PREPARATION OF TRANSGENIC FLAX WITH YEAST GENE FOR INCREASING HEAVY METAL ACCUMULATION

Transkript

1 PREPARATION OF TRANSGENIC FLAX WITH YEAST GENE FOR INCREASING HEAVY METAL ACCUMULATION PŘÍPRAVA TRANSGENNÍCH LNŮ OBSAHUJÍCÍCH GEN PRO ZVÝŠENOU AKUMULACI TĚŢKÝCH KOVŮ Jan Fišer 1,2), Martina Nováková 1,2), Martina Macková 1,2), Tomáš Macek 2,1) 1) Vysoká škola chemicko-technologická, Fakulta potravinářské a biochemické technologie, Ústav biochemie a mikrobiologie, Technická 5, Praha 6, fiserj@vscht.cz 2) Spojená laboratoř VŠCHT a UOCHB, Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, Flemingovo nám. 2, Praha Abstract: In nature exist plants able to accumulate heavy metals in high concentration. These plants have very often slow growth, produce small amount biomass and therefore they are not suitable for phytoremediation. This problem could be solved by preparation of transgenic plants with appropriate properties. The yeast CUP gene encoding yeast protein metallothionein has high affinity to heavy metals and therefore it was chosen for cloning into plant genome of flax (Linum usitatissimum). Plasmid pnov2819 (Syngenta) containing gene for enzyme phosphomannose isomerase (for selection of transgenic plants) was chosen as plant cloning vector. Cassette RbcS with promoter (P-RbcS) and terminator (T-RbcS) of the RUBISCO enzyme was first cleaved out of plasmid piv and then inserted into plasmid pnov2819. HisCUP gene (CUP with histidine tail) was amplified by PCR from plasmid ptrchiscup, formerly used for preparation of transgenic tobacco plants. HisCUP gene was then cloned into prepared plasmid pnov2819/rbcs. Afterwards, the engineered plasmid pnov2819/rbcs/hiscup was transferred to bacteria Agrobacterium tumefaciens C58-C1 (pch32). The possible expression of HisCUP gene in plant of Nicotiana tabacum was studied by transient expression using A. tumefaciens C58-C1 (pch32) harboring pnov2819/rbcs/hiscup. Metallothionein with histidine tail was isolated from plant tissue by affinity chromatography and then it was detected immunochemically by commercial antibody against histidine tail. Finally the transformation of flax was performed via agrobacterial infection. Regenerated plants are nowadays growing on selective medium with mannose as a selective agent. Keywords: fytoremediation, metallothionein, transgenic plant, gene HisCUP, phosphomannose isomerase Lidskou činností, především intenzivní těžbou surovin, zemědělstvím, průmyslem a válečnými operacemi došlo k uvolnění řady toxických sloučenin do životního prostředí. Tyto látky představují vážnou hrozbu rostlinám i živočichům, včetně člověka, a je proto nutné odstranit je z kontaminovaných míst. Konvenční metody remediace půdy zahrnují vykopání a transport kontaminované půdy a následné promývání, imobilizaci nebo extrakci fyzikálně-chemickými metodami. Tyto metody jsou finančně velice náročné a při nízké koncentraci znečištění ekonomicky nevýhodné [1]. Tyto překážky mohou být řešeny využitím metod, jako je např. bioremediace. Při bioremediaci jsou pro rozklad kontaminujících látek na jednodušší produkty využívány bakterie. Další metoda dekontaminace půd i vod, která získává na významu, je fytoremediace. Při této metodě jsou využívány rostliny pro degradaci, zadržení či metabolizaci jak organických, tak anorganických kontaminantů [2], [3]. Vedle ekonomické výhodnosti této technologie jde především o to, že fytoremediace je šetrná k životnímu prostředí, zachovává půdní úrodnost a je použitelná na velké plochy s možnou aplikací pro řadu toxických látek. Oproti konvenčním metodám se však jedná o poměrně dlouhodobé opatření [4]. Výhodou fytoremediace oproti bioremediaci je, že rostliny jsou autotrofní organismy s velkým množstvím biomasy, vyžadují jen skromný přísun živin a navíc zabraňují rozšiřování kontaminace

2 větrnou a vodní erozí [5]. Rostliny také dodávají živiny rhizosférním bakteriím a tak umožňují růst mikrobiálních konsorcií pro další detoxifikaci [1]. V reálných podmínkách nelze oddělovat působení samotných rostlin, ale je nutno komplexně zvažovat interakce rostlin s půdními mikroorganismy. Rostliny mají schopnost detoxifikovat některé polutanty (látky přírodního původu) a xenobiotika (cizorodé látky vytvořené uměle člověkem), ale obecně mají nedostatek katabolických cest pro úplnou mineralizaci organických kontaminantů [6]. Mikroorganismy se přímo účastní odstraňování organických sloučenin, ovšem některé mohou ovlivňovat i příjem anorganických látek rostlinou [7]. Jak již bylo řečeno výše, rostliny se mohou uplatnit při odstraňování kontaminace jak anorganickými, tak organickými sloučeninami. Tím jak komunikují se svým okolním prostředím a berou si z něho živiny, přijímají z anorganických sloučenin různé kovy a jiné stopové prvky. Mechanismy příjmu těchto sloučenin umožňují různým rostlinám v odlišném množství přijímat i toxické těžké kovy a hromadit je v pletivech. Kovy jsou obvykle ukládány ve vakuole po vazbě k různým typům sloučenin snižujících jejich toxicitu a umožňující jejich transport [8]. U organických látek je situace odlišná. Přeměnou organické látky (tzv. fytotransformace) vzniká nefytotoxická látka, která však nemusí být netoxická pro savce a zejména člověka. Může docházet i k redukci na mutagenní či kancerogenní sloučeniny. V ideálním případě by fytoremediace organických xenobiotik měla vést až k úplné mineralizaci [9]. Mezi anorganické polutanty patří především těžké kovy (dále např. radionuklidy). Kontaminace kovy vzniká např. při tavení kovových rud, elektrickém pokovování, hnojení nekvalitními hnojivy a vyvážení čistírenských kalů na pole [10]. Těžké kovy jako Cu 2+, Zn 2+, Mn 2+, Fe 2+, Ni 2+ a Co 2+ jsou esenciální stopové prvky důležité pro rostlinný metabolismus. Avšak tyto kovy v nadbytku a neesenciální těžké kovy jako Cd 2+, Hg 2+ a Pb 2+ jsou extrémně toxické [11]. Jsou příčinou vzniku oxidativního stresu a ovlivňují funkce enzymů. Navíc, na rozdíl od organických polutantů, nemohou být těžké kovy chemicky nebo biologicky degradovány, ale pouze uloženy do různých rostlinných kompartmentů či imobilizovány nebo odstraněny fyzikálně-chemickými metodami (Ghosh a Singh, 2005) [12]. Akumulace kovů pomocí rostlin může být ovlivněna nejen schopnostmi dané rostliny a charakterem kontaminující látky, ale též její koncentrací a formou, ve které se v prostředí vyskytuje. Kovy se mohou v přírodě vyskytovat jako: 1) volné ionty kovů a rozpustné komplexy, 2) ionty kovů specificky adsorbované na anorganické složky půdy, 3) organicky vázané kovy, 4) sraženiny nebo nerozpustné sloučeniny (oxidy, uhličitany, hydroxidy), 5) křemičité minerály [13]. Rostlinné kořeny dobře absorbují kovy, jestliže jsou dostupné pouze v rozpustné formě. Dostupnost a akumulaci lze zvýšit v případě mnoha kovů snížením ph půdy (kovy se uvolní do půdního roztoku) nebo použitím chelatačních činidel (tvorbou komplexů brání sorpci na složky půdy) [14]. V principu se při odstraňování anorganických látek uplatňují následující procesy: Rhizofiltrace je definována jako použití rostlin, vodních i suchozemských, k absorpci, koncentraci a precipitaci kontaminantů ze znečištěných vodních zdrojů s nízkou koncentrací kontaminujících látek v jejich kořenech. Může být použita pro olovo, kadmium, měď, nikl, zinek a chrom, které jsou primárně zadržovány v kořenech [15]. Fytostabilizace hlavním úkolem rostlin je snížit množství vody prosakující přes půdní matrix, který může vést k tvorbě nebezpečných filtrátů, a zabránit půdní erozi a rozšíření toxických kovů na další plochy. Hustý kořenový systém stabilizuje půdu a zabraňuje erozi [16]. Fytoextrakce rostliny absorbují, koncentrují a precipitují toxické kovy a radionuklidy z kontaminovaných půd do biomasy. Je nejvhodnější pro remediaci širokých ploch, kde se polutanty vyskytují v relativně nízké koncentraci a na povrchu [17]. Fytovolatilizace rostliny absorbují kontaminanty z půdy, přemění je na těkavé sloučeniny a uvolní je do atmosféry. Týká se to především arsenu, rtuti a selenu, které mohou existovat v plynných formách [18].

3 Hydraulická regulace využití rostlin s hlubokými kořeny (především stromů) pro odstranění velkého množství vody z půdy, čímž se brání migraci kontaminantů do spodní vody [19]. U většiny rostlin se akumulace těžkých kovů pohybuje v rozmezí hodnot 0,1 100 mg/kg sušiny. Vyšší schopnost akumulovat těžké kovy byla zaznamenána jen u některých rostlin, tzv. hyperakumulátorů. Kritérium pro hyperakumulaci se liší pro různé kovy a je představováno koncentrací kovu v sušině, která je větší než normální fyziologická úroveň [20]. Hyperakumulující rostliny disponují účinnými transportními a detoxifikačními mechanismy, díky nimž jsou schopny koncentrovat ve svých pletivech kov (iont kovu) v koncentracích 50 až 500 vyšších oproti půdním koncentracím [21]. Příklady některých rostlin, u nichž byla zjištěna zvýšená schopnost akumulovat těžké kovy, jsou uvedeny v tabulce I. Kromě druhů uvedených v tabulce I patří mezi hyperakumulující rostliny i druhy schopné akumulovat těžké kovy z vody. Např. vodní hyacint tokozelka nadmutá (Eichhornia crassipes), pupečník obyčejný (Hydrocotyle umbellanta), okřehek menší (Lemna minor) a azolla zpeřená (Azolla pinnata). U těchto druhů byla zjištěna schopnost akumulovat olovo, měď, kadmium, železo a rtuť [19]. Obecně jsou hyperakumulující rostliny úzce vázány na určitý biotop, nebo produkují velmi malá množství biomasy (např. Thlaspi rotundifolium akumulující mg Pb/kg má přírůstek biomasy 50 mg za pět měsíců), což je diskvalifikuje pro praktické použití při fytoextrakci kovů, tj. akumulaci kovů kořenovým systémem a translokaci do prýtu, který lze snadno sklidit [21], [25], [26]. Řešení nabízí technologie genových manipulací rychle rostoucích rostlin s velkou produkcí biomasy, široce větveným kořenovým systémem a jednoduchou agrotechnikou. Tabulka I Příklady rostlinných hyperakumulátorů těžkých kovů [22], [23], [24] Těţký kov Rostlinný druh Konc. kovu po sklizni (mg/kg sušiny) Kadmium Thlaspi caerulenscens ve výhoncích [22] Měď Ipomoea alpina ve výhoncích [22] Kobalt Haumaniastrum robertii ve výhoncích [22] Olovo Thlaspi rotundifolium ve výhoncích [22] Mangan Macadamia neurophylla ve výhoncích [22] Nikl Psychotria douarrei ve výhoncích [22] Sebertia acuminata 25% hm. sušiny dřeva [23] Zinek Thlaspi caerulenscens ve výhoncích [24] Jedním z nejvýznamnějších detoxifikačních mechanismů kovů v rostlinách a obecně eukaryotních buňkách je chelatace kovů ligandy bohatými na sulfhydrylové skupiny, jakými jsou např. glutathion, fytochelatiny a metalothioneiny. Řada modelových studií potvrzuje, že zavádění genů kódujících účinné heterologní ligandy, včetně metalothioneinů, do genomů rostlin může vést ke zvýšenému příjmu kovů a jejich translokaci do prýtu modifikovaných rostlin [27]. Metalothioneiny jsou nízkomolekulární peptidy přítomné v mnoha organismech. Mají vysoký obsah aminokyseliny cysteinu, tudíž jsou bohaté na sulfhydrylové skupiny. Vysoký obsah této funkční skupiny indukuje vazbu kovů do stabilních komplexů, zejména kovů v elektronové konfiguraci d 10 [28], [29]. Dříve panoval názor, že metalothioneiny produkují živočichové, zatímco v rostlinách ochranu proti těžkým kovům zajišťují enzymaticky syntetizované fytochelatiny. Asi před 25 lety byl z rostlinného materiálu izolován první malý protein bohatý na cystein a byl uznán jako metalothionein. Byl to metalothionein nalezený v obilkách rostliny Triticum aestivum (pšenice setá) a označený jako E c [30], [31]. Možná role metalothioneinů ve zvýšení rezistence rostlin k mědi byla identifikována Van Hoofem a kol. [32]. Zjistili, že MT-like gen SvMT2b z Silene vulgaris (silenka nadmutá) měl

4 významně zvýšenou úroveň transkripce v kořenech i v nadzemních částech v populaci rezistentní na měď v porovnání s citlivou populací, a to jak v přítomnosti, tak i nepřítomnosti Cu. Komplementačními studiemi s mutantními kvasinkami Saccharomyces cerevisiae citlivými na kovy byla potvrzena funkce při vazbě esenciálních (Zn, Cu) i neesenciálních kovů (Cd, Pb, Cr) [33]. Cílem práce bylo připravit genový konstrukt s genem HisCUP pro kvasničný metalothionein spojený s histidinovou kotvou a tímto konstruktem transformovat rostliny lnu setého. Gen CUP pochází z kvasinky Saccharomyces cerevisiae a pro zvýšení vazebné kapacity a zároveň usnadnění purifikace produktu exprese byla k tomuto genu připojena další funkční skupina, histidinová kotva (6 histidinových zbytků za sebou). Již dříve bylo na modelu Nicotiana tabacum ukázáno, že exprese genu HisCUP vede ke zvýšení přirozené schopnosti tabáku akumulovat Cd 2+ [34]. Jako rostlinný vektor byl zvolen plazmid pnov2819 (Syngenta), který obsahuje gen pro rezistenci ke spektinomycinu a gen pro fosfomanosaisomerasu (pro selekci transgenních rostlin na mannose). Princip selekce na mannose je založen na faktu, že transgenní rostliny obsahující selekční gen pro fosfomanosaisomerasu přeměňují mannosu-6-fosfát na fruktosu-6-fosfát, která je na rozdíl od mannosy-6-fosfát dále metabolizována, zatímco netransgenní rostliny na selekčním médiu odumírají. Tento selekční mechanismus je alternativou k používání antibiotik. Do plazmidu pnov2819 (Syngenta) byla vnesena kazeta (RbcS) obsahující promotor (P-RbcS) a terminátor (T-RbcS) proteinu RUBISCO, která byla vyštěpena pomocí restrikčních enzymů HindIII a PacI z plazmidu piv. Promotor proteinu RUBISCO je indukován světlem a je až osmkrát silnější než promotor CaMV 35S. Gen HisCUP byl získán pomocí metody PCR z plazmidu ptrchiscup, který byl dříve použit právě pro transformaci rostlin tabáku [34]. Pro tuto reakci byly použity modifikované primery, které v sekvencích na 5 koncích nesly místa pro restrikční enzymy NcoI a BglII. Získaný gen HisCUP byl vložen do připraveného konstruktu pnov2819/rbcs. Plazmid pnov2819/rbcs/hiscup byl poté vnesen elektroporací do bakterie Agrobacterium tumefaciens C58C1 (pch32). Ověření exprese genu HisCUP v rostlinných buňkách bylo provedeno metodou transientní exprese s použitím agrobakteriální infiltrace. Jako modelová rostlina pro transientní expresi byla nejdříve zvolena rostlina tabáku, Nicotiana tabacum. Při této metodě je suspenze bakterie A. tumefaciens s příslušným plazmidem vtlačena spodní stranou do listů. Proto jsou rostliny tabáku vhodnější než rostliny lnu s nedostatečnou plochou listů. Metalothionein obsahující histidinovou kotvu byl poté izolován z rostlinného pletiva afinitní chromatografií na Ni-NTA agarose. Po rozdělení proteinů Tricin SDS elektroforézou a následném přenesení na nitrocelulózovou membránu byl metalothionein detekován imunochemicky komerční protilátkou proti histidinové kotvě. Vyhodnocení pokusu však nebylo v tomto konkrétním případě zcela jednoznačné, neboť určitá positivní odezva byla detekována i v negativní kontrole. Trvalá transformace rostlin lnu setého byla provedena pomocí bakterie Agrobacterium tumefaciens C58C1 (pch32) s plazmidem pnov2819/rbcs/hiscup. Transformovány byly hypokotyly sterilně vypěstovaných rostlin, ze kterých byly získány regenerující rostliny. Tyto rostliny byly nejprve selektovány na médiu s nízkou koncentrací mannosy a pro další práci byly vybrány pouze prodlužující se rostliny. Ty byly následně přeneseny na kořenící médium s mannosou, kde by transgenní rostliny měly začít tvořit kořeny. V současné době je proces transformace rostlin lnu a selekce transgenních rostlin dále optimalizován. Pouţitá literatura [1] CHERAIN S., OLIVEIRA M. M. (2005): Transgenic plants in phytoremediation: Recent advances and new possibilities. Environ. Sci. Technol 39: [2] CUNNIGHAM S. D., BERTI W. R., HUANG J. W. (1995): Phytoremediation of contaminated soils. TIBTECH 13: [3] CUNNIGHAM S. D., OW D. W. (1996): Promises and prospects of phytoremediation. Plant Physiol. 110:

5 [4] KUMAR P. B. A. N., DUSHENKOV V., MOTTO H., RASKIN I. (1995): Phytoextraction: The use of plants to remove heavy metals from soils. Environ. Sci. Technol. 29: [5] PULFORD I., WATSON C. (2003): Phytoremediation of heavy metal-contaminated land by trees a review. Environ. Int. 29: [6] EAPEN S., SINGH S., D SOUZA S. F. (2007): Advances in development of transgenic plants for remediation of xenobiotic pollutants. Biotechnol. Adv. 25: [7] DE SOUZA M. P., HUANG C. P. A., CHEE N., TERRY N. (1999): Rhizosphere bacteria enhance the accumulation of selenium and mercury in wetland plants. Planta 209: [8] CHERAIN S., OLIVEIRA M. M. (2005): Transgenic plants in phytoremediation: Recent advances and new possibilities. Environ. Sci. Tech. 39: [9] MACEK T., PAVLÍKOVÁ D., MACKOVÁ M. (2004): Phytoremediation of metals and inorganic pollutants. V knize: Soil Biology, Vol. 1, Applied bioremediation and phytoremediation (Singh A., Ward O. P.). Springer Verlag Berlin, Heidelberg, [10] RASKIN R. D., KUMAR P. B. A. N., DUSHENKOV S., SALT D. E. (1994): Bioconcentration of heavy metals by plants. Curr. Opin. Biotechnol. 5: [11] WILLIAMS L. E., PITTMAN J. K., HALL J. K. (2000): Emerging mechanism for heavy metal transport in plants. Biochim. Biophys. Acta. 1465: [12] GHOSH M., SINGH S. P. (2005): A reviw on phytoremediation of heavy metals and utilization of byproducts. Appl. Ecol. Env. Res. 3: 1-18 [13] SCHNOOR J. L. (2002): Phytoremediation of soil and ground-water. GWRT Series, E-Series: TE-02-01, 1-45 [14] ROMKENS P., BOUWMAN L., JAPENGA J., DRAAISMA C. (2002): Potential and drawbacks of chelate-enhanced phytoremediation of soils. Env. Pollution 116: [15] CHAUDHRY T. M., HAYES W. J., KHAN A. G., KHOO C. S. (1998): Phytoremediation focusing on accumulator plants that remediate metal-contaminated soils. Australas. J. Ecotox. 4: [16] BERTI W. R., CUNNINGHAM S. D. (2000): V knize: Phytoremediation of toxic metlas: Using plants to clean up the environment (Raskin I., ed.), John Wiley & Sons, New York [17] RULKENS W. R., TICHÝ R., GROTENHUIS J. T. C. (1998): Remediation of polluted soil and sediment: Perspectives and failures. Water Sci. Technol. 37: [18] PRASAD M. N. V., FREITAS H. M. O. (2003): Metal hyperaccumulation in plant bioprospecting for phytoremediation technology. Electr. J. Biotech. 6: [19] MCCUTCHEON S. C., SCHNOOR J. L. (2003): V knize: Phytoremediation: Transformation and control of contaminants. Wiley [20] BAKER A. J. M., MCGRATH S. P., SIDOLI C. M. D., REEVES R. D. (1994): The possibility of in situ heavy metal decontamination of polluted soils using crops of metal-accumulating plants. Resour. Conserv. Recyc. 11, [21] CLEMENS S., PALMGREN M., KRÄMER U. (2002): A long way ahead: understanding and engineering plant metal accumulation. Trends Plant Sci. 7: [22] BAKER A. J. M., WALKER P. L. (1990): Ecophysiology of metal uptake by tolerant plants. V knize: Heavy metal tolerance in plants: Evolutionary aspects (Shaw A. J., ed.). CRC Press, Boca Raton, FL, [23] JARVIS S. C., JONES L. H. P., HOPPER M. J. (1976): Cadmium uptake from solution by plants and its transport from roots to shoots. Plant Soil 44: [24] BROWN S. L., CHANEY R. L., ANGLE J. S., BAKER A. J. M. (1994): Zinc and cadmium uptake by Thlaspi caerulescens and Silene vulgaris in relation to soil metals and soil ph. J. Environ. Qual. 23: [25] MACEK T., KOTRBA P., SVATOŠ A., NOVÁKOVÁ M., DEMNEROVÁ K., MACKOVÁ M. (2008): Novel roles for genetically modified plants in environmental protection. Trends Biotechnol. 26: [26] BANUELOS G. S., LIN Z. Q., TERRY N. (2002): Phytoremediation of selenium-contaminated soils and waters: Fundamental and future prespect. Rev. Environ. Health 17: [27] KOTRBA P., NAJMANOVÁ J., MACEK T., MACKOVÁ M. (2009): Genetically modified plants in phytoremediation of heavy metal and metalloid soil and sediment pollution. Biotechnol. Adv. 27: [28] KÄGI J. H. R., HIMMELHOCH S. R., WHANGER P. D., BETHUNE J. L., VALLEE B. L. (1974): Equine hepatic and renal metallothioneins: purification, molecular weight, amino acid composition, and metal content. J. Biol. Chem 249: [29] KOJIMA Y., BERGER C., VALLEE B. L., KÄGI J. H. R. (1976): Amino-acid sequence of equine renal metallothionein-1b. Proc. Natl. Acad. Sci USA 73: [30] HANLEY-BOWDOIN L., LANE B. G. (1983): A novel protein programmed by the mrna conserved in dry wheat embryos. The principal site of cystein incorporation during early germination. Eur. J. Biochem. 135: 9-15 [31] LANE B. G., KAJIOKA R., KENNEDY T. (1987): The wheat germ Ec protein is a zinc-containing metallothionien. Biochem. Cell Biol. 65:

6 [32] VAN HOOF A. L. M. N., HASSINEN V. H., HAKVOORT H. W. K., BALLINTIJN K. F., SCHAT H., VERKLEIJ J. A. C., ERNS W. H. O., KARENLAMPI S. O., TERVAHUATA A. I. (2001): Enhanced copper tolerance in Silene vulgaris (Moench) Garcke populations from copper mines is associated with increased transcrip levels of a 2b-type metallothionein gene. Plant Physiol. 126: [33] MA M., LAU P. S., JIA Y. T., TSANG W. K., LAM S. K. S., TARN N. F. Y., WONG Y. S. (2003): The isolation and characterization of type 1 metallothionein (MT) cdna from a heavy-metal-tolerant plant, Festuca rubra cv. Merlin. Plant Sci. 164: [34] Macek, T., MACKOVÁ, M., PAVLÍKOVÁ, D., SZÁKOVÁ, J., TRUKSA, M., SINGH CUNDY, A., KOTRBA, P. a kol. (2002): Accumulation of Cadmium by Transgenic Tobacco. Acta Biotechnologica 22: