MOŽNOSTI ANALÝZY ARCHEOLOGICKÝCH MATERIÁLŮ POMOCÍ ICP-MS

Transkript

1 UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI Fakulta přírodovědecká Katedra analytické chemie MOŽNOSTI ANALÝZY ARCHEOLOGICKÝCH MATERIÁLŮ POMOCÍ ICP-MS DIPLOMOVÁ PRÁCE Autor práce: Studijní program: Studijní obor: Bc. Jana Bohunská N Chemie Analytická chemie Vedoucí diplomové práce: Ing. David Milde, Ph.D. Olomouc 2013

2 SOUHRN Tato práce se zabývá studiem vzorků zubů a kostí pocházejících ze starší doby bronzové, které poskytlo Archeologické centrum Olomouc, pomocí hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem ve spojení s laserovou ablací. V teoretické části je uveden základní popis stavby zubů a kostí a jejich vývoj, dále možnosti zavádění kapalných i pevných vzorků do plazmatu a popis jednotlivých částí hmotnostního spektrometru s indukčně vázaným plazmatem. Experimentální část je převážně zaměřena na analýzu poměrů izotopů 87 Sr/ 86 Sr, 88 Sr/ 43 Ca a 138 Ba/ 43 Ca ve vzorcích zubů a kostí pomocí metody ICP- MS ve spojení s laserovou ablací.

3 SUMMARY This thesis deals with the study of samples of teeth and bones from Early Bronze Age, which were provided by Archeological Center Olomouc, by means of inductively coupled plasma mass spectrometry combined with laser ablation. Basic description of the structure of teeth and bones and their evolution, as well as options how to introduce liquid and solid samples to the plasma and description of the various parts of the inductively coupled plasma mass spectrometer are introduced in the theoretical section. The experimental section is predominently focused on the analysis of the isotopic ratio 87 Sr/ 86 Sr, 88 Sr/ 43 Ca a 138 Ba/ 43 Ca in samples of teeth and bones using the ICP-MS combined with laser ablation.

4 Prohlašuji, že jsem tuto práci vypracovala samostatně. Veškeré literární prameny a informace, které jsem v práci využila, jsou v seznamu použité literatury. Souhlasím s tím, že práce je prezenčně zpřístupněna v knihovně Katedry analytické chemie, Přírodovědecké fakulty, Univerzity Palackého v Olomouci. V Olomouci dne.

5 Poděkování Děkuji svému vedoucímu diplomové práce Ing. Davidu Mildemu, Ph.D. za cenné rady, praktické připomínky a trpělivost při zpracování mé diplomové práce. Dále děkuji Mgr. Anně Pankowské z Archeologického centra Olomouc za poskytnutí vzorků kostí a zubů k měření a panu Zbirovskému z firmy URGA s.r.o. za spolupráci při přípravě vzorků zubů a kostí k měření na laserové ablaci. Poděkování také patří mému příteli a mé rodině, kteří mě podporovali po celou dobu mého studia.

6 OBSAH 1 ÚVOD TEORETICKÁ ČÁST Kost Stavba kosti Kostní buňky Mezibuněčná hmota (kostní matrix) Typy kostní tkáně Vláknitá kostní tkáň Lamelózní kostní tkáň Tvorba kostní tkáně Desmogenní osifikace Chondrogenní osifikace Zub Stavba zubu Sklovina ( ) Zubovina (dentin) Cement (cementum) Zubní dřeň (pulpa dentis) Vývoj zubu Možnosti izotopové analýzy kostí a zubů Hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem (ICP-MS) Možnosti zavádění kapalných vzorků do plazmatu Zmlžovače Mlžné komory Dávkování do proudu (FI Flow Injection) Generování těkavých par do ICP Možnosti zavádění pevných vzorků do plazmatu Elektrotermické odpařování (ETV) Laserová ablace Princip Elementární frakcionace Lasery Parametry ovlivňující ablační procesy Kalibrace Výhody a aplikace Indukčně vázané plazma (ICP) Plazma Plazmová hlavice Princip výboje Princip ionizace Ionizační a excitační mechanismy Teplota v plazmatu Interface Iontová optika Hmotnostní analyzátory Kvadrupólový analyzátor... 30

7 Sektorový analyzátor Průletový analyzátor (TOF) Detektory Kanálový elektronový násobič Elektronový násobič Faradayova klec Interference Spektrální interference Nespektrální interference Kolizní/reakční cela EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST Přístroje Pomůcky Chemikálie Příprava tablety NIST SRM 1486 Bone Meal Rozklad prášku NIST SRM 1486 Bone Meal Příprava kalibračních roztoků Vzorky Příprava vzorků Použité metody Analýza roztoků ICP-MS ve spojení s laserovou ablací Vyhodnocení signálu VÝSLEDKY A DISKUZE Optimalizace podmínek na LA Intenzita laseru (hustota zářivé energie) Průměr laserového paprsku Celkový průtok He Poměr průtoků He MFC1 (He) a MFC2 (He) ICP-MS s průletovým analyzátorem Analýza laserovou ablací Standardní referenční materiály Vzorky zubů a kostí Vyhodnocení vzorků Časové závislosti vzorků 194/809 a 374/ Analýza roztoků Kalibrační závislosti Výsledky roztoků ICP-MS s kvadrupólovým analyzátorem Analýza laserovou ablací Standardní referenční materiály Vzorky zubů a kostí Analýza roztoků ZÁVĚR LITERATURA SEZNAM ZKRATEK... 80

8 1 ÚVOD Hlavním úkolem archeologie je rekonstrukce událostí, jež se staly v minulosti, z hmotných pozůstatků. Mezi většinu archeologických nálezů se řadí kostry, kamenné nástroje, úlomky rozbitých nádob, zrezivělé kovové předměty, atd. Podrobný popis archeologických předmětů je uveden v literatuře 1. Příkladem studia archeologických předmětů může být odvození obchodních cest za pomocí analýzy fragmentů skla či keramiky, které byly vyrobené na jiném místě, než byly nalezeny nebo studium ekonomiky starověkých měst pomocí analýzy zvířecích kostí nalezených na hnojištích. Proto je třeba získat maximum informací o objektech nalezených během archeologických průzkumů. K tomu slouží zejména aplikace analytické chemie, tedy instrumentální techniky chemické analýzy pro detekci a kvantifikaci anorganických prvků, dále metody pro organickou analýzu, ale i techniky pro měření izotopového zastoupení řady prvků. Mezi nejdůležitější cíle analýzy archeologických předmětů patří identifikace, původ, stáří, chemické složení, proces výroby, pravost předmětu, analýza lidských ostatků či organická analýza 2. Tato diplomová práce je zaměřena na analýzu lidských ostatků (zubů a kostí), které poskytlo Archeologické centrum Olomouc, za pomocí hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem a laserovou ablací pro možnost zavádění pevných vzorků do plazmatu. ICP-MS je významná technika používaná k získávání informací o archeologických předmětech, jež umožňuje analýzu většiny prvků periodické tabulky kromě některých lehčích prvků (H, He, C, N, O, F, Ne, Cl, Ar) a lze sledovat i jednotlivé izotopy prvků. Laserová ablace, jako málo destruktivní technika, poskytuje možnost analýzy pevných vzorků, aniž by byl pouhým okem vidět kráter na vzorku vytvořený po zásahu laserem. Pomocí izotopové analýzy lidských zubů a kostí v porovnání s izotopovým profilem zubu zvířete pocházejícího z určité oblasti lze sledovat mobilitu jedinců nebo je možné provést rekonstrukci stravy. Pro tyto účely byly vybrány pro analýzu izotopy 43 Ca, 86 Sr, 87 Sr, 88 Sr, 137 Ba, 138 Ba (cit. 3 ). 1

9 2 TEORETICKÁ ČÁST 2.1 Kost Kostní tkáň je bílá, pevná, pružná a patří mezi nejtvrdší tkáně lidského těla. Slouží jako pevná opora těla a ochrana měkkých tkání a orgánů nezbytných k životu. Je významným zdrojem vápníku, fosfátů a dalších minerálních iontů, které se mohou uvolňovat a ukládat podle potřeby tak, že jejich obsah je v kosti konstantní 4, Stavba kosti Kostní tkáň je tvořena mezibuněčnou hmotou (tzv. kostní matrix) a třemi typy kostních buněk: osteocyty, osteoblasty, osteoklasty. V tenkých kanálcích (canaliculi ossei), které prostupují matrixem, probíhá propojování buněk pomocí jejich buněčných výběžků, aby se usnadnil přenos látek přes matrix, který je zvápenatělý. Prostor kanálků je vyplněn protein polysacharidovým gelem. Vnitřní a vnější povrch kosti je také propojen kanálky. Na povrchu je kost chráněna silnou vazivovou vrstvou, která se nazývá periost, jehož strukturu tvoří kolagenní vlákna a fibroblasty. Vnitřní vazivová vrstva se nazývá endost, jenž je složen z jedné vrstvy oploštěných osteoprogenitorových buněk a menšího množství vazivové tkáně. Periost a endost slouží k výživě kostní tkáně a tvorbě nových buněk, které zajišťují růst a hojení kostí 4,6, Kostní buňky Osteoblasty se podílí na tvorbě mezibuněčné hmoty a syntéze jejích organických složek (kolagen I, glykoproteiny). V závislosti na přítomnosti životaschopných osteoblastů, které jsou uloženy úzce vedle sebe na povrchu kosti, nastává ukládání anorganických složek do kosti. Sousední osteoblasty jsou spojovány pomocí jejich cytoplazmatických výběžků. Osteoblasty, jež jsou celé obklopené novou mezibuněčnou hmotou, se přeměňují na osteocyty. Organické komponentě, která je nově syntetizovaná a ještě nebyla kalcifikovaná, se říká osteoid 4,7. 2

10 Osteocyty jsou uložené vždy po jedné buňce v lakunách matrixu a vznikají z osteoblastů. Nepodílí se na produkci nové mezibuněčné hmoty, avšak účastní se výměny minerálů a regulují obsah minerálů v tělních tekutinách 7. Osteoklasty jsou buňky velkých rozměrů (až 100 µm), z nichž vystupují nepravidelné výběžky různých tvarů a velikostí. Jsou vytvářeny z osteoprogenitorových buněk. Funkcí osteoklastů je resorpce kostní tkáně, jejíž postup není docela vysvětlen. S pomocí osteoblastů je kost neustále přetvářena 4, Mezibuněčná hmota (kostní matrix) Mezibuněčná hmota je tvořena anorganickou a organickou složkou. Tvrdost, odolnost a pružnost kosti poskytuje kombinace anorganické složky a organické, tedy vazby hydroxyapatitu na kolagenní vlákna 4. Anorganická hmota tvoří asi 50 % hmotnosti kostní matrix. Nejvíce zastoupené anorganické prvky jsou vápník a fosfor, které jsou součástí krystalů hydroxyapatitu Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2. Mezibuněčná hmota dále obsahuje ve velkém množství uhličitan vápenatý. Krystaly hydroxyapatitu vypadají jako ploténky o velikosti 40 x 25 x 3 mm, které jsou uloženy podél kolagenních fibril a jsou obklopené mezibuněčnou hmotou. Na povrchu krystalů jsou ionty hydratované a vytváří tak vrstvu (tzv. vodní pouzdro) vody a iontů, jež je schopna vyměňovat ionty mezi krystalem a tělními tekutinami 4. Organická složka je z 95 % tvořena kolagenem typu I a amorfní hmotou obsahující glykosaminoglykany navázané na proteiny. Obsahuje různé glykoproteiny jako sialoprotein nebo osteokalcin podílející se na kalcifikaci mezibuněčné hmoty. Ostatní tkáně, které neobsahují glykoproteiny, se nepodílí na kalcifikaci Typy kostní tkáně Z mikroskopického hlediska rozlišujeme dva typy kostních tkání: lamelózní a vláknitou kost. Z makroskopického hlediska rozdělujeme kost (Obr.1) na kompaktní a spongiózní (houbovitou) kost, v dutinkách houbovitých a dlouhých kostí ještě kostní dřeň. Rozlišujeme buď červenou kostní dřeň s vysokou homeopatickou aktivitou, nebo žlutou kostní dřeň, kterou tvoří tuková tkáň 4. 3

11 Vláknitá kostní tkáň Jako první při tvorbě a hojení kostí vzniká během primární osifikace nezralá vláknitá kost, která je časem nahrazena sekundární zralou kostí, tzv. lamelózní kostí. Vláknitá kostní tkáň obsahuje kolagenní vlákna uspořádané nepravidelně (náhodně), je méně kalcifikována a obsahuje více osteocytů Lamelózní kostní tkáň Vzniká během sekundární osifikace a kolagenní vlákna jsou uspořádána ve vrstvách s tloušťkou 3 7 mm zvaných lamely, které jsou mezi sebou paralelně uložené nebo jsou uspořádány kolem kanálku s cévami koncentricky. Celý systém lamel obklopujících kanálek spolu s cévami a nervy je pojmenován Haversův systém nebo osteon, jehož funkcí je přívod živin do kompaktní tkáně 4. Kompaktní a spongiózní kost Kompaktní kost je složena z koncentrických lamel Haversova systému. Spongiózní kost tvoří kostní trámce, které jsou rozvětvené a představují houbovitou strukturu. Trámce se skládají z paralelně uspořádaných lamel. Plocha mezi trámci je vyplňována kostní dření. Dlouhé kosti jsou tvořeny diafýzou a epifýzou. Diafýza obsahuje tlustou vrstvu kompaktní tkáně, uvnitř které je dutina vyplněná kostní dření. Epifýzy navazují na konce diafýz a obsahují houbovitou tkáň. Krátké kosti jsou zpravidla tvořeny tenkou kompaktní vrstvou a vyplněny houbovitou kostí. Ploché lebeční kosti obsahují vnější i vnitřní kompaktní vrstvu a mezi nimi vrstvu spongiózní tkáně. Kompaktní a spongiózní kost lze rozlišit podle stupně pórovitosti nebo hustoty. Zpravidla platí, že spongiózní kost je metabolicky aktivnější, častěji přetvářena a tedy i mladší než kost kompaktní a i přesto, že mohou být tvořeny ze stejného materiálu, tak může zrání kompaktní kosti měnit v mikroskopickém měřítku mechanické vlastnosti. Mechanické vlastnosti kompaktní kosti jsou dány stupněm mineralizace, pórovitosti a uspořádáním pevné matrice 5,8. 4

12 Obr. 1. Struktura dlouhé kosti (převzato z cit. 9 ) Tvorba kostní tkáně Proces vyvíjení kosti z vazivové a chrupavkové tkáně ě se nazývá osifikace. Rozlišujeme dva typy osifikací: desmogenní a chondrogenní osifikaci. Desmogenní osifikace probíhá ve vazivové tkáni, kdežto chondrogenní nastává v chrupavkové tkáni. Diferenciací buněk z periostu vzniká kostní tkáň, tedy nedochází k přeměně ě ě tkáně chrupavky. V obou typech osifikace nejprve vzniká primární kost nezralá, která je postupně nahrazována konečnou nou sekundární kostí (lamelózní). V průběhu růstu kosti se kombinuje syntéza a přestavba kosti, kdy jsou vedle sebe oblasti primární kosti, resorpce a sekundární kosti 4,5. 5

13 Desmogenní osifikace Desmogenním způsobem vznikají kosti lebeční klenby, kosti lebky v obličejové části a část klíčních kostí. Desmogenní osifikace probíhá v místě, kde se mění mezenchymové buňky v osteoblasty schopné vytvářet kostní matrix. Ve vzniklém osteoidu nastává ukládání vápníku a fosforu za tvorby hydroxyapatitových krystalů, které tvoří kostní trámeček a na němž se ukládají další osteoblasty a vytvoří souvislou vrstvu tvořící kost. Některé osteoblasty jsou obalovány kostní matrix a mění se na osteocyty. Osteoklasty pak v určitých místech kostního trámečku přeměňují kost do její funkční podoby. Kostem vznikajícím desmogenní osifikací se jinak říká primární, vazivové či krycí kosti Chondrogenní osifikace Chondrogenní osifikací (na základě chrupavčitého modelu) vznikají kosti dlouhé. Primární osifikace, při které vzniká kost primární (vláknitá), probíhá na chrupavkovém nebo vazivovém podkladu. Během sekundární osifikace se vytváří tvar a vnitřní struktura kosti sekundární (lamelózní) 5. Během primární osifikace vznikají osifikační centra, kde se chondrocyty zvětšují a následuje degenerace a zánik buněk. V místech zániku chondrocytů zůstávají zbytky kalcifikované chrupavčité hmoty, kde se vytváří osteoblasty z osteoprogenitorových buněk a na zbytky kalcifikované matrix ukládají nově produkovanou mezibuněčnou hmotu za tvorby periostální kosti. Kostní tkáň tedy nevzniká přeměnou chrupavčité tkáně, ta slouží pouze jako podklad. Do osifikačního centra vrůstají krevní cévy a mezenchymové buňky, které se přetvářejí v chondroklasty a pomocí nichž jsou odbourávány a resorbovány chondrocyty. V poloze osifikačního centra (centra diafýzy) je vytvářena primární dřeňová dutina rozšiřující se k oběma epifýzám. Růst diafýzy do délky zajišťuje enchondrální osifikace a její růst do tloušťky pak způsobuje periostální osifikace. Osifikační centra v epifýzách se objevují mnohem později než v diafýzách. Chrupavka v kloubní oblasti mezi epifýzou a diafýzou se nazývá epifýzo-diafyzární ploténka, po jejímž vymizení nastává periostální osifikace epifýzy. Vzniklá primární kost je pevná a plní funkci kostry. V průběhu sekundární osifikace je primární kost přeměňována na lamelózní kost s osteony. Přestavba kosti začíná v centru diafýzy a rozšiřuje se od dřeňové dutiny k periostu longitudinálním a radiálním směrem. Kompaktní kost vzniká pomocí osteoblastů a tvoří ji hustě rozložené osteony lamelózní kostní 6

14 tkáně. Zevní a vnitřní vrstvy primární kompakty se nepřeměňují sekundární osifikací a kostní tkáň je zde uspořádána z rovnoběžných lamel 4, Zub Zuby jsou tvrdé orgány, porcelánově bílé až nažloutlé barvy, jejichž funkcí je rozmělňování a dělení potravy a podílí se na činnosti řeči Stavba zubu Morfologicky se zub (Obr. 2) rozděluje na zubní korunku (corona dentis), krček (collum dentis), kořen (radix dentis) a dutinu (cavitas dentis). Z hlediska stavby zubu se rozlišuje sklovina ( ), zubovina (dentin), cement (cementum) a zubní dřeň (pulpa dentis) 11. Obr. 2. Struktura zubu (převzato z cit. 12 ) 7

15 Na povrchu zubní korunky se vyskytuje žvýkací plocha, jež je rozčleněna na rýhy a zubní hrbolky. Na rozhraní korunky a kořenu zubu se vyskytuje krček zubu, který zahrnuje sklovinu, zubovinu a cement. V zubním lůžku lze najít kořen zubu. V dutině zubu se vyskytuje zubní dřeň Sklovina ( ) Sklovina je tkáň ektodermového původu a vzniká z ameloblastových buněk procesem zvaným amelogeneze. Jedná se o nejtvrdší tkáň lidského těla. Sklovina pokrývá v různé tloušťce celou korunku a představuje její ochranný obal, na který žvýkací sliny nemají vliv. Obsahuje 98 % anorganických látek (především krystalky hydroxyapatitu), 0,5 % organických látek (glykoproteidy, lipidy) a zbytek vodu. Sestává z prismat a interprismatické substance. Prismata tvoří pětiboké až šestiboké hranoly průměru 3 6 µm vzájemně vázané pomocí interprismatické substance. Prismata se spirálově otáčejí od hrbolků k pulpě a mohou se i křížit, na výbrusu se střídají podélně a příčně zachycené hranoly, které se jeví jako světlé a tmavé proužky nazývající se Hunterovy-Schregerovy proužky. Místa odrážející postupnou tvorbu skloviny, kde jsou prismata na sebe nahuštěná, se jmenují Retziusovy linie, jež se vyskytují kolmo na Hunterovy-Schregerovy proužky. Interprismatická hmota obsahuje oproti prismatu více organických složek (amelogeniny, enameliny). Mezi prenatální a postnatální sklovinou se vyskytuje neonatální pruh, který se jeví širší a je méně mineralizovaný. Tato linie je rozeznatelná u zubů dočasných a prvních stálých stoliček 11, Zubovina (dentin) Zubovina je tkáň mezenchymového původu a vzniká z ondoblastů procesem zvaným dentinogeneze. Kromě ondoblastů se v zubovině vyskytuje i mezibuněčná hmota, jež je ondoblasty produkována. Zubovina tvoří hlavní část zubu, obsahuje 75 % anorganických látek (zejména krystalky hydroxyapatitu) a 28 % organických složek (především kolagenní vlákna a mukopolysacharidy). Funkcí ondoblastů je tvorba zuboviny, přetavba její vnitřní struktury podle tlaku a pomáhat při její regeneraci. Z ondoblastů vychází dlouhé cytoplasmatické výběžky nazývající se Tomesova vlákna. Lidské zuby rozlišují 3 druhy dentinu primární, sekundární a terciární. Primární zubovina vzniká v průběhu vývoje zubu a vyskytuje se v dentinové stěně. Po ukončení vývoje kořene se vytváří sekundární zubovina, 8

16 která se vyskytuje nejvíce na stropu a dně dřeňové dutiny. Terciární zubovina vzniká důsledkem dráždivých podnětů a nazývá se také obranný, reparativní či iregulární dentin. U všech zubů se v dentinu vyskytuje neonatální linie, jež vzniká z důvodu přerušení mineralizace dentinu a skloviny dva týdny po narození 11, Cement (cementum) Cement je tvrdá tkáň (podobá se kompaktní kosti) ektomezenchymového původu a je produkován cementoblasty procesem zvaným cementogeneze. Pokrývá povrch krčku a kořene zubu. Rozlišují se dva typy cementu: primární a sekundární. Primární cement, jinak zvaný bezbuněčný, acelulární, fibrilární cement, tvoří první tenkou vrstvu mineralizované hmoty, která navazuje přímo na dentin, vyskytuje se od krčku až ke konci kořene a jeho úkolem je navázat vazivová vlákna závěsného aparátu ozubice. Sekundární cement, jinak zvaný buněčný či celulární, periodicky navazuje na vrstvu primárního cementu, obsahuje cementocyty a úkolem těchto buněk je výživa zubu. Cementem prostupují tzv. Sharpeyova vlákna skládající se z kolagenních vláken, jejichž funkcí je ukotvení zubu v zubním lůžku. Ukládání cementu na povrch kořene probíhá celý život 11, Zubní dřeň (pulpa dentis) Zubní dřeň se skládá z řídkého rosolovitého vaziva mezenchymového původu. Je obsažena v dřeňové dutině korunky a kořenovém kanálku. Matrix dřeně je tvořen amorfní základní substancí složenou z glykoproteinů, glykosaminoglykany a vody. Dále dřeň obsahuje kolagenní vlákna, buňky, cévy i nervy. Ondoblastové buňky slouží k tvorbě a výživě zuboviny a řadí se zde fibroblasty, jež vytváří kolagenní vlákna a amorfní substanci. Pro imunitu se zde vyskytují ještě makrofágy, které fagocytují. Účelem nediferencovaných vazivových buněk je změnit se na odontoblasty či fibroblasty a ujmout se jejich funkce, pokud je třeba 11, Vývoj zubu Zuby se vyvíjí ze zubního zárodku, jenž se skládá z epitelové tkáně (ameloblasty produkující sklovinu) a ektomezenchymové tkáně (ondoblasty produkující dentin, 9

17 cementoblasty tvořící cement, osteoblasty tvořící alveolární kost). Vývoj zubu nastává indukční tkáňovou interakcí mezi oběma tkáněmi. Proces, při kterém jsou zuby obnažovány z dásní a vstupují do okluze, se nazývá prořezávání zubů. Rozlišují se dva typy prořezávání zubů: prořezávání dočasných (mléčných) zubů a stálých zubů 4,11. Prořezávání dočasných zubů nastává v rozmezí období od prořezání prvních dočasných řezáků po první stálý zub. Tyto zuby časem ztrácí kořeny, jež jsou vstřebávány po 4. roce života řezáků, po 6. roce dočasných stoliček. Perivaskulární buňky se mění na cementoklasty a ondoklasty, které dané tkáně odstraňují a zubní kořeny jsou uvolňovány 11. Prořezávání stálých zubů je mnohem pomalejší proces (roky) než prořezávání dočasných zubů. Tento proces se rozděluje na tři časová období. V prvním období mezi 6. a 9. rokem života prořezává první stolička a řezáky. V druhém období mezi 9. a 12. rokem prořezávají třenové zuby, špičáky, druhé stoličky. V třetím období mezi 14. a 18. rokem prořezává stolička třetí nazývající se zub moudrosti, ale tento proces je velmi individuální Možnosti izotopové analýzy kostí a zubů Z obsahu izotopů uložených v zubech a kostech lidí a zvířat lze zjistit informace týkající se trofické úrovně jedince, čili složení jejich potravy (býložravci mají odlišné hodnoty izotopů oproti masožravcům), dále se sleduje migrace lidí a zvířat pomocí srovnání izotopů prvků v kostech a zubech člověka a místa, kde se daný jedinec nacházel v průběhu jeho života. Každá oblast má svůj vlastní geochemický profil odpovídající obsahu stabilních izotopů různých prvků nacházejících se v horninách. Tyto prvky se dostávají do vody a půdy zvětráváním hornin, dále ve stejném poměru izotopů, který je charakteristický pro jednotlivé oblasti, pronikají do rostlinné a živočišné potravy, tzn., že se stabilní izotopy dostávají do organismu prostřednictvím výživy a postupně jsou ukládány do kostí a zubů. Z archeologického hlediska patří mezi nejzajímavější izotopy 87 Sr/ 86 Sr, 13 C/ 12 C, 15 N/ 14 N, 34 S/ 32 S, 18 O/ 16 O, jež se dostávají do těl rostlin a živočichů z atmosféry, vody a hornin. Zuby se vytvářejí v prvních letech života jedince, tudíž obsah izotopů jednotlivých prvků je po celý život v zubních tkáních stabilní a izotopový profil zubu odpovídá prvním rokům života jedince. Kosti se v průběhu života přeměňují a izotopový profil kosti odpovídá hodnotám 10

18 v posledních letech života jedince. V případě rozdílného izotopového složení míst, kde daný jedinec žil na počátku života a kde zemřel, lze určit jeho migraci 14. Izotopy stroncia Stroncium je nejvhodnější prvek pro určení migrace člověka či zvířete. Stroncium má 4 izotopy s různým přirozeným zastoupením: 84 Sr (0,56 %), 86 Sr (9,86 %), 87 Sr (7,00 %) a 88 Sr (82,58 %). Jediné 87 Sr je produktem beta rozpadu 87 Rb. Pro určování stravy jedince se používá poměr izotopů stroncia 88 Sr/ 86 Sr, kdežto pro určování mobility 87 Sr/ 86 Sr. Poměr 87 Sr/ 86 Sr odpovídá přibližně geologickému stáří podloží daného místa. Starším horninám přísluší vyšší hodnoty tohoto poměru, kdežto mladším horninám nižší hodnoty. Pokud jsou hodnoty poměru 87 Sr/ 86 Sr v zubech a kostech daného jedince odlišné, pak lze vyvodit z geografického hlediska závěr, který poukazuje na změnu prostředí (migrace) jedince v průběhu jeho života. Pro získání srovnávacích izotopových hodnot z dané oblasti je nejvhodnější použít analýzu kostí (zubů) místní fauny, tedy malých domácích zvířat pocházejících z dané oblasti 14,15,16. Poměry izotopů Sr/Ca, Ba/Ca Stroncium i baryum nahrazují vápník v hydroxyapatitových krystalech v minerální části kostní tkáně. Zastoupení těchto prvků ve stravě odpovídá zastoupení těchto prvků v dané lokalitě. Poměry Sr/Ca a Ba/Ca jsou v rostlinách nižší než v půdě, ve které rostou, ještě nižší poměry mají býložravci a úplně nejnižší hodnoty mají masožravci. Hodnota poměru Sr/Ca v kostech má tendenci být 20% hodnotou stravy a hodnota poměru Ba/Ca okolo 10 % stravy, tudíž lze z naměřených hodnot zjistit průměrnou hodnotu původní potravy. Hodnoty těchto poměrů mohou vést k informaci o trofické úrovni jedince či migraci 17. Izotopy uhlíku a dusíku Pro rekonstrukci stravy lze využít stabilní izotopy uhlíku (poměr 13 C/ 12 C) a dusíku (poměr 14 N/ 15 N). 98,93 % uhlíku v přírodě tvoří stabilní izotop 12 C a pouze 1,07 % stabilního izotopu 13 C, dále existuje nestabilní izotop 14 C, který se vyskytuje ve velmi malé míře. Izotopy uhlíku poskytují informace ohledně typu rostlin a mořské stravy. Dusík se v přírodě vyskytuje ve formě stabilních izotopů 14 N (99,63 %) a 15 N (0,37 %). Izotopy dusíku poskytují informace týkající se důležitosti masa a role sladkovodních ryb ve stravě. Izotopy uhlíku a dusíku se k účelu rekonstrukce stravy analyzují v kolagenu kostní tkáně 16,18,19. 11

19 Pro izotopovou analýzu lehčích prvků organického původu, jako je uhlík, kyslík, vodík, síra a dusík, lze použít hmotnostní spektrometrii izotopových poměrů (IRMS). Nejběžnějším typem zavádění vzorku do IRMS je prvkový analyzátor (EA). Spojení EA- IRMS poskytuje reprezentativní data pro průměrný izotopový signál v celém vzorku Hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem (ICP-MS) Hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem je analytická technika, která se používá pro anorganickou multielementární analýzu zejména stopových a ultrastopových koncentrací prvků. V dnešní době existuje řada aplikací zahrnujících především oblasti environmentální, geochemické, biomedicínské a analýzu potravin. Spojení ICP-MS s vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) je použitelné pro speciační analýzu 21. ICP-MS představuje spojení indukčně vázaného plazmatu, ve kterém nastává ionizace prvků vzorku za vzniku kladně nabitých iontů, a hmotnostní spektrometrie, v níž jsou vzniklé ionty separovány (v hmotnostním analyzátoru) a detekovány (v detektoru). Mezi základní součásti přístroje patří systém zavádění vzorku do plazmatu (v případě kapalných vzorků je to zmlžovač a mlžná komora), plazmová hlavice, iontová optika, hmotnostní analyzátor a detektor (Obr. 3). Důležitým prvkem je interface, který umožňuje průchod iontů z indukčně vázaného plazmatu pracujícího za atmosférického tlaku do hmotnostního spektrometru pracujícího za vakua 21,22,23. 12

20 Obr. 3. Obecné schéma hmotnostního spektrometru s indukčně vázaným plazmatem (převzato z cit. 21 ) Možnosti zavádění kapalných vzorků do plazmatu Většina aplikací ICP-MS v dnešní době zahrnuje analýzu kapalných vzorků. Existuje několik způsobů zavádění kapalného vzorku do plazmatu a v podstatě všechny dosahují stejného výsledku, tedy tvorby jemného aerosolu vzorku pro účinnou ionizaci v plazmatu. Tento proces se skládá ze dvou samostatných kroků, které zahrnují tvorbu aerosolu za použití zmlžovače a následné odstranění velkých kapek v mlžné komoře, aby se do plazmatu dostaly pouze malé kapičky 21. Kapalný vzorek je obecně nasáván peristaltickým čerpadlem (jedná se o malé čerpadlo s určitým počtem malých válečků, které se otáčí stejnou rychlostí) do zmlžovače. Peristaltické čerpadlo zajišťuje konstantní průtok kapaliny, běžně asi 1 ml/min, nezávisle na viskozitě vzorku, standardu nebo slepého vzorku. V zmlžovači je kapalina převedena na jemný aerosol pneumatickým působením průtoku plynu (argonu). Následuje odstranění velkých kapek aerosolu v mlžné komoře

21 Zmlžovače Koncentrický zmlžovač Kapalný vzorek je veden tenkou kapilárou, na jejímž konci přichází do styku s plynem (argonem), který proudí vysokou rychlostí. Kombinace rychle proudícího plynu a pomalé kapaliny způsobuje rozprášení kapaliny v plynu na konci kapiláry (Obr. 4). Jako materiál koncentrických zmlžovačůů se používá borosilikátové sklo nebo křemen. Pro aplikace vyžadující odolnost vůči korozi lze použít i polymerní materiály. Typický průtok vzorku se pohybuje u klasických koncentrických zmlžovačů okolo 1 3 ml/min. Tento typ zmlžovače poskytuje pro čisté roztoky vynikající stabilitu a citlivost. Problémy mohou nastat tehdy, pokud je matrice vzorku složitá nebo vzorek obsahuje větší obsah soli. V tomto případě se 21. může tenká kapilára ucpat 21 Obr. 4. Schéma koncentrického zmlžovače (převzato z cit. 24 ) Mikrokoncentrický zmlžovač Mikrokoncentrické zmlžovače pracují na stejném principu jako koncentrické s tím rozdílem, že používají vyšší tlak plynu k získávání nižších průtoků ů ů kapaliny, které jsou pod 0,1 ml/min. Výhodou extrémně nízkých průtoků je uplatnění zmlžovače v oblastech vyžadujících omezený objem vzorku a díky tvorbě aerosolu s menšími kapičkami je účinnější než klasický koncentrický zmlžovač. K výrobě mikrokoncentrických zmlžovačů se používají polymerní materiály jako polyvinylfluorid (PVF) či polytetrafluorethylen (PTFE), avšak některé typy se vyrábí z borosilikátového skla nebo křemene. Mikrokoncentrické oncentrické zmlžovače jsou obecně méně ě tolerantní k vysokým koncentracím rozpuštěných pevných částic a 14

22 suspendovaných částic,, protože používají velmi tenké kapiláry potřebných pro nízké průtoky. Z tohoto důvodu jsou vhodné pouze pro analýzu vzorků ů obsahujících nižší množství rozpuštěných pevných látek 21. Úhlový zmlžovač Kapilára vedoucí plyn (argon) je umístěna v pravém úhlu ke kapiláře vedoucí kapalinu (Obr. 5). Na konci obou kapilár dochází ke styku kapaliny a plynu a tvorbě aerosolu. Tento typ zmlžovače je vhodný pro analýzu vzorků se složitější matricí nebo menším obsahem nerozpuštěné né látky, protože má větší průměr r kapiláry vedoucí kapalinu a vzdálenost mezi vnášením kapaliny a plynu je velká, což snižuje riziko ucpání. Obvyklý materiál pro výrobu úhlového zmlžovače je plast 21. Obr. 5. Schéma úhlového zmlžovače (převzato z cit. 24 ) Další typy zmlžovačů Modifikací úhlového zmlžovače pro analýzu vzorků ů obsahujících větší množství rozpuštěných pevných částic (nad 20 %) jsou Babbingtonův a V-groove zmlžovač. Tyto zmlžovače ale nejsou ideální pro analýzu roztoků pomocí ICP-MS, protože se zde požaduje, aby obsah složek matrice byl pod 0,2 % (cit. 25,21 ). V ultrazvukovém zmlžovači je kapalina přiváděna na vibrující piezoelektrický krystal pracující v rozmezí 200 khz 10 MHz, což je dostatečná frekvence na převedení kapalného vzorku na jemný aerosol. Ten je nosným plynem (argonem) veden přes vyhřívanou trubici a 15

23 chladící komoru, čímž se odstraní rozpouštědlo vzorku jako kondenzát a do plazmatu vstupuje jemný suchý aerosol 21,25. Další možnost zmlžování je pomocí termosprejového zmlžovače. Kapalný vzorek prochází elektrotermicky vyhřívanou kapilárou s teplotou vyšší než je teplota varu kapalného vzorku a vzorek se částečně odpařuje. Na konci kapiláry dochází k expanzi par vzorku, které převedou zbývající kapalinu na aerosol 26, Mlžné komory Hlavní funkce mlžné komory je zadržet velké kapky aerosolu a vykompenzovat zmlžovací pulzy, které vytváří peristaltické čerpadlo. Ideální mlžná komora by měla mít velkou povrchovou plochu, aby docházelo k roztříštění hrubého aerosolu, minimální mrtvý objem k zabránění zřeďování vzorku a snadné odstranění kondenzovaného vzorku, aniž by se vyvolaly tlakové pulzy. Některé typy mlžných komor jsou externě chlazené z důvodu tepelné stability vzorku, snížení množství rozpouštědla jdoucího do plazmatu, čímž je k dispozici více energie na excitaci a ionizaci analytů, a pokud se do plazmatu dostává méně vody, je menší pravděpodobnost tvorby oxidů a hydroxidů, které by jinak mohly interferovat s jinými analyty. V dnešní době se v komerčních přístrojích ICP-MS vyskytují v zásadě dva typy mlžných komor, Scottova a cyklonická mlžná komora 21,25. Scottova mlžná komora Skládá se ze dvou soustředných trubic. Do vstupní trubice se přivádí aerosol ze zmlžovače a výstupní trubice slouží pro odvod jemného aerosolu do plazmatu a odvod odpadu. Aerosol ze zmlžovače je přiváděn do vnitřní trubice a při výstupu z ní změní směr o 180 a míří do plazmové hlavice. Interakce hrubého aerosolu s vnitřním povrchem mlžné komory vede k produkci jemnějšího aerosolu a přebytečná zkondenzovaná kapalina odchází do odpadu (Obr. 6) (cit. 25 ). 16

24 Obr. 6. Schéma Scottovy mlžné komory s koncentrickým zmlžovačem (převzato z cit. 28 ) Cyklonická mlžná komora Tato mlžná komora pracuje na principu odstředivých sil. Aerosol je zaveden do zmlžovače tangenciálně ě a způsobí vír. Na počátku se aerosol pohybuje směrem k dolní stěně komory, kde druhá vnitřní spirála unáší aerosol k výstupu (Obr. 7). Snížení velikosti částic nastává kombinovaným procesem navozeného tangenciálního toku a následného víření aerosolu 25. Cyklonická mlžná komora má všeobecně vyšší účinnost pro čisté vzorky, což vede k vyšší citlivosti a nižším limitům detekce. Materiály pro výrobu této mlžné komory zahrnují kromě skla a křemene také různé typy polymerních látek

25 Obr. 7. Schéma cyklonická mlžné komory (převzato z cit. 29 ) Dávkování do proudu (FI Flow Injection) Část vzorku je dávkována do proudu nosného média a za pomocí skupiny čerpadel a ventilů může být provedena on-line fyzikální či chemická změna vzorku nebo analytu ještě před vstupem do hmotnostního spektrometru. Jedná se o užitečný nástroj pro ICP-MS použitelný pro přípravu, předúpravu či zakoncentrování vzorku 21, Generování těkavých par do ICP Analyty přítomné v kapalném vzorku lze vhodnou reakcí s činidlem v daném prostředí převést na plynný či těkavý produkt, který lze následně zavést do plazmatu. V případě zavádění analytu jako těkavé látky do plazmatu se výrazně zlepšuje citlivost a detekční limity a převod analytu do plazmového výboje probíhá s účinností až 100 %. Tento způsob také umožňuje odstranění ě či separaci analytu od částic matrice, čímž lze odstranit spektrální a nespektrální interference. Navíc použití této techniky v módu dávkování do proudu (FI) se používá ve spojení s ICP-MS jako jednoduchá a rychlá metoda 30,31. 18

26 Jednou z možností generování těkavých par je tvorba hydridů. Za laboratorní teploty jsou schopny tvořit těkavé hydridy pouze některé prvky včetně arsenu, cínu, olova, antimonu, bismutu, germania, selenu a telluru. Pro reakci se většinou používá tetrahydridoboritan sodný jako redukční činidlo obvykle v přítomnosti kyseliny chlorovodíkové. Kromě chemické reakce tvorby hydridů lze využít i elektrochemické generování využívající průchod elektrického proudu v přítomnosti čistých minerálních kyselin, jehož výhodou je znemožnění kontaminace analytu redukčním činidlem 32,33. Technika generování studených par se využívá zejména pro stanovení rtuti, ale lze ji využít i při stanovení kadmia či některých drahých a přechodných kovů. Jako redukční činidlo zde slouží buď tetrahydridoboritan sodný či roztok chloridu cínatého Možnosti zavádění pevných vzorků do plazmatu Elektrotermické odpařování (ETV) Pro oddělení analytu od složek matrice a jejich zavedení do hmotnostního spektrometru pro analýzu tato technika využívá elektrotermicky vyhřívanou kyvetu (uhlíkovou) nebo žhavené kovové vlákno. Poté, co je vzorek zaveden v kapalné nebo pevné formě do grafitové trubice nebo na kovové vlákno, nastává sušení při 80 C, poté žíhání při C a nakonec odpařování při teplotě okolo 2800 C a pomocí nosného plynu (argonu) je vzorek transportován do plazmatu. Výhodou zvyšování teploty je odstranění interferující matrice, zatímco analyt postupuje dále. Výhodné je i použití malého množství vzorku (obvykle µl pomocí autosampleru). Nevýhodou ETV pro multielementární analýzu je přechodný signál, který umožňuje ve skutečnosti analyzovat pouze malý počet prvků s dobrou správností a přesností za dobu menší než 3 s (cit. 21,34 ). 19

27 Laserová ablace Princip Laserová ablace je důležitá technika umožňující přímou analýzu pevných vzorků bez rozpouštění 21. Na vzorek umístěný v ablační komoře je namířen pulzní laserový paprsek vhodné energie. Ablatovaný materiál je veden nepřetržitě proudícím nosným plynem (argon 26 ). nebo helium) do ICP (cit. 26 Obr. 8. Schéma laserové ablace (převzato z cit. 35 ) Laserový ablační systém se skládá z laseru, pomocných optických součástí, ablační komory pro umístění vzorku a nastavitelné platformy (Obr. 8). Povrch vzorku lze sledovat prostřednictvím CCD kamery přes okno ablační komory z taveného křemene. Ablační komora je naplněná ná inertním plynem (nejčastěji ji argonem nebo heliem) pro odvod ablatovaného materiálu. Nastavitelná platforma je řízena počítačem a umožňuje nastavení polohy vzorku v x-, y-, z- osách 36,37. 20

28 Když je vzorek ozářen laserovým zářením, uvolní se materiál ve formě částic, elektronů, atomů a iontů, které vytváří plazmový oblak nad ablatovaným místem 26. Při interakci laseru se vzorkem mohou nastat dva mechanismy: termické (odpařování) a netermické (ablace), které lze odlišit v závislosti na hustotě zářivého toku a době trvání pulzu. Netermické procesy nastávají při vyšší hustotě zářivého toku okolo 10 9 W/cm 2 s kratší dobou trvání pulzu (nanosekundy a kratší). Pokud mají lasery nižší hustotu zářivého toku (pod 10 6 W/cm 2 ) a doba trvání pulzu je v mikrosekundách a delší, pak převažují procesy termické. V případě laserů s hustotou zářivého toku W/cm 2 dochází k odpařování a ablaci a mohou nastat i další mechanismy 38. Obr. 9. Znázornění průběhu interakce laserového paprsku se vzorkem (převzato z cit. 26 ) Plazmový oblak může interagovat s laserovým paprskem v závislosti na době pulzu, což způsobuje stínění vzorku (plasma shielding) a tím snížení energie dodávané na povrch vzorku (Obr. 9) (cit. 26 ) Elementární frakcionace Frakcionace je proces, při kterém dochází k progresivní změně ě poměru prvků či izotopů, přičemž její průběh nezávisí na mechanismu ani místě ě jejího průběhu. Může nastat 21

29 v místě ablace, během transportu ablatovaného vzorku do plazmatu i v samotném plazmovém výboji. Během termických procesů laserové záření absorbují elektrony a převádí jej na atomovou mřížku, čímž nastává tavení a odpařování materiálu. Tyto mechanismy mohou způsobit frakcionaci. Jedná se o dynamický proces a stupeň frakcionace (tzn. do jaké míry se během ablace vyskytuje) závisí na složení vzorku, velikosti a tvaru kráteru, dále na transportu vzorku do plazmatu a distribuci velikosti částic. Frakcionace je také ovlivňována použitou vlnovou délkou laseru, energií a dobou trvání pulzu. Obecně je frakcionace nejkritičtější pro nízkoenergetické vzorkování s vysokým rozlišením. Obvykle vlivem frakcionace nastává zhoršení přesnosti a správnosti LA ICP-MS se zvyšujícím se počtem laserových pulzů aplikovaných na vzorek. Frakcionace byla pozorována například při stanovení alkalických kovů v silikátových geologických vzorcích nebo při stanovení poměru Pb/U v silikátových vzorcích 35,39, Lasery Laser je optické zařízení soustřeďující energii v čase. Je schopen produkce koherentních, monochromatických energetických pulzů, trvajících velmi krátkou dobu, v určitých vlnových délkách, které jsou v rozsahu od ultrafialové oblasti (UV), přes viditelnou (VIS), až po infračervenou oblast (IR) v závislosti na typu laseru 35. Podle délky vytvářeného pulzu se lasery dělí na nanosekundové (ns), pikosekundové, femtosekundové (fs) atd. Zatímco při použití nanosekundového laserového pulzu je při ablaci dostatek času na rozptýlení energie fotonu do mřížky ve formě tepla, femtosekundové lasery jsou schopny ablatovat přesně definované krátery s minimálním tepelným ohřevem okolí kráteru a téměř celá energie laseru je přeměněna na kinetickou energii ablatovaných par. Femtosekundové lasery neinteragují s ablatovanými parami vzorku opouštějící povrch vzorku a byly navrženy jako alternativa pro chemickou analýzu laserovou ablací kvůli jejich možnému potenciálu redukovat frakcionaci. V případě nanosekundových laserů je mechanismus plazmového stínění považován za ztrátu energie laseru a ns lasery jsou pak považovány jako přispěvatelé k možné frakcionaci. Z hlediska velikosti částic produkovaných laserovou ablací vznikají v případě fs laseru menší částice, které tvoří velké aglomeráty, kdežto v případě ns laseru vznikají částice větší a menší aglomeráty 41,42,43. Pro ablaci pevných látek byly jako první použity rubínové lasery. V současné době většina laserových ablačních systémů používá Nd:YAG (yttrio-hlinitý granát dopovaný ionty 22

30 neodymu) nebo excimerový laser. Pevné neodymové lasery (Nd:YAG) jsou rozsáhle využívány zejména proto, že jsou relativně levné, nenáročné na údržbu a snadno se dají začlenit do malých komerčních ablačních systémů. Pracují primárně při vlnové délce 1064 nm, což je blízká IR oblast, ale pomocí optických součástek lze získat dvojnásobnou (532nm), trojnásobnou (355 nm), čtyřnásobnou (266 nm) či pětinásobnou (213 nm) frekvenci. Excimerový laser produkuje výběr výstupních vlnových délek (308, 248, 193 a 157 nm) za použití XeCl, KrF, ArF nebo F 2. V zásadě kratší vlnové délky poskytují vyšší energie fotonů pro účinné přetržení vazeb a ionizaci tuhého vzorku. Absorpce záření zaměřeným materiálem a laserem-indukovaným plazmatem výrazně závisí na vlnové délce laseru Parametry ovlivňující ablační procesy Ablační procesy ovlivňuje mnoho parametrů, které závisí zejména na vlastnostech laseru a vzorku. Hlavním parametrem podílejícím se na průběhu laserové ablace je vlnová délka laseru, která ovlivňuje tvorbu aerosolu (distribuci velikosti částic a absorpci laserového záření). Záření o vlnové délce z UV oblasti vyvolává přímou ablaci materiálu (malé stínění plazmatu), kdežto IR záření je absorbováno plazmovým oblakem, čímž dochází k značnému stínění a vzorek je odpařován vlivem plazmového oblaku. Vyšší účinnost ablace se získá použitím laseru s vlnovou délkou z UV oblasti. Hustotu výkonu laseru ovlivňuje energie laserového pulzu, jenž má vliv na množství ablatovaného vzorku a velikost kráteru. Na tvorbě plazmového oblaku, geometrii kráteru i množství tepla přeneseného na vzorek se podílí délka pulzu. Důležitým parametrem udávajícím míru ablace vzorku (při dané energii a době pulzu) je frekvence laseru, která ovlivňuje poměr intenzit signál/pozadí a dobu nezbytnou pro produkci kráteru specifické velikosti. Mezi další parametry podílející se na ablačních dějích patří energetický profil laserového paprsku, který závisí na typu použitého laseru, zaostření laserového paprsku, které určuje velikost ozářené plochy vzorku, transport ablatovaného materiálu a nosný plyn. Množství ablatovaného vzorku, geometrie kráteru a velikost částic vzorku se může výrazně měnit v závislosti na druhu matrice vzorku Kalibrace Rozdíly v ablaci různých materiálů a nedostatek vhodných, homogenních a dobře charakterizovaných referenčních materiálů na úrovni stopových prvků komplikují kalibraci. Kalibrace vyžaduje, aby signál korigovaný pozadím z ablace vzorku byl vztažen na standardní 23

31 materiál. Signály pozadí jsou obvykle získány z měření plynného blanku (tedy bez ablace) buď jako samostatný záznam, nebo ještě lépe jako záznam před zahájením ablace. V praxi se používají tři základní kalibrační postupy: externí kalibrace za použití pevného referenčního standardu, externí kalibrace na pevný referenční standard ve spojení s vnitřní standardizací a kalibrace pomocí roztoků. Externí kalibrace vyžaduje použití referenčního materiálu, jehož složení úzce souvisí se složením matrice vzorku (s ohledem na složení majoritních prvků ve vzorku). Použití interních standardů vede k robustnější kalibrační metodě za použití korekce aplikované na různé výtěžky ablace vzorku a referenčního materiálu. Pro analýzu pevných látek v jejich přírodním stavu je potřeba použít přirozeně se vyskytující vnitřní standardy. V případě roztokové kalibrace se před vstupem do plazmové hlavice mísí průtok nosného plynu z laserové ablace s aerosolem generovaným zmlžováním standardního roztoku Výhody a aplikace Laserová ablace má schopnost analyzovat v principu jakýkoliv materiál včetně hornin, minerálů, polymerních materiálů, keramiky, rostlinných a biologických vzorků, dále schopnost analyzovat práškové materiály po vytvoření tablety prášku s pojivem. Nevyžaduje, aby byl vzorek elektricky vodivý. Redukuje polyatomické spektrální interference a je zde minimální kontaminace v porovnání s roztokovou analýzou 21. V závislosti na době mezi pulzy laserového záření a pohybu platformy umožňuje elementární mapování povrchů heterogenních látek (prostorové profily), hloubkové profily pro charakterizaci tenkých vrstev nebo nátěrů (povlaků), povrchové a objemné analýzy Indukčně vázané plazma (ICP) Plazma Plazma je ionizovaný plyn složený z kladných iontů, elektronů a neutrálních částic inertního plynu, který je v makroskopickém měřítku neutrální. Pokud je použit jako plazmový plyn argon, jsou pozorovatelné pouze ionizované Ar ionty. Aby došlo k ionizaci plynu a udržení plazmatu, je třeba dodat vnější energii ve formě elektrického pole. Podle druhu elektrického pole pak rozlišujeme stejnosměrně vázané plazma (DCP), indukčně vázané plazma (ICP) a mikrovlnně indukované plazma (MIP) (cit. 26 ). 24

32 Stejnosměrně vázané plazma vzniká při zavádění plynu mezi 2 3 elektrody, mezi kterými teče vysoký proud. Ionizace plynu vytváří plazma ve tvaru Y. Analytici DCP techniku běžně nepoužívají, protože se potýkají s problémy použitelnosti, spolehlivosti a interferencemi. Avšak DCP má i výhodu v možnosti nasávání velkého množství rozpuštěných nebo nerozpuštěných pevných látek 21. V technice mikrovlnně indukovaného plazmatu se aplikuje mikrovlnná energie ( W) na plazmový plyn a vzniká prstencový plazmový výboj uvnitř skleněné (křemenné) trubice. MIP je náchylný k velmi vážným matričním efektům, protože většinou nikdy nepřekročí teplotu K. Snadno dochází ke zhášení při analýze kapalných vzorků, a proto nejsou dostatečně robustní pro analýzu reálných kapalných vzorků 21. Z výše uvedených důvodů (omezení DCP a MIP) se v dnešní době nejběžněji používá pro optickou emisní analýzu a hmotnostní spektrometrii indukčně vázané plazma Plazmová hlavice Pro generaci a udržení indukčně vázaného plazmatu se používají tři základní komponenty: plazmová hlavice, radiofrekvenční cívka (RF) a napájecí zdroj 21. Plazmová hlavice je tvořena třemi soustřednými křemennými trubicemi vnější, prostřední a vnitřní (nástřik vzorku) trubicí (Obr. 10). Vyrábí se ve dvou možných uspořádáních: buď jsou všechny trubice navzájem spojeny jako jedna součást, nebo je vnitřní trubice oddělena. Pro analýzu vysoce korozivních vzorků může být vnitřní trubice vyrobena i z jiných materiálů (např. oxidu hlinitého, platiny). Plyn (nejčastěji argon) potřebný pro tvorbu plazmatu (vytváří výboj) prochází tangenciálně mezi vnější a prostřední trubicí s průtokem okolo l/min. Druhý tok plynu (pomocný plyn), který stabilizuje výboj, prochází mezi prostřední a vnitřní trubicí s průtokem asi 1 l/min. Třetí plyn procházející vnitřní trubicí s průtokem asi 1 l/min vytváří analytický kanál a slouží k zavádění vzorku (aerosolu). Plazmová hlavice je umístěna v horizontální pozici a ve středu RF cívky ve vzdálenosti asi mm od interface. V hmotnostním spektrometru s ICP musí být cívka uzemněna, aby byl v oblasti interface potenciál blížící se nule. V případě, že by cívka nebyla uzemněna, by mohl nastat sekundární výboj mezi plazmatem a kuželem interface, což by mohlo mít za následek negativní ovlivnění výkonu přístroje 21,44. 25

33 Obr. 10. Schéma plazmové hlavice (převzato z cit. 21 ) RF generátory pro ICP pracují běžně při dvou frekvencích: 27 a 40 MHz. Tyto frekvence byly vybrány výhradně pro tyto přístroje, aby neinterferovaly s jinými frekvencemi. Většina moderních RF generátorů pracují s účinností %, z čehož vyplývá, že % energie se využívá k tvorbě plazmatu. Existují dva typy generátorů: volně kmitající a krystalově řízený. Výhodou volně kmitajícího generátoru oproti krystalově řízenému generátoru je téměř okamžitá kompenzace změn impedance, protože neobsahuje žádné pohyblivé části 21, Princip výboje Na začátku je tok plynu tangenciálně veden mezi vnější a střední trubici křemenné plazmové hlavice. Horní konec hlavice je obklopen RF cívkou napojenou na generátor. Na cívku je vložena radiofrekvenční energie (obvykle W v závislosti na vzorku) a v cívce začne oscilovat střídavý proud rychlostí odpovídající frekvenci generátoru, což způsobí produkci silného elektromagnetického pole, které se bude vyskytovat v horní oblasti hlavice. Na plyn proudící plazmovou hlavicí je aplikován jiskrový výboj z Teslova transformátoru a způsobí uvolnění některých elektronů z atomů ů argonového plynu. Tyto uvolněné né elektrony jsou elektromagnetickým polem zachyceny a urychleny a nastávají jejich 26