Přístupy k analýze opticky aktivních látek metodou HPLC

Transkript

1 Přístupy k analýze opticky aktivních látek metodou HPLC Karel Lemr Katedra analytické chemie, Přírodovědecká fakulta Univerzity Palackého tř. Svobody 8, Olomouc lemr@prfnw.upol.cz Zentiva, Praha, 2007

2 Chiralita

3 Chiralita interakce chirálních látek s chirálním prostředím (léčiva, pesticidy, potraviny) případ Thalidomidu S-thalidomide teratogenní, ale s protizánětlivými a imunomodulačními účinky rychlá in-vivo interkonverze separace enantiomerů (HPLC, CE, GC) ale i jinak např. MS O H N O N O O H R(+)-thalidomide O H N O O N H S(-)-thalidomide O

4 Odlišení enantiomerů interakce s chirálním prostředím L + D + 2D LD + DD tří(dvou)bodová interakce (v okolí chirálního centra, relativní síla interakcí, konfigurace a konformace) L D D D * * * * * *

5 Rozpoznání enantiomerů v HPLC detektory optické aktivity derivatizace chirálními činidly chirální aditiva v mobilní fázi chirální stacionární fáze

6 Detektory optické aktivity polarimetrie cirkulární dichroismus magnetooptická rotace (Faradayův efekt)

7 Detektory optické aktivity IBZ Messtechnik

8 Detektory optické aktivity IBZ Messtechnik

9 Derivatizace chirálními činidly L + D + 2D LD + DD Požadavky na derivatizační činidlo stabilní a snadno dostupné v opticky čisté formě při derivatizační reakci nesmí docházet k racemizaci (analytu ani činidla) jednoznačný a kvantitativní průběh derivatizace vhodná je přítomnost chromoforu či fluoroforu v deriv. činidle

10 Derivatizace chirálními činidly funkční skupina -OH -COOH -SH -NH 2 -NHR činidlo 1-(9-fluorenyl)ethylchloroformiát (FLEC) 1-(p-nitrofenyl)ethylamin FLEC o-ftalaldehyd (OPA)+chirální amin FLEC OPA+N-acetyl-L-cystein OPA+N-isobutyryl-L-cystein (i jiný N-acyl-L-cystein)

11 Derivatizace chirálními činidly H CH O C O FLEC CH 3 Cl R2 CHCOOH + NH R1 R2 H CH CH 3 CHCOOH O C N O R1 CHO CHO + H 2 N R* + R1 * SH R1* S N R* OPA chirální amin

12 Derivatizace chirálními činidly Hewlett Packard

13 Chirální aditiva v mobilní fázi tvorba ternárních komplexů (Cu 2+, Ni 2+, L-prolin, L- a D- fenylalanin, N-oktylamid L-prolinu) vznik iontových párů ((+)-10-kafrsulfonová kyselina, (+)-3- brom-10-kafrsulfonová kyselina, chinin) uplatnění vodíkových vazeb (N-acetyl-L-valin terc.butylamaid) použití cyklodextrinu, makrocyklických antibiotik.. Porovnání se stacionárními fázemi

14 Chirální stacionární fáze π-donorové a π-akceptorové fáze (Pirklovy) ternární komplexy cyklodextriny makrocyklická antibiotika cyklické chirální polyethery proteiny a peptidy polysacharidy syntetické polymery

15 Ch.J.Welch:Journal of Chromatography A, 666 (1994) 3-26 π-donorové a π-akceptorové fáze (Pirklovy) dinitrobenzoyl deriváty aminokyselin hydantoinové deriváty

16 π-donorové a π-akceptorové fáze (Pirklovy) využití π-π elektronových interakcí vodíkových vazeb a interakcí dipólů sterických interakcí někdy derivatizace analytu (zavedení π-akceptorové resp. π-donorové skupiny, pokrytí vysoce polárních funkčních skupin) Ch.J.Welch:Journal of Chromatography A, 666 (1994) 3-26 stacionární fáze se širším záběrem i specifické racionální přístup k přípravě stacionární fáze dolaďování její struktury pro daný analyt

17 π-donorové a π-akceptorové fáze (Pirklovy) (3R, 4R)-Whelk-O 1 (3S, 4S)-Whelk-O 1 4-(3,5-dinitrobenzamido)-1,2,3,4-tetrahydrofenanthren

18 π-donorové a π-akceptorové fáze (Pirklovy)

19 Ternární komplexy chromatografie ligandové výměny Tvorba ternárních komplexů [MLX] + A [MLA] + X stacionární fáze - dynamicky pokryté chemicky vázané možnost popsat interakce chirální selektor separované enantiomery (podobně jako u Pirklových stac. fází) pomalá ligandová výměna nízká účinnost separace (vliv teploty a průtoku) V.A. Davankov: Journal of Chromatography A, 666 (1994) 55-76

20 Ternární komplexy chromatografie ligandové výměny V.A. Davankov: Journal of Chromatography A, 666 (1994) 55-76

21 Cyklodextrinové stacionární fáze Astec

22 Cyklodextrinové stacionární fáze Astec

23 Cyklodextrinové stacionární fáze Astec

24 Cyklodextrinové stacionární fáze jedny z nejrozšířenějších - velký počet úspěšně separovaných enantiomerů inkluze interakce dipólů vodíkové vazby π-π elektronové interakce sterické interakce vliv derivatizace cyklodextrinu reverzní fáze normální fáze polární organické fáze

25 Cyklodextrinové stacionární fáze Astec

26 Cyklodextrinové stacionární fáze Astec

27 Makrocyklická antibiotika Vancomycin 18 chirálních center, M.h chirální selektivita pro řadu látek (aminy, estery, amidy, neutrální molekuly) Teicoplanin 23 chirálních center, M.h chirální selektivita pro řadu látek (aminokyseliny, hydroxykarboxylové a karboxylové kyseliny, fenoly, neutrální aromatické látky) Astec

28 Vancomycin - Teicoplanin vzájemně komplementární π-π interakce vodíkové vazby interakce dipólů inkluze sterické interakce elektrostatické interakce reverzní fáze normální fáze polární organické fáze

29 analyt s více než jednou fční skupinou analyt s jednou fční skupinou polární organické fáze CH 3 OH/HAc/TEA 100/1,0/1,0 eluce < 5 min. CH 3 OH/HAc/TEA 100/0,1/0,1 látky se neeluují separace optimalizace HAc/TEA reverzní fáze CH 3 OH/H 2 O 20/80 1% TEAAc, ph 4 normální fáze Hex/EtOH 80/20 eluce < 5 min. CH 3 OH/HAc/TEA 100/0,01/0,01 separace optimalizace HAc/TEA eluce < 5 min. Teicoplanin Astec

30 Teicoplanin Astec

31 Teicoplanin vliv teploty separace diastereoizomerů captoprilu P. K. Owens, L. A. Svensson, J. Vessman: J. Pharm. and Biomed. Anal. 25 (2001)

32 Teicoplanin vliv teploty separace diastereoizomerů captoprilu (0,05% TEAA (ph 3,8), 1,0 ml/min) P. K. Owens, L. A. Svensson, J. Vessman: J. Pharm. and Biomed. Anal. 25 (2001)

33 Ristocetin A K. H. Ekborg-Ott, Y. Liu, D. W. Armstrong:CHIRALITY 10: (1998)

34 Cyklické chirální polyethery tvorba komplexů s vhodným kationtem interakce ion dipól vodíkové vazby rozměry cyklu, analytu vliv substituentů cyklu, analytu separace látek s primární aminoskupinou (m.f. vodná HClO 4 )

35 Proteiny hydrofobní a elektrostatické interakce vodné a vodně organické mobilní fáze široký záběr omezená kapacita kolon hovězí sérový albumin lidský sérový albumin kyselý α 1 -glykoprotein ovomukoid

36 Peptidy vyšší kapacita kolon užší záběr reverzní fáze (hydrofobní a elektrostatické interakce) (analýza peptidů, aminokyselin) normální fáze (vodíkové vazby) (derivatizované aminokyseliny)

37 Polysacharidy Daicel derivatizovaná celulosa a amylosa vliv funkčních skupin příspěvek helikální struktury separace aromatických látek, látek s karbonylovou skupinou, nitrilovou, nitro, hydroxylovou skupinou normální fáze (hexan/alkohol) reverzní fáze

38 Polysacharidy Daicel, Chiral Technologies

39 Syntetické polymery Helikální polymery separace např. aromatických nepolárních látek m.f. methanol, hexan/isopropylalkohol poly(trifenylmethylmetakrylát) poly(difenyl-2- pyridylmethylmetakrylát) Předtištěné polymery polymerace za přítomnosti čistého enantiomeru vhodné látky polymerace enantiomeru monomerní jednotky za přítomnosti racemátu vhodné látky selektivita pro určitý typ látek, chvostování píků

40 Jiné stacionární fáze např. chininové a chinidinové (W. Lindner) M. Lämmerhofer, W. Lindner: J. Chromatogr. A 741 (1996)

41 Daicel, Chiral Technologies Jiné stacionární fáze např. chininové a chinidinové (W. Lindner)

42 Volba chirálního selektoru?!