Biotechnologická syntéza antibiotik

Transkript

1 Biotechnologická syntéza antibiotik ANTIBIOTIKA ANTIBIOTIKA: produkty různých organizmů, zejména mikroorganizmů hubí patogenní mikroorganizmy baktericidní, fungicidní zastavují růst patogenních mikroorganizmů bakteriostatická, fungistatická přírodní (penicilin, tetracyklin) ANTIBIOTIKA polosyntetická (ampicilin, oxacilin) syntetická (chloramfenikol) s úzkým spektrem ANTIBIOTIKA se širokým spektrem Vývoj antibiotik Alexander Fleming 1929 Objev penicilinu Technologie průmyslové výroby penicilinu o 10 let později.a. Waksman (UA) a G. Brotz (IT) 1943 Zahájení průmyslové výroby penicilinu (UA) 1

2 Vývoj antibiotik elman Abraham Waksman v jeho laboratoři objeveno přes 20 antibiotik treptomycin (proti tuberkulóze) 1950 Antracyklinová antibiotika 1963 Cytostatikum léčba leukémie do dnešní doby objeveno přes různých antibiotik, malý počet nalezl klinické využití VÝROBA ANTIBIOTIK ETAPA PŘEDVÝROBNÍ výběr kmene šlechtění a úprava konzervace Cíl: najít vhodný kmen produkčního mikroorganizmu ETAPA VÝROBNÍ Cíl: produkovat co nejvíce antibiotika ETAPA IZOLACE sporulace chlazení Cíl: filtrace namnožit izolace spóry Cíl: fermentace získat antibiotikum v surovém stavu ČIŠTĚNÍ ÚPRAVA syntéza krystalizace jiné metody Cíl: získat čisté antibiotikum zlepšit jeho vlastnosti - snížit nežádoucí účinky PŘEDVÝROBNÍ ETAPA Výběr kmene najít v přírodě produkční kmen kritéria: antibiotická účinnost (produkce AB) stálost (nemění vlastnosti po několik generací) Šlechtění a úprava hledání nových mutací ozařování účinek jedů selekce mutací výběr podle stejných kritérii Konzervace kapalný dusík lyofilizace KONZERVA adatace snést co nejvyšší koncentraci antibiotika, které sám tvoří 2

3 KONZERVA očkování 1. sporulační generace očkování PORULACE zkumavky, šikmý agar 2. sporulační generace očkování 3. sporulační generace ŽIVNÉ PŮDY složení voda zdroj energie zdroj dusíku ionty speciální přísady (tlumí růst mycelia, stimulují tvorbu spór) - Petriho misky PORULAČNÍ INOKULUM očkovací konev, baňka ŽIVNÉ PŮDY kapalné tuhé - agar - želatina PORULAČNÍ INOKULUM 1. vegetativní generace očkovací několik hodin tank 2. vegetativní generace předočkovací tank několik hodin fermentační tank 3. vegetativní generace desítky hodin IZOLACE FERMENTACE ŽIVNÉ PŮDY složení - voda - zdroj energie - zdroj dusíku - ionty - speciální přísady (tlumí tvorbu spór, stimulují růst mycelia) - prekurzory (usnadňují tvorbu antibiotika) jen do fermentačního tanku! PŘÍKRMY - doplněk živin - do fermentačního tanku během fermentace fermentační tank ochlazení 5 C (zastavení metabolických procesů) filtr ace TUHÁ FÁZE mycelium zbytky živin někdy AB KAPALNÁ FÁZE zbytky živin produkty metabolizmu někdy AB IZOLACE AB z tuhé fáze TUHÁ FÁZE suš ení roze mletí extr akce EXTRAKT zahu štění krysta lizace filtr ace suš ení ANTIBIOTIKUM surové 3

4 IZOLACE AB z kapalné fáze a) existuje organické rozpouštědlo, které se nemísí s vodou a v němž je AB lépe rozpustné než ve vodě extrakce b) existuje činidlo, s nímž AB selektivně reaguje za vzniku ve vodě nerozpustné sraženiny srážení c) AB se selektivně váže na měnič iontů či jiný sorbent adsorpce KAPALNÁ FÁZE ROZPOUŠTĚDLO extr akce odděle ní fází EXTRAKT zahu štění krysta lizace filtr ace suš ení RÁŽEDLO srá žení RAŽENINA (sloučenina AB) roz klad rozpuš tění ROZTOK AB zahu štění krysta lizace filtr ace suš ení ORBENT adso rpce RAŽENINA adso rpce (AB + sorbent) extr akce EXTRAKT zahu štění krysta lizace filtr ace suš ení ANTIBIOTIKUM surové ČIŠTĚNÍ A ÚPRAVA AB krystalizace filtrace, srážení aj. ANTIBIOTIKUM čisté ANTIBIOTIKUM metody chemické syntézy ANTIBIOTIKUM polosyntetické HODNOCENÍ AB Analytické metody fyzikální fyzikálně chemické chemické biologické metody stanovení účinnosti mezinárodní jednotky 4

5 Průmyslová výroba antibiotik velké fermentory nárůst biomasy a metabolitů využití produkčních mikroorganismů aerobní proces (přítomnost kyslíku) vodný roztok živin amonné ionty síranové ionty fosforečnanové ionty uhlíkaté složky (sacharidy, oligosacharidy) FERMENTOR únik plynu kyseliny hydroxidy přívod vody kontrola ph kontrola teploty odběr vzorků míchadlo výpusť plnění odpěňovač průzor kontrola pěny kontrola hladiny výstup vody duplikace průlez vzduch Šlechtění produkčních kmenů produkční kmeny : mikroorganismy produkující antibiotika působení mutagenů na produkční kmeny pro zvýšení jejich aktivity UV záření Rentgenové záření Chemické látky: kyselina dusitá nitrosometylmočovina nitrosometylquanidin 5

6 Mikrobiální kinetika reakční směs = kultivační roztok substráty (živiny, kyslík) metabolické produkty mikroorganismy suspendované ve vodě rychlost závisí na koncentraci složek v reakční směsi, teplotě, (tlaku) vlastní bioreakce - uvnitř buňky Mikrobiální kinetika vícefázový systém (kapalná, plynná, pevná fáze) na celkovou rychlost má vliv rychlost přenosu hmoty přes buněčnou stěnu Využití živin na růst a dělení buňky (tvorba biomasy) Cytoplazmantická membrána Bioreakce přenos živin přes membránu do buňky přenos produktů metabolismu z buňky kultivační roztok Mikrobiální kinetika Zjednodušení: populace mikroorganismů = kontinuum koncentrace biomasy (hmotnost mikroorganismů v jednotce objemu kultivačního roztoku) biomasa = chemické individuum nezabýváme se změnou složení biomasy 6

7 Růst biomasy růstová křivka (vsádkový reaktor) Adaptační (Lag fáze) buňky se nerozmnožují, zvětšují svůj objem, dochází k aktivaci enzymového systému Exponenciální (logaritmická fáze) vlastní množení buněk rychlost tvorby se s časem zvětšuje (autokatalytický charakter) tacionární fáze rovnováha mezi dělením a odumíráním buněk (nedostatek živin) Fáze postupného odumírání buňky se již nerozmnožují, pouze odumírají vlivem toxických produktů metabolismu Modely rychlosti růstu dn dm dc d d d n = počet jedinců populace m = hmotnost biomasy c = koncentrace biomasy (hmotnostní) Exponenciální fáze: dn d f n Malthusův model pouze exponenciální růst, bez inhibice τ = 0 n = n 0 f n k n k = specifická rychlost růstu Modely rychlosti růstu Ricatiho model faktor inhibice β řešení βn 1 adaptační fáze 0 k n0e n 1 n0 1 e asymptota βn = 1 poč.exponenciální f. τ 1/2 dn k n1 n d k začíná působit faktor inhibice τ k = konstanta růstu β = konstanta tvorby toxinu poč. podmínky τ = 0 n = n 0 PŘECHOD NA TACIONÁRNÍ FÁZÍ (nezahrnuje odumírání) 7

8 Modely rychlosti růstu Volterův model dn d kn 1 n k0 n d 0 Numerické řešení Parametr řešení: k0 k Inhibiční člen (Ricati) 2 Paměťový člen (Inhibiční vliv toxinu) λ = k 0 = 0 k 0 > 0 k 0 < 0 růst kultury není ani inhibován ani promotován přítomnost promotoru ihibice toxinem (odumírání buněk) dn k c r A d k M c Kinetické modely růstu biomasy Monodova rovnice tvorby biomasy (empirická) nejpoužívanější rovnice v mikrobiální kinetice r max r r K max c c k r max = maximální rychlost bioreakce c = koncentrace substrátu K = koncentrace substrátu pro rychlost = ½ max. rychlosti dn k c r A d k M c Kinetické modely růstu biomasy Monodova rovnice analogie k heterogenně katalytizovaným reakcím (Langmuir Hinshelwood) proměnná hodnota zdánlivého reakčního řádu pro c >> k... nultý řád pro c << k... první řád neplatí pro podmínky velmi rychlého růstu r r k max c c 8

9 Vliv vnějšího prostředí na růst mikroorganismů úzký rozsah podmínek, za kterých mikrobiální procesy probíhají Teplota urychluje řadu metabolických reakcí (Arrheniovská závislost) ale při vyšších teplotách rychlejší denaturace bílkovin a dezaktivace enzymů (využití při sterilizaci) optimum obvykle C max E A 1 a1 exp RT E K D 1 0 exp RT μ = specifická růstová rychlost E A = aktivační energie růstu biomasy E D = aktivační energie denaturace biomasy Vliv vnějšího prostředí na růst mikroorganismů ph růst mikroorganismů velmi citlivý na hodnotu ph (enzymová aktivita závisí na ph) většina mikroorganismu ph 4-8 Pepsin ph 3 Argináza ph 10 s hodnotou ph souvisí i odolnost vůči vyšším teplotám čím vyšší odchylka od ideálního ph, tím nižší odolnost vůči vysokým teplotám eparace biomasy Biomasa tvoří dominantně suspenze Cílem oddělit biomasu a produkt Využívané metody separace: filtrace sedimentace odstřeďování (centrifugace) ultrafiltrace (membrány μm) eparace produktu čištění produktu úprava produktu Recyklace biomasy (omezená stárnutím biomasy) 9

10 RIZIKA LÉČBY ANTIBIOTIKY vznik rezistentních MO nepravidelné dávkování, neúplné vyléčení zkřížená rezistence MO rezistentní na jedno AB je rezistentní i na příbuzná AB dysmikrobie změna složení střevní flóry průjmy, zažívací potíže superinfekce v důsledku změny střevní flóry se rozmnoží patogenní MO, rezistentní k použitému AB rozvine se jiná choroba, než která je léčena alergie zejména penicilinová AB DEXTRAN JINÉ PRODUKTY BIOTECHNOLOGiÍ polysacharid, náhrada krevní plazmy ze sacharózy účinkem Leuconostoc mesenteroides AMINOKYELINY zejména esenciální výživa hospodářských zvířat L-lysin, L-threonin, L-tryptopfan, L-methionin aj. VITAMÍNY B 2, riboflavin buď biotechnologicky nebo synteticky B 12, kyanokobalamin výhradně biotechnologicky C, kys. askorbová pouze jeden stupeň biotechnologicky další vitamíny: A, D 2, B 6, H ENZYMY amylázy a proteázy, produkty Aspergillus oryzae růstové faktory erythropoetin, neutropoetin a trombocytopoetin VAKCÍNY rekombinantní vakcíny biotechnologicky získané peptidy na povrchu stejná struktura jako na bílkovinách na povrchu virů či bakterií PROTILÁTKY monoklonální protilátky produkty jednoho klonu hybridomů AFINITNÍ CHROMATOGRAFIE účinná dělicí metoda izolace cenných látek, např. monoklonálních protilátek 10

11 ALKALOIDY námelové alkaloidy efedrin kvašení sacharózy za přítomnosti benzaldehydu HORMONY steroidní (kortizon, hydrokortizon, prednizolon, dexametazon, spironolakton, pohlavní hormony) plíseň Rhizopus nigricans, některé baktererie lidský inzulín U lidského inzulínu se zastavíme pokračování příště (další snímek)1 lidský růstový hormon somatostatin a jiné liberiny (releaisng faktory hypotalamu) živočišné hormony LIDKÝ INZULÍN peptidický hormon, 51 molekul aminokyselin, 2 řetězce lidskému Thr je nejpodobnější Rozdíl: Ala 1 aminokyselina vepřový na konci 2. řetězce Výroba lidského inzulínu fermentací gen pro tvorbu inzulínu Escherichia coli upravená Eschericha coli lidský inzulín izolace fermentace 11