MELANIN A JEHO FUNKCE

Transkript

1 MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV BOTANIKY A ZOOLOGIE MELANIN A JEHO FUNKCE U ŽIVOČICHŮ I ROSTLIN Bakalářská práce Anna Findurová Vedoucí práce: Mgr. Jiřina Medalová, Ph.D. Brno 2016

2 Bibliografický záznam Autor: Název práce: Studijní program: Studijní obor: Vedoucí práce: Anna Findurová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav botaniky a zoologie Melanin a jeho funkce u živočichů i rostlin Chemie Biologie se zaměřením na vzdělávání Chemie se zaměřením na vzdělávání Mgr. Jiřina Medalová, Ph.D. Akademický rok: 2015/2016 Počet stran: 54 Klíčová slova: melanin; eumelanin; feomelanin; allomelanin; struktura melaninu; melanogeneze

3 Bibliographic Entry Author Title of Thesis: Degree programme: Field of Study: Supervisor: Anna Findurová Faculty of Science, Masaryk University Department of Botany and Zoology Melanin and its Function in Animals and Plants Chemistry Biology with a View to Education Chemistry with a View to Education Mgr. Jiřina Medalová, Ph.D. Academic Year: 2015/2016 Number of Pages: 54 Keywords: melanin; eumelanin; pheomelanin; allomelanin; melanin structure; melanogenesis

4 Abstrakt Tato bakalářská práce je zaměřena na pigmenty melaninového typu, jejichž častá přítomnost u rozmanitých živočišných i rostlinných druhů přináší mnohé výhody. Mezi ty nejvýznamnější patří jeho schopnost fotoprotekce tedy ochrany buněk před negativními účinky UV záření. Melanin se obecně zapojuje do ochrany před patogeny, a pomáhá také organizmům zbavovat se toxických látek v těle a volných radikálů. Polymerní struktura pigmentu umožpuje zvýšení mechanické odolnosti melanizovaných buněk a částí těl organizmů. Některým živočichům melanin usnadpuje termoregulaci. Jiní živočichové používají melanin ve svých povrchových strukturách k maskování. Bakalářská práce zahrnuje popis struktury, syntézy melaninu a jeho uplatnění u jednotlivých skupin organizmů s cílem popsat hlavní rozdíly a analogie.

5 Abstract This bachelor thesis is focused on the pigment of melanin type. It is frequently present in a diverse plants and animals because it is benefitial for them in many ways. One of the most significant benefits is ability to protect cells against the negative effects of UV radiation. Melanin is also involved in protection against pathogens and it also helps organisms to dispose toxic substances and free radicals. Polymer structure of the pigment increases the mechanical resistance of melanised cells and parts of body. Melanin facilitates thermoregulation of some animals. Other animals camouflage themselves by using the melanin in surface structures. Bachelor thesis is focused on description of the melanins structures, syntheses, and their application inorganisms in order to describe the main differences and analogies among them.

6

7 Poděkování Na tomto místě bych chtěla velmi poděkovat vedoucí své bakalářské práce, paní Mgr. Jiřině Medalové, Ph.D., za odborné vedení, ochotu a trpělivost, rady a připomínky, které mi poskytla v průběhu práce na bakalářské práci. V průběhu celého studia mě také velmi podporovala rodina a přítel, jimž bych chtěla také moc poděkovat.

8 Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji bakalářskou práci vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány. Brno 29. dubna 2016 Anna Findurová

9 OBSAH OBSAH ÚVOD MELANIN FUNKCE MELANINU VLASTNOSTI MELANINU ABSORPČÍ VLASTNOSTI REDOXNÍ VLASTNOSTI ANTIBIOTICKÉ VLASTNOSTI CHELATAČNÍ VLASTNOSTI ROZPUSTNOST VÝSKYT MELANINU TŘÍDA SAVCI STRUKTURA MELANINU SAVCŮ SYNTÉZA MELANINU SAVCŮ DEGRADACE MELANINU UPLATNĚNÍ MELANINU U SAVCŮ TŘÍDA PTÁCI STRUKTURA A SYNTÉZA MELANINU PTÁKŮ UPLATNĚNÍ MELANINIU U PTÁKŮ TŘÍDY OBOJŽIVELNÍCI, PLAZI A RYBY STRUKTURA A SYNTÉZA MELANINU OBOLŘIVELNÍKŮ, PLAZŮ A RYB UPLATNĚNÍ MELANINU U OBOJŽIVELNÍKŮ, PLAZŮ A RYB TŘÍDA HLAVONOŽCI STRUKTURA A SYNTÉZA MELANINU HLAVONOŽCŮ UPLATNĚNÍ MELANINU U HLAVONOŽCŮ

10 3. 5 TŘÍDA HMYZ STRUKTURA MELANINU HMYZU SYNTÉZA MELANINU HMYZU UPLATNĚNÍ MELANINU U HMYZU ŘÍŠE HOUBY STRUKTURA MELANINU HUB SYNTÉZA MELANINU HUB UPLATNĚNÍ MELANINU U HUB ŘÍŠE ROSTLINY STRUKTURA MELANINU ROSTLIN SYNTÉZA MELANINU ROSTLIN UPLATNĚNÍ MELANINU U ROSTLIN ŘÍŠE PRVOBUNĚČNÉ ORGANIZMY STRUKTURA MELANINU PRVOBUNĚČNÝCH ORGANIZMŮ SYNTÉZA MELANINU PRVOBUNĚČNÝCH ORGANIZMŮ UPLATNĚNÍ MELANINU U PRVOBUNĚČNÝCH ORGANIZMŮ ANALOGIE A ROZDÍLY SROVNÁNÍ STRUKTURY MELANINU SROVNÁNÍ MELANOGENEZE SROVNÁNÍ UPLATNĚNÍ MELANINU U RŮZNÝCH SKUPIN ORGANIZMŮ ZÁVĚR SEZNAM POUŽÍVANÝCH ZKRATEK SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY

11 1 ÚVOD Melanin je pigment pohlcující světlo. Melanin pojmenoval v roce 1840 švédský chemik J. J. Berzelius. Název pravděpodobně pochází z řeckého melanos černý, proto jako melanin bývají často nesprávně označovány všechny tmavé pigmenty. V povrchových strukturách obratlovců je melanin nejčastěji se vyskytujícím pigmentem. Jeho vlastností využívají také jiné organizmy prvobuněčné organizmy, houby, rostliny i další živočichové. Pigment u těchto organizmů však nemá vždy stejnou strukturu. Způsob syntézy se může lišit enzymy, které se syntézy účastní, ale i výchozími látkami a meziprodukty syntézy. Melanin plní rozdílné funkce u různých organizmů. Cílem této bakalářské práce je shrnout poznatky o struktuře, syntéze a uplatnění melaninu u různých skupin živočichů i rostlin a nalézt analogie a rozdíly ve výše uvedeném. Komerční využití melanin nachází jako složka ochranných krémů, ne však pro svou schopnost pohlcovat záření, ale převážně díky schopnosti likvidovat volné radikály. Pigment také vzbuzuje zájem pro potenciální možnost využití nově získávaných znalostí při léčbě melanomů (Riley, 1997). Studiem melaninu a melanogeneze u živočichů a rostlin lze získat nové poznatky, které je pak možné uplatnit při hledání nových možností léčby melanomů, které často vykazují rezistenci vůči konvenční léčbě, právě kvůli specifickým vlastnostem melaninu. V této práci jsou shrnuty tyto poznatky o melaninu, melanogenezi a uplatnění melaninu u dalších organizmů, nejen u člověka. 11

12 2 MELANIN Melanin je produktem oxidace a polymerizace tyrozinu u živočichů, nebo fenolických látek u rostlin a nižších organizmů. Pigment nemá jednotnou strukturu. Podle struktury rozeznáváme několik hlavních typů melaninu. U živočichů včetně člověka je možné se nejčastěji setkat s eumelaniny a feomelaniny. U rostlin dominuje katecholický melanin nazývaný allomelanin. Pigment má vysokou molekulovou hmotnost díky tomu, že se jedná o polymer. Základní strukturní jednotku melaninu tvoří indolové monomery. V různé míře jsou zastoupeny pre-indolové a chinonové produkty vznikající v průběhu syntézy. Přesná struktura konkrétních typů pigmentů je blíže popsána v kapitolách o struktuře u jednotlivých skupin organizmů. Zkoumání struktury ztěžuje nerozpustnost pigmentu ve vodě a ve většině organických rozpouštědel. Poptávka po melaninu v posledních letech stále stoupá, protože nachází své využití v potravinářském, farmaceutickém, lékařském i kosmetickém průmyslu pro své detoxikační, fotoprotekční a chelatační vlastnosti. Mnoho průmyslových odvětví získává pigment extrakcí z rostlin nebo hub. K průmyslovému využití je vhodnější přírodní než syntetický melanin. Nejčastěji je melanin k průmyslovému využití produkován jedlou houbou Auricularia auricula (Sun et al., 2016a) FUNKCE MELANINU Pigmentace melaninem poskytuje organizmům výhody v mnoha ohledech. U různých skupin organizmů má často velmi rozmanité funkce, i když ve většině případů převažuje funkce ochranná. Pro savce je nejdůležitější jeho schopnost absorbovat ultrafialové a ionizační záření. Absorpcí tohoto záření poskytuje melanin ochranu buněk před degradací způsobenou nebezpečným zářením. Molekulární struktura polymeru umožpuje zvýšení mechanické odolnosti melanizované části těla. Této skutečnosti využívají především ptáci, jejichž peří je vystaveno nepříznivým podmínkám. Jedná se např. o ptáky osidlující pouštní oblasti. Melanizací je peří chráněno nejen proti mechanickému obrušování, ale i proti bakteriální degradaci. 12

13 Opeření díky melaninu získává tmavou barvu. Zejména pro chladnokrevné živočichy má melanin nezastupitelnou roli při pohlcování a přeměně slunečního záření, čímž se podílí na termoregulaci. Nočním živočichům pomáhá s maskováním během jejich noční aktivity. Kryptické zbarvení snižuje pravděpodobnost napadení predátorem (Galván and Solano, 2016). Jako element zvyšující pevnost buněk vystupuje melanin v kutikule hmyzu. Posílení mechanické odolnosti je dosaženo vytvářením sítě proteinů a jejich ochranou před degradací. Působením melaninu může docházet k zániku volných radikálů (Riley, 1997). Melanin nacházející se u rostlin se podílí na pigmentaci rostlinných buněk a díky svým vlastnostem opět zvyšuje pevnost buněk rostlin. Způsobuje barevné změny (tmavnutí) v reakci na mechanické poškození buněk, nebo po napadení rostliny patogenem (Singh et al., 2013). V dalších kapitolách bude pojednáno o jednotlivých funkcích melaninu v souvislosti s konkrétním organizmem VLASTNOSTI MELANINU ABSORPČÍ VLASTNOSTI Mezi mnoha vlastnostmi melaninu nejnápadněji vystupuje schopnost absorpce širokého spektra záření, kterou způsobuje vysoký stupep konjugace (interakce π elektronů se sousední násobnou vazbou) v molekule. Tmavé zbarvení pigmentu je dáno právě absorpcí velmi širokého spektra viditelného záření včetně záření s nízkou kvantovou energií. Pokud dochází k excitaci elektronů z nevazebných do protivazebných π orbitalů, jedná se o nízkoenergetické přechody. Dochází k nim především na vazbách karbonylové funkční skupiny (dvojná vazba uhlík kyslík), které jsou v melaninech hojně přítomné. K absorpci ultrafialové části spektra záření, zahrnující energetický přechod z vazebných do protivazebných π orbitalů, dochází na nenasycených uhlíkových vazbách. Tento přechod z vazebných do protivazebných π orbitalů usnadpuje konjugace umožpující delokaci elektronů. Většina přijaté energie záření se převádí na tepelnou energii. Eumelaniny, pigmenty s vysokou úrovní indolových chinonů, se jeví tmavěji díky silné absorpci červené části spektra. Feomelaniny, světlejší pigmenty žluté až červené barvy, obsahují ve své struktuře 13

14 méně karbonylových funkčních skupin, které zprostředkovávají absorpci záření o nižší frekvenci. Nejnápadnější z těchto pigmentů jsou melaniny červené barvy, v jejichž struktuře se nachází benzothiazoly obsahující síru REDOXNÍ VLASTNOSTI Melaniny, eumelaniny především, vykazují nápadné redoxní účinky. ESR spektroskopií (electron spin resonance spectroscopy) byla zjištěna přítomnost volných semichinonových radikálů. Tyto radikály vznikají delokalizací elektronů mezi ortochinonovými a katecholickými skupinami polymeru melaninu. Melaniny mají schopnost vystupovat v jednoelektronových a dvouelektronových redoxních reakcích. Fotooxidace melaninu, jedna z reakcí vyvolaná absorpcí světla, pozměpuje absorpční vlastnosti pigmentu tak, že zvyšuje množství karbonylových skupin. Tato reakce má za následek okamžité ztmavnutí pigmentu (IPD, tzn. immediate pigment darkening reaction). Produktem fotooxidační reakce je superoxidový radikál ANTIBIOTICKÉ VLASTNOSTI Během syntézy melaninu vznikají jako meziprodukty reaktivní chinony vykazující antibiotické vlastnosti. Evoluční význam ortochinonů s největší pravděpodobností spočívá v jejich vysoké reaktivitě. Antibiotické účinky umožpuje velmi ochotná reakce ortochinonů především s nukleofilními skupinami jako je thio- nebo aminoskupina. Těchto vlastností využívá i imunitní systém hmyzu CHELATAČNÍ VLASTNOSTI Melanin má v organizmech nezastupitelnou roli také pro svou vlastnost pohlcovat nebezpečné volné radikály. Do své struktury dokáže vázat kationty, jedná se především o kationty přechodných kovů, které mohou být nebezpečné (např. rtuť, kadmium). Této vlastnosti melaninu tělo využívá při zbavování se kovů nejen z kůže. Výrazné chelatační vlastnosti melaninu způsobují aniontové karboxylové a deprotonované hydroxylové skupiny obsažené ve struktuře pigmentu (Riley, 1997). Bupky aerobních organizmů mohou být poškozovány v těle vznikajícími superoxidovými anionty 14

15 a peroxidem vodíku (za katalýzy z nich dále mohou vznikat nebezpečné radikály). Na ochraně proti vzniku hydroxylových radikálů se obvykle podílí kataláza, peroxidáza a superoxid dismutáza. Melanin však dokáže vyvázat superoxidy i vzniklé volné radikály (Shivprasad and Page, 1989) ROZPUSTNOST Polární rozpouštědla jako je voda, methanol, aceton, ethanol, ether, ethylacetát a chloroform vykazovala relativně nízkou schopnost melanin rozpustit. Naproti tomu v alkalickém prostředí byla zjištěna relativně vysoká rozpustnost pigmentu. Kyselé prostředí rozpustnost snižuje. Melanin se začíná srážet při hodnotě ph 4. V alkalickém prostředí se pigment dokáže rozpustit a se zvyšující se hodnotou ph se zvyšuje rozpustnost. Působením zředěného peroxidu vodíků dochází k vyblednutí pigmentu (Sun et al., 2016a). Stejného výsledku lze docílit působením manganistanu draselného a následně kyseliny šťavelové (Liu et al., 2013). 15

16 3 VÝSKYT MELANINU 3. 1 TŘÍDA SAVCI STRUKTURA MELANINU SAVCŮ V kůži vystupují dva hlavní typy melaninu, hnědo černý eumelanin a žlutý až červený feomelanin. Syntézu obou typů umožpuje tyrozináza působící na tyrozin. Eumelanin je chemicky velmi odolný a nerozpustný ve většině rozpouštědel (Jimbow et al., 1976). Podílí se na ochraně před UV zářením účinněji než světlejší feomelanin (Videira et al., 2013). Za základní strukturní jednotky eumelaninu jsou považovány DHI (5,6-dihydroxyindolové monomery) a DHICA (5,6-dihydroxyindol-2-karboxylové kyseliny) (Sun et al., 2016b). Ve struktuře dále vystupují IQ (5,6-indolchinony) a SQ (semichinony). Tyto strukturní monomery se spojují a tvoří polymer eumelanin (Perna et al., 2011). Obr. 1: Strukturní model eumelaninu. Jednotky označené U1, U4 a U6 představují DHI. Jednotky s označením U2 a U5 znázorpují DHICA. Jednotka se značením U3 odpovídá IQ, U7 L-dopa a U8 karboxylovanému pyrolu. Šipky naznačují, kde je možnost navázání dalších jednotek (Solano, 2014). 16

17 Ve struktuře feomelaninu vystupuje síra. Do struktury je vnášena reakcí dopachinonu s aminokyselinou obsahující thioskupinu (nejčastěji cystein). Do feomelaninu (a melanocytů syntetizujících feomelanin) je začleněno více glutathionu a cysteinu (obsahujících thiolovou skupinu) než do eumelaninu (a melanocytů syntetizujících eumelanin). Množství feomelaninu v pokožce neodpovídá její výsledné pigmentaci. Ve světlé i tmavé kůži je pozorováno podobné množství feomelaninu (Jimbow et al., 1976). Zatímco tmavý eumelanin se hojně vyskytuje v pigmentových skvrnách a mateřských znamínkách, feomelanin můžeme nacházet v pihách nebo v bradavkách. Přítomnost feomelaninu je běžná u savců a ptáků. Nedávno byla jeho přítomnost dokázána u plazů, ale u jednodušších organizmů je velmi vzácná (Solano, 2014). Obr. 2: Strukturní model feomelaninu. Ve struktuře vystupují dvě základní jednotky - benzothiaziny (označené U1+U2 a U6+U7) a benzothiazoly (U4+U5). Obě jednotky jsou produktem adice cysteinu na L-dopachinon. Jednotka U3 vznikla zacyklením postranního dopachinonového řetězce (někdy zůstává otevřen). Šipky naznačují, kde je možnost navázání dalších jednotek (Solano, 2014). Neuromelanin je pigment se strukturou polymeru vystupující v centrálním nervovém systému. Do struktury polymeru jsou kromě melaninu začleněny složky proteinové, lipidové a kovové ionty (Wakamatsu et al., 2015). V neuromelaninu se objevují indolové i benzothiazinové jednotky, strukturně tedy neuromelanin odpovídá kombinaci eumelaninu a feomelaninu. Jednotky strukturně odpovídající eumelaninu se nacházejí na povrchu neuromelaninových granul, zatímco feomelaninové jednotky se nacházejí v jádrech granul. Se stárnutím mozkové tkáně narůstá množství neuromelaninu, z toho je možné vyvodit, že neuromelanin je odpadním produktem metabolizmu katecholaminů (Solano, 2014). 17

18 SYNTÉZA MELANINU SAVCŮ MELANOCYTY Syntéza melaninu se odehrává ve specializovaných bupkách zvaných melanocyty. Ze sférické bupky melanocytu nepravidelně vybíhají dlouhé výběžky. Zaokrouhlená těla jsou pravidelně umístěny mezi bupkami stratum basale. Vrstvu stratum basale dále tvoří pokožkové bupky zvané keratinocyty, produkující velké množství proteinu keratinu. Poměr mezi počtem buněk vrstvy stratum basale keratinocytů a počtem melanocytů je stálý a závisí na místě výskytu v organizmu. Melanocyt je uchycen na bazální lamině pomocí hemidezmozomů, toto spojení však chybí mezi melanocyty a keratinocyty (Vajner et al., 2012). Obr. 3: Řez kůží melanocyty a keratinocyty (URL 1). Při použití elektronového mikroskopu je možné v bupkách melanocytů spatřit ve velkém počtu drobné mitochondrie, dobře vyvinutý Golgiho komplex, drsné endoplazmatické retikulum s nepříliš dlouhými cisternami, intermediární filamenta, jejichž průměr dosahuje 10 nm a melanozomy v různých fázích vývoje (Junqueira et al., 1997). Na počet melanocytů v kůži nemá vliv lidská rasa. Různý stupep pigmentace je zapříčiněn počtem a velikostí melanocytů, množstvím a typem syntetizovaného melaninu a přenosem a rozmístěním melaninu v keratinocytech. Melanocyty větší, početnější a podlouhlé mají za následek tmavší zbarvení pokožky. 18

19 S jejich tvarem a velikostí souvisí pomalejší degradace v keratinocytech a nápadnější pigmentace. Takováto stavba melanocytů je zachována od narození a není ovlivněna vnějšími faktory (Videira et al., 2013). Kulovitý tvar melanocytů ve vlasech světlé a rezavé barvy se liší od tvaru sférických melanocytů ve vlasech tmavých. Hustota aktivních melanocytů se zvyšuje vystavením pokožky UV záření. Experimenty in vitro potvrdily aktivitu tyrozinázy kromě melanozomů také na hladkém a drsném endoplazmatickém retikulu a na ribozomech (Jimbow et al., 1976). Poprvé se v lidské kůži objevují nediferenciované prekurzory melanocytů melanoblasty v osmém týdnu embryonálního vývoje. Svůj původ mají v neurální liště. Neurální lišta pochází z ektodermálního zárodečného listu (Jimbow et al., 1976). Melanoblasty pocházející z neurální lišty jsou po uzavření neurální trubice přemístěny do míst působení. Bupky dorzální neurální trubice, ektodermu a keratinocytů jsou původci mediátorů, které určují transport melanoblastů, jejich proliferaci a diferenciaci v melanocyty. Mezi tyto určující faktory patří rodina glykoproteinů WNT, endothelin 3 a růstový faktor kmenových buněk (stem cell factor, SCF) (Videira et al., 2013) MELANOMY Kožní melanom je nejobávanější agresivní forma rakoviny kůže. Melanomy vznikají z melanocytů, jsou tedy většinou schopné melanogeneze. Příčinou vzniku melanomů je vystavení buněk pokožky slunečnímu UV záření a následné poškození buněčné DNA. Poškození DNA vede k mutacím, které způsobují aktivaci onkogenů nebo vyřazují z provozu tumorsupresorové geny. Za vznik melanomů je zodpovědné neionizující záření, které nemá dostatek energie k rozbití chemických vazeb, ale vede k excitaci molekul na vyšší energetickou hladinu. Mezi neionizující záření patří i UV záření, které je možné dále rozdělit na UVA (s nejdelší vlnovou délkou nm a nejmenší energií), UVB (s vlnovou délkou nm) a UVC záření (s nejkratší vlnovou délkou nm a nejvyšší energií). Silně mutagenní UVC záření je zastaveno ve stratosféře a na povrch Země nedopadá % dopadajícího UV záření je záření UVA a 5 10 % záření UVB. Záření UVA s delší vlnovou délkou a menší energií proniká do kůže hlouběji (až do dermis), zatímco UVB je převážně absorbováno epidermis. 19

20 Záření UVB je zodpovědné za vznik mutací DNA, potažmo melanomů přímo. UVA se také na karcinogenezi podílí, ale nepřímo např. produkcí reaktivních forem kyslíku (poškození se týkají především guaninu nebo vznikajících pyrimidinových dimerů). Hlavním karcinogenním účinkem UVB záření je vznik CPDs (cyklobutanových pyrimidinových dimerů) a 6-4 PPs (fotoproduktů). Tyto produkty vznikají poté, co DNA absorbuje UVB záření. Častěji vznikají CPDs (66 %), 33 % náleží vzniku PPs. CPDs tvoří cyklobutanový kruh reakcí sousedících skupin tyminu a cytozinu. Jednoduchou vazbou mezi uhlíky (6 a 4) sousedících pyrimidinů vzniká PPs. Takto poškozená DNA není schopná transkripce nebo replikace probíhající při dělení buněk. Pokud nedojde k opravě poškození nebo apoptóze poškozené bupky, mohou vzniknout mutace, které vedou ke ztrátě kontroly nad dělícími se bupkami. Pouze 2 % rakovinových onemocnění kůže je způsobeno kožními melanomy, přesto maligní melanomy vzbuzují bázep pro vysokou úmrtnost v důsledku tohoto onemocnění, které velmi často metastazuje a v pokročilých stádiích je vůči léčbě rezistentní. Rychle rostoucí počet postižených v posledních letech má pravděpodobně na svědomí častější vystavení pokožky UV záření a pokles hladiny ochranného ozonu. Právě ochrana před UV zářením poškozujícím DNA je nejlepším preventivním opatřením proti vzniku melanomu. Po propuknutí nemoci je velmi důležitá rychlá diagnostika a zahájení léčby. Po diagnostice melanomu jsou všechny nádorové bupky chirurgicky odstraněny a ve většině případů se zahajuje chemoterapie nebo radioterapie (Seebode et al., 2016). Melanomy jsou vůči konvenční léčbě jako je chemoterapie velmi rezistentní, nejčastějším důvodem je schopnost melanogeneze a s tím související detoxikace cytotoxických látek pomocí melaninu. Pro závažnost tohoto onemocnění a vysokou úmrtnost je nezbytné hledat další poznatky o mechanizmu a regulace vzniku melanomů. Studium je možné provádět i na modelových organizmech z živočišné a rostlinné říše. Získávání nových poznatků o melaninu a melanogenezi u různých forem organizmů je tedy často motivováno snahou nalézt nové způsoby léčby melanomů. 20

21 MELANOGENEZE Biochemický proces probíhající v melanocytech, během něhož se syntetizuje melanin, se nazývá melanogeneze. Syntéza se uskutečpuje v organelách melanocytů melanozomech. Druh syntetizovaného pigmentu závisí především na dostupnosti substrátů a přítomných enzymech katalyzujících syntézu. Výchozí látku v biochemické reakci představuje tyrozin jedna ze základních proteinových aminokyselin (Cichorek et al., 2013). Katalytický enzym tyrozináza zahajuje hydroxylační reakcí proces syntézy. Tyrozináza je enzym obsahující ve své struktuře dva atomy mědi v aktivním centru enzymu, které se téměř shoduje s aktivním centrem respiračního metaloproteinu hemocyaninu. Aktivní centrum se může vyskytovat se třemi typy struktury atomů mědi mettyrozináza, oxytyrozináza a deoxytyrozináza (Videira et al., 2013). Tyrozináza katalyzuje v průběhu biosyntézy melaninu dvě reakce. První tyrozinázou katalyzovanou reakcí je hydroxylace tyrozinu (krok určující reakční rychlost) a druhou rychlejší reakcí je oxidace vzniklého 3,4-dihydroxyfenylalaninu (L-Dopa) na dopachinon. Oxidace se účastní molekulární kyslík O 2. Substrát poskytuje dva elektrony potřebné k redukci druhého atomu kyslíku. Z redukční reakce vystupuje voda. Dopachinon není ve vodném prostředí stabilní. Na postranním řetězci se nacházející aminoskupina dopachinonu uskuteční intramolekulární 1,4-adici na benzenové jádro, což vede k cyklizaci za vzniku leukodopachromu. Působením další molekuly dopachinonu je leukodopachrom oxidován dále na dopachrom za současné regenerace molekuly L-Dopa z dopachinonu (Kim and Uyama, 2005). Dopachrom samovolnou ztrátou karboxylové skupiny dává vznik 5,6-dihydroxyindolu (DHI). DHI podléhá rychlé oxidaci a polymerizaci zrod tmavšího DHI-melaninu. Pro zrod světlejšího DHICAmelaninu je nezbytná přítomnost dopachrom tautomerázy (TYRP2), jejímž působením na dopachrom se tvoří DHI-2-karboxylová kyselina (DHICA). DHICA-melanin je výsledkem působení enzymu tyrozináze příbuzného proteinu 1 (TYRP1) na DHICA. Tvorba žluto-červeného rozpustného feomelaninu je realizována v případě přítomnosti thiolů jako je cystein, glutathion nebo thioredoxin. Dopachinon (vzniklý hydroxylací tyrozinu na L-Dopa a následnou oxidací) reaguje s cysteinem (neesenciální 21

22 aminokyselina s thiolovou skupinou ve své struktuře). Výsledkem reakce cysteinu s dopachinonem je 3-cysteinyldopa nebo častěji 5-cysteinyldopa, feomelanin je produktem jejich oxidace na alanylhydroxybenzothiazol a polymerace (Cichorek et al., 2013). Syntéza eumelaninu nebo naopak feomelaninu odpovídá aktivitě tyrozinázy a koncentraci cysteinu. Obr. 4: Syntéza eumelaninu a feomelaninu (Solano, 2014). Syntéza neuromelaninu začíná jako u syntézy eumelaninu a feomelnainu u tyrozinu. Tyrozináza však do melanogenze neuromelaninu není zapojena. Na tyrozin působí tyrozin hydroxyláza za vzniku L-Dopa. L-Dopa je přeměněna aktivitou aminokyselinové dekarboxylázy na dopamin a ten působením dopamin-β-hydroxylázy na noradrenalin. Malé množství dopaminu a noradrenalinu může být zoxidováno na odpovídající ortochinony. Dopaminchinon může cyklizací vytvořit DHI nebo se k němu může připojovat L-cystein. Polymerizací vzniklých intermediátů se tvoří neuromelanin (Solano, 2014). 22

23 Obr. 5: Syntéza neuromelaninu (Solano, 2014) REGULACE MELANOGENEZE Melanogeneze je regulována jak vnějšími, tak vnitřními faktory. Vnitřní regulace funkce melanocytů přichází převážně z keratinocytů a fibroblastů (buněk vazivových tkání) a dále jsou melanocyty ve vzájemné komunikaci s endokrinní, imunitní a centrální nervovou soustavou. Jako nejdůležitější vnější faktor působí UV záření přicházející do organizmu z okolního prostředí, které aktivuje dráhu proteinu p53. Pro pigmentaci významný hormon α-msh (melanocyty stimulující hormon) je produkován keratinocyty i melanocyty a má tedy parakrinní nebo autokrinní účinky. Membránovým receptorem α-msh a ACTH (adrenokortikotropního hormonu) v melanocytech je MC1-R (melanokortin 1 receptor). Antagonisticky k α-msh působí ASP (agouti signaling protein) a vazbou na MC1-R tedy brání navázání α-msh. Po napojení α-msh nebo ACTH na MC1-R se zvyšuje hladina camp, které indukuje aktivaci MITF (microphthalmia-associated transcription factor). MITF podporuje expresi různých proteinů zapojených do melanogeneze včetně tyrozinázy, která 23

24 podmipuje syntézu eumelaninu, zatímco po navázání ASP na MC1-R převažuje následná syntéza feomelaninu. Produkce enzymů vystupujících v procesu melanogeneze je usměrpována proteinem MATP (membrane-associated transporter protein). Transport melanozomů z oblasti kolem jádra do dendritů melanocytů zajišťují proteiny asociované s mikrotubuly kinezin a dynein. Mezi vnitřní faktory ovlivpující melanogenezi se řadí také ET-1 (endothelin-1) nebo SCF. ET-1 se na regulaci melanogeneze podílí aktivací tyrozinázy a také stimulací proliferace melanocytů a tvorby dendritů. Zvyšuje afinitu α-msh k MC1-R. SCF způsobuje aktivaci MITF a tím zvyšuje transkripci enzymů podílející se na melanogenezi. ET-1, SCF spolu s IL (interleukiny) a GM-CSF (faktor stimulující kolonie granulocytů makrofágů) tedy podporují melanogenezi vyvolanou účinky UV záření (Park et al., 2009). UV záření způsobuje aktivaci tumor supresorového proteinu p53. Na aktivaci p53 reaguje keratinocyt expresí POMC (proopiomelanokortinu). POMC působí zejména v hypofýze, ale mohou být syntetizovány také v keratinocytech. POMC štěpí karboxypeptidáza za vzniku β-endorfinů, ACTH a α-msh (Cui et al., 2007; Kondo and Hearing, 2011; Videira et al., 2013). Obr. 6: Účast MC1-R na regulaci melanogeneze (Rosenkranz et al., 2013). 24

25 ZRÁNÍ MELANINOVÝCH GRANUL Vyzrávání melaninových granul v melanocytech lze rozdělit do čtyř stádií. V prvním stádiu se tvoří váček s membránou - premelanozom. Enzym tyrozináza zahajuje svou aktivitu. Uvnitř váčku se začíná tvořit materiál s jemně zrnitou strukturou. Molekuly tyrozinázy jsou pravidelně uspořádány na proteinové matrix, na obvodu váčku to naznačují elektrondenzní vlákna. Ve druhém stádiu už je váček nazýván melanozomem. Uvnitř melanozomu ovoidního tvaru leží filamenta. Mohou být rozložena rovnoběžně, nebo s patrným příčným pruhováním o periodicitě průměrně 10 nm. Probíhá depozice melaninu na proteinové matrix. Třetí stádium je charakteristické ztrátou jemné periodické struktury. Příčinou je intenzivní tvorba melaninu. V posledním stádiu melanin zcela vyplnil melanozom. Aktivita tyrozinázy ustává. Ultrastruktura melanozomu chybí. Melaninová granula jsou tedy melanozomy zralé, zcela zaplněné melaninem. Zralá melaninová granula elipsoidního tvaru dosahují délky 1 μm a průměru 0,4 μm. Po dozrání se melaninová granula transportují do keratinocytů. Transport zprostředkovávají dlouhé výběžky cytoplazmy melanocytů. Proces přechodu granul z melanocytů a jejich vstupu do keratinocytů se nazývá cytokrinní sekrece a jeho mechanizmus ještě není plně objasněn. Pro transport bylo navrženo několik možných způsobů. Jedním z nich je membránové spojení melanozomu s keratinocytem pomocí nanotubulárních filopodií a přechod melanozomů mezi nimi. Dalším možným způsobem je uvolnění melanozomu z melanocytu a následná fagocytóza melanozomu keratinocytem. Keratinocyt by také mohl fagocytovat celou špičku dendritu melanocytu, kde se melanozomy nacházejí. Nověji popsaný způsob přenosu zahrnuje uvolnění melaninových globulárních jednotek, obsahujících několik melanozomů, z různých částí dendritu melanocytu do extracelulárního prostoru. Z extracelulárního prostoru je jednotka pohlcena keratinocytem a uvnitř keratinocytu dochází k postupné degradaci membrány globulární jednotky a rozmístění melanozomů v keratinocytu. V keratinocytech se nevyskytují granula náhodně, ale shlukují se v oblasti nad jádrem 25

26 bupky. Tady je jejich funkcí ochrana DNA dělících se buněk před nebezpečným UV zářením. Úlohou melanocytů je tedy syntéza melaninových granul a jejich transport. Ve výsledku převyšuje množství melaninu v keratinocytech množství v melanocytech (Ando et al., 2012) DEGRADACE MELANINU Pigment melanin je jedním ze čtyř faktorů udávajících barvu lidské kůže. Dalšími faktory jsou karotenoidy, okysličený hemoglobin a redukovaný hemoglobin v kapilárách a venulách. Karotenoidy jsou původci žlutého zbarvení, okysličený hemoglobin dodává pokožce červené zabarvení, redukovaný hemoglobin zbarvení do modra a melanin umožpuje hnědé zbarvení (Junqueira et al., 1997). Rozdílnou barvu kůže způsobuje nejen odlišný počet melaninových granul obsažených v keratinocytech, ale také rozdílná rychlost degradace granul pomocí lyzozomů (organel obsahujících hydrolytické enzymy) (Vajner et al., 2012). Druh enzymů podílejících se na degradaci melaninových granul není přesně znám, ale s velkou pravděpodobností s rozkladem souvisí aktivita kyselé fosfatázy (jeden z enzymů skladovaných v lyzozomech). Vyplývá to z přítomnosti fosfatázy ve vakuolách obsahujících rozložené části melanozomů a jemných zrn patrně pocházejících z rozkladu melaninu. Pokud tyto vakuoly dosáhnou až ke zrohovatělé vrstvě, membránu často ztrácí a jejich obsah vyprázdněný do okolí jednotlivé melanozomy degraduje. Degradace může probíhat také intramolekulárně uvnitř melanocytu. Po vystavení kůže UV záření dochází k silné pigmentaci, pak například zde může následně docházet k degradaci intramolekulárně (Jimbow et al., 1976). 26

27 UPLATNĚNÍ MELANINU U SAVCŮ PŘÍTOMNOSTI MELANINU V EPIDERMIS Epidermis je nejsvrchnější vrstvou kůže. Nejdůležitější funkcí melaninu zde je obrana buněk před poškozením UV zářením. Pigmentem, který prostupuje stratum basale, je eumelanin. O barvě kůže jedince přednostně rozhoduje množství melaninu. Viditelná změna barvy zapříčiněná melaninem nastává až po transportu melaninu z buněk vzniku melanocytů do keratinocytů, kde je melanin skladován. Melanocyty a keratinocyty dohromady vytváří epidermální melaninové jednotky. Melaninovou jednotku tvoří 1 melanocyt a přibližně 36 keratinocytů, do kterých melanocyt vysílá melaninová granula (Jimbow et al., 1976). Epidermální melaninová jednotka podléhá regulaci přilehlého parakrinního systému. Obr. 7: Epidermální melaninová jednotka (Cichorek et al., 2013). Opálení pokožky znamená dvoustuppový proces. V prvním kroku dochází k fyzikálně chemické reakci způsobující tmavnutí již syntetizovaného melaninu a jeho urychlené doručení na určené místo v keratinocytu. Druhým krokem je výrazné navýšení množství melaninu a to rychlou syntézou v melanocytech. Proces opálení zahajuje vystavení pokožky UV záření, jehož vlnová délka se pohybuje v rozmezí nm (Junqueira et al., 1997). 27

28 PŘÍTOMNOST MELANINU V KOŘENI VLASU Vlasy, chlupy a vousy se řadí mezi deriváty epidermis a také mají stejný stavební plán (z tohoto důvodu je dále v práci uváděn pouze vlas). Pigment melanin se zde vyskytuje v části vlasu, která se nachází zanořená v kůži. Rozšířená část kořene vlasu se nazývá vlasová cibulka a právě zde jsou přítomny melanocyty. Aktivita melanocytů určuje barvu vlasů ryšavé vlasy signalizují produkci a ukládání feomelaninu, zatímco v ostatních případech je produkován černohnědý eumelanin. Feochromy (menší a světlejší formy feomelaninu) se v malém množství nalézají ve vlasech narezlé barvy. Z melanocytů jsou melaninová granula přenášena do dřeně a kůry vlasu. Způsob přenosu je shodný jako u přenosu do keratinocytů v epidermis (Vajner et al., 2012) PŘÍTOMNOST MELANINU V DUHOVCE Melanin obsahuje také výběžek cévnatky duhovka. Pigmentové bupky jsou součástí přední plochy duhovky i vaziva, které se nachází pod ní. Značné množství melaninu se též nachází ve vnitřním epitelu, který je součástí zadní plochy duhovky. Výskyt melaninu je zde nezbytný. Zásluhou silné pigmentace světlo prochází dovnitř oka pouze zornicí. Melanin napomáhá ostrému vidění absorpcí zbloudilých světelných paprsků. Melanocyty a jejich množství, nacházející se ve stromatu duhovky, mají na svědomí také barvu očí. Modré oči naznačují mírně pigmentovanou duhovku, se zvyšujícím se počtem pigmentových buněk získává tmavší odstíny barev od zelenomodrého, přes šedou až po hnědou barvu. Růžová barva očí, kterou lze pozorovat u albínů, značí nedostatek pigmentových buněk v duhovce (Junqueira et al., 1997) PŘÍTOMNOST MELANINU V NEURONECH Dalším možným místem výskytu melaninu jsou nervové bupky. Neuromelanin produkuje skupina neuronů katecholaminergního systému. Větší množství neuromelaninu pochází z části středního mozku substantia nigra, v menší míře jej produkuje i locus coeruleus protáhlá skupina buněk ve stěně horní části IV. mozkové komory namodralého vzhledu, způsobeného právě melaninem. V lidském 28

29 mozku je zastoupení neuromelaninu relativně vysoké a klesá u primátů, u jiných druhů savců se neobjevuje. Neuromelanin (pro jeho široký a specifický výskyt v mozku) je intenzivně studován v souvislosti s apoptózou a neurodegenerací spojených s Parkinsonovou chorobou (Solano, 2014). Některá neurodegenerativní onemocnění souvisí s nadměrným ukládáním kovů v mozku (např. železa nebo mědi, které působí ve vysokých koncentracích toxicky). Mezi vlastnosti neuromelaninu totiž patří schopnost vázat potenciálně toxické molekuly a kovy, tedy i železo (díky chelatačním schopnostem neuromelaninu vzniká stabilní komplex). Také vysoká koncentrace dopaminu může způsobovat degradaci neuronů. Zakomponování dopaminu do struktury neuromelaninu během jeho syntézy zabrapuje nežádoucí akumulaci dopaminu v mozku (Zucca et al., 2015) PŘÍTOMNOST MELANINU VE VNITŘNÍM UCHU Zevní stěnu blanitého hlemýždě vnitřního ucha pokrývá vaskularizovaný epitel stria vascularis obsahující melanocyty. Melanocyty hrají důležitou roli už při vývoji hlemýždě vnitřního ucha. Nepřítomnost, nebo poškození melanocytů během vývoje může způsobovat poruchy struktury i funkce hlemýždě. Vyvinutý hlemýžď dále nevyžaduje melanocyty pro svou správnou funkci. Melanin však chrání hlemýžď před následky ototoxicity (onemocnění uší způsobené vyšší koncentrací cizích látek v organizmu, např. léků). Melanin totiž dokáže nežádoucí látky vázat do své struktury a vypouštět je postupně ve snížených koncentracích (Tachibana, 1999) PŘÍTOMNOST MELANINU V DALŠÍCH ČÁSTECH TĚLA Melaninová granula nalezená v srdečním svalu mohou mít několik funkcí, ale přítomnost pigmentů v srdečním svalu patrně není nezbytná. Pozitivní vliv melanocytů na funkci atrioventrikulárních chlopní může být způsoben zlepšením jejich elastických vlastností. Srdci mohou prospívat také protizánětlivé, antibakteriální a cytotoxické vlastnosti melaninu (Reyes-Moya et al., 2015). Melaninová granula byla nalezena také v sítnici, adipocytech, nadledvinkách (medula a zona reticularis), játrech, svalech a střevech (Cichorek et al., 2013). 29

30 Granula mohou obsahovat i neosvětlené části těla jako je orální nebo vaginální sliznice, dýchací ústrojí a trávicí trakt. Nacházející se zde pravděpodobně pro své antibakteriální vlastnosti a schopnosti vyvazovat toxické látky (Césarini, 1996). Za zvláštnost lze považovat to, že melanin nacházející se např. v bupkách sítnice nebo adipocytech je syntetizován přímo těmito bupkami TŘÍDA PTÁCI STRUKTURA A SYNTÉZA MELANINU PTÁKŮ Ve většině ptačího opeření nacházíme směs eumelaninů a feomelaninů. Struktura a syntéza eumelaninu a feomelaninu byla popsána v kapitole týkající se savců (kapitoly a ). Melanin objevující se v opeření drůbeže a jiných ptáků spadá do skupiny feomelaninů. Menší formy feomelaninu nalézajícího se u slepičího plemene hempšírka se nazývají trichochromy nebo feochromy. Feochromy se získávají dimerizací dvou benzothiazinů (vzniklých oxidací 5-cysteinyldopa). Míra zastoupení těchto pigmentů je malá a také barva je ještě světlejší než barva většího feomelaninu (Solano, 2014). Obr. 8: Strukturní model feochromu. Molekula má strukturu dimeru složeného ze dvou benzothiazinových jednotek (Solano, 2014). Hypopigmentace opeření u bílých kuřat Leghorn je způsobena nadměrnou intramolekulární degradací melanozomů uvnitř melanocytu. Degradace melanozomu může vést až k rozkladu samotného melanocytu (Jimbow et al., 1976). 30

31 UPLATNĚNÍ MELANINIU U PTÁKŮ Třída ptáků dává na odiv světu nejvýraznější a nejpestřejší zbarvení v živočišné říši. Ptáci spoléhají na vizuální signalizaci více než na jiné komunikační podněty. Pigment se nachází nejen v opeření. Méně často se objevuje i v neopeřených částech pokryvu těla ptáků (Galván and Solano, 2016). Eumelaniny a feomelaniny jsou jedním z faktorů určujících barvu opeření, případně vzor na opeření. Kromě pigmentů jsou za barvu peří zodpovědné fyzikálně optické jevy. Melanocyty se podílejí na konečné struktuře ptačího opeření, exportují melanozomy do větví a paprsků per. Tvorba a přesun melanozomů z melanocytů probíhá před keratinizací pera. Melanizovaná pera jsou odolnější vůči mechanickému opotřebení. Struktura polymeru pigmentu a jeho vlastnosti (nerozpustnost téměř ve všech rozpouštědlech, vysoká molekulová hmotnost) umožpuje zvyšovat mechanickou odolnost pigmentovaných částí organizmu. Pigmentované opeření je také odolnější vůči bakteriálnímu rozkladu (Straker, 2016). Příkladem může být pigmentace sovy pálené, která se vyznačuje značnou variabilitou. Feomelanin určuje barevný tón od tmavě načervenalé až po bílé zbarvení, kdy feumelanin zcela chybí. Množství eumelaninu rozhoduje o vzoru a velikosti skvrn, ukazujících se na opeření. Pigmentem ovlivněné zbarvení opeření je dáno geneticky, vliv prostředí je zanedbatelný. Zajímavý je experiment ukazující, že jedinci s menším podílem eumelaninu a vyšším podílem feomelaninu mají větší apetit. Pokud mají jedinci dostatečný přístup k potravě, na váze rychleji přibývají ti, kteří mají více feomelaninem pigmentované peří, než ti méně zbarvení. Mláďata sovy pálené se vyznačují vzácným chováním. Sourozenci v hnízdě se dělí o potravu. Tmavěji feomelaninem zbarvená mláďata se dělí o potravu ochotněji, než ta světle zbarvená (Roulin et al., 2012). Ptáci mají zvláštní výrůstek uvnitř oka zvaný vějířek (pecten). Vějířek začíná poblíž vstupu zrakového nervu a ční do prostoru vyplněného sklivcem. Jeho hlavní funkcí je výživa sítnice. Migrující ptáci se na svých cestách musejí vyrovnávat s vysokými ztrátami energie, žízní, hladem nebo hypoxií. Tito ptáci mají vějířek zvětšený a silně pigmentovaný. Vějířek s melaninem by mohl ptákům pomáhat vyrovnávat energetické 31

32 a nutriční ztráty pomocí přeměny světla na metabolickou energii, kterou mohou využít k recyklaci metabolitů. Tento poznatek je extrémně důležitý, protože existuje dogma, že živočichové nedokážou zpracovávat světelnou energii, kdežto tento příklad ukazuje, že za jistých podmínek to možné je (Goodman and Bercovich, 2008) TŘÍDY OBOJŽIVELNÍCI, PLAZI A RYBY STRUKTURA A SYNTÉZA MELANINU OBOLŘIVELNÍKŮ, PLAZŮ A RYB Převážná část pigmentů nacházejících se u obojživelníků, plazů a ryb se řadí mezi eumelaniny (u želv byla odhalena přítomnost feomelaninu) (Solano, 2014). Struktura a syntéza eumelaninu a feomelaninu byla popsána v kapitole týkající se savců (kapitoly a ) UPLATNĚNÍ MELANINU U OBOJŽIVELNÍKŮ, PLAZŮ A RYB U obojživelníků se po syntéze v melanocytech melanin shromažďuje ve velkých bupkách naplněných pigmentem melanoforech. Pokud dojde k nahromadění pigmentu v melanoforu, tělo živočicha zbledne, zatímco při rozptýlení pigmentu dochází k tmavnutí pokožky. Melanin zde tedy zastává funkci maskovací, případně funkci ozdobnou. Změna zbarvení přesunem pigmentů v rámci melanoforů je řízena hormonálně (Césarini, 1996). Hormon MCH (melanin concentrating hormone) nese zodpovědnost za rychlý a vratný transport do určitých oblastí kůže živočicha. Aktivita MCH u obojživelníků mnohonásobně převyšuje aktivitu u savců. Hormon α-msh regulující melanizaci je u obojživelníků stejně důležitý jako u ptáků a savců. Eumelanin je schopný absorbovat sluneční záření a až 90 % tohoto záření přeměnit na tepelnou energii. Této vlastnosti využívají především studenokrevní živočichové při termoregulaci (Solano, 2014). 32

33 3. 4 TŘÍDA HLAVONOŽCI STRUKTURA A SYNTÉZA MELANINU HLAVONOŽCŮ Eumelanin produkovaný sépiemi nese název sepiamelanin. Hojně se objevuje v inkoustu nejen sépií, ale také chobotnic, olihní a jiných hlavonožců. Sepiamelanin je nepravidelný heteropolymer se začleněnými indolovými a karboxylovanými pyrolovými jednotkami. Sepiamelanin se dá získat ve velkém množství poměrně snadno a proto se stal modelovou látkou pro studium struktury a vlastností eumelaninu (Solano, 2014). Zařazení sepiamelaninu mezi eumelaniny podporuje složení pigmentu. Struktura pigmentu se skládá ze 75 % z monomeru DHICA a z 20 % z monomeru DHI a dále z některých dalších látek (Xin et al., 2015) UPLATNĚNÍ MELANINU U HLAVONOŽCŮ Sepiamelanin vykazuje výraznější chelatační vlastnosti než kterýkoliv jiný melanin (Solano, 2014). Na obranu vypouštěný inkoust má podobu bezbarvé plazmy s obsahem granul v ní rozptýlených. Granula dodávají inkoustu tmavé zbarvení. Pro svoje vlastnosti a efektivitu v obraně měkkýšů by mohl pigment sehrát roli ve vývoji látky, vypouštěné na obranu proti žralokům (Riley, 1997) TŘÍDA HMYZ STRUKTURA MELANINU HMYZU Velká většina pigmentu hmyzu se strukturně řadí do skupiny mezi eumelaniny. Přesto se v kutikulách hmyzu objevuje i malé množství feomelaninu, naznačuje to obsah síry a dusíku ve struktuře některých pigmentů (Xin et al., 2015). Melanocyty se v těle hmyzu neobjevují. Někteří zástupci hmyzu (např. octomilky) organely obsahující pigment obsahují, tento pigment ale není melanin. 33

34 SYNTÉZA MELANINU HMYZU Syntézu melaninu zahajují, nebo se na ní podílejí krvinky nebo hemocyty. Melanogeneze, zahájená v důsledku napadení organizmu parazitem, je místně velmi specifická. Enzym fenoloxidáza u hmyzu zastává stejnou funkci jako tyrozináza v melanogenezi savců. Přítomnost fenoloxidázy byla zjištěna v hemolymfě a hemocytech. K aktivaci inaktivní formy enzymu je nutná aktivace proteázou. Aktivace je reakcí na infekci nebo poranění (Nappi and Christensen, 2005). Působením tohoto enzymu na tyrozin vzniká L-dopa, dekarboxylací přecházející na dopamin. Z dopaminu N-acetyltranferáza dává vznik N-acetyldopaminu (NADA). NADA je specifickým prekurzorem syntézy melaninu u hmyzu. Z NADA se přes chinonové formy tvoří hlavní sklerotizační jednotka 1,2-dehydro-N-acetyldopamin (DeNADA). DeNADA může znovu podstoupit reakci s fenoloxidázou a výsledkem je vznik polymeru pigmentu zpevpujícího a ztmavujícího kutikulu (Solano, 2014). Obr. 9: Syntéza hmyzího melaninu (Solano, 2014). 34

35 UPLATNĚNÍ MELANINU U HMYZU Obratlovci využívají na svou obranu proti patogenům mechanizmy imunity vrozené i získané. Hmyz disponuje pouze vrozenou imunitou. Hmyz je přenašečem mnoha chorob, mezi které patří malárie, lymfatická filariáza, africká tripanozomáza, Chagasova choroba, leishmanióza, onchocerkóza, horečka dengue nebo žlutá zimnice. Parazité způsobující tyto nemoci jsou velmi dobře geneticky vyvinuti a jsou schopni přežít u dvou různých hostitelů hmyz i člověk. Imunitní odpověď hmyzu využívá pro boj s parazity mechanizmus syntézy pigmentu melaninu. Melanogeneze se odehrává v hemocoelu. Melanizace často doprovází proces fagocytózy a pouzdření. Na povrchu kutikuly se pigment objeví při narušení povrchové struktury patogenem. Pigmenty se mohou objevovat v blízkosti povrchu při proniknutí patogenu do organizmu. Meziprodukty melanogeneze mají schopnost reagovat s reaktivními formami kyslíku a zvyšují tak cytotoxickou aktivitu. Během fagocytózy bakterií u komárů dochází k syntéze melaninu v oenocytech (Nappi and Christensen, 2005). Enzym fenoloxidáza se u hmyzu uplatpuje nejen během melanogeneze, ale podílí se na vývoji a obraně hmyzu. Enzym hraje roli při hojení ran, pouzdření parazitů nebo sklerotizaci a tvorbě pevné kutikuly. Inhibitory tyrozinázy jsou zkoumány v souvislosti s vývojem alternativních insekticidů (Kim and Uyama, 2005) ŘÍŠE HOUBY STRUKTURA MELANINU HUB U hub se melanin nachází v buněčných stěnách v několika koncentrických vrstvách. Vrstvy dosahují tloušťky přibližně 100 nm. U hub je možné se setkat s několika typy pigmentu GHB-melaninem (glutaminylhydroxybenzen-melaninem), DHN-melaninem (1,8-dihydroxynaftalen-melaninem) a vzácněji se vyskytujícím pyomelaninem. DHN-melanin se běžně vyskytuje u stopkovýtrusných a vřeckovýtrusných hub. Mycelium stopkovýtrusných není melanizováno. Syntéza DHN-melaninu je jedním z faktorů určujících patogenitu těchto hub. Největší koncentrace pigmentu se objevuje 35

36 v konidiích (nepohlavně vzniklých sporách) zbarvených šedo-hnědě (Schmaler-Ripcke et al., 2009). Schopnost syntetizovat nejen DHN-melanin, ale také pyomelanin byla zjištěna např. u vřeckovýtrusné patogenní houby Aspergillus, způsobující infekční onemocnění zvané aspergilóza. Pyomelanin je syntetizován uvnitř buněk a tmavá barva mycelií poukazuje na hromadící se pigment na povrchu hyf. Pyomelanin je nažloutlý feomelaninu podobný pigment (Solano, 2014). Ve struktuře pyomelaninu, též označovaného jako alkaptomelanin, vystupuje síra. Od allomelaninu se liší obsahem dusíku. Pyomelanin vyniká mezi ostatními přírodními melaniny svou vysokou termální stabilitou, ta pravděpodobně souvisí se stupněm polymerace melaninu (Gómez-Marín and Sánchez, 2010). Stopkovýtrusná holubinka produkuje melanin, řadící se do skupiny eumelaninů, nazývaný GHB-melanin s odlišnou melanogenezí než eumelanin savců. Pigment nalezený u vřeckovýtrusného lanýže byl identifikován jako DHN-melanin. Nalezen byl jak ve vnitřní, tak ve vnější vrstvě plodnic lanýže (De Angelis et al., 1996). Druh melaninu u některých hub není přesně definován. Ve struktuře pigmentu se objevovala síra jako u feomelaninu, ale podle indolových jednotek polymeru se jedná spíše o eumelanin. Přítomnost síry může být dána začleněním thiolové skupiny na struktury eumelaninu (Solano, 2014) SYNTÉZA MELANINU HUB Tyrozináza má podobu tetrameru s lehkou a těžkou podjednotkou a má stejnou úlohu jako tyrozináza u savců zahajuje melanogenezi (Kim and Uyama, 2005). Tyrozináza produkovaná stopkovýtrusnou pečárkou je celosvětově laboratorně využívána pro svou vysokou aktivitu. Výchozí látkou při syntéze DHN-melaninu je acetyl-coa. Enzym acetyl-coa karboxyláza zprostředkovává karboxylaci acetyl-coa na malonyl-coa. Malonyl-CoA vystupuje jako substrát pro systém reakcí katalyzovaných pentaketidovými syntázami a produktem těchto reakcí je 1,3,6,8-tetrahydroxynaftalen, ze kterého se formuje hydratačními a dehydratačními reakcemi až 1,8-dihydroxynaftalen (DHN). 36

37 Působením enzymu lakázy na DHN se tvoří naftalenchinon. Vzájemnými reakcemi naftalenchinonů a DHN vznikají první dimery a z nich DHN-melaninové polymery (Solano, 2014). Obr. 10: Syntéza DHN-melaninu (Solano, 2014). Prekurzorem GHB-melaninu je glutaminylhydroxybenzen (GHB) vznikají reakcí aminofenolu a kyseliny glutamové. Tyrozináza v prvním kroku GHB oxiduje na glutaminyldihydroxybenzen (GDHB) a v druhém kroku GDHB na glutaminylbenzochinon (GBQ). Před konečnou polymerizací odchází kyselina glutamová a vzniká GHB-melanin. Obr. 11: Syntéza GHB-melaninu (Solano, 2014). 37

38 UPLATNĚNÍ MELANINU U HUB Melanin obsahovaly houby už v období křídy, dokládá to jeho přítomnost v nalezených sporách plísní v sedimentech. Houby využívající vlastností melaninu obývají prostředí, která jsou často pro mnohé jiné druhy organizmů neobyvatelné. Výzkum melaninu syntetizovaného houbami podpořil nález hub rostoucích po stěnách reaktoru v Černobylu a v okolní půdě. Toto prostředí vykazovalo vysokou úrovep radioaktivního záření. Přítomnost melaninu chrání houby nejen před slunečním zářením, ale také před ionizujícím zářením. Přestože prostředí vykazující radioaktivitu obývají převážně organizmy obsahující melanin, melanin jimi není syntetizován primárně jako ochrana před ionizujícím zářením. Využití pigmentu různými organizmy jako nespecifický ochranný prvek je pravděpodobně důsledkem relativně snadné biosyntézy z velké škály prekurzorů (Dadachova et al., 2007). Funkce DHN-melaninu vřeckovýtrusných hub spočívá v ochraně před reaktivními formami kyslíku, pocházejících od imunitních buněk hostitele. DHN-melanin dále ochrapuje bupky před vysokou teplotou, UV zářením i těžkými kovy. Produkce melaninu může zabrapovat účinnosti aplikovaných antimykotik. Tvorba pyomelaninu chrání před oxidativním stresem. Není vyloučeno, že pyomelanin se podílí spolu DHN-melaninem na patogenitě některých vřeckovýtrusných hub (Schmaler-Ripcke et al., 2009). Přírodní melanin vykazuje výrazně lepší kvalitu, než melanin syntetizovaný uměle. Boltcovitka, známá jako ucho Jidášovo, je jedlá houba zkoumaná pro svou schopnost v optimalizovaných podmínkách syntetizovat přírodní jedlý melanin velmi efektivně. Takto syntetizovaný pigment lze použít v potravinářském, kosmetickém, farmakologickém i lékařském odvětví (Sun et al., 2016a). 38