneb první zmínka o neurální liště Profesor anatomie a fyziologie Wilhelm His ( ) z Basileje byl jedním z prvních průkopníků embryologie jako takové. V roce 1868 popsal populaci buněk v kuřecím embryu, která se nacházela mezi vyvíjející se neurální trubicí a budoucím epidermálním ektodermem jako zdroj kraniálních a spinálních ganglií. Tuto buněčnou populaci pojmenoval Zwischenstrang (His 1868, 1879; podle Hall, 2009). His ji v roce 1874 označil jako zárodečný region, ze kterého v pozdější době vznikají různé tkáně. Termín neurální lišta poprvé použil profesor zoologie Artur Milnes Marshall ( ) z Manchesteru v roce 1879 (Hall, 2009) Embryonální vznik buněk neurální lišty Buňky neurální lišty vznikají během neurulace. Jedná se o proces, kdy se v embryu začínají utvářet neurální valy, které se postupně přibližují a fúzují, až vytvoří neurální trubici. Dorzální část nově vzniklé nervové trubice je tvořena buňkami, které byly původně na vrcholcích neurálních valů. Již během uzavírání nervové trubice začnou tyto buňky ztrácet postupně adhezi a jsou vystaveny cytoskeletárním a morfologickým změnám. Takto nově vzniklé buňky neurální lišty poté migrují a po ukončení migrace se diferencují v širokou škálu buněčných typů (Kulesa et al., 2004). Obr. 1: Diferenciace neurálního a ne-neurálního ektodermu, tvorba neurální ploténky, základní signální molekuly. Upraveno podle Sauka-Spengler a Bronner-Fraser, Celý proces od indukce přes migraci až k diferenciaci buněk neurální lišty je řízen velmi důmyslnou genovou regulační sítí. Iniciace tvorby neurální lišty je založena na několika základních signálních drahách (FGF,BMP a Wnt Notch/Delta), které působí jak z mesodermu tak i z epidermálního ektodermu a indukují tvorbu neurálních valů (LaBonne a Bronner- 8

9 Buňky neurální lišty Fraser, 1998; Sauka-Spengler, 2007; Tríbulo et al., 2003; Monsoro-Burq et al., 2003) (Obr. 1; 2). Buňky neurální lišty po svém vzniku procházejí tvz. epitelo-mesenchymální tranzicí. Jedná se o proces, při němž se mění epiteliální buňky v mesenchymatické (Thiery et al., 2009). Hlavní roli v tomto ději hrají kadheriny, což jsou transmembránové proteiny podílející se na vzniku mezibuněčných spojů. Postupné tlumení exprese kadherinů a jejich indukovaná degradace umožňuje buňkám neurální lišty odmigrovat z neurální trubice (Chu et. al, 2006). Obr. 2: Schéma základních signálních drah podílejících se na indukci, migraci a diferenciaci buněk neurální lišty. Převzato z Meulemans a Bronner-Fraser, Pro začátek migrace je také důležitá aktivace cyklinu D a zvýšená exprese genu Snail, který indukuje vstup všech budoucích buněk neurální lišty do S-fáze buněčného cyklu (Thiery et al., 2009). Murray a Gridley při komparativní analýze žabích, ptačích a myších embryí zjistili, že i přes konzervativnost v signálních drahách vzniku neurální lišty existuje jakási funkční redundace (Murray a Gridley, 2006). U myších mutantů v genech Snail1 a Snail2 ukázali, že ani jeden z nich není nezbytný pro delaminaci a počáteční fázi migrace neurální lišty. Tyto výsledky jsou překvapující, protože u žab a ptáků jsou tyto geny pro vznik neurální lišty 9

10 Buňky neurální lišty esenciální. Ovšem je nutné dodat, že mutantní formy myší vykazovaly malformace v kraniofaciální části hlavy, tedy v oblasti, kde jsou buňky neurální lišty nejabundantnější Migrace buněk neurální lišty Migrace buněk neurální lišty je u obratlovců velice konzervativní (Kuratani et al., 1997). Buňky neurální lišty migrují v hlavové části těla ve třech základních proudech. Nejanteriornější proud se nazývá trigeminální. Posteriorněji od něj je hyoidní proud a nejposteriornějším je branchiální proud (obr. 3). Migrace buněk mandibulárního proudu probíhá z několika oblastí: z prosencephala, mesencephala a prvních dvou rhombomer (segment zadního mozku) rhombencephala, která tvoří nejposteriornější část migrace buněk trigeminálního proudu (Lumsden et al., 1991; Černý et al., 2004). Mandibulární proud z počátku migrace pokrývá poměrně značnou část přední části hlavy, ale později dojde k rozdělení kolem budoucího oka (Černý et al., 2004). Buňky hyoidního proudu odmigrovávají z oblasti čtvrté rhombomery a z šesté a sedmé rhombomery migrují buňky branchiálního proudu (Lumsden et al., 1991). Populace buněk branchiálního proudu je dělena do několika proudů a to dle postupně vznikajících žaberních oblouků. V oblastech rhombomery tři a pět buňky neurální lišty také vznikají, ale většina podlehne řízené buněčné smrti a jen malá část migruje s vedlejšími proudy (Kulesa et al., 2004) (obr. 3). Výše migrační jsou oddělené nedochází k míšení zmíněné proudy striktně a buněk jednotlivých proudů. (Kulesa et al., 2004) Obr. 3: Migrační proudy buněk neurální lišty. Obrázek ze SEM Ambystoma mexicanum. Populace buněk neurální lišty počítačově obarvena zelenou barvou. Převzato z Černý et al., Během migrace jsou exprimovány specifické geny jako např. Slug/Snail, AP-2, Foxd3, Sox9/10, Id, Twist, které jsou regulovány již zmíněnými signálními drahami (Fgf, 10

11 Buňky neurální lišty Wnt, BMP) a také geny, které jsou exprimovány na hranici neurální destičky (Zic, Msx1/2 a Pax3/7) (Meulemans a Bronner-Fraser, 2004) (obr. 2). Další důležitou podmínkou pro migraci je tvorba specifických buněčných receptorů, metaloproteáz a adhezivních molekul, což jim umožní interagovat s okolím při migraci (Kurosaka a Kashina, 2008). Po dosažení prostoru v embryu, kam mají buňky neurální lišty doputovat a diferencovat se do různých buněčných typů, dochází k utlumení exprese genů AP-2, Slug/Snail, FoxD3 a Id (Meulemans a Bronner- Fraser, 2004). Migrace buněk neurální lišty v definovaných migračních proudech je u obratlovců velice konzervativní. Jeden z rozdílů při migraci může být spatřován v časovém intervalu, kdy začínají buňky neurální lišty odmigrovávat - buňky neurální lišty u ptáků, ryb a žab odmigrovávají až po uzavření neurální trubice, zatímco u myši dochází k migraci ještě před úplným uzavřením neurální trubice (např. shrnuto Kulesa et al., 2004). Tyto časové posuny (heterochronie) mohu nastat i v rámci jednoho řádu. Asi nejznámější příklad je doložen na dvou druzích skokanů, a to Rana temporaria (skokan hnědý) a Sylvirana nigrovittata (skokan černoboký). U R. temporaria buňky neurální lišty odmigrovávají ještě před úplným uzavřením neurální trubice, zatímco u S. nigrovittata je migrace zahájena až při zcela uzavřené neurální trubici (Mitgutsch et al., 2007). Autor se bohužel nezmiňuje o evolučním významu této heterochronie Příspěvky neurální lišty Jak již bylo zmíněno výše, neurální lišta může být vnímána jako čtvrtý zárodečný list (Hall, 2000). Buňky neurální lišty stejně jako ostatní tři zárodečné listy přispívají do tvorby mnoha různých orgánů, ať už přímo či nepřímo. Přímým příspěvkem je myšlena diferenciace, kdy se buňky neurální lišty transformují v určitý typ buňky a o nepřímý příspěvek se jedná tehdy, ovlivňuje-li okolní buňky v cílové pozici (Hall, 2009). Po migrace dochází k diferenciaci buněk neurální lišty. Deriváty buněk neurální lišty můžeme rozdělit do dvou skupin: mesenchymové a ne-mesenchymatického typu (obr. 4). Do skupiny mesenchymových derivátů řadíme chondrocyty, osteocyty, odontoblasty a buňky pojivové tkáně (např. povázky svalů). K ne-mesenchymové skupině řadíme většinu nervových buněk a pigmentové buňky, jako např. melanocyty (shrnuto Donoghue et al., 2008) (obr. 4). 11

12 Buňky neurální lišty Obr. 4: Deriváty buněk neurální lišty. Rozděleny na dvě základní skupiny. Převzato z Donoghue et al., Další možností rozdělení derivátů buněk neurální lišty je dle lokalizace, odkud buňky odmigrovávají, tj. na buňky hlavové, vagální a trupové neurální lišty (shrnuto např. Huang a Saint-Jeannet, 2004). Buňky hlavové neurální lišty se liší od trupové neurální lišty nejen ve vlastnostech migrace, ale i v rozmanitosti derivátů (shrnuto Hall, 2009). Jelikož se v této práci zaměřuji na kraniofaciální morfologii, zdůrazňuji důležitost příspěvku buněk neurální lišty do lebky obratlovců, kde tvoří celé viscerokranium a minimálně část neurokrania, jak je podrobněji rozebráno v následující kapitole. 12

13 Lebka (Cranium) 3. Lebka (Cranium) Vývoj a původ lebky obratlovců je už dlouhou dobu v popředí zájmů morfologů. Lebka je nesmírně komplexní strukturou, mající primárně ochrannou funkci mozku a smyslových orgánů, ale také nese čelisti, které jsou klíčové pro zachycení a zpracování větší potravy. Proto je lebka chápána jako jedna z klíčových evolučních novinek obratlovců. Na vývoji lebky se podílí především neurální lišta (tvořící obličejovou část lebky a část neurokrania) a mesoderm. 3.1 Historický přehled o evoluci lebky Cesty evoluce lebky byly předmětem studia srovnávacích morfologů již po velmi dlouhou dobu. Za jakýsi svatý grál morfologů může být povožován problém segmentace hlavy, známý v historii morfologie jako Kopfprobleme. Hlavní otázkou této myšlenky bylo, jestli existuje nebo existoval předek (archetyp) obratlovců, jenž by měl rozsegmentovanou hlavu (obr. 5). S prvním hlubším zájmem o původ obratlovčí lebky přišel Johann Wolfgang von Goethe ( ) a Lorenz Oken ( ) na přelomu 18. a 19. století nezávisle na sobě. Byli té myšlenky, že lebka je tvořena seriálně uspořádanými obratli, které splynuly a vytvořily lebku. K tomuto závěru prý došli při setkání s rozkládající se hlavou ovce na hřbitově (Olsson et al., 2005). Tato myšlenka se ukázala mylnou po analýze T. H. Huxleyho (1858), který ukázal, že lebka je tvořena plochými kostmi a pod nimi je chrupavčité chondrokranium. Nicméně okcipitální část lebky je opravdu tvořena splynulými obratli, jak ukázal Stöhr v roce 1879 (a mnozí další) kupř. na ocasatých obojživelnících (Mitgutsch, 2003). Na přelomu 19. a 20. století během období rozkvětu srovnávací morfologie se problém evoluce lebky opět stal hlavním tématem, díky objevu hlavových kavit v žraločím embryu, které byly homologizovány se somity (podle Kuratani, 2005). Hlavové kavity vznikají segmentálně, jako tři páry a každý pár byl asociován s jedním faryngeálním obloukem. (podle Kuratani, 2005). 13 Obr. 5: Schéma archetypálního stádia lebky podle Goetha. Převzato z Kardong, Proto byla lebka chápána jako sada několika segmentů a tyto myšlenky byly obhajované až do dnešní doby kupříkladu zastánci tzv. Stockholmské školy (pro historické detaily viz. Olsson et al., 2005).

14 Lebka (Cranium) S nástupem vývojové biologie a embryologie se změnil pohled na evoluci lebky. Současné stanovisko je orientováno na podíl jednotlivých zárodečných listů na vývoj lebky a především je zdůrazňována role buněk neurální lišty jako hlavního činitele morfogeneze kraniofaciální části lebky (např. Gans a Northcutt, 1983). Na lebce se klasicky rozlišuje několik částí: viscerokranium, chondrokranium a dermatokranium, ale také můžeme rozlišit tzv. neurokranium či další části. Původem nejstarší částí je viscerokranium (splanchnokranium), které původně sloužilo jako podpora žaberních oblouků a později v evoluci tvoří obličejovou část lebky. Druhou částí je chondrokranium, které tvoří endoskelet chrupavčitého neurokrania bezčelistnatých a paryb, podporuje mozek a u ostatních obratlovců tvoří bázi lebky. Dermatokranium u vyšších obratlovců tvoří velkou většinu lebky a v dospělosti je pouze na bázi lebky rudimentární chondrokranium (Gaisler a Zima, 2007). Poslední částí, kterou je možno rozlišovat na lebce, je neurokranium, které tvoří u obratlovců ochranu nejdůležitějšího orgánu, mozku a smyslových orgánů. Neurokranium je těžké přesně nadefinovat, jelikož tvoří překryv výše zmíněných částí. 3.2 Chondrokranium Pod pojmem chondrokranium se obecně definuje lebka složená z chrupavčitých elementů a kostí vzniklých enchondrální osifikací. V této práci je zvolené dělení chondrokrania dle jako tvořící lebeční (Kardong, Kardonga strukturu bázi 2009). Báze lebeční se zakládá jako tři samostatné Obr. 6: Schématické znázornění embryonálního vývoje chondrocrania. Tmavě šedou označena chrupavka; světle šedá- kostěnné elementy. Převzato z Kardong, hlavové kapsuly (pouzdra pro smysly), které jsou po stranách dvou tyčinkovitých útvarů zvanými praechordalia (neboli trabeculae cranii) a parachordalia. Praechordalia jsou anteriorněji lokalizované vůči parachordáliím, která jsou ve styku s chordou dorsalis (struna hřbetní) (obr. 6). Tyto útvary později v ontogenezi srůstají (Kardong, 2009). Japonský biolog 14

15 Lebka (Cranium) Shigeru Kuratani navrhuje evoluční model, podle kterého jsou trabekuly původu z buněk neurální lišty a jsou pouze sekundárně začleněny do neurokrania, jelikož původně vznikly jako součásti viscerokrania (Kuratani, 1997). 3.3 Splanchnokranium (viscerokranium) Splanchnokranium je nejstarší součástí lebky. U obratlovců, kteří dýchají žábrami, podpírá žaberní oblouky jako tzv. branchiální (či žaberní) aparát. Jeho původní podoba, složená ze sedmi žaberních oblouků, je zachována pouze u bezčelistnatců. U čelistnatců se některé elementy původního faryngeálního aparátu podílejí na tvorbě čelistí a hyoidního aparátu. Branchiální nebo faryngeální struktury jsou tvořeny párovými chrupavčitými elementy, u nichž můžeme rozlišit tzv. pharyngobranchiale, epibranchiale, ceratobranchiale, hypobranchiale a basibranchiale (obr. 7) (Kardong, 2009). Obecně lze říci, že viscerokranium tvoří obličejovou část lebky. Viscerokranium je embryonálního původu z buněk neuralní lišty (Le Douarin a Kalcheim, 1999; Černý et al., 2006). Obr. 7: Schématické znázornění primitivního viscerokrania. A-Meckelova chrupavka; B- palatoquadratum; C-hyomandibula;. I-V-branchiální oblouky. Převzato z Kardong,

16 Lebka (Cranium) 3.4 Dermatokranium Dermatokranium je část lebky, která je tvořena plochými kostmi. V evoluci pravděpodobně vznikly evolučně odvozené kosti dermatokrania z tělních respektive hlavových štítů fosilních ryb. Dermální kosti se poprvé objevily u štítnatců (Ostracodermi) (Gaisler a Zima, 2007). Jak již název napovídá, tyto kosti vznikají endesmální osifikací ve škáře. Kosti, jenž utváří dermatokranium se obecně rozřazují do tzv. sérií: orbitální, temporální, palatální, mandibulární, faciální a série klenby lebeční. Dermální kosti u moderních ryb (Teleostei) a kupř. u recentních obojživelníků (Lissamphibia) mají v evoluci tendenci srůstat, přesouvat se a redukovat počet, což by zřejmě mohlo souviset s rozvojem pohybu u těchto organismů (Kardong, 2009). U amniot tyto kosti vytváří ochranou schránku pro mozek a spolupodílí se na tvorbě dolní a horní čelisti nesoucí zuby (Kardong, 2009). 3.5 Neurokranium Neurokranium má ochrannou funkci mozku a smyslových orgánů (statoakustického, čichu a zraku). Neurokranium se pro jednoduchost rozděluje na bázi lebeční a klenbu lebeční. Klenba lebeční je velmi stará struktura, která tvořila ochranný obal hlavy bezčelistnatých fosilních ryb (Agnatha). U současně žijících bezčelistnatých obratlovců klenba lebeční chybí. Důležité je zmínit osifikační původ neurokrania. Dochází zde k oběma typům osifikace, jak enchondrální (osifikace přes stádium chrupavky) tak endesmální (osifikace přímo ze škáry). Báze lebeční je utvářena enchondrální osifikací a tvoří tzv. chondrokranium (Kardong, 2009). Klenba lebeční vzniká endesmální osifikací, čímž tvoří tzv. dermatokranium (Morris- Kay, 2001). 16

17 Buňky neurální lišty jako hlavní faktor kraniofaciální diversity obratlovců 4. Buňky neurální lišty jako hlavní faktor kraniofaciální diversity obratlovců Pochopení principů a vznik diversity je už dlouhou dobou v centru zájmu evolučních biologů. Kraniofaciální (obličejová) část hlavy může být považován za jeden z nejlepších znaků, který velmi dobře reflektuje obrovskou diversitu (obr. 8) i v rámci jednoho druhu. Nejznámějším a zároveň nejjednodušším příkladem je člověk. Na naší planetě žije necelých sedm miliard lidí a každý jedinec je naprostým unikátem (snad jedinou výjimku tvoří jednovaječná dvojčata). Na této obrovské kraniofaciální diversitě má hlavní podíl populace buněk neurální lišty a to především její nejanteriornější část, trigeminální proud. Obr. 8: Obrázek představující diverzitu obratlovců v chondrokraniu. 1-Chondrichthyes; 2-Actinopterygii; 3-Amphibia; 4-Reptilia; 5-Aves; 6-Mammalia. a-petromyzon. Žlutá-maxilarní část; růžová-mandibulární oblouk a kaudální oblouky bílá/lososová. Převzato z Depew a Simpson, Signální dráhy spojené s buňkami neurální lišty, které se podílejí na utváření kraniofaciální části hlavy, jsou z velké většiny u všech obratlovců konzervativní. Laureát Nobelovy ceny François Jacob poprvé postuloval, že evoluce přednostně využívá již existující mechanismy, než by měla vytvářet nové (Jacob, 1977; podle Gilbert, 2006; Carroll, 2010). Jacob dále vyřkl myšlenku, že změny probíhající v evoluci, které přispívají k fenotypové diversitě, jsou ovlivňovány embryonálními a ne adultními geny (Jacob, 1977; podle Gilbert, 2006). Tyto Jacobovy změny byly rozděleny do několika kategorií: heterotopie (změna v pozici exprese genu), heterochronie (časová změna v expresi genu) a heterometrie (změna v množství exprese genu) (Artur, 2004; podle Gilbert, 2006). 17

18 Buňky neurální lišty jako hlavní faktor kraniofaciální diversity obratlovců Hlava obratlovců je synapomorfií, která odděluje tuto skupinu od ostatních druhoústých (Deuterostomat) a je z velké většiny tvořena buňkami neurální lišty tzv. nová hlava (detailněji ve třetí kapitole) (Gans a Northcutt, 1983; Northcutt, 2005). Neurální lišta v hlavě funguje podobně jako mesoderm v trupu a vytváří skeletální, svalové a pojivové tkáně. Se spoluúčastí ektodermálních plakod se podílí na tvorbě smyslových orgánů (Gans a Northcutt, 1983). Dle některých náhledů (kupř. Kuratani, 2005) je pro evoluci hlavového skeletu nejdůležitější první, trigeminální proud buněk neurální lišty, neboť to jsou právě tyto buňky a jejich morfogeneze, která konstituuje evolučně důležité elementy lebky obratlovců. 4.1 Darwinovy pěnkavy diversita způsobená heterometrií Darwinovy pěnkavy jsou skupina pěvců, čítajících 14 druhů z Galapág a Kokosových ostrovů, které popsal Charles Darwin při jeho cestě na lodi Beagle v roce 1835 (Grant, 1999; podle Abzhanov, 2004). Pěnkavy z těchto souostroví inspirovaly Charlese Darwina při formulaci jeho evoluční teorie. Pro kraniofaciální studie je důležité, že tyto pěnkavy jsou velice variabilní ve velikosti a tvaru zobáků. Morfologická variace zobáků byla vysvětlovaná adaptivní radiací, díky které se tito ptáci specializovali na různou potravu a vzájemně si tak nekonkurují při hledání potravy. Ekologické využití potravních nik jednotlivými pěnkavami bylo dobře prostudované, ale vývojový proces, jenž způsobuje jednotlivé morfologické varianty zobáků, byl donedávna neznámý. V roce 2004 se Abzhanov a kol. pokusili rozluštit vývojový proces, který zapříčiňuje variabilitu. morfologickou Při pokusech o rozluštění Obr. 9: Exprese genů Bmp4 CaM v zobácích pěnkav rodu Geospiza. Upraveno podle Abzhanov et al., 2004 a Abzhanov et al.,

19 Buňky neurální lišty jako hlavní faktor kraniofaciální diversity obratlovců vývojových mechanismů podílejících se na tvorbě zobáků, byly zprvu analyzovány geny, u kterých se vědělo, že se účastní kraniofaciální morfogeneze u ptáků. K prvnímu objevu přímé korelace mezi expresí určitého genu a velikosti zobáku přispěli svým objevem Abzhanov a kol., kteří objevili expresi genu Bmp4 ve faciálním ektodermu u rodu Geospiza (Abzhanov et al., 2004). U druhů se širším a větším zobákem byla exprese genu Bmp4 mnohem větší (heterometrie) a navíc tato exprese začala dříve (heterochronický posun) oproti druhům s rovným a užším zobákem (Abzahnov et al., 2004) (obr. 9). O dva roky později přišel stejný tým s interpretací vzniku dlouhých a špičatých zobáků, kdy hlavní molekulou podílející se na tomto ději byl shledán calmodulin (CaM) (Abzahnov et al., 2006) (Obr. 9). Aby se potvrdila ústřední role calmodulinu při tvorbě dlouhých a špičatých zobáků, byla experimentálně zvýšena hladina calmodulinu u kuřete. Právě vyšší hladina calmodulinu vyvolala tvorbu dlouhého a špičatého zobáku. (Abzhanov et al., 2006). Studiemi na Darwinových pěnkavách se potvrdil evoluční význam heterometrie. Zvýšená hladina Bmp4 a CaM ve faciálním ektodermu vyvolala fenotypové změny v kraniofaciální části lebky. Tyto signály faciálního ektodermu v kooperaci s buňkami neurální lišty pomohly ke vzniku veliké diversity v zobácích pěnkav. Tím mohlo dojít ke specializaci na různé potravní nabíky a nově vzniklé fenotypy si tak nekonkurovaly při zápase o potravu. Dalším modelovým zvířetem na studium kraniofaciální diversity byly africké cichlidy. Je velice zajímavé, že i u cichlid byla potvrzena klíčová role genu Bmp4. Zvýšená exprese genu Bmp4 způsobila tvorbu masivnějších čelistí (jako je tomu u Darwinových pěnkav). Stejně významnou funkci má gen pro calmodulin CaM1, který je zodpovědný za vývoj skeletálních elementů na lebce cichlid (Parsons a Albertson, 2009). Díky různým modifikacím exprese genu Bmp4 a CaM1 mohlo ve východoafrických jezerech vzniknout tolik různých fenotypů čelistí, díky kterým si rozdělily potravní niky (Parsons a Albertson, 2009). 19

20 Buňky neurální lišty jako hlavní faktor kraniofaciální diversity obratlovců 4.2 Evoluce čelistí důležitý faktor diversity obratlovců Obratlovci s čelistmi (Gnathostomata) tvoří velkou většinu všech současně žijících obratlovců. Do taxonomické skupiny bezčelistnatců patří jen kolem 100 recentních druhů (z toho přes 60 druhů tvoří sliznatky a 44 druhů mihule), naopak do Gnathostomat patří přes zbývajících druhů obratlovců (Gaisler a Zima, 2007). Obrovský početní rozdíl mezi bezčelistnatci a čelistnatci je zřejmě způsoben přítomností čelistí. Čelisti jsou jednou z klíčových evolučních novinek čelistnatců, jelikož umožnily polapit a zpracovat mnohem větší a pohyblivější kořist, díky které dosáhli velkého evolučního úspěchu. První fosilní záznam přítomnosti čelistí je datován do časného siluru (cca 400 mil. let) u skupiny pancířnatci (Placodermi) (Kardong, 2009; Gaisler a Zima, 2007). Čelisti jsou tvořeny dorsálními a ventrálními elementy, které jsou kloubně spojeny (Cerny et al., 2004). Dorsální element je tvořen palatoquadratem (prefigurující horní čelist) a ventrální Meckelovou chrupavkou (spodní čelist) (Kardong, 2009). Vývoj čelistí je umožněn díky skeletogenním vlastnostem buněk neurální lišty trigeminálního proudu, který vytváří maxilární a mandibulární (ventrálněji položenou) kondenzaci (Cerny et al., 2004). Původně se myslelo, že obě tyto kondenzace (maxilární i mandibulární) přispívají k vývoji čelistí, ale tato hypotéza byla vyvrácena Černým a kol., kteří ukázali, že palatoquadratum a Meckelova chrupavka je odvozena pouze z tzv. mandibulární kondenzace a maxilární kondenzace se vývoje čelistí neúčastní, ale podílí se na tvorbě trabekul (Cerny et al., 2004) (obr. 10). Obr. 10: Schéma porovnávající klasický model a model, jenž navrhuje Černý et al., MC- Meckelova chrupavka; PQ-Palatoquadratum; TR-Trabekula; ot-otická kapsula; e-oko; n- nasální kapsule. Převzato z Černý et al., Evoluční vznik čelistí je vysvětlován různými teoriemi. S jedním řešením evoluce čelistí obratlovců (hypotéza heterotopického posunu tkáňových interakcí) přišla Shigetani a kol. (Shigetani et al., 2002). Tato teorie pracuje s myšlenkou kaudálního prostorového posunu exprese genů spolupodílejících se na tvorbě orální oblasti. Geny Fgf8 a Bmp4 jsou hlavními 20

21 Buňky neurální lišty jako hlavní faktor kraniofaciální diversity obratlovců patternujícími faktory během tvorby horního rtu u mihulí. Díky heterotopickému posunu exprese těchto genů kaudálním směrem by měla vzniknout horní čelist, protože původně geny Bmp4 a Fgf8 fungují jako induktory tvorby horního rtu u mihulí a po heterotopickém posunu přebírají roli induktorů vzniku horní čelisti (Shigetani et al., 2005; Mallatt, 2008). Důležitou funkci v evoluci čelistí zástává také nasohypofyzární komplex, který u mihulí tvoří mechanickou bariéru pro migraci trigeminálního proudu buněk neurální lišty (Mallatt, 2008). U čelistnatců je nasohypofyzární komplex díky heterotopickému posunu exprese Fgf8 a Bmp4 rozdělen na dva páry nasálních plakod a kaudálněji umístěné primordium adenohypofýzy. Uvolnění prostoru rozdělením nasohypofyzárního komplexu mohlo umožnit migraci trigeminálního proudu buněk neurální lišty mnohem rostrálněji než tomu je u mihulí a umožnilo by tak vznik horní čelisti (Mallat, 2008). Hypotéza postulovaná Černým a kol. v roce 2010 se zabývá myšlenkou koopce genů v buňkách trigeminálního proudu buněk neurální lišty (Cerny et al., 2010). Dle molekulárních náhledů do expresních patternů ve faryngeálním aparátu víme, že tento pattern musel sdílet poslední společný předek bezčelistnatců a čelistnatců. Každý z oblouků faryngeálního aparátu je rozdělen do čtyř oblastí, kde je různá kombinace exprese genů Msx, Dlx a Hand, která díky těmto kombinacím v expresi definuje různé typy skeletálních elementů orální oblasti (Cerny et al., 2010). Důležitou inovací při vzniku čelistí dle hypotézy koopce genů bylo začlenění exprese dalších genů v rámci mandibulárním oblouku. Jedná se o geny Gdf 5/6/7 a Bapx, díky kterým se vyvinul čelistní kloub (Cerny et al., 2010). 4.3 Plasticita buněk neurální lišty Přínosem pro pochopení plasticity buněk neurální lišty byly transplantační experimenty mezi kuřetem a křepelkou (Schneider, 1999). Jako první byly provedeny kontrolní transplantace křepelčího mesodermálního mesenchymu ze somitomer (4-6) do identické pozice v kuřetím mesodermu, čímž se potvrdilo, že vznikne naprosto nerozeznatelná laterální část neurokrania. Při heterotopické transplantaci buněk neurální lišty křepelky z oblasti středního mozku do mesodermálního mesenchymu somitomer (4-6) kuřete se ukázalo, že buňky neurální lišty dokáží vytvořit laterální neurokranium, které by bylo bez jakýchkoli morfologických změn (Schneider, 1999). Klasickou otázkou morfogeneze kraniofaciální oblasti bylo, zda jsou buňky neurální lišty již předem naprogramovány k tvorbě finálních tkání, či jsou-li pouze pasivní buněčnou populací reagující na signály z okolních tkání. Klíčové experimenty ukazující, že buňky 21

22 Buňky neurální lišty jako hlavní faktor kraniofaciální diversity obratlovců neurální lišty nesou morfogenetickou informaci pro vznik zobáku, přinesli s využitím ptačích chimér Schneider a Helms (Schneider a Helms, 2003). Křepelky a kuřata však Schneider a Helms nepoužili, jelikož jsou si dosti příbuzné a mají i podobný zobák, a jako modelová zvířata zvolili křepelku a kachnu. Křepelky mají zobák krátký, úzký a konvexní oproti zobákům kachen, které mají zobák dlouhý, široký a plochý. Při transplantaci kraniální části buněk neurální lišty křepelčího (angl. quail) embrya do hostitelského kachního (angl. duck) embrya vznikla chiméra, která byla pojmenována quck a objevil se u ní křepelčí zobák. Podobně při transplantaci kachní neurální lišty do křepelčího embrya vznikla chiméra označovaná jako duail u které vznikl zobák typický pro kachny (Schneider a Helms, 2003). K dosažení takovýchto morfologických změn byla dárcovská (donorová) neurální lišta nejprve indukována faciálním ektodermem, poté začala kondenzovat a utvářet specifické zobáky a přitom musela v hostitelském embryu regulovat genovou expresi v přilehlých epiteliálních tkáních (Schneider a Helms, 2003). Regulace okolních tkání donorovou neurální lištou byla potvrzena při rozklíčování genových expresí v hostitelských tkáních. V kachním embryu faciální ektoderm exprimoval gen Pax6 a nebyla zaznamenaná exprese genu Shh, který byl exprimován v křepelčím faciálním ektodermu. Nicméně u chiméry quack byla objevena exprese genu Shh v hostitelské tkáni a nebyla zaznamenána exprese genu Pax6 (Schneider a Helms, 2003). Populace buněk neurální lišty je díky své plastičnosti schopna převzít funkci okolní tkáně, do které byla transplantovaná, jak ukazuje Schneider, 1999, což je velice zajímavé vezmeme-li v potaz, že mesodermální mezenchym je relativně starý zárodečný list a tato nová buněčná populace je schopna převzít jeho funkci a vytvořit skeletální element, který je bez jakékoli fenotypové změny. To znamená, že buňky neurální lišty umí přepnout své vnitřní nastavení a jsou schopny vnímat i signály, kterými se při své morfogenezi řídí mesoderm, takže jej dokáží nahradit a udělat i něco navíc. Samotná evoluce lebky je nesmírně komplikovaný děj, kterého se účastní několik komponent. Podle některých recentních studií (např. Schneider a Helms, 2003 ) se zdá, že klíčovou roli při kraniofaciální morfogenezi hrají buňky neurální lišty a okolní tkáně této extenzivně migrující populaci pouze poskytují signály nutné pro proliferaci, migraci a diferenciaci v cílový buněčný typ právě v konkrétní oblasti. Nicméně pokud se zaměříme na data z článků (např. Abzhanov et al., 2004) ze kterých naopak vyplývá, že nejpodstatnější funkci při kraniofaciální morfogenezi nesou epiteliální tkáně, mohou být buňky neurální lišty chápány pouze jako naivní nosič se schopností diferenciace v určitý buněčný typ. 22

23 Buňky neurální lišty jako hlavní faktor kraniofaciální diversity obratlovců Vzájemná interakce mezenchymu a epitelu, které řídí morfogenezi kraniofaciální části lebky se nazývá epitelo-mesenchymální cross-talk (Santagati a Rijli, 2003). Klasickým příkladem významu interakce mezi epitelem a mezenchymem je vývoj zubu. Prvotní indukci spouští mesenchym původu buněk neurální lišty a v další fázi vývoje zubu jsou důležité signály od okolních tkání (pro detailnější informace např. Soukup et al., 2008). K tématu rozřešení otázky hlavního činitele kraniofaciální diversity se zatím bohužel nevyjadřuje žádná publikace do detailu. Otázkou tedy stále zůstává, která část během embryonálního vývoje řídí kraniofaciální diversitu. 23

24 Závěr 5. Závěr Ze zmíněných kapitol vyplývá, že buňky neurální lišty jsou jednou z klíčových evolučních novinek nás obratlovců, díky kterým jsme se stali poměrně úspěšnou skupinou živočichů. Neurální lišta má veliký počet buněčných derivátů a z hlediska mého dalšího studia jsou nejdůležitější skeletogenní deriváty podílející se na kraniogenezi, tedy chrupavky a kosti. V této práci se snažím shrnout základy informace o neurální liště, o jejím vzniku, migraci a derivátech. Pokouším se sepsat i stručný přehled základních molekul nezbytných pro funkci neurální lišty. V další kapitole je shrnuta morfologie lebky a pokusil jsem se úvest krátký přehled o evolučních náhledech na tuto obratlovčí evoluční novinku. Cílem této práce je popsat podíl příspěvku buněk neurální lišty při tvorbě kraniofaciální morfogeneze lebky. Nicméně při studiu různých článků jsem narazil i na jiný druh interpretace vzniku kraniofaciální diversity. V těchto článích byla zdůrazňována role okolního epitelu, jakožto zprostředkovatele hlavních signálů pro buňky neurální lišty a buňky neurální lišty byly chápány pouze jako pasivní činitel morfogeneze. Z toho lze usuzovat, že na kraniofaciální diversitu bylo ve většině studií nahlíženo pouze z jedné strany, anebo nebyly tyto studie dosti podrobné, přestože se ví o důležitosti vzájemných interakcí mezi mesenchymem a epitelem. Proto by bylo velice zajímavé pokusit se rozklíčovat hlavního činitele diversity v obličejové části lebky. Nicméně je nutné zdůraznit, že buňky neurální lišty jsou pro obratlovce zásadní novinkou, díky které vznikly nové tkáně, které jsou specifické pouze pro nás obratlovce. Tato bakalářská práce mi posloužila jako teoretický úvod do studia neurální lišty a především slouží jako základ pro mou diplomovou práci. V té bychom se chtěli zaměřit na komparativní a deskriptivní analýzu buněk neurální lišty a rádi bychom se pokusili vyjádřit k vzájemné interakci buněk neurální lišty a okolního epitelu při morfogenezi. 24

25 Seznam použité literatury 6. Seznam použité literatury 6.1 Přímé citace Abzhanov A., Protas M., Grant B. R., Grant P. R. & Tabin C. J., Bmp4 and morphological variation of beaks on Darwin s finches. Science 305: Abzhanov A., Kuo W. S., Hartmann Ch., Grant B. R., Grant P. R. & Tabin C. J., The calmodulin pathway and evolution of elongated beak morphology in Darwin s finches. Nature 442: Carroll S.B., Nekonečné, nesmírně obdivuhodné a překrásné. Praha: Galileo Cerny R., Horacek I. & Olsson L., The trabecula cranii: development and homology of an enigmatic vertebrate head structure. Animal Biology 56: Cerny R., Lwigale P., Ericsson R., Meulemans D., Epperlein H.-H. & Bronner-Fraser M., Developmental origins and evolution of jaws: new interpretation of maxillary and mandibular. Developmental Biology 276: Cerny R., Cattell M., Sauka-Spengler T., Bronner-Fraser M., Yu F. & Meulemans Medeiros D., Evidence for the prepattern/cooption model of vertebrate jaw evolution. PNAS 107: Depew M. J. & Simpson C. A., st Century neontology and the comparative development of the vertebrate skull. Developmental dynamics 235: Donoghue P. C. J., Graham A. & Kelsh R. N., The origin and evolution of the neural crest. BioEssays 30: Gaisler J. a Zima J., Zoologie obratlovců. Vydání 2., přepracované. Praha: Academia 25

26 Seznam použité literatury Gans C. & Northcutt., Neural crest and the origin of vertebrates: a new head. Science 220: Gilbert S.F., Developmental biology. Eight edition. Sunderland: Sinauer Associates, Inc., Publishers Hall B. K., The neural crest as a fourth germ layer and vertebrates as quadroblastic not triploblastic. Evolution & Development 2: 3-5 Hall B. K., The neural crest and neural crest cells in vertebrate development and evolution. Springer Huang X. & Saint-Jeannet J.-P., Induction of the neural crest and the opportunities of life on the edge. Developmental Biology 275: 1-11 Jeffery W. R., Strickler A. G. & Yamamoto Y., Migratory neural crest-like cells form body pigmentation in a urochordate embryo. Nature 431: Kardong K. V., Vertebrates: Comparative anatomy, function, evolution. Fifth edition. McGraw-Hill Kulesa P., Ellies D. L. & Trainor P. A., Comparative analysis of neural crest cell death, migration, and function during vertebrate embryogenesis. Developmental Dynamics 229: Kuratani S., Matsuo I. & Aizawa S., Developmental patterning and evolution of the mammalian viscerocranium: Genetic insights into comparative morphology. Developmental Dynamics 209: Kuratani S., Craniofacial development and the evolution of the vertebrates: the old problems on a new background. Zoological Science 22: 1-19 Kurosaka S. & Kashina A., Cell biology of embryonic migration. Birth Defects Research 84:

27 Seznam použité literatury LaBonne C. & Bronner-Fraser M., Neural crest induction in Xenopus: evidence for a two-signal model. Development 125: Le Dourain N. M. & Kalcheim C., The neural crest, second edition. Cambridge: Cambridge University Press Lumsden A., Sprawson N. & Graham A., Segmental origin and migration of neural crest cells in the hindbrain region of the chick embryo. Development 113: Mallatt J., The origin of the vertebrate jaw: Neoclassical ideas versus newer, developmental-based ideas. Zoological science 25: Meulemans D. & Bronner-Fraser M., Gene-regulatory interactions in neural crest evolution and development. Developmental cell 7: Mitgutsch Ch., On Carl Gegenbauer s theory on head metamerism and the selection of taxa for comparisons. Theory in Biosciences 122: Mitgutsch Ch., Piekarski N., Olsson L. & Haas A., Heterochronic shifts during early cranial neural crest cell migration in two ranid frogs. Acta Zoologica 88: 1-10 Monsoro-Burq A.-H., Fletcher R. B. & Harland R. M., Neural crest induction by paraxial mesoderm in Xenopus embryo requires FGF signále. Development 130: Morris-Kay G. M., Derivation of the mammalian skull vault. Journal of Anatomy 199: Murray S. A. & Gridley T., Snail family genes are required for left-right asymmetry determination, but not neural crest formation, in mice. PNAS 103: Northcutt R. G., The new head hypothesis revisited. Journal of experimental zoology 304:

28 Seznam použité literatury Olsson L., Ericsson R. & Cerny R., Vertebrate head development: Segmentation, novelties, and homology. Theory in Biosciences 124: Parsons K. J. & Albertson R. C., Roles for Bmp4 and CaM1 in shaping the jaw: Evo- Devo and beyond. Annual Review of Genetics 43: Santagati F & Rijli F., Cranial neural crest and the building of the vertebrate head. Nature 4: Sauka-Spengler T., Meulemans D., Jones M. & Bronner-Fraser M., Ancient evolutionary origin of the neural crest gene regulatory network. Developmental Cell 13: Sauka-Spengler T. & Bronner-Fraser M., A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nature reviews molecular cell biology 9: Shigetani Y., Sugahara F., Kawakami Y., Murakami Y., Hirano S. & Kuratani S., Heterotopic shift of epithelial-mesenchymal interactions in vertebrate jaw evolutions. Science 296: Shigetani Y., Sugahara F. & Kuratani S., A new evolutionary scenario for the vertebrate jaw. BioEssays 27: Schneider R. A., Neural crest can form cartilages normally derived from mesoderm during development of the avian head skeleton. Developmental Biology 208: Schneider R.A. & Helms J. A., The cellular and molecular origins of beak morphology. Science 299: Soukup V., Epperlein H. H., Horacek I. & Cerny R., Dual epithelial origin of vertebrate oral teeth. Nature 455: Thiery J. P., Acloque H., Huang R. Y. J. & Nieto M. A., Epithelialmesenchymal transitions in development and disease. Cell 139:

29 Seznam použité literatury Tríbulo C., Aybar M. J., Nguyen V. H., Mullins M. C. & Mayor R., Regulation of Msx genes by a Bmp gradient is Essentials for neural crest specification. Development 130: Vickaryous M. K. & Hall B. K., Human cell type diversity, evolution, development, and classification with special reference to cells derived from the neural crest. Biological review 81: Nepřímé citace Chu Y. S., Eder O., Thomas W. A., Slmcha I., Plncet F., Ben-Ze ev A., Perez E, Thiery J. P. & Dufour S., Prototypical Type I E-cadherin and Type II cadherin- 7 mediate very distinct adhesiveness through thein extracellular domains. The Journal of biological chemismy 281: Grant P.R., The ecology and evolution of Darwin s finches. New Jersey: Princeton University Press 29