Transport - protein sorting

Transkript

1 Transport - protein sorting Savčí buňka > typů proteinů Kvasinková buňka - cca 5000 proteinů přesná lokalisace (organely, membrány, atd.) část proteinů syntetisována z DNA mitochondrií a chloroplastů syntéza na ribosomech těchto organel X častěji syntéza cytosol distribuce mrna Nascentní protein - ER signální sekvence ER GA

2 Drsné ER - vstup proteinů do ER během translace ER- signální sekvence na N-konci (6-12 hydrofobních AK za 1-2 basickými AK) Buňky specialisované pro sekreci - velké množství ER a cisteren GA

3 SEKREČNÍ DRÁHY EXOCYTOSA Pouze, je-li signál (hormon), do té doby ve vesiklech LYSOSOM Nejdále od ER Migrace cisteren Mnoho proteinů modifikováno (glykosylace) RETROGRÁDNÍ TRANSP. Nejblíž k ER Cis - Golgi reticulum TRANSPORTNÍ VESIKLY - o 50 nm RETROGRÁDNÍ TRANSP. GA-ER Regulovaná sekrece: (př. insulin, endorfiny, trypsin, casein..) Konstitutivní sekrece: (př. proteiny séra - albumin, proteiny extracel. matrix - collagen, fibronectin ) mrna

4 MATURACE SEKRETOVANÝCH PROTEINU - 5 KROKU Kvasinkové sec mutanty - akumulace sekretovaných proteinů v místě bloku Membránové glykoproteiny - podobná cesta jako sekretované proteiny

5 1. Translokace proteinů přes membránu ER AK signální sekvence ER transport -N -konec 6-12 hydrofobních AK za nabitými AK - vlastní sekvence odlišné SEKRETOVANÉ PROTEINY mohou přejít přes ER membránu a signální sekvence je odstraněna POUZE BĚHEM PROTEINOVÉ SYNTÉZY Membrány ER KO-TRANSLAČNÍ TRANSPORT SIGNÁLNÍ PEPTIDASA - lokalisovaná v lumen ER X některé malé peptidy (např. a-mating faktor, cca 70 AK) -POST-TRANSLAČNÍ transport do ER (chaperony) Mikrosomy musí být přidány před tím, než je nasyntetizováno cca 70 AK

6 SEKRETORICKÉ PROTEINY - syntéza na ER membránách (ne na jiných membránách) - Signální sekvence - rozpoznání SRP ( signal recognition particle ) SRP receptor Signal recognition particle SRP - cytosolická partikule transientně se váže na ER-signální sekvenci na proteinu vazba k SRP receptoru na membráně ER 300 nukleotidů dlouhá RNA 6 proteinů (5 z nich vazba k RNA) Signální sekvence signal recognition particle TRANSLOKON zavřený otevřený Signální sekvencevazba na translokon Disociace SRP hydrolysa GTP odštěpení signální sekvence chaperon Vazba signální sekvence Nutný pro proteinovou translokaci Interakce s ribosomem RIBONUKLEOPROTEINOVÝ KOMPLEX Hsc70 chaperon (kvasinky, ne savčí buňky) - vazba spojená s hydrolysou ATP TRANSLOKON - nascentní protein TRAM (translocating chain associated membrane protein) (ATP se do ER dostává pomocí - savčí ATP/ADP antiporteru) - 8 membránových domén (ER) - glykosylace - Asp, Ser, Thr -nezbytný pro translokaci zbytky SEC61 (savčí) - homolog kvasinkového SEC61 proteinu - dokončení syntézy - uvolnění - 10 transmembránových domén, vazba s dalšími proteiny (sec61β, sec61γ) -? vazba ribosomu

7 Hydrolýza GTP - nutná pro proteinový transport do ER (energie) V kvasinkách - translokace (fce Hsc70) vyžaduje ATP hydrolysu (x v savčích buňkách stačí GTP)

8 2. Inserce membránových proteinu do membrany ER CYTOSOL LUMEN ER, GA nebo VNĚJŠÍ STRANA BUŇKY Membránové proteiny - stejná sekreční dráha jako nemembránové topologie (N,C konec, nemembránové a transmembránové oblasti) -určena již v ER - zůstává zachována během transportu Inserce do membrány ER - závisí na specifických TOPOGENNÍCH SEKVENCÍCH (<24 AK)

9 Inserce insulinoveho receptoru (a podobných proteinu) - vnitřní stop-transfer membrane-anchor sekvence (α-helix) cca 22 AK - zůstane vázána v translokonu, protein se přestane translokovat do ER -přerušení těsné vazby mezi translokonem a ribosomem Dokončení syntézy v cytosolu Uvolnění sekvence z translokonu Signální sekvence

10 Interní signální sekvence Inserce asialoglykoproteinového receptoru (a podobných proteinů) -vnitřní signal-anchor sekvence (transferrinový receptor) obrácená orientace v membráně než insulinový receptor Funguje jako -ER signální sekvence -membránová kotva není štěpena, zůstává N konec v cytopl. uvolnění sekvence z translokonu závisí na konkrétních chemických vlastnostech sekvence CYTOCHROM P450 také interní sekvence x obrácená orientace

11 Transmembránové proteiny s více transmembránovými doménami - multiple topogenic sekvence - iontové pumpy, kanály, transportery... αhelixy Na inserci neparticipují SRP a SRP receptor 2. signal anchor sekvence 2. STOP- transfer anchor sekvence 1. signal anchor sekvence (interní) iniciuje inserci do ER 1.STOP-transfer anchor sekvence posun se zastaví

12 Některé proteiny po inserci do ER membrány - transport k GPI kotvě řada proteinů ukotvena do fosfolipidové dvojvrstvy nikoli hydrof. AA, ale GPI kotvou (glycosyl fosfatidyl inositol) Rozpoznání endoproteasou štěpení přenos na GPI kotvu 1. inserce do ER membrány jako insulinový receptor (štěpení N-koncové signál. sekvence) + internal stop-transfer membrane anchor sekv. 2. odštěpení a přenos na GPI kotvu odstranění cytoplasm. hydrofilní domény Proteiny s GPI kotvou z proteinu mohou difundovat v membráně např. polarisované epiteliální b. GPI kotva lokalisace proteinů do apikální domény (x Proteiny s alfa-helixy často vázány cytosol. sekvencemi s cytoskeletem)

13 Post-translační modifikace a kontrola kvality proteinů v drsném ER 1. Tvorba disulfidických mustků drsné ER 2. Správný folding drsné ER 3. Připojeni a úprava carbohydrátů drsné ER + další 4. Specifické proteolytické štěpení drsné ER + další 5. Assembly multimerních proteinů drsné ER Pouze správně sbalené proteiny transport z drsného ER do GA a dále Špatně upravené proteiny zpět do cytoplasmy (přes translokon) ERAD dráha (ER associated protein degradation) rozpoznává špatně sbalené nebo poškozené proteiny (např. špatné a neopravitelné S-S můstky) Maturace proteinu Správně sbalený protein Transport nesbaleného proteinu Špatně sbalený protein směrován na receptor membránově vázané ubiquitin ligasy, přenos do cytosolu (mechanismus?) polyubiquitinace Transport do proteasomu

14 1. Tvorba disulfidických mustků (-S-S-) nutný správný výběr (někdy během synthesy) x Někdy nutné přeměnit vazby -S-S- po synthese stabilisace terciární (kvart.) struktury proteinů Cys thiolové skupiny (-SH) oxidativní propojení tvorba S-S můstků pouze v ER (nikoli v cytoplasmě) PDI = protein disulfide isomerase intermediát pouze v sekretovaných proteinech ER lumen - vhodné redox prostředí pro oxidaci -SH skupin (x cytosol) PDI široké spektrum účinku pomáhá proteinům zaujmout termodynamicky stabilní konformace Glutathion (tripeptid) majoritní molekula obsahující thiolové skupiny v EB prevence formace -S-S- můstků v cytosolu Glutathion přechod mezi reduk. a oxid. formou GSH 50 GSSG : 1 (cytosol) Glutathion reduktase NADPH + H + + GSSG NADP + + 2GSH PDI - vazba proteinu, který nejde opravit PDI se z komplexu uvolní tvorba vnitřního S-S můstku

15 2. Správný folding - zprostředkován řadou proteinů ER folding - velmi rychlý (min) pomocné proteiny PDI (proteindisulfide isomerase) transientní vazba Hsc 70 2 homologní lektiny (Calnexin, Calreticulin) vazba k specifickým karbohydrátům Calnexin Tvorba trimeru Calreticulin + další proteiny Peptidyl prolyl isomerasy rotace kolem peptid. vazby (např. Drosophila: Nina A protein) Disulfidické vazby Hematoglutinin (HA) trimer tvorba trvá asi 7 min

16 Kontrola správně sbalených proteinů pro transport ER - GA špatný folding blok transportu např. permanentní vazba na Hsc 70 nebo Calnexin Endonuclease Unfolded proteins Kinase neštěpená HAC1 mrna štěpení endon. IRE1 Jaderný pór štěpená HAC1mRNA HAC1 (transkripční faktor) Kvasinky + savčí buňky: přítomnost nefoldovaných nebo špatně sbalených proteinů v drsném ER zvýšení transkripce genů kódujících chaperony (i Hsc 70) unfolded protein response IRE1 protein IRE1: transmembr. protein vnitřní jaderné membrány propojena s ER doména otočená do jádra kinasa (? fce) + endonukleasa RNA-specifická Vazba nefold. proteinu dimerisace receptoru IRE1 aktivace endonukleasy štěpení prekursoru mrna pro transkripční faktor HAC1 aktivace exprese CHAPERONŮ

17 Mnoho špatně assemblovaných proteinu je z ER transportováno do cytosolu a degradováno - špatné sekretorické i membranové proteiny - degradace za 1-2 hod- - transport zpet do cytoplasmy přes translokon - degradace prostřednictvím ubiquitin/proteasomu - 2 ubiquitin konjugujici enzymy - lokalisace na cytosolickou stranu ER -? Mechanismus rozpoznání a transportu ven z ER Proteiny ER se do ER vracejí zpět z Cis-Golgi cisteren - residentní proteiny ER (Hsc70, PDI ) - specifická C-koncová sekvence KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu)- nezbytná a dostačujici pro udržení proteinu v ER. - KDEL receptor - záchytává proteiny s KDEL sekvencí, lokalisace v membránách malých transportních vesiklu mezi cis-golgi a ER + v cis-golgi + ER proteiny - oligosach. řetězce s modifikacemi specifickými pro cis-golgi

18 N a O glykosylace: velmi odlišné, různé cukerné zbytky O-glykosylace: oligosacharidy připojeny a) k hydroxylové skupině Ser nebothr prostřednictvím N-acetylgalactosaminu nebo b) k hydroxylové skupine hydroxylysinu přes galaktosu (kolageny). - oligosacharidy krátké (1-4 cukerné zbytky) - biosynthesa: pridávání cukru po jednom, různé GLYKOSYLTRANSFERASY N-glykosylace: N-acetylglukosamin je připojen k amidoskupině Asn - složité oligosacharidy (manosa, k.sialová, větvení) - biosynthesa: pripojování dlouhých preformovaných oligosacharidu (14 cukerných zbytku) 3. Glykosylace proteinů v ER a GA Thr Většina cytosolických a jaderných proteinu není glykosylována (vyjimka - některé transkripční faktory + proteiny lokalisované v komplexu jaderného póru).

19 O-glykosylace Prekursory: nucleoside di-p nebo mono-p cukry Glykosyltransferasy: integrální membránové proteiny, specifické - donor / akceptor Nucleotid-cukr: - syntéza v cytosolu z NTP a cukr-fostátu. - import do ER a GA - specifické antiporterové proteiny (nukleotidy ven, UMP, CMP, GMP) UDP-Gal = UDP-galaktosa UDP-GalNAc = UDP- N-acetyl-galaktosamine

20 Dolicholfosfát: silně hydrofobní, 4-5 x přes membránu 1. vazba makroergní N-glykosylace Biosynthesa N-oligosacharidu zacíná v drsném ER připojením dlouhého prekursoru - vázán na DOLICHOL= polyisoprenoid lipid (79-95 C) v membráně ER přenašeč oligosacharidu. Dolichol pyrophosphoryl oligosacharid - tvorba na ER membráne. Oligosacharid - orientován smerem do lumen ER. Struktura prekursoru: stejná u rostlin, zivočichu, jednobuněčných eukaryot 3 x Glc, 9 x Man, 2 x N-acetyl- glucosamine Přenos z dolicholu na Asn zbytek nascentního polypeptidu Hotový prekursorpřenos na proteiny Konservované zbytky Asn-X-Ser nebo Asn-X-Thr oligosacharide - protein transferase: - 3 podjednotky - 1 a 2 podjednotka - Ribophorins (integralní membránové proteiny ER, cytosolické domény se váží s velkou podjednotkou ribosomu) - 3. podjednotka - uvnitř ER - vlastní přenos

21 Drsné ER oligosacharide - protein transferase 3 Glc + 1 Man jsou odstraněny Glc zbytky -? signál, ze oligosacharid je pripraven k přenosu na protein Glucosyltransferasa - lumen ER - znovu přidává 1 Glc zbytek - glukosylace špatně sbalených proteinu (ne nativnich) Calnexin, Calreticulin: selektivní vazba na re-glukosylované oligosacharidy, zabrání sbalení sousedních AA segmentu, po uvolnění deglukosylace. Přechod do GA - další modifikace (ruzné enzymy v cis, medial a trans GA) - variabilita - nekteré modifikace proběhnou, jiné ne Oligosacharidy: - někdy nutné pro správný folding, x řada sekretorických proteinu se sbalí správně a je transportována i bez gykosylace. - rozdíly ve stabilitě - glykosylované obvykle stabilnější než neglykosylované

22 Některé N-oligosacharidy - směrování lysosomálních enzymu do lysosomu -přidání a počáteční processing oligosacharidových prekursoru v drsném ER je stejný pro membránové, sekretorické i lysosomální enzymy. - v cis-golgi - manosové zbytky (1-více) FOSFORYLACE -2 kroky: a) připojení N-acetyl-glucosamin fosfátu (GlcNAc phosphotransferasa) b) odstranení N-acetyl-glucosaminu fosfodiesterasou - zustává mannosa-6p mannosa-6p

23 mannosa-6p - vazba mannosa 6-P receptory -vtrans Golgi - VESIKLY obsahující M6P receptory - pučení z trans Golgi a fuse s organelami late endosomy (vnitřní ph 5.5). M6P váže M6P-receptory při ph > 6, M6P se uvolní v endosomech + fosfatasa uvnitř endosomu - defosforylace lysosomálních enzymu Z late endosomu -pučí 2 typy vesiklu. 1) obsahují lysosomální enzymy, ale nikoli M6P receptor - fusují následně s LYSOSOMY; 2) recyklují M6P-receptory (zpět do trans-golgi nebo na buněčný povrch) M6P-receptor- přenáší neaktivní lysosomální proenzymy, aktivace v late endosomu nebo lysosomu POZDNÍ ENDOSOM

24 Protein sorting a processing - Golgi a post-golgi Golgi-enzymy: inserce do membrány drsného ER, pohyb transportními vesikly do GA. Ruzné GA - lokalisované enzymy (napr. glykosylacní) - podobná struktura: N-terminální doména (cytosol), 1 x transmembránový alpha-helix (důležitý pro lokalisaci v Golgi, zabrání transportu dále,? mechanismus), C-koncová doména (GA-lumen) s katalytickým místem A) Konstitutivní sekrece Kontinuální versus regulovaná (reakce na stimul) sekrece Proalbumin proteinu - Sorting do regulované dráhy - kontrola selektivní agregací proteinů. - Nematurované vesikly (pučící z trans-golgi) - zabalené do CLATHRINU, obsahují core tvořené agregovaným sekretorickým proteinem (k agregaci zřejmě dochází před inkorporací do vesiklu). B) Regulovaná sekrece - Regulované sekretorické vesikly (savčí buňky) obsahují 2 proteiny CHROMOGRANIN B a SECRETOGRANIN II (agregují při inkubaci při Proinsulin ph 6.5 a Ca, i v trans-golgi. Agregáty se netvoří při neutrálním ph (v ER)? Selektivní agregace regulovaných proteinu - sorting do regulovaných vesiklů Proteolytický processing pro-proteinu -některé proteiny plasmatické membrány a vetšina sekretovaných proteinu-syntéza jako inaktivní prekursory ( proproteiny ) (albumin, insulin ) -většinou probíhá v sekretorických vesiklech odvozených z trans-golgi Albumin Endoproteasy: Štěpí za sekvencemi Arg-Arg nebo Lys-Arg (kvasinkový homolog KEX2) savčí buňky : Furin, PC3, PC2 Insulin

25 Sorting proteinu z GA do apikální nebo basolaterární membrány - Plasmatická membrána polarisovaných epitheliálních bunek - 2 domény - apikální a basolaterární - ruzné proteiny - specifický sorting (řada mechanismů) - sorting v trans-golgi - proteiny, které finálně lokalisují na různých místech, v trans-golgi nalezeny na stejné membráně. - 2 typy vesiklu pučí z trans-golgi - 1 typ - fusuje s apikálni membránou, 2 typ fusuje s basolaterární membránou. Vesikly obsahují specifické Rab a V-SNARE proteiny - role v lokalisaci do správného místa. - např. proteiny s GPI (glycosylphosphatidyl inositol) kotvou - v různých typech buněk specifické lokalisace - kromě GPI kotvy nebyly identifikovány unikátní sekvence pro specifický targeting,? Mnohonásobné sekvence - Hepatocyty: všechny proteiny nejprve z trans-golgi do basolaterární membrány, poté jak basolaterární tak apikální proteiny - endocytosa do vesiklu - dráhy se odliší, basolaterární se vrátí zpět, apikální se prostřednictvím transportních vesiklu dostanou do apikální membrány - TRANSCYTOSA -role cytoskeletu BASO- LATERÁRNÍ VSV APIKÁLNÍ Chřipkový HA glykoprotein Infekce buněk VSV virem a chřipkovým virem

26 Receptorem zprostredkovaná endocytosa, sorting internalisovaných proteinů - Internalisace materiálu z okolí - fagocytosa (závislá na aktinu, pouze specialisované bunky) a endocytosa (tvorba membránových vesiklu o velikosti μm; většina eukaryotických buněk) Endocytosa: -pinocytosa (nespecifická, příjem kapek z okolí) -receptor-mediated endocytosis: specifický receptor na bunecném povrchu - vazba na extracelulární makromolekulu (ligand) - endocytosa, receptor - ligand komplex - inkorporace do intracelulárního transportního vesiklu CAVEOLAE (invaginace plasmatické membrány) obsahují membránový protein caveolin, obsahují některé receptorové proteiny - specifický typ endocytosy Clathrin-coated pit X nejčastější receptor- endocytosa CLATHRINOVÉ VESIKLY (clathrin coated pits) - tvoří asi 2 % povrchu některých buněk (napr. hepatocyty a fibroblasty) Ferritin LDL particles (low-density-lipoprotein) - savcí bunky

27 LDL (low-density lipoprotein) - PARTIKULE -přenásejí cholesterol v krvi nm v prumeru - vetsina savcich bunek produkuje povrchový receptor, který váze a internalisuje LDL partikule - po endocytose, LDL transport do lysosomu, hydrolasy štěpí ApoB na aminokyseliny a cholesterol, estery na cholesterol a mastné kyseliny - LDL receptor - glykoprotein 839 AK, transmembránový ApoB protein LATE ENDOSOMES - acidické ph - fibroblasty - internalisace cca 50 % povrchových proteinu / hod. - vetsina povrchových receptoru - opakovane umístí ligand uvnitr bunky a vrátí se do membrány. - napr. LDL receptory - cyklus za min X nekteré receptory (napr. insulin, rustové faktory) - cyklus jen 2-3 x a poté degradovány v lysosomech (- snízení citlivosti bunky k hormonální signalisaci) - disociace receptoru a ligandu - obvykle v late endosomech pozdní endosomy: obvykle blízko bunecného povrchu

28 LDL partikule Clathrin Coated pit Coated vesicle Clathrin triskelion Uncoated vesicle (early endosome) Sorting vesicle (late endosome) Separace LDL partikule od receptoru při nízkém ph (ph 5.0) - recyklace receptoru na plasmatickou membránu Transport vesicle Lysosome - degradace LDL na AK, cholesterol, mastné kyseliny

29 Ferrotransferrin Transferrinový receptor Apotransferrin se uvolní z transferrinovému receptoru při neutrálnímph Transport Fe Transferrin = majoritní glykoprotein krve, transportuje zelezo do bunek Apotransferrin - váže dva Fe3+ ionty a tvoří ferrotransferrin Transferrinový receptor - váže ferrotransferrin při neutrálním ph endocytosa Při ph <6, Fe3+ disociují z ferrotransferrinu Apotransferrin zustane vázán k transferrinovému receptoru při nízkém ph

30 Transcytosa: pohyb ligand buňkou Import extracellularního ligandu na jedné straně buňky, transport cytoplasmou a export z druhé strany Polarizované epithelialni bunky Při ph 7 uvolnění z receptoru Fc receptor - vazba Fc oblast IgG při ph 6

31 Molekulární mechanismy transportu pomocí vesiklu 3 typy obalených ( coated ) vesiklu (mají proteinový obal na cytosolickém povrchu) - transport proteinu ze zdrojové organely do cílové organely -během tvorby vesiklu - subjednotky obalového proteinu - polymerace okolo vznikajícího vesiklu -některé subjednotky obalových proteinu nebo s nimi asociovaných adapterových proteinu - role v selekci prenasených proteinu (cargo proteiny) - cargo proteiny - mají specifické sekvence, které je směrují do specifického vesiklu - Role GTP-vazebného proteinu regulujícího úcinnost tvorby vesiklu membrána GTP-vazebný protein Membránový receptorový protein solubilní cargo p. membránový cargo protein obalové a adapterové proteiny

32 VESIKLY: 1. Clathrinové - z plasmatické membrány a trans-golgi; do pozdních endosomu 2. COPI - retrograde směr mezi GA cisternami a z cis-golgi do drsného ER 3. COPII - z drsného ER do GA

33 1. CLATHRINOVE VESIKLY nm průmer - obal tvořený clathrinem (težký a lehký řetězec) Triskelion -assembly i bez membránového vesiklu

34 integralní proteiny vyloucené z transportního vesiklu Triskelion - vazba k tzc. assembly particle - obsahuje adapterové proteiny assembly particle - vazba i k membránovým proteinům -určení, které budou zahrnuty do pučiciho transportního vesiklu 3 typy assembly partikulí - AP1, AP2, AP3 - různé adapterové proteiny DYNAMIN - nezbytný pro tvorbu clathrin-coated pit - vazba a hydrolysa GTP -? regulace kontrakce a odškrcení vesiklu - inkubace b.extraktu s derivatem GTP, který nemůže být hydrolysován - akumulace clathrin-coated pits s prodlouzenymi krčky s polymerovaným dynaminem - neuvolni se Další dva proteiny - nezbytné pro tvorbu clathrinových vesiklu: AMPHYPHYSIN - vazba na dynamin a assembly particle SYNAPTOJANIN - vazba na amphyphysin a dynamin CLATHRIN-COATED VESICLE Depolymerace clathrinových vesiklu: clathrinové vesikly - stabilní při ph a iontovém slození cytosolu X ztrací clathrinový obal rychle po vzniku - asi role cytosolického Hsc70 (a dalsich chaperonu) - clathrin - recirkulace na další vesikly

35 2. COPI VESIKLY COPI vesikly - tvořeny z cytosolických komplexů coatomers obsahujících 7 polypeptidových podjednotek - polymerace na povrchu pučicích vesiklu a disociují pryč rychle po jejich uvolnení - některé podjednotky - spojka mezi membránovým proteinem a obalem - specificka inkorporace proteinu integralní proteiny vyloucené z transp. vesiklu Golgi cisterna ARF receptor ARF = malý GTP-vazebný protein hladina ARF-GTP - regulace podle potreby ARF-GTP - vazba na ARF-receptor COPI coatomer - vazba na ARF a další proteiny cytosolické strany GA Fatty acyl CoA - nutný pro uvolnení a maturaci vesiklu -? mechanismus Depolymerace obalu -? řídí hydrolysa GTP GTP analog - nedojde k hydrolyse ani k depolymeraci Retrograde transport - KDEL sekvence -vzbak COPα a β podjednotkam Kvasinkové sec mutanty

36 3. COPII VESIKLY (transport z ER do GA) - tvorba podobná jakocopi (analog Arf proteinu je Sar1 Cis-Golgi Pohyb podél mikrotubulu Fuse COPII vesiklu - tvorba ER-Golgi intermediárního kompartmentu Drsné ER

37 Specifické fuse vesiklu Fuse - poté co depolymerují obaly - vyzadují konservované skupiny proteinu nutné pro privedení vesiklu k cílovému partnerovi a poté pro fusi Komplex T-SNARE a SNAP25 Rab protein V-SNARE Akceptorová membrána? NSF,α,β,γ-SNAPs V-SNARE Depolymerace - odkryje specifické integrální membránové proteiny V-SNARE (inkorporované při pučeni ) - pro každý typ vesiklu - privedou vesikly k cíli Membrány vsech typu obsahují protein pro fusi (SNAP25) a 1-více integrálních membránových proteinu T-SNARE - kooperativní specifická vazba V-SNARE V-SNARE, T-SNARE a SNAP25 - dostatečné pro zprostředkování fuse (liposomy) - pomalu X v bunkách - fuse během sekund další proteiny NSF - tetramer, váže a hydrolysuje ATP α, β a γ - SNAPs (soluble NSFattachment proteins) - vazba NSF k membráně vesiklu GTP-vazebné Rab proteiny - regulatory pohybu vesiklu -struktura podobná Ras - GTP hydrolysa -? Regulace frekvence fuse - regulace pomeru Rab-GTP : Rab-GDP Prefusion complex Přidržení vesiklu u membrány Vesikly nesoucí V-SNARE - návrat k puvodní membráně

38 TARGETING SEKVENCE - ORGANELY (SKL) SYNTHESA A TARGETING DO MITOCHONDRIÍ A CHLOROPLASTU Mitochondrie a chloroplasty strukturně podobné -dvě membrány, chloroplasty navíc interní membránový kompartment - thylakoidy - vyuzívají proton-motivní sílu a F-ATPasy pro generování ATP - podobné elektron transportní proteiny - většina proteinu syntetisovana na cytosolických ribosomech, které nejsou vázány na drsné ER - uptaketargeting sequences - příjem proteinu větsinou vyžaduje energii a závisí na integrálních proteinech organel Mitochondrie - prekursorové proteiny - syntéza v bezbuněčném systému, pak přidání mitochondrií -inkorporace prekursoru do organel + odstřižení (většinou)sekvence

39 A) Transport do mitochondriální matrix Hlavní charakteristiky importu do mitochondrií 1) informace pro targeting do matrix je v N-terminální targeting sekvenci (fusní proteiny - experimenty) 2) Pouze nesbalené proteiny mohou být importovány 3) Translokace probíhá pouze v místech, kde jsou vnitrní a vnejsí membrána v blízkosti Nascentní prekursorový protein MSF Chaperon - energie z ATP Matrix-targeting sequence MSF se uvolní Hsc70 MSF (mitochondrial-import stimulating factor) - zabrání spatnému sbalení a agregaci prekursoru Transport přímo na Tom20/22 Tom40 = kanál vnejší membrány Transport do mitochondrií vyzaduje energii 3 zdroje energie 1) ATP hydrolysa v cytosolu - chaperony - udrzení proteinu v nesbaleném stavu 2) proton-motivní síla na vnitřní membráně -pro translokaci, ne pro vazbu na receptor, transmembránový potenciál (200 mv, matrix negativní) 3) ATP hydrolysa v mitochondriální matrix Tom receptory presun z 70/37 na 20/22 Proteasa odstepí N-koncovou matrix-targeting sekvenci Tim44 kanál vnitrní membrány Translokace do matrix vyzaduje proton motivní sílu vnitrní membrány Hsc60 Contact site Matrix Hsc70 chaperon Nekteré proteiny potrebují matrixový chaperonin Hsc60

40 Dlouhá sekvence hydrofobních AA na N konci, zastaví v Tom40, není odštěpena žádná z targetting sekvencí

41 B) Transport do vnitřní membrány Proteiny vnitrní a vnejsí membrány - inkorporace pomocí kotevních sekvencí receptor Zprostředkovávají přenos mezi vnějším a vnitřním kanálem (fce jako chaperony) kanál N-terminální matrix-targeting sekvence

42 C) Transport do dalších mitochondriálních kompartmentů Mezimembránový prostor - různé dráhy, často další sekvence Intermembrane space-targeting sequence (2.sekvence) Intermembrane space-targeting sequence (2.sekvence) Odstepení 2.sekvence Receptor + kanál

43 Transport do chloroplastu -N-koncová targeting sekvence, odštěpena při transportu do stroma - vyzaduje energii Prekursorvazba chaperonu Stromal import sequence A) Transport do stroma chloroplastu GTP Toc komplex Toc kanál - vazba GTP asi dulezitá pro otevrení kanálu Tic komplex Hsc70 stromal chaperon - Proteiny pravdepodobne importovány nesbalené - není proton-motivní síla - asi role ATP pro translokaci Odstepení sekvence

44 B) Transport do thylakoidu - dalsí sekvence - 4 thylakoid import systémy - nekteré vyuzívají ph gradient na membráne 2 ze 4 drah Protein zůstává nesbalen ArgArg Protein folding SRP dependent pathway ph dependent pathway

45 SYNTHESA A TARGETING DO PEROXISOMU Peroxisomy: - malé organely μm - jedna membrána - vsechny proteiny syntetizovány v cytoplasmě - volné ribosomy, inkorporace do peroxisomu - proteiny se v cytoplasmě sbalí do maturované konformace před importem - import vyzaduje ATP hydrolysu, nevyžaduje elektrochemicky gradient - targeting sekvence SKL (Ser-Lys-Leu) na C-konci (katalasa), vyjimečně na N-konci SKL uptake targeting sequence Apo catalase Heme Catalase tetramer PTSIR = solubilní receptor v cytosolu Komplex Pex14 receptor Jiné proteiny - signální sekvence na N-konci (thiolasa), po transportu je odstepena SKL sekvence se neodstepí

46 TRANSPORT DO / Z JÁDRA Transport proteinů a mrna Komplex jaderného póru - jaderný obal cytoplasmatická strana jaderná strana Vazba k jaderné lamině 50 (kvasinky) 100 (savčí buňky) proteinů (nukleoporiny) - více kopií Ionty, malé metabolity a globulární proteiny (do 60 kdal) difuse kanálem (H 2 0) X velké proteiny a ribonukleoproteinové komplexy neprojdou selektivně transportovány dovnitř/ven jádra za pomoci solubilních transporterových proteinů váží makromolekulu a interagují se specifickým nukleoporinem

47 Jaderné proteiny syntéza v cytoplasmě transport do jádra, NLS ( nuclear localisation signal ) různá struktura např. basické AK Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val 4 cytosolické proteiny nutné pro import proteinů s basickou NLS sekvenci: Importin α, importin β TRANSPORT DO JÁDRA Nuclear import receptor Importin α vazba NLS Importin β interakce s FG nukleoporiny (i na cytosolických filamentech), mají mnohonásobné repetice krátkých hydrofobních sekvencí bohatých na phenyl-alanine a glycine (FG repeats) cargo Homology importinu: interakce s jinými NLS Ran (GTPasa) Ran-GTP a Ran-GDP Importin NTF2 (nuclear transport factor 2) bez spotřeby ATP x jiné proteiny vyžadují ATP interakce s Ran-GDP vrací ho do jádra Interakce s FG nukleoporiny Interakce s importinem β Ran cargo disociace komplexu Importin NLS Ran cargo + NTF2 Ran NLS FG repetice - interakce s importinem Translokace vyžaduje ATP hydrolysu Importin (α+β) cargo GTPase-accelerating protein Importin Ran Ran

48 TRANSPORT Z JÁDRA DO CYTOSOLU Nuclear export signal (NES) -různé typy - stimulace exportu jaderným pórem, někdy v kombinaci s NLS leucine - rich NES Nuclear export receptor = exportin - interakce s FG nukleoporiny a difuse pórem Importiny + exportiny skupina Karyopherins (14 v kvasinkách, 20 v savčích buňkách) Pouze u některých identifikovány NLS a NES na které se váží Některé fungují jako importiny i exportiny Některé exportiny role v exportu trna + některé mrna (asociované s některými hnrnp proteiny) role Ran X většina mrna transportovaná nezávisle na Ran Ran + NTF2 Ran Podobný mechanismus Ran Regulace transportu některých cargo transkripčních faktorů - Vazba ligandu stimuluje translokaci (odkrytí NLS) -Odštěpení sekvence, která je udržuje jinde (např. na membráně) - Modifikace (např. fosforylace) zvyšuje afinitu k importinu/exportinu exportin exportin cargo NES cargo exportin Ran cargo exportin Ran

49 TRANSPORT mrna Z JÁDRA DO CYTOSOLU Heterodimerní mrna-exporter protein (studium ts mutant kvasinek s defektem v exportu mrna) směruje většinu mrna ven z jádra jaderným pórem mutanty akumulují polyadenylovanou mrna v jádře homology u všech eukaryot nevyžaduje Ran malá podjednotka homologní s NTF2 interakce s NTF2 homologní doménou vetší podjednotky doména interagující s FG nukleoporiny větší podjednotka RNA vazebná doména vazba mrna spolu s mrnp proteiny + další proteiny vazba mrna -výběr mrna mrnp proteins

50 EXPORT mrnp (messenger ribonuclear protein complex) Slinné žlázy hmyzích larev Chironomous tentans model pro studium transportu mrna z jádra pomocí EM pre-mrna asociace s hnrnp proteiny uspořádání do kruhové mrnps s mrna (75 kb) kódují proteiny, které pomáhají larvám adherovat k listům mrnps (elektronová mikroskopie) transport jaderným pórem rozbalení během průchodu a vazba ribosomů po vstupu do cytosolu 5 konec vstupuje první Jaderný obal nukleoplasma cytoplasma