PRAKTICKÁ CVIČENÍ Z ENVIRONMENTÁLNÍ MIKROBIOLOGIE

Transkript

1 Fakulta technologie ochrany prostředí Ústav chemie ochrany prostředí PRAKTICKÁ CVIČENÍ Z ENVIRONMENTÁLNÍ MIKROBIOLOGIE Jana Chumchalová Martin Kubal 0

2 Dr. Ing. Jana Chumchalová a Doc. Dr. Ing. Martin Kubal, 2017 Ilustrovala: Tereza Chumchalová Vysoká škola chemicko-technologická v Praze 1

3 ÚVOD Testování mikroorganismů nacházejících se v prostředí může vyžadovat široký rozsah různých přístupů, a to od přímého mikroskopického pozorování vzorků odebraných z prostředí za účelem pozorování buňky, přes kultivační metody, až po zjištění hladiny specifických látek v buňce nebo ve vzorku. V případě kultivačních metod je možné spočítat některé (ale zřídka všechny) mikroorganismy, pokud vykazují odpověď na testovací metodu, (vhodnou pro jejich růstové požadavky). Přestože se prohlubuje poznání o mikroorganismech z oblasti genetiky, evoluce nebo diversity, stále chybí dostatek informací, které by nám pomohly porozumět chování mikroorganismů v prostředí a kontrolovat zde jejich přítomnost, a dokonce chybí informace, jak kultivovat řadu mikroorganismů. Vzhledem k těmto aspektům byla sestavena Praktická cvičení environmentální mikrobiologie. Tato Praktická cvičení environmentální mikrobiologie byla vytvořena pro použití při laboratorních činnostech v environmentální mikrobiologii. Zejména byla Praktická cvičení z environmentální mikrobiologie optimálně sestavena pro používání studenty magisterského studia, kteří také absolvují přednášky předmětů Mikrobiologie v ochraně životního prostředí a Mikroorganismy v kontaminovaném prostředí. Praktická cvičení jsou koncipována takovým způsobem, aby studenti získali základní mikrobiologické dovednosti z metodologie dostupné pro detekci, stanovení počtů a identifikaci mikroorganismů a jejich aktivit. Studenti se seznámí: I. S mikroskopickým pozorováním buněk a sledováním jejich morfologie. Studenti se seznámí s přípravou preparátů z kolonií čistých kultur a kolonií ze vzorků z prostředí a s různými technikami barvení. II. Se základními koncepty růstu, charakterizace a identifikace čistých kultur mikroorganismů. Tyto koncepty jsou uváděny na příkladu bujonových a agarových kultur a stanovení schopnosti růstu na různých substrátech. III. Se sledováním přítomnosti mikroorganismů v odebraném vzorku z prostředí. V této části se studenti se budou zabývat mikrobiálním osídlením vodného prostředí, horninového prostředí a prostředí uvnitř budov. Seznámí se způsobem odběru vzorku, přepravou a úchovou vzorku a následným stanovením základních skupin mikroorganismů v těchto vzorcích. V neposlední řadě se studenti naučí interpretovat dosažené výsledky. 2

4 Obsah Úvod... 2 Obecné instrukce pro absolvování laboratoří... 6 Základní bezpečnostní pokyny a opatření v mikrobiologické laboratoři... 7 Opatření podle normy ČSN ISO Hygienická opatření v průběhu zkoušení... 7 Nakládání s odpady... 8 Další opatření vznikající při práci s mikroorganismy... 8 Příprava a sterilizace pomůcek, ředících roztoků, kultivačních a diagnostických medií... 9 Příprava médií... 9 Teoretické úvedení... 9 Obecný postup přípravy... 9 Nalévání živného média s agarem na Petriho misky Složení medií používaných pro rozbory a jejich příprava Agar s glukosou, kvasničným extraktem a oxytetracyklinem nebo chloramphenikolem (GKCH, CM0545) Živný agar (M001) Živný bujón Agar s kvasničným extraktem (AKE, M456I) Endův agar (M1077) Agar s karboxymethylcelulosou (CMC agar) OF základní medium s glukosou polotekuté Příprava zřeďovacích roztoků Teoretické úvedení Obecný postup přípravy Fyziologický roztok Příprava pracovních roztoků Minerální olej Roztok na potvrzení cytochromoxidasy Roztok peroxidu vodíku (3 %) Roztok KOH (3 %) Lugolův roztok Příprava sterilních pomůcek Teoretické uvedení Příprava stěrovek Stanovení počtu mikroorganismů Teoretické úvedení

5 Obecný postup stanovení Příprava výchozí suspense Stanovení počtu mikroorganismů za použití tuhých půd Technika zalévání inokula tuhou půdou Technika inokulace na povrch tuhé půdy Inkubace Výpočet a vyjádření výsledků získaných za použití tuhých půd Obecný případ Nízké počty Miska neobsahuje žádné kolonie Vysoké počty Stanovení mikroorganismů v prostředí Kontrola vnitřního prostředí Teoretické uvedení Stanovení celkového počtu kvasinek a plísní v prostředí metodou spadu Mikrobiologická kontrola osobní hygieny Teoretické uvedení Stanovení mikrobiální kontaminace rukou stěrovou metodou Izolace a identifikace vybraného mikroorganismu z vybrané části těla stěrovou metodou Stanovení aerobních heterotrofních mikroorganismů v horninovém prostředí Teoretické uvedení Odběr vzorku horninového prostředí Stanovení celkového počtu aerobních heterotrofních mikroorganismů Stanovení celkového počtu mikroorganismů ve vzorku vody Způsoby provádění odběrů vody (ČSN EN ISO 19458, 2007) Pitná voda z vodovodního kohoutku Voda z pramenů a studní Odpadní vody Stanovení celkového počtu kultivovatelných a indikátorových mikroorganismů ve vzorku vody Odběr vzorku vody (ČSN EN ISO 19458, 2007) Doprava a uchovávání (ČSN EN ISO 19458, 2007) Stanovení celkového počtu koliformních bakterií (ČSN ) IZOLACE MIKROORGANISMŮ, JEJICH CHARAKTERIZACE A IDENTIFIKACE Teoretické uvedení Izolace mikroorganismů Kultivační vlastnosti mikroorganismů Zjišťování optimálních podmínek růstu

6 Morfologie buňky Příprava preparátů Fixace preparátu Barvení preparátů Barvení methylenovou modří Gramovo barvení Mikroskopování Mikroskop Postup při pozorování suchým systémem Pozorování s imerzním objektivem Identifikační testy Alternativa Gramova barvení Katalasový test OF test Test na přítomnost cytochromoxidasy Stanovení celulolytické aktivity u neznámého mikroorganismu Sledování vzájemné snášenlivosti mikroorganismů Identifikace bakterií podle protokolu A na mikrodestičce Biolog GEN III MicroPlate Mikrodestička Biolog GEN III MicroPlate Jednotlivé kroky analýzy Příprava kultury Příprava inokula Zaočkování mikrotitrační destičky Kultivace Odečet na zařízení Biolog a interpretace výsledků Použitá a doporučená literatura Příloha Protokol o odběru a transportu vzorku zeminy Protokol o odběru a transportu vzorku vody

7 OBECNÉ INSTRUKCE PRO ABSOLVOVÁNÍ LABORATOŘÍ Před příchodem do laboratoří je nezbytné si projít program cvičení. V každém pracovním dni se dělá více úloh, proto je nezbytné vytvořit si plán postupu prací. V laboratořích se pracuje v čistém plášti. Do laboratoří je zapotřebí si přinést psací pomůcky (propisku, lihový fix na sklo), laboratorní program a blok na poznámky. Cvičení je povinné, náhrada cvičení je velmi obtížná vzhledem k tomu, že úkoly na sebe navazují. Všechny výsledky z měření a vyhodnocení se odevzdávájí v protokolu. Protokol by měl mít tyto základní části: Jméno studenta, studijní obor, název úlohy, cíl práce, podrobnosti pracovního postupu, které nejsou specifikovány, nebo které jsou pavažovány za volitelné (navážky, ředění) způsoby výpočtu výsledků a výpočty, zhodnocení výsledků a všechny podrobnosti o okolnostech, které by mohly ovlivnit výsledky, obrazovou dokumentaci. Součástí protokolu budou dále odpovědi na dotazy, které jsou zadány na začátku každého laboratorního kursu. 6

8 ZÁKLADNÍ BEZPEČNOSTNÍ POKYNY A OPATŘENÍ V MIKROBIOLOGICKÉ LABORATOŘI Opatření podle normy ČSN ISO 7218 Při provádění mikrobiologického zkoušení je zvlášť důležité, aby: - pouze ty mikroorganismy, které jsou ve vzorcích přítomny, byly izolovány nebo stanoven jejich počet, a - mikroorganismy nekontaminovaly prostředí. Aby toho bylo dosaženo, je nezbytné věnovat pozornost osobní hygieně a užívat pracovní techniky, které v maximální míře zajišťují vyloučení vnější kontaminace. Hygienická opatření v průběhu zkoušení Používá se řádně zapnutý laboratorní oděv, který je čistý a v dobrém stavu, vyrobený z tkanin s omezenou hořlavostí. Plášť musí být vyroben z materiálu, který snese vyváření, eventuálně sterilizaci. Proto jsou zcela nevhodné pláště ze syntetických vláken. Dlouhé vlasy musí být pevně svázány nebo překryty speciální pokrývkou hlavy. Ruce se musí umýt bezprostředně před započetím zkoušení a znovu v průběhu zkoušení, pokud došlo k jejich kontaminaci. Ruce se myjí důkladně ve vlažné vodě, nejlépe s obsluhou nevyžadující ruční ovládání. K osušení rukou se používají jednorázové ručníky. Všechny nástroje musí být sterilní a chráněné před kontaminací před použitím a v průběhu zkoušení. Pomůcky se použijí jen jednou (poté jsou kontaminované). Všechny použité nástroje a pomůcky musí být umístěny do vhodných kontejnerů pro následnou likvidaci nebo sterilizaci. Aby se práce prováděly pokud možno v aseptickém prostředí, učiní se opatření. Například: zdroje kontaminace se redukují na minimum; v pracovním prostoru se zamezí vzniku průvanu (tj. aby okna a dveře byly zavřené), zamezí se nadbytečnému pohybu pracovníků v průběhu zkoušení; před prací a po jejím skončení se pracovní plocha musí očistit a otřít vhodným desinfekčním prosředkem; před započetím práce se zajistí, aby všechny potřeby k provedení práce byly k dispozici; práce se provede bez prodlení; pokud není celý obsah balení se špičkami nebo Petriho miskami apod. spotřebován v průběhu zkoušení, zajistí se, aby bylo balení po odebrání potřebného počtu jednotek řádně uzavřeno; 7

9 jakékoliv polití nebo jiné znečištění pracovní plochy se ihned odstraní vhodným materiálem smočeným ve vhodném desinfekčním prostředku. Poté se plocha očistí, desinfikuje a teprve poté se pokračuje v práci; při vyjímání pipet a špiček z boxů se musí zabránit dotyku konce špičky s prostředím, jinak se stanou nesterilními; při práci se vzorky po otevření jejich obalu, s kulturami, půdami a při inokulaci je třeba se vyvarovat mluvení, kašlání atd. Hlavním zdrojem environmentální kontaminace a infekce jsou aerosoly, a proto se musí jejich tvorba minimalizovat. Ty se mohou vytvářet například: při otevření Petriho misek, zkumavek a baněk; při používání vortexu, mixerů, injekčních stříkaček; při vyprazdňování pipet; při žíhání mokrých kliček, hokejek nebo jehel; při otevírání ampulí obsahujících lyofilizované kultury; při neopatrném přelévání kultury v tekutém médiu spojené s rozstřikováním kapek do okolí či praskáním bublin. Klička či jehla znečištěná mikroorganismy se nejprve vkládá do studené části plamene, kde se materiál vysuší. Tím se zabrání eventuálnímu vzniku aerosolu ze zahřívaného materiálu do okolí, který nemusí být ve středních partiích dokonale vysterilizován. Teprve potom se klička či jehla vyžíhá v horké části plamene. Pinzety se pouze několikrát protahují horkou částí plamene. Nakládání s odpady Nakládání s odpady má odpovídat národním environmentálním, zdravotnickým a bezpečnostním předpisům. S nekontaminovanými odpady lze nakládat jako s komunálním odpadem. Kontaminovaný materiál, který lze recyklovat se autoklávuje a poté se umyje a sterilizuje obvyklým způsobem. Ostatní kontaminovaný material se přesune do určených nádob a spálí se. Materiály kontaminované mikroorganismy rizikové kategorie 3 a jejich kontejnery se musí před spálením autoklávovat. Další opatření vznikající při práci s mikroorganismy Při rozlití kultury mikroorganismů se kultura přelije desinfekčním roztokem (např. roztokem Sava) a pokud není možné dané místo setřít, ponechá se desinfekční roztok působit 15 až 30 min do vyjasnění kultury. V případě kontaminovaného rozbitého skla se sklo sesbírá pomocí pinzety a hodí se do nádob na sklo a stříkačky určené ke spálení (Harrigan, 1998). 8

10 PŘÍPRAVA A STERILIZACE POMŮCEK, ŘEDÍCÍCH ROZTOKŮ, KULTIVAČNÍCH A DIAGNOSTICKÝCH MEDIÍ Příprava médií Teoretické úvedení Mikroorganismy se kultivují v živných půdách různé konzistence - v tekutých bujónech nebo ve zpevněných půdách např. s přídavkem agaru. Příprava probíhá tak, že jednotlivé složky media se obvykle rozpustí v destilované vodě a medium se poté sterilizuje autoklávováním. Sterilizace probíhá v nádobách, ve kterých bude probíhat kultivace (zkumavky, vialky), nebo se média sterilizují ve větším objemu a poté se rozplňují do sterilních pomůcek (Petriho misky). Pokud by mohlo dojít k interakcím některých složek, takových jako jsou kovy, a jejich precipitaci, roztoky musí být připraveny a sterilizovány zvlášť před smícháním, aby se získalo kompletní medium. Při sterilizaci teplota v komoře autoklávu se musí udržovat na 121 o C po dobu nejméně 15 min. Obecný postup přípravy Médium se připraví podle návodu na obalu. Pokud není uvedeno jinak, přidávají se složky do určeného objemu vody, místo aby se nádoba doplňovala na určitý objem, protože to je při přípravě mikrobiologických kultivačních médií obvyklé (ČSN EN ISO 8199, 2008). Vypočítané množství kompletního dehydratovaného média se naváží do nádoby např. Erlenmayerovy baňky, ve které bude probíhat sterilace. Poté v případě přípravy agarových médií se naváží agar a přisype se. Agar se navažuje v takovém množství, aby výsledná koncetrace v médiu byla 1,2 % hm. Přilije se destilovaná voda (cca 50 ml) a složky media se rozmíchají. Po rozmíchání práškového média se do nádoby přilije zbylé množství destilované vody. Nádoba se uzavře. Po uzavření nádoby se otočí víčkem o jeden závit zpět (nesmí být uzavřeno těsně). Takto připravené medium se předá se ke sterilizaci (121 o C, 15 min). Nádoba může být naplněna médiem přibližně ze 75 % celkového objemu. Při větším objemu média by došlo při záhřevu k jeho úniku. Média používaná k rozborům není nutné před sterilizací rozvařovat. V případě přípravy agarového media s agarem, ale agar po rozmíchání ve vodě zůstává v pevném stavu. Proto je důležité navažovat médium a agar do nádoby, ve které bude probíhat sterilace, a podle toho si spočítat navážku. Po sterilizaci se medium ihned použije pro stanovení nebo se uchovává v lednici do doby použití. Při použití agaru pro techniku inokulace na povrch tuhé půdy se rozlévá do Petriho 9

11 misek v předstihu, aby medium před rozborem mělo pevný povrch a bylo předsušeno. Při použití techniky stanovení mikroorganismů přelivem se rozehřeje krátce před rozborem a použije se do 4 h od rozehřátí. Nalévání živného média s agarem na Petriho misky Živné médium s agarem se rozehřeje na vodní lázní nebo v mikrovlnné troubě tak, aby byl dokonale tekutý. Indikátorem správného rozehřátí je změna vzhledu agaru (vyjasnění). V případě, že médium má příliš vysokou teplotu, chladí se pomalu pod tekoucí vodou a průběžně se kontroluje jeho teplota. Při ponoření do vodní lázně medium u dna zatuhne a musí se znovu rozehřívat. Rozehřáté sterilní medium se rozlévá do Petriho misek za sterilních podmínek u kahanu. Po ožehnutí hrdla se otevře nádoba a agar se co nejrychleji nalije do Petriho misky, která je jen částečně pootevřená. Naleje se takové množství, aby se vytvořila nejméně 3 mm vysoká vrstva. V případě misek o průměru 60 mm se nalije asi 10 ml média, o průměru 90 mm ml media. Medium se ponechá zchladnout a ztuhnout. Po zatuhnutí by plocha měla být rovná a bez bublin. Při rozlévání je nezbytné udržovat nádobu s mediem v úhlu cca 45 o, aby nedošlo ke spadu nežádoucích mikroorganismů do média. V případě přerušení práce hrdlo nádoby a víčko ožehněte a uzavřete a event. vložte do termostatu na 55 o C. Složení medií používaných pro rozbory a jejich příprava Agar s glukosou, kvasničným extraktem a oxytetracyklinem nebo chloramphenikolem (GKCH, CM0545) Médium bude použito pro stanovení kvasinek a plísní. Složení: Kvasničný extrakt 5,0 g Glukosa 20,0 g Agar 12,0 g Příprava: Médium se připraví podle návodu tzn. naváží se vypočítané množství kompletního dehydratovaného média do nádoby, ve které bude probíhat sterilace. Po homogenizaci se medium předá ke sterilizaci (121 o C, 15 min). Po sterilaci a vychlazení agaru na teplotu 55 o C se přilije roztok připravený z vialky obsahující antibiotikum (chloramfenikol nebo oxytetracyklin). Obsah nádoby se důkladně rozmíchá a medium se rozplní do sterilních Petriho misek po 15 až 20 ml (cca 3 mm) a ponechá zatuhnout. Antibiotikum je možné přilít do rozehřátého média v den, kdy se medium bude rozplňovat do sterilních Petriho misek. 10

12 Příprava antibiotika: Do vialky se napipetuje sterilní destilovaná voda. Po rozmíchání se antibiotikum převede za sterilních podmínek do média (jedna vialka na 500 ml media). Živný agar (M001) Médium bude použito pro stanovení heterotrofních mikroorganismů. Složení: Pepticky natrávená zvířecí tkáň 5,0 g Chlorid sodný 5,0 Masový výtažek 1,5 g Kvasničný extrakt 1,5 g Agar 15 g Příprava: Médium se připraví podle návodu tzn. naváží se dehydratované médium do nádoby, ve které bude probíhat sterilace. Po nalití destilované vody se práškové medium rozmíchá, uzavře a předá ke sterilizaci v autoklávu (121 o C, 15 min). Po sterilaci se opět rozmíchá a rozplní do sterilních Petriho misek po 15 až 20 ml (cca 3 mm). Po zatuhnutí se Petriho misky zabalí do alobalu a uchovávají se v lednici do doby použití. Živný bujón Médium bude použito pro sledování vlivu kultivačních podmínek na růst izolovaných mikroorganismů. Složení: Pepticky natrávená zvířecí tkáň 5,0 g Chlorid sodný 5,0 Masový výtažek 1,5 g Kvasničný extrakt 1,5 g Příprava: Médium se připraví podle návodu tzn. naváží se dehydratované médium do nádoby, rozmíchá v destilované vodě a rozpipetuje se po 9 ml do skleněných zkumavek. Zkumavky se uzavřou a předají ke sterilizaci v autoklávu (121 o C, 15 min). Agar s kvasničným extraktem (AKE, M456I) Agar je sestaven podle ČSN ISO 6222 Jakost vod Stanovení kultivovatelných mikroorganismů Stanovení počtu kolonií očkováním do živného agarového kultivačního média. Složení média: Trypton 6,0 g Kvasničný extrakt 3,0 g Agar 15,0 g Destilovaná voda 1000 ml 11

13 Příprava: Médium se připraví podle návodu na obalu. Vypočítané množství kompletního dehydratovaného média se naváží do nádoby, ve které bude probíhat sterilace. Po rozmíchání v destilované vodě se nádoba uzavře a předá se ke sterilizaci v autoklávu (121 o C, 15 min). Před použitím se kultivační médium rozehřeje a poté se udržuje v termostatu při 55 o C. Endův agar (M1077) Agar je sestaven podle ČSN Jakost vod Stanovení koliformních bakterií v nedesinfikovaných vodách. Složení média: pepton 10 g Masový výtažek 8,6 g Laktosa 10 g Siřičitan sodný 1,2 g Chlorid sodný 5,0 g Agar 12 g 5 % roztok bazického fuchsinu v ethanolu Destilovaná voda 1000 ml Příprava: Médium se připraví podle návodu. Vypočítané množství kompletního dehydratovaného média se naváží do nádoby, ve které bude probíhat sterilace. Nakonec se do media napipetuje roztok basického fuchsinu v ethanolu a vše se promíchá. Po uzavření se agar předá ke sterilaci v autoklávu (121 o C, 15 min). Po sterilaci se opět rozmíchá a rozplní do malých sterilních Petriho misek po cca 10 ml. Médium by mělo být slabě růžové. Po zatuhnutí agaru se Petriho misky zabalí do alobalu a uchovávájí se v lednici do doby použití. Příprava fuchsinu: Fuchsin se rozmíchá v ethanolu a napipetuje se potřebné množství do média. Zbylý roztok předat personálu. U některých medií je fuchsín součásti namíchané směsi. Proto si před přípravou pozorně přečtěte složení. Basický fuchsin je kancerogenní a při manipulaci s ním musí být dodržována náležitá bezpečnostní opatření. Agar s karboxymethylcelulosou (CMC agar) Médium bude použito pro sledování celulolytické aktivity mikrobiálních kultur. Složení: 0,2 % NaNO 3 0,1 % K 2 HPO 4 0,05 % MgSO4 0,05 % KCl 12

14 0,2 % sodná sůl karboxymethylcelulosy (CMC, Sigma) 0,02 % peptonu (HiMedia) 1,7 % agaru (HiMedia) 1 l destilované vody Postup: Naváží se všechny soli a rozmíchají se ve vodě. V případě vysrážení solí se médium zahřeje, aby došlo k jejich rozpuštění. Zvlášť se naváží CMC a pepton. Přilije se destilovaná voda a obě složky se důkladně rozmíchají a nalijí do roztoku solí. Do lahviček se naváží agar (množství odpovídá výslednému objemu kultivačního média). Válcem se odměří požadovaný objem média, přelije se do lahviček s agarem. Po důkladném rozmíchání se předá ke sterilaci (15 min při 121 C). OF základní medium s glukosou polotekuté Agar je sestaven podle knihy Handbook of Microbiological Media (Atlas, 2010). Použije se pro sledování fermentace a respirace mikrobiálních kultur. Složení: Chlorid sodný 5,0 g Hydrogenfosforečnan draselný 0,3 g Pepton 2,0 g Bromthymolová modř 0,08 g Glukosa 10,0 g Agar 2,0 g Voda 1000 ml hodnota ph 7,1 Příprava: Všechny složky kromě agaru se naváží a převedou do kádinky. Rozmíchají se v destilované vodě do rozpuštění. Hodnota ph se upraví na ph 7,1. Poté se do nádob, ve kterých bude probíhat sterilace, naváží agar a přilije se vypočítané množství media. Agarové medium se předá ke sterilizaci v autoklávu (121 o C, 15 min). Po sterilaci se horké tekuté medium rozmíchá a rozplní do sterilních zkumavek po 9 ml. Po zatuhnutí agaru se zkumavky uchovávájí v lednici do doby použití. Příprava zřeďovacích roztoků Teoretické úvedení Pro získání počitatelného množství mikroorganismů v kultivačních médiích je obvykle zapotřebí použít ředěný vzorek. V mikrobiologii se používájí zřeďovací roztoky jako např. fyziologický roztok, peptonová voda, peptonová voda s chloridem sodným nebo fosforečnanový tlumivý roztok (ČSN EN ISO 8199, 2008). 13

15 Obecný postup přípravy Zřeďovací roztok se připraví podle návodu. Vypočítané množství chemikálií pro přípravu roztoků se naváží se naváží do kádinky. Přilije se destilovaná voda (cca 50 ml) a složky media se rozmíchají. Po rozmíchání všech složek se do kádinky přilije zbylé množství destilované vody. Roztok se rozdělí do nádob (zkumavky, Erlenmayerovy baňky), ve kterých bude probíhat sterilace. Po uzavření nádoby se otočí víčkem o jeden závit zpět (nesmí být uzavřeno těsně). Takto připravený roztok se předá se ke sterilizaci (121 o C, 15 min). Nádoba může být naplněna přibližně ze 75 % celkového objemu. Při větším objemu roztoku by došlo při záhřevu k jeho úniku. Fyziologický roztok Složení: NaCl 8,5 g destilovaná voda 1000 ml Příprava: Naváží se vypočítané množství chloridu sodného a rozmíchá se v destilované vodě. Po rozpuštění se rozpipetuje po 9 ml do prachovnic na objem 50 ml se skleněnými kuličkami (přidat cca 10 kuliček) a do plastových zkumavek. Vše se předá ke sterilizaci v autoklávu (121 o C, 15 min). Po sterilaci se uchovává v lednici do doby použití. Příprava pracovních roztoků Minerální olej Do láhve se šroubovacím víčkem (Duran Schott) nalijte minerální olej. Takto připravený olej se předá ke sterilizaci v autoklávu (121 o C, 15 min). Po sterilaci se uchovává v lednici do doby použití. Roztok na potvrzení cytochromoxidasy Složení: tetramethylparafenylendiamindihydrochlorid 1,0 g pentahydrát thiosíranu sodného 0,2 g disodná sůl ethylendiamintetraoctové 0,1 g destilovaná voda 100 ml 14

16 Příprava: Postupně se rozpustí jednotlivé složky v destilované vodě a doplní do 100 ml. Roztok nesmí přijít do styku se železem a musí se chránit před světlem. Roztok se uchovává v tmavých zábrusových lahvičkách v chladničce. Pokud roztok zmodrá, nesmí se již použít. Pozn. Pro navážení tetramethylparafenylendiamindihydrochloridu se použijí porcelánové nebo plastové pomůcky, sloučenina nesmí přijít do styku se železem. Roztok peroxidu vodíku (3 %) Připravte 50 ml roztoku. Naředit destilovanou vodou. Skladovat v chladničce. Roztok KOH (3 %) Připravte 50 ml. Naředit destilovanou vodou. Skladovat v chladničce. Lugolův roztok Složení: 3,3 g KI 1,7 g I ml destilované vody Postup: Navážený jodid draselný se převede do odměrné láhve a přelije cca 20 ml destilované vody. Po jeho rozpuštění se přidá krystalický jod. Roztok se doplní destilovanou vodou po rysku. Po rozmíchání se přelije do hnědé zásobní láhve a uchová se při pokojové teplotě. Příprava sterilních pomůcek Teoretické uvedení Skleněné zkumavky s kovovými uzavěry, skleněné kultivační nádoby, kovové uzávěry a další pomůcky se sterilizují horkým vzduchem 60 min při teplotě 170 o C nebo za podmínek tomu ekvivalentních (např. 120 min při teplotě 160 o C). Pomůcky před sterilizací se uzavřou originálními zátkami nebo víčky z hlínikové folie. Některé pomůcky jako např. špachtle, lžíce a další nástroje (kovové nebo porcelánové) jsou před sterilací neprodyšně baleny do hliníkové folie. Příprava stěrovek Na dřevěnou špejli se namotá kousek vaty, tak aby se vytvořil tampón o velikosti cca 20 mm na délku a 10 mm na šířku. Stěrovky se zabalí po čtyřech kusech do alobalu a vysterilizují se. 15

17 STANOVENÍ POČTU MIKROORGANISMŮ Teoretické úvedení Stanovení počtu mikroorganismů je kvantitativní metoda, která používá techniku očkování. Očkováním se nazývá přenesení mikroorganismů ze vzorku do nového sterilního prostředí. Očkování je základní mikrobiologická technika, která má široké uplatnění. Používá se kromě stanovení počtu mikroorganismů ve vzorku, pro izolaci čistých kultur, pro úchovu kultur atd. Očkování může probíhat z tekutých médií a vzorků nebo z pevných médií a vzorků (agarové medium, horninové prostředí) do tekutých nebo zpevněných médií. K očkování je možné použít sterilní pipetu, bakteriologickou kličku a nebo jehlu, stříkačku. Očkuje se neředěný vzorek, výchozí suspense nebo další desetinásobná ředění. Termínem výchozí suspense (primární ředění) se rozumí suspenze, roztok nebo emulze získaná poté, kdy odvážené či objemově odměřené množství výrobku určeného ke zkoušení bylo smícháno s devítinásobným množstvím ředícího roztoku a poté, kdy velké částice, pokud byly přítomny, byly ponechány sedimentovat. Z tohoto primárního ředění se připraví další desetinásobná ředění smícháním určeného objemu výchozí suspenze s devítinásobným objemem ředícího roztoku a opakováním této operace s každým takto připraveným ředěním postupně tak, až se získá série desetinásobných ředění vhodná k inokulaci kultivačních půd (ČSN EN ISO , 1999). Zkoušený podíl vzorku nebo zředění se očkuje buď přímo nebo po zakoncentrování na membránovém filtru na povrchu specifického pevného kultivačního media nebo do roztopeného média tak, že po inkubaci mikroorganismy vytvoří kolonie buď na povrchu nebo uvnitř kultivačního media. Předpokládá se, že každá kolonie je vytvořena z jednoho mikroorganismu, nebo ze shluku přítomných mikroorganismů přítomných ve vzorku v okamžiku jeho očkování (ČSN EN ISO 8199, 2008). Misky nebo membránové filtry musí být vyhodnoceny ihned po inkubaci. Není-li to možné, mohou být uchovány po krátkou dobu (např. několik dnů) při teplotě (5±3) o C za podmínky, že to neovlivní počty, vzhled nebo následné potvrzení kolonií (ČSN EN ISO 8199, 2008). Obecný postup stanovení Stanovení počtu mikroorganismů se sestává z několika kroků: - příprava výchozí suspenze, - očkování roztěrem na agar, přelivem nebo metodou membránových filtrů, - kultivace a - výpočet. Vzorek se ředí odhadem nebo podle předchozích výsledků takovým způsobem, aby narostlé kolonie byly počitatelné. Nejčastěji se používá desítkové ředění. Po zaočkování a kultivaci se spočítá množství kolonií a přepočítá se na původní množství vzorku. 16

18 Příprava výchozí suspense Do sterilní nádoby nebo do plastového sáčku se odváží hmotnost m g nebo se odměří objem V ml z reprezentativního vzorku. Přidá se ředící roztok jehož množství je rovno hmotnosti 9 x m g nebo objemu 9 x V ml. Směs se homognizuje podle doporučení a je-li třeba, velké částice se ponechají sedimentovat. Z tohoto primárního ředění se připraví další desetinásobná ředění smícháním určeného objemu výchozí suspenze s devítinásobným objemem ředícího roztoku a opakováním této operace s každým takto připraveným ředěním postupně tak, až se získá série desetinásobných ředění vhodná k inokulaci kultivačních půd. Pomocí pipety s novou sterilní špičkou se přenese 1 ml suspenze do zkumavky obsahující 9 ml sterilního ředícího roztoku o vhodné teplotě. Vzorek se dokonale zhomogenizuje (ručně nebo na vortexu po dobu 5 až 10 sec) a použije se pro další ředění. Aby se zabránilo poškození mikroorganismů prudkými změnami teploty, má být v průběhu pracovních operací teplota vzorku a ředícího roztoku přibližně shodná s okolní teplotou v laboratoři. Doba mezi ukončením přípravy výchozí suspense a okamžikem, kdy dojde k očkování tedy kontaktu inokula s živnou půdou, nesmí přesáhnout 45 min, pokud to v příslušném doporučení není uvedeno jinak (ČSN EN ISO , 1999). Stanovení počtu mikroorganismů za použití tuhých půd Pro stanovení se používají zejména tři základní techniky: 1. Technika zalévání inokula tuhou půdou. 2. Technika inokulace na povrch tuhé půdy. 3. Technika inokulace ploten formou spirály. V laboratoři budou použity první dvě techniky. Před započetím práce se spodní strana Petriho misky označí číslem vzorku, jménem, použitým ředěním a datem. Pro přenosy z každého ředění se použije nová sterilní pipeta. Technika zalévání inokula tuhou půdou Příprava agarového média Živné médium s agarem se rozehřeje na vodní lázní nebo v mikrovlnné troubě tak, aby byl dokonale tekutý. Indikátorem správného rozehřátí je změna vzhledu agaru (vyjasnění). 17

19 V případě, že médium má příliš vysokou teplotu, chladí se pomalu pod tekoucí vodou a průběžně se kontroluje jeho teplota, která by se měla pohybovat v rozmezí 44 o C až 47 o C. Při ponoření do vodní lázně medium u dna zatuhne a musí se znovu rozehřívat. Po rozmíchání vzorku se za sterilních podmínek napipetuje do Petriho misky stanovený objem vzorku (obvykle 1 ml vzorku nebo jeho zředění. Nadzvedne se víčko misky jen natolik, aby to umožnilo vložit pipetu a obsah pipety se nechá vytéct. U nádoby obsahující agarové médium se ožehne hrdlo, po otevření se medium co nejrychleji nalije 15 ml až 20 ml do Petriho misky, která je jen částečně pootevřená. Rozehřátá půda se nalévá mimo inokulum, aby nedošlo k bezprostřednímu kontaktu. Obsah misky se pečlivě promíchá krouživým pohybem, aby došlo k rovnoměrné distribuci mikroorganismů v půdě. Pak se obsah misky nechá ztuhnout. Po zatuhnutí by plocha měla být rovná a bez bublin. Doba mezi naočkováním vzorku a přidáním roztopeného média nesmí překročit 15 min. Technika inokulace na povrch tuhé půdy Před pokusem se zkontrolují agarové plotny. Agar by měl být předsušen, aby se rovnoměrně rozmístilo inokulum a došlo k zasáknutí inokula do 15 min. Pokud je na agaru viditelná povrchová vlhkost, agar se předsuší při 55 o C po dobu cca 15 min. Sterilní pipetou se přenese inokulum na předsušený agar. Na plotnu o průměru 90 mm se přenese 100 µl vzorku daného ředění a co nejrychleji a rovnoměrně se rozetře sterilní hokejkou na celý povrch. Přitom se dbá, aby nedošlo k dotknutí boční stěny Petriho misky. Inoulum se ponéchá vsáknout do agaru v miskách orientovaných víčkem vzhůru po dobu přibližně 15 min. Po vsáknutí inokula se kultivují Petriho misky s agary podle doporučení. Inkubace Pokud není ve specifických normách stanoveno jinak, po inokulaci se misky obrátí dnem vzhůru a umístí se do inkubátoru. Výpočet a vyjádření výsledků získaných za použití tuhých půd Po ukončení inkubace se spočítají kolonie na každé plotně obsahující méně než 300 kolonií nebo jiný počet stanovený specifickou normou. Uvedené metody popisují nejčastější případy, které se vyskytují při zkoušení. Výsledek se uvede jako počet mikroorganismů [KTJ/g] přítomných ve vzorku. Obecný případ Pro výpočet používejte misky, ve kterých je maximálně 300 kolonií a minimálně 10 kolonií pro misky o průměru 90 mm, pro misky o průměru 60 mm maximálně 150 kolonií a 18

20 minimálně 10 kolonií (ČSN ISO 7218, 2008). Počet mikroorganismů N [KTJ/g] přítomných ve vzorku se vypočítá podle rovnice: N = C / V(n 1 + 0,1 n 2 )d kde C je součet kolonií ze všech misek vybraných pro výpočet ze dvou po sobě následujících ředění; V je objem inokula v mililitrech očkovaného na každou z ploten; n 1 je počet misek vybraných k výpočtu z prvního zvoleného ředění; n 2 je počet misek vybraných k výpočtu z druhého zvoleného ředění; d je faktor ředění odpovídající prvnímu zvolenému ředění (např ). Výsledek se vyjádří jako počet mikroorganismů v gramu, a to jako číslo 1,0 až 9,9 násobené 10 x, kde x je příslušná mocnina 10. PŘÍKLAD Technika počítání poskytla tyto výsledky: z prvního ředění zvoleného k výpočtu (10-2 ): 168 kolonií z druhého ředění zvoleného k výpočtu (10-3 ): 14 kolonií N = C / V(n 1 + 0,1 n 2 )d = ( ) / 0,1 x 1,1 x 10-2 = Po zaokrouhlení výše uvedeným způsobem je počet mikroorganismů KTJ nebo 1,7 x 10 4 KTJ v gramu zeminy. Nízké počty Pokud misky obsahují méně než 10 kolonií, ale nejméně 4 kolonie, vypočítá se výsledek stejně jako v obecném případě, ale vyjádří se jako odhad počtu mikroorganismů v gramu nebo v mililitru. Pokud je celkový počet kolonií v rozmezí od 3 do 1, je shodnost výsledku příliš nízká a výsledek se musí vyjádřit jako: Mikroorganismy přítomny, ale v počtu nižším než 4/(V x d) v gramu nebo ml. Miska neobsahuje žádné kolonie Výsledek se vyjádří takto: Méně než 1/(V x d) mikroorganismů v gramu nebo v mililitru. Vysoké počty Pokud všechny misky naočkované všemi použitými ředěními obsahují počet kolonií vyšší než 300, výsledek se vyjádří takto: více než 300/(V x d) mikroorganismů v gramu nebo v mililitru. 19

21 STANOVENÍ MIKROORGANISMŮ V PROSTŘEDÍ Kontrola vnitřního prostředí Teoretické uvedení Aeromikrobiologie zahrnuje různé aspekty vnitřní a vnější aerobiologie, která se vztahuje ke vzdušnému přenosu relevantních mikroorganismů včetně virů, bakterií, kvasinek a plísní a prvoků. Jedná se o mikroorganismy z ovzduší, které způsobují onemocnění lidí, zvířat nebo rostlin. Přenášeny mohou být také jejich toxiny (Pepper and Dowd, 2009). Studium bioaerosolů má význam z hlediska prevence a predikce rozšíření nemocí přenášených vzduchem, ale i pro detekci agresivních biologických zbraní a hrozeb terorismu (Stites, 2002). Vnější aeromikrobiologie se zabývá studiem mikroorganismů, které jsou spojeny s vnějším prostředím. Rozloha sledovaného prostředí a přítomnost vzdušné turbulence jsou dva kontrolní faktory pohybu bioaerosolů ve vnějším prostoru. Aeromikrobiologickou cestu bioaerosolů pozměňují environmentální faktory takové jako je UV záření, teplota, relativní vlhkost. Omezují časové období, po které aerosolizované mikroorganismy zůstávají životaschopné (Pepper and Dowd, 2009). Z hlediska vnitřní aeromikrobiologie je velmi důležité zabývat se výskytem mikroorganismů pocházejících z ovzduší v prostředí domácností a pracovních prostor. Tato místa je zapotřebí dávat do souvislosti s obavami týkajícími se veřejného zdraví. Při porovnání vnitřního prostředí s vnějším prostředím, je ve vnitřním prostředí limitovaná cirkulace vnějšího vzduchu, mnohem menší expozice UV záření, kontrolovaná teplota a relativní vlhkost. To vše usnadňuje větší akumulaci mikroorganismů a jejich přežívání (Pepper and Dowd, 2009). Nyní se obecně uznává, že principiálně nepatogenní biologičtí činitelé zodpovědní za zdravotní problémy jsou spíše plísně než bakterie a viry. Tradičně se v tomto kontextu na plísně pohlíží jako na alergeny (a v některých případech jako na patogeny). Na základě získaných dat nežádoucí zdravotní efekt vyplývá z inhalace spór, ve kterých jsou obsaženy mykotoxiny (Jarvis, 2002). Limity výskytu mikroorganismů jsou definovány ve Vyhlášce (č. 6/2003 Sb.). Nepřípustný je viditelný nárůst plísní na zdech a povrchu pobytových místností. Ve sporných případech se za prokázaný růst plísní na povrchu považuje nález potvrzený odběrem a kultivací na živné půdě při 25 C způsobem provedeným v souladu s ČSN ISO Požadavky na kvalitu vnitřního prostředí staveb se pokládají za splněné, nepřekročí-li koncentrace bakterií 500 JTK/m 3 vzduchu a koncentrace plísní 500 JTK/m 3 vzduchu při stanovení koncentrace mikroorganismů aktivním nasáváním vzduchu aeroskopem a kultivací na živné půdě provedené v souladu s ČSN ISO 4833 pro stanovení celkového počtu mikroorganismů při 25 C a na živné půdě v souladu s ČSN ISO 7954 pro stanovení celkového počtu plísní a kvasinek. 20

22 Stanovení celkového počtu kvasinek a plísní v prostředí metodou spadu Cíl: Stanovit celkový počet kvasinek a plísní ve vybraném prostředí a zhodnotit čistotu prostředí. Pomůcky, materiál: 1 Petriho miska s GKCH agarem Postup: Na vybraném místě ponechte otevřenou Petriho misku s GKCH agarem, podle cirkulace vzduchu v intervalu 5 min až 15 min. Dobu expozice si zapište. Po působení Petriho misku uzavřete a ponechte kultivovat 5 dní při 25 o C. Misky se neobracejí dnem vzhůru. Vyhodnocení: Po inkubaci se spočítají všechny narostlé kolonie na plotně. Výpočet se provádí obvyklým způsobem. Výsledek se vyjádří v počtu mikroorganismů na 100 cm 2 za 10 min. Mikrobiologická kontrola osobní hygieny Teoretické uvedení Mikroflora člověka je stálá a dále přechodná. U stálé (rezidentní) mikroflóry kůže se jedná o mikroorganismy vyskytující se v hlubších vrstvách epidermis, ve vývodech potních mazových žláz, okolí nehtů zpravidla v konstantních poměrech. Přechodná (transientní) mikroflóra kůže zahrnuje mikroorganizmy kontaminující povrch kůže rukou; jejich množství a poměr je odrazem mikrobiálního zatížení prostředí a charakteru vykonávané práce. Při mechanickém mytí rukou jako součástí osobní hygieny se mechanicky odstraní nečistoty a částečně přechodná mikroflóra z pokožky rukou. U hygienického mytí rukou se odstraní nečistoty a sníží množství přechodné mikroflóry na pokožce rukou mycími přípravky s dezinfekční přísadou. Tento způsob mytí se používá ve zdravotnictví, potravinářství, osobní hygieně apod. Dalším způsobem je hygienická dezinfekce rukou, kdy se redukuje množství přechodné mikroflóry z pokožky rukou s cílem přerušení cesty přenosu mikroorganismů. Provádí se po náhodné kontaminaci rukou biologickým materiálem, při protržení rukavic apod. Nejúčinnější je chirurgická dezinfekce rukou, kdy se redukuje množství přechodné i trvalé mikroflóry na pokožce rukou a předloktí (Vít, 2005; MZd /2005). K zajištění jednotného postupu hygienického zabezpečení rukou existuje metodický pokyn zásady osobní hygieny, který přesně definuje dílčí postupy při mytí a dezinfekci rukou a tyto postupy standardizuje (Vít, 2005; MZd /2005). Mikrobiologická kontrola se zaměřuje na stanovení kontaminace rukou a oděvů osob. K vyšetření mikroflóry rukou a oděvů, popř. pracovní obuvi, zaměstnanců se používá běžně stěrová metoda (odběr pomocí sterilních vatových tampónů) nebo metodou otisků. Při kultivačním vyšetření se stanovuje zejména celkový počet mikroorganismů, tj. bakterií na např. masopeptonovém agaru, kvasinek a plísní na sladinovém agaru, a celkový počet koliformních bakterií na Endově agaru. 21

23 Stanovení mikrobiální kontaminace rukou stěrovou metodou Cíl: Stanovení celkového počtu mikroorganismů stěrovou metodou z rukou před a po umytí. Ruce se umyjí mechanicky, hygienicky a hygienicky s desinfekcí. Pomůcky, materiál: 4 fyziologický roztok po 9 ml 4 Petriho misky s Trypton sojovým agarem 4 stěrovky s vatovým tamponem tekoucí pitná voda tekutý mycí přípravek z dávkovače, toaletní mýdlo apod. mycí přípravek s mycím a s desinfekčním účinkem alkoholový desinfekční nebo jiný dezinfekční prostředek (Persteril, Braunol apod.). Postup: Nemyté ruce Sterilní tampon se namočí ve sterilním ředícím roztoku (např. fyziologický roztok s peptonem) a dvaceti tahy ve směrech na sebe kolmých se tamponem setře 100 cm 2 vyšetřovaného povrchu. Tampon se vloží do 10 ml fyziologického roztoku s peptonem. Po vytřepání mikroorganismů 25-ti úhozy o dlaň se z roztoku očkuje přímo nebo po naředění do Petriho misek. Mechanické mytí rukou ruce se zvlhčí vodou, nanese se mycí přípravek a dobře se rozetře na rukou technikou uvedenou na obr. č. 1, s malým množstvím vody se napění, vlastní mytí trvá 30 vteřin, ruce se dobře opláchnou tekoucí pitnou vodou (Vít, 2005), setřepe se voda (neotírat do ručníku, tím se změní účinnost mycích prostředků). Setře se vyšetřovaný povrch tamponem jako v předchozím případě. Obr. č. 1 Technika správného mytí rukou podle ČSN EN 1499 a ČSN EN

24 Hygienické mytí rukou Ruce se zvlhčí vodou, nanese se výrobcem doporučené množství mycího přípravku s desinfekční složkou dobře se vetře do rukou technikou uvedenou na obr. č. 1, vlastní mytí trvá 30 nebo 60 sec ruce se dobře opláchnou pod tekoucí pitnou vodou (MZd /2005), setřepe se voda (neotírat do ručníku, tím se změní účinnost mycích prostředků). Setře se vyšetřovaný povrch tamponem jako v předchozím případě. Hygienická dezinfekce rukou Do suché pokožky (bez použití vody) se vtírá cca 3 ml baktericidního alkoholového dezinfekčního prostředku nebo v množství doporučeném výrobcem, po dobu 30 nebo 60 sec. do úplného zaschnutí. Ruce se neoplachují ani neotírají. Kultivace: Kultivace probíhá pro celkový počet mezofilních mikroorganismů na agarovém mediu při teplotě 37 C po dobu 72 hodin aerobně. Vyhodnocení: Po inkubaci se spočítají kolonie na plotně. Výpočet se provádí obvyklým způsobem. Výsledek se vyjádří v počtu mikroorganismů na 100 cm 2. Pozn. Jako kontrola se používá u hygienického mytí rukou referenční mýdlo a u hygienické dezinfekce 60 % iso-propanol. Způsob mytí se testuje za použití Escherichia coli na 12 až 15 osobách a poté se výsledky statisticky vyhodnotí. Hygienické mytí rukou: Průměrná redukce uvolněných zkušebních mikroorganismů docílená výrobkem pro dezinfekční mytí rukou musí být statisticky významně vyšší než ta, která je docílena referenčním mytím rukou referenčním mýdlem 1 minutu. (p=0,01) Hygienická dezinfekce rukou: Průměrná redukce uvolněných zkušebních mikroorganismů docílená výrobkem pro dezinfekci rukou musí být statisticky významně vyšší, než ta, která je docílena referenční dezinfekcí rukou 60% 2-isopropanolem 2 x 3ml / 30sec. (p=0,1) (MZd /2005). Izolace a identifikace vybraného mikroorganismu z vybrané části těla stěrovou metodou Cíl: Izolovat a identifikovat mikroorganismy z vybrané části těla po získání vzorku stěrovou metodou. Pomůcky, materiál: 1 Petriho miska s krevním agarem 1 klinická stěrovka 23

25 Postup: Stěrovkou se setře mikroflóra z vybrané části těla. Stěrovkou se frakcionovaným způsobem očkuje na krevní agar. Kultivace probíhá při teplotě 37 C po dobu 72 hodin aerobně. Vyhodnocení: Po inkubaci se pozoruje nárůst mikroorganismů a hemolytická aktivita, která může být označena jako α-hemolýza nebo -hemolýza. Hemolytická aktivita označená jako α-hemolýza znamená, že došlo k částečnému rozložení hemoglobinu a jeho přeměně na methemoglobin za vzniku zelehnědého pigmentu. Úplné rozložení hemoglobinu se nazývá -hemolýza. Pozn. Způsob očkování a izolace je uveden v kapitole izolace mikroorganismů a identifikační testy. Obr. č. 2 Hemolytická aktivita bakterií na krevním agaru. a) α-hemolýza - částečné rozložení hemoglobinu a jeho přeměna na methemoglobin. b) -hemolýza - úplné rozložení hemoglobinu a) b) 24

26 Stanovení aerobních heterotrofních mikroorganismů v horninovém prostředí Teoretické uvedení Zemina je komplexní ekosystém, který obsahuje nepočitatelně lokalit a puklin o minimální velikosti, které jsou obývané mikroorganismy. Zemina je trojrozměrná matrice složená z organických a minerálních částic a produktů jejich rozkladu. Různé zeminy, včetně zemin různých biomů, mají velmi rozdílné fyzikální a biotické charakteristiky. Výsledkem těchto rozdílných charakteristik je, že zeminy obsahují různorodou populaci mikroorganismů různých aktivit (Thorn, 2002). Povrch zeminy je obýván původními populacemi archeí, bakterií, kvasinek a plísní, řasami a prvoky. Kromě původní mikroflory se do zeminy dostávají mikroorganismy činností lidí nebo zvířat. V povrchových zeminách jsou nejvíce zastoupeny bakterie. Kultivovatelné bakterie se mohou pohybovat v rozmezí JTK/g zeminy. V nesaturovaných zónách aeroby převyšují anaeroby o dva až tři řády (Maier and Pepper, 2009). Aerobní heterotrofní bakterie hrají v zeminách hlavní roli při rozkladu organické hmoty a při bioremediaci zemin kontaminovaných organickým odpadem. Tyto bakterie velmi rychle metabolizují sacharidy, bílkoviny a nukleové kyseliny v organické hmotě zemin, ale další látky, takové jako ligniny, vosky, oleje a pryskyřice degradují velmi pomalu (Alexander, 2002). Kvasinky a plísně jsou přítomné ve většině povrchových zemin. Přestože jejich počet je nižší, přispívají obvykle proporcionálně více než bakterie. Kvasinky jsou nalézány v počtech do 10 3 JTK/g, plísně v rozsahu JTK/g zeminy (Maier and Pepper, 2009). Jiný autor uvádí, že kvasinky a plísně dominují početně ale i množstvím biomasy v mnoha ekosystémech zemin, zejména v mírných, severních a arkticko-alpinských regionech a v dalších oblastech, ve kterých zeminy obsahují velké množství organické hmoty. Neuvěřitelně důležitá role kvasinek a plísní je při rozkladu organické hmoty a při mykorhizní symbiose (Thorn, 2002). Z plísní, které se vyskytují v zeminách a které se podílejí na cyklu živin, to jsou např. plísně rodu Penicillium nebo Aspergillus (Maier and Pepper, 2009). 25

27 Odběr vzorku horninového prostředí Cíl: Cílem práce je odebrání vzorku na vybraném stanovišti za aseptických podmínek a následné stanovení celkového počtu aerobních heterotrofních mikroorganismů (HM) a stanovení celkového počtu kvasinek a plísní (KP) v horninovém prostředí v den odběru a po skladování. Pro stanovení využijte metodu roztěrem inokula na agarové médium. Materiál: Sterilní volně uzavřený plastový sáček Sterilní lopatka Vydezinfikované odběrové zařízení (sondýrka, špachtle a vratidlo) Chladící box Ethanol Sterilní lžička Metr Postup: Výběr plochy a popis stanoviště Na vybraném území se popiše plocha, ze které se budou odebírat vzorky (vegetační pokryv, morfologie vzorkované oblasti - rovina, svah, chemické nebo biologické příměsi, kontaminace). Postup odběru je shodný s ČSN ISO dle pokynů asistenta. Odběr vzorku (ČSN ISO ) Odstraní se vegetační pokryv, velké části rostlin, kořeny, viditelná fauna. Odebraný vzorek se přenese do sterilního plastového sáčku, který se volně uzavře, a uchová v temnu a v chladu do zpracování. Stanovení celkového počtu aerobních heterotrofních mikroorganismů. Materiál Petriho misky obsahující živný agar Petriho misky Zkumavky s 9 ml fyziologického roztoku (ČSN EN ISO 8199, 2008) Prachovnice s 9 ml fyziologického roztoku se skleněnými kuličkami Mikropipety a špičky s filtrem (Eppendorf) Laboratorní váhy Desinfekce 26

28 Postup: Příprava ředění vzorků horninového prostředí a sedimentu Vzorek se zhomogenizuje a rozdělí do dvou přibližně stejných části. První část vzorku se zpracuje v den odběru, druhá část se použije k rozboru po skladování v lednici. Příprava ředění v den odběru i po skladování se provádí stejným způsobem. Ze vzorkovnice se sterilně odebere přibližně 1 g vzorku horninového prostředí a přenese se do předem zvážené prachovnice s 9 ml fyziologického roztoku se skleněnými kuličkami. Vzorkovnice s nadávkovaným vzorkem se zváží. Po 30 min míchání na třepačce (100 rpm) se získá 1. ředění vzorku. Z 1. ředění se odebere 1 ml vzorku a přenese do zkumavky s 9 ml fyziologického roztoku. Ředění se důkladně promíchá. Stejným způsobem se připraví tři po sobě následující ředění. Tímto způsobem se získá celkem 5 ředění. Řada desítkového ředění se použije pro stanovení počtů. Dávkování ředění a kultivace Na Petriho misky s agarovým mediem se uvedou následující údaje: označení vzorku, použité ředění, datum a příjmení. Poté se sterilní pipetou přenese na předsušený agar (55 o C po dobu 15 min nebo 24 h při pokojové teplotě) 100 µl vzorku a co nejrychleji a rovnoměrně se rozetře sterilní hokejkou na celý povrch. Každé ředění se nadávkuje na jednu Petriho misku. Po zasáknutí inokula se misky otočí dnem vzhůru a kultivují se 7 dní při teplotě 22 o C (HM) nebo 5 dní při teplotě 25 o C (KP). V průběhu kultivace se počítají narostlé kolonie (Obr. č. 3 a č. 4) a vypočítá se celkový počet mikroorganismů podle ČSN ISO 7218 (2008). Pozn. Pro stanovení celkového počtu heterotrofních mikroorganismů se použije 2. až 5. ředění a pro stanovení kvasinek a plísní 1. až 3. ředění. Obr. č. 3 Výsledek stanovení aerobních heterotrofních mikroorganismů v den odběru z horninového prostředí po kultivaci na živném agaru: a) 2.ředění; b) 3. ředění; c) 4. ředění; d) 5. ředění. a) b) c) d) 27

29 Obr. č. 4 Výsledek stanovení kvasinek a plísní mikroorganismů v den odběru z horninového prostředí po kultivaci na agaru s chloramphenikolem. a) 1.ředění; b) 2. ředění a c) 3. ředění. a) b) c) Vyhodnocení (ČSN ISO 7218, 2008) K výpočtu se použijí misky s agarovými medii, na kterých je maximálně 300 narostlých kolonií a minimálně 10 kolonií (HM) resp. agary s 10 až 150 koloniemi (KP) na Petriho miskách. Pokud se uvedené počty kolonií na médiích nevyskytují, postupuje se způsobem uvedeným v kapitole Výpočet a vyjádření výsledků získaných za použití tuhých půd. Výsledný počet mikroorganismů přítomných ve vzorku se vypočítá metodou uvedenou v kapitole, která je citována výše. Výsledek se vyjádří jako počet (nebo odhad) mikroorganismů v gramu zeminy [KTJ/g zeminy] a porovnají se získané výsledky. 28

30 Stanovení celkového počtu mikroorganismů ve vzorku vody Způsoby provádění odběrů vody (ČSN EN ISO 19458, 2007) Místo odběru musí zajišťovat reprezentativní charakteristiky vzorku a musí zahrnovat všechny vertikální, horizontální a teplotní změny a musí být přesně určitelné. Místa odběru, kde jsou podmínky nestabilní, mají být vyloučena. Pitná voda z vodovodního kohoutku Všeobecně Před odběrem je nutno zajistit asepticky čisté ruce nebo používat sterilní rukavice. Při odběru z nádrží na pitnou vodu musí být použity vzorkovnice, které jsou sterilní z vnitřní i vnější strany. Během plnění nesmí přijít část zátky, která je uvnitř vzorkovnice s ničím do kontaktu. Při odběru je nutné ponechat ve vzorkovnici malou bublinu (láhev se plní pouze po značku tzn. asi 2 cm směrem dolů od rozšířené části vzorkovnice). Voda, jak je dodávána ke kohoutku spotřebitele Při odběru se nesmí dostat do vzorku kontaminace z vnějšího povrchu kohoutku. Proto se z kohoutku oškrábe veškerá nečistota (vodní kámen, mazací tuk, sliz,...), která by mohla spadnout do vzorkovice před plněním. Neodebírá se z podtékajících kohoutků. Dále je zapotřebí odstranit z kohoutku veškeré nástavby, hadice nebo předměty vsunuté do kohoutku. Kohoutek je nutné dezinfikovat opálením nebo jiným vhodným dostupným způsobem (chlornan, ethanol). Poté se voda nechá odtékat tak dlouho, aby vzorek nebyl ovlivněn teplotou nebo dezinfekčním činidlem. Při plnění se vzorkovnice umisťují pod kohoutek, aniž by se před tím zavřel a opět otevřel. Voda v rozvodné síti Vzorky se odebírají přímo v rozvodném potrubí nebo blízko něj (těsně za vodoměrem). Musí být zajištěno, že nedojde ke kontaminaci z vnější strany kohoutku. Postupuje se stejným způsobem jako u vody dodávané ke kohoutku spotřebitele. Po dezinfekci kohoutku se kohoutek otevře na poloviční průtok a voda se nechá odtékat, dokud nemá konstantní teplotu (aby odtekla voda z rozvodu v budově). Potom se otevřená vzorkovnice umístí do proudu vody z kohoutku a za aseptických podmínek se naplní. Voda, jak je spotřebovávána Při stanovení vody, jak je spotřebovávána (např. při epidemiích) se musí brát v úvahu její kontaminace pocházející z vnější strany kohoutku a ze všech zařízení na něm umístěných. Proto se z kohoutku neodstraňují a kohoutek se před odběrem nedezinfikuje. 29

31 Voda z pramenů a studní Analýza se provádí, aby se zjistila jakost podzemní vody, jakost studniční vody nebo jakost vody, která je spotřebovávána. Podle toho se volí, zda se bude odčerpávát a dezinfikovat kohoutek. Dále záleží, zda se jedná o studnu nebo vrt se stálým odčerpáváním nebo bez instalace čerpadel. Tab. č. 1 Odběr vzorků ze studní se stálým odčerpáváním a kovovým kohoutkem či výpustí Účel Odčerpávání Dezinfekce kohoutku Jakost podzemní vody Ano (rozsáhlé) Ano Jakost studniční vody Ne (minimální) Ano Jakost vody, jak je spotřebovávána Ne Ne Tab. č. 2 Odběr vzorků ze studní bez stále instalovaných čerpadel Účel S ponornými Se vzorkovnicemi Z vědra čerpadly sterilními na povrchu i uvnitř Jakost podzemní + a) - - vody Jakost studniční vody + b) + - Jakost vody, jak je spotřebovávána - u + a) po rozsáhlém čerpání b) pouze minimální čerpání Odpadní vody Při podpovrchových odběrech je účelné používat rukavice pro jedno použití nebo sterilizovatelné tyče či kleště, aby se omezilo infekční riziko pro pracovníky. Z vnějšího povrchu vzorkovnic je nutné odstranit znečištění. Takto upravené vzorkovnice se vloží do čistých sáčků a dopravují se odděleně od vzorků pitné vody. 30

32 Stanovení celkového počtu kultivovatelných a indikátorových mikroorganismů ve vzorku vody Cíl: Cílem práce je odebrat vzorek vody za aseptických podmínek ze zvoleného místa a stanovit celkový počet kultivovatelných mikroorganismů a koliformních bakterií ve vzorku. Úkoly práce: 1) popis bodu odběru, 2) odběr vzorku vody, 3) stanovení celkového počtu kultivovatelných mikroorganismů a koliformních bakterií Materiál a zařízení pro odběr vzorku Sterilní prachovnice (objem 500 ml resp. podle vzorku vody ) Chladící box Pracovní postup při odběru a úchově vzorků Sterilizace vzorkovnic (ČSN EN ISO 19458, 2007) Vzorkovnice se sterilizují nejméně 1 h při 170±10 o C. Sterilní vzorkovnice musí být ze skla se zabroušenou zátkou překryté hliníkovou folií. Skleněné zátky se sterilizují odděleně nebo se používají papírové nebo hliníkové proužky vkládané mezi hrdlo vzorkovnice a zátku, aby se zabránilo nalepení zátky k hrdlu vzorkovnice během ochlazování. Vzorkovnice se označí datem sterilizace. Pro vzorky obsahující dezinfikované oxidační činidlo se přidává do vzorkovnic před sterilizací (vlhkým nebo suchým teplem) redukční činidlo např. thiosíran sodný. Na 1 mg chloru je nutno přidat 7,1 mg thiosíranu sodného. Na 100 ml objemu vzorku se přidává 0,1 ml 1,8 % roztok pentahydrátu thiosíranu sodného, to stačí na inaktivaci 2 mg/ až 5 mg/l volného zbytkového chloru. Odběr vzorku vody (ČSN EN ISO 19458, 2007) Způsob odběru vzorku je uveden výše. Před odběrem nebo těsně po něm je nutné označit vzorkovnice a vyplnit odběrový formulář. Doprava a uchovávání (ČSN EN ISO 19458, 2007) Doba mezi odběrem a analýzou musí být co nejkratší. V ideálním případě mají být vzorky pitné vody analyzovány v den odběru. Vzorky musí být přepravovány v chladu (5±3 C). Vzorky nesmí zmrznout a musí být chráněny před slunečními paprsky. Je-li doprava delší než 8 h musí se uvést do protokolu. Teplé a chladné vzorky se musí dopravovat odděleně. 31

33 Materiál a pomůcky v laboratoři Filtrační zařízení Kultivovatelné mikroorganismy o Agar s kvasničným extraktem o Petriho misky plastové o průměru 90 mm 4 ks o Prachovnice s 9 ml fyziologického roztoku (ČSN EN ISO 8199, 2008) pro případné ředění Koliformní bakterie o pinzeta s plochými nevroubkovanými hroty o Endův agar připravený v plastových Petriho miskách o průměru 50 mm o Roztok pro cytochromoxidasový test o Membránové filtry o průměru 47 mm a velikosti pórů 0,45 µm 2 ks o Fyziologický roztok na opláchnutí nálevky (2 x 30 ml na jedno ředění stanovení počtů membránovou filtrací) Příprava vzorku k rozboru a stanovení mikroorganismů Před rozborem se vzorek ponechá vytemperovat (na teplotu o C). Obvykle stačí doba nutná pro přípravu rozboru tedy příprava pracovního stolu a pomůcek k rozboru. Na začátku rozboru se vzorek důkladně promíchá, aby se bakterie rozptýlily v celém objemu. Poté podle předpokládaného výskytu mikroorganismů se vzorek očkuje na Petriho misku nebo se filtruje se membránovou filtrací. V případě předpokládaného vysokého počtu mikroorganismů se vzorek nejprve ředí. Stanovení celkového počtu kultivovatelných mikroorganismů (ČSN EN ISO 6222) Všechny druhy vod obsahují rozmanité druhy mikroorganismů pocházejících z různých zdrojů, jako jsou půda, rostlinstvo a stanovení celkového počtu kultivovatelných mikroorganismů poskytuje užitečnou informaci pro posouzení jakosti vody a její kontrolu. Kultivovatelné mikroorganismy jsou všechny aerobní bakterie, kvasinky a plísně, schopné tvořit kolonie v kultivačním mediu za popsaných podmínek zkoušky. Obecně je metoda vhodná pro všechny druhy vod. Podle teploty kultivace můžeme charakterizovat posoudit čistotu vody a účinnosti procesu úpravy. Kultivace při teplotě 22±2 o C poukazuje na kvalitu vody, vodního toku. Tyto mikroorganismy nemají hygienický význam. Z výsledků kultivace při teplotě 36±2 o C se může posoudit zastoupení mikroorganismů, které může mít hygienický význam. Použije se technika zalévání inokula. Po temperaci a rozmíchání vzorku se do Petriho misky naočkuje 1 ml vzorku nebo jeho zředění, přidá se 15 ml až 20 ml kultivačního média (agar s kvasničným extraktem) a obsah misky se pečlivě promíchá krouživým pohybem. Obsah misky se nechá ztuhnout. Očkuje se nejméně jedna miska pro inkubaci při každé teplotě. Doba mezi naočkováním vzorku a přidáním roztopeného média nesmí překročit 15 min. 32

34 Po zatuhnutí agaru se misky obrátí dnem vzhůru a jedna sada se kultivuje při teplotě 22±2 o C po dobu 68±4 h a druhá sada při 36±2 o C po dobu 44±4 h. Misky se vyhodnotí ihned po vyjmutí z inkubátoru. Pokud to není možné, uchovávají se při teplotě 5±3 C a vyhodnotí se do 24 h. Pro vyhodnocení se používá lupa (zvětšení 4x). Počítají se misky, na nichž vyrostlo 30 až 300 kolonií. Pozn. U pitných vod a u čistých surových vod se očkuje 1 ml vzorku a nasazují se dvě misky. Z více znečištěných vod (surové vody, studny) nebo z neznámých vod se připravují a očkují ředění. Vyhodnocení: Pro výpočet se použijí misky, ve kterých je maximálně 300 kolonií a minimálně 10 kolonií. Počet mikroorganismů N přítomných ve vzorku se vypočítá podle metody uvedené v kapitole Výpočet a vyjádření výsledků získaných za použití tuhých půd. Výsledek se vyjádří jako počet (nebo odhad) mikroorganismů v mililitru. Stanovení celkového počtu koliformních bakterií (ČSN ) Koliformní bakterie byly až donedávna považovány za nejvýznamnější ukazatel fekálního znečištění. V současné době převládá názor, že jejich přítomnost svědčí jenom o použití nevhodné technologie úpravy vody, dodatečné kontaminaci, nebo o zvýšeném obsahu živin - organických látek. Přesto jsou nadále využívány jako ukazatel, který indikuje zvýšený přísun nežádoucích mikroorganismů z vnějšího prostředí. Koliformní bakterie jsou gramnegativní tyčinky netvořící spory, s negativním cytochromoxidasovým testem, které tvoří za aerobních podmínek kolonie během 24 h kultivace při teplotě 36±2 o C na selektivním diferenciačním mediu s laktosou za současné tvorby kyselin (nebo aldehydu). Princip stanovení: Po temperaci a rozmíchání vzorku se vzorek přefiltruje přes membránový filtr. U pitných nedesinfikovaných vod se filtruje 100 ml vzorku a nasazují se dvě misky. U surových vod povrchových se použije menší objem vzorku nebo vzorek zředěný. Filtrační zařízení pro membránovou filtraci (ČSN ISO 7704, 1994) Filtrační zařízení je sestaveno z filtračního aparátu upevněného v odsávací baňce napojené na vodní filtr a zdroj vakua. Příprava filtračního zařízení Na spodní část nálevky se vloží teflonové těsnění. Na těsnění se přenese nerezový disk, který se před vložením vysterilizuje plamenem z vrchní strany. Pomocí sterilní pinzety se asepticky položí membránový filtr na porézní disk spodní části filtračního zařízení tak, aby mřížkovaná strana filtru směřovala vzhůru (Obr. č. 5). Na závěr se na zařízení s filtrem pečlivě položí filtrační komínek. Potom se odsávací baňka napojená na vodní filtr připojí na zdroj vakua. 33

35 Filtrace Do nálevky filtračního aparátu se při vypnutém odsávání asepticky přenese vzorek, zapne se vývěva a celý obsah nálevky se přefiltruje. Při stále zapnuté vývěvě se nálevka dvakrát opláchne cca 30 ml sterilního zřeďovacího roztoku. Jakmile poslední zbytky zřeďovacího roztoku použitého k opláchnutí projdou filtrem, vývěva se ihned vypne. Během filtrace je zapotřebí zacházet se vzorky tak, aby nedošlo k poškození sledovaných mikroorganismů např. v důsledku vysušení nebo tlaku způsobeného vznikem vakua. Z filtračního aparátu se sejme nálevka a odebere se membránový filtr sterilní pinzetou. Obr. č. 5 Pracovní postup při membránové filtraci Kultivace Membránové filtry po filtraci se položí na povrch Endo agaru. Přiloží se na povrch kultivačního média tak, aby se nevytvořily bubliny vzduchu mezi filtrem a povrchem agaru. V případě, že se bubliny přesto vytvoří, je třeba filtr z agaru zvednout a znovu ho pečlivě na agar přiložit. Zavřené misky se uloží dnem vzhůru do termostatu, který je vytemperován na 36±2 o C, kde se inkubují po dobu 18 h až 24 h. Pokud u vzorků pitných vod nedojde k vývinu charakteristických kolonií, misky se inkubují dalších 24 h. Průkaz přítomnosti cytochromoxidasy Po skončení kultivace se membránový filtr přenese na filtrační papír, nasycený činidlem pro cytochromoxidasový test. Po 2 min se spočítají kolonie koliformních bakterií, které jsou laktosapozitivní (Obr. č. 6), tj. tmavočervené, s tmavočervenou spodinou s negativním cytochromoxidasovým testem (tj. vyloučí se kolonie, které působením činidla na cytochromoxidasu zmodraly). 34

36 Vyhodnocení: Počítají se agarové plotny, na nichž vyrostlo 10 až 100 kolonií. Pokud vyrostl nižší nebo vyšší počet mikroorganismů, výsledek se vyjádří jako odhad mikroorganismů. Výsledek se vyjadřuje na 100 ml objem vzorku. Obr. č. 6 Sledování přítomnosti cytochromoxidasy u vzorku vody po membránové filtraci 35

37 IZOLACE MIKROORGANISMŮ, JEJICH CHARAKTERIZACE A IDENTIFIKACE Teoretické uvedení Pro biochemickou konfirmaci se používají čisté kultury. Příprava čisté kultury se započne výběrem jediné kolonie vyrostlé na nebo v agarové půdě. Vybraná kolonie se inokuluje na neselektivní agarovou půdu. Po inkubaci se vybere dobře izolovaná kolonie pro následné konfirmační testy. V případě nutnosti se tato pracovní operace opakuje. V případě, že buněčný materiál jedné kolonie není dostatečný, doporučuje se takovou kolonii nejprve subkultivovat do tekuté půdy nebo na šikmý agar a vzniklou subkulturu pak použít k provedení testů (ČSN EN ISO 7218, 2008). U vybraných kolonií se studují vlastnosti související s jejich následnou aplikací v prostředí. V první fázi se zjištˇuje morfologie buňky a vliv teploty, ph, přístupu kyslíku a její růst v médiích. Dále se stanovuje typ metabolismu a degradace vybraných substrátů. Při aplikaci mikroorganismů ve formě konsorcia je nutné také posoudit vztahy jednotlivých kultur mezi sebou. Izolace mikroorganismů Cíl: Izolujte mikroorganismus. Pro izolaci mikroorganismů použijte frakcionované rozočkování. Postup: Vybere se vhodná kolonie na agaru. Ta se ze spodní strany misky označí. Sterilní očkovací kličkou se odebere část kolonie z agarové půdy a přenese se na vybranou předsušenou sterilní agarovou půdu postupným očkováním (podle obr. č. 7). Mezi jednotlivými kroky je zapotřebí ožíhnout kličku, aby po kultivaci narostl dostatečný počet jednotlivých kolonií. Obr. č. 7 Postup při izolaci frakcionovaným rozočkováním Po inkubaci se vybere vhodná kolonie pro opakované frakcionované očkování. Z druhé nebo až ze třetí izolace se typická kolonie naočkuje na vhodnou půdu, aby se získalo dostatečné množství pro charakterizaci mikroorganismu. Pozn. Z důvodu časových možností se v laboratoři bude provádět pouze jedno frakcionované rozočkování. 36

38 Kultivační vlastnosti mikroorganismů Hodnocení kultivačních znaků po růstu na agaru Při hodnocení se pozoruje velikost, okraje, povrch, profil, vnitřní struktura, konzistence a barva (Obr. č. 8). Obr. č. 8 Vzhled kolonií na agaru Hodnocení kultivačních znaků po růstu v bujónu Zde se hodnotí čirost, zákal, povrchový růst, sediment, zápach. 37

39 Zjišťování optimálních podmínek růstu Optimální teplota se zjišťuje podle intenzity nárůstu na pevných nebo v tekutých médiích. Hodnotí se stejné znaky, jako jsou uvedeny v kapitole Kultivační vlastnosti. Postup: Do každé ze tří zkumavek s živným bujónem se naočkuje kličkou nebo jehlou část vybrané kolonie. Zkumavky se vloží do termostatu na 22, 30 a 45 o C. Po kultivaci se zjistí podle intenzity nárůstu a určí se optimální teplota. Morfologie buňky Při pozorování mikroskopického preparátu se hodnotí tvar, velikost a seskupení, tvorba spor (Obr. č. 9). Preparát se po fixaci obarví methylenovou modří. Obr. č. 9 Tvary bakteriálních buněk (Anonymous, 2017a) 38

40 Příprava preparátů Fixace preparátu Vyžíhanou kličkou se přenese na podložní sklíčko suspenze mikroorganismů nebo přímo část kolonie (možno do kapky vody nebo fyziologického roztoku) a rozetře se rovnoměrně v tenké vrstvě na povrch podložního sklíčka. Získaný nátěr se opatrně suší vysoko nad plamenem, závěrem se dvakrát až třikrát protáhne plamenem. Barvení preparátů Barvení methylenovou modří Na preparát po fixaci se nakape barvivo methylenová modř. Po 2-3 min se barvivo spláchne pod slabě tekoucím proudem vody a preparát se osuší. Stejný postup je možné použít pro barviv např. krystalovou violeť, kyselý fuchsin nebo malachitovou zeleň. Gramovo barvení Složení GRAM- sady roztoků pro barvení mikrobiologických mikroskopických preparátů podle Grama (TEST-LINE s.r.o.): roztok krystalové violeti roztok šťavelanu amonného Lugolův roztok roztok karbolfuchsinu (10 x koncentrovaný), naředit 1:9 destilovanou vodou Postup: Smíchá se jeden díl roztoku krystalové violeti a čtyři díly šťavelanu amonného. Fixovaný preparát se nabarví krystalovou violetí. Po 20 sec se preparát spláchne Lugolovým roztokem. Roztok se sleje i s původním barvivem a opětovně zalije Lugolem a ponechá se působit sec. Preparát se odbarvuje acetonem, dokud se odplavuje barvivo. Preparát se potom opláchne destilovanou vodou a odbarví se zředěným karbolfuchsinem po dobu sec. Mikroskopuje se v olejové imerzi. Grampozitivní mikroorganismy jsou modré, Gramnegativní červené. Gramlabilní: některé jsou Grampozitivní, jiné Gramnegativní nebo se buňky barví zčásti Grampozitivně a z části Gramnegativně. 39

41 Mikroskopování Pomůcky: Mikroskop s imerzním objektivem Imerzní olej Směs etheru s ethanolem (1:1) Podložní a krycí sklíčka na mikroskopování Mikroskop Součástí mikroskopu je optická soustava, osvětlovací soustava a mechanické zařízení. Optickou část zajišťuje vznik a promítání obrazu. Tuto soustavu tvoří objektiv, okulár a tubus. Mikroskop může být monokulární (pozorování jedním okem), binoklární (pozorování oběma očima) a nebo trinokulární (pozorování kamerou nebo propojení s fotoaparátem). Osvětlovací soustava zajišťuje osvětlení pozorovaného předmětu. Její konstrukce závisí na k jakému pozorování bude mikroskop použit. Průhledné preparáty se osvětlují procházejícím světlem, neprůhledné světlem odraženým. Mechanická část chrání optickou část a tvoří tělo mikroskopu. Mechanická část sestává ze stativu, který drží tělo mikroskopu, a stolku. Součástí stativu může být také osvětlení, poté makro- a mikrošroub sloužící k ostření na preparát. Pod stolkem bývá umístěn nosič kondenzoru. Poslední částí je hlavice, pokud je u mikroskopu možnost měnit objektivy různých zvětšení, pak je na ní umístěný takzvaný revolverový nosič objektivů (Anonymous, 2017). Rozlišovací schopnost je dána minimální vzdáleností dvou ještě rozlišitelných bodů (Anonymous, 2016a). Rozlišovací schopnost mikroskopu je přímo úměrná číselné apertuře (účinná světelnost objektivu) a nepřímo úměrná světelné vlně (délce) používané k pozorování. Zvětšení rozlišovací schopnosti se dosáhne zvýšením číselné apertury: tzn.zvýšením úhlu alfa nebo zvýšením indexu lomu n před objektivem. Pro suchý objektiv n = 1, pro imerzní objektiv n (cedrový olej) = 1,51. Imerzní olej je imerzní tekutina s indexem lomu (n) větší než 1. Může se používat cedrový olej (1,515 n), voda či glycerin. Při použití imerzního objektivu se před pozorováním na krycí sklíčko s fixovaným preparátem kápne imerzní tekutina a čočka objektivu se do ní ponoří. Zároveň se zvýší kontrast zobrazení, protožese omezí rušivé odrazy na krycím sklíčku i na povrchu objektivu. Někdy se požívá imerze i u světelného kondenzoru (Anonymous, 2016b). V tomto případě se na kondenzorovou čočku kápne imerze (kondenzorová imerze). Bez ní nelze dosáhnout plné numerické apertury kondenzoru. Průhledné preparáty se osvětlují procházejícím světlem, neprůhledné světlem odraženým. Aktuálně používané zvětšení se zjistí vynásobením hodnoty zvětšení okuláru s hodnotou zvětšení objektivu. 40

42 Postup při pozorování suchým systémem Mikroskop se připraví k pozorování - zkontroluje je se čistota optiky, upraví se clona. Vybere se objektiv s nejmenším zvětšením. Rozsvítí se mikroskop. Vloží se preparát pod mikroskop. Zaostří se na preparát pohybem stolku vzhůru - nejdříve makro, pak mikro posuvem. Seřídí se intenzita osvětlení. Jemně se pohybuje mikroposuvem a ostří se na různé úrovně preparátu. Pozorování s imerzním objektivem Objekt se nejprve pozoruje suchým systémem při malém zvětšení. V tomto kroku se nastaví poloha preparátu do středu zorného pole. Na preparát resp. na místo, které bude pozorováno, se nanese kapka imerzního oleje. Kapka nesmí být příliš velká, aby preparát "neplaval." Při neustálém pozorování vzdálenosti objektivu od preparátu pohledem ze strany se přibližuje makrošroubem preparát tak aby se čelní čočka imerzního objektivu dotkla kapky oleje a dále se opatrně snižuje až se čočka opatrně ponoří (téměř nadoraz, ale pozor, aby neprasklo sklíčko a nedošlo k poškození objektivu). Preparát se mírně od objektivu oddálí, aby bylo možné s preparátem posouvat, ale zároveň aby nedošlo k přerušení spojení čočky objektivu s imerzí. Najde se vhodné pozorovací místo tzn. barevné neostré pole. Mikrometrickým šroubem se preparát začne velmi pomalu přibližovat/oddalovat až je objekt doostřen. Zaostřování se musí provádět, co nejpomaleji, aby objekt byl zachycen. V případě neúspěchu se preparát přesune na jiné pozorovací místo a doostří se eventuálně je možné s obrazem při doostřování mírně pohybovat. Po pozorování se pečlivě otře olej na objektivu směsí etheru s ethanolem (1:1). 41

43 Identifikační testy Alternativa Gramova barvení Princip: U Gramnegativních bakterií se působením 3 % roztoku KOH rozpouští buněčná stěna. Rozpuštěná stěna uvolňuje intercelulární viskózní nebo emulgovaný materiál, který vytváří vlákna. Postup: Plná klička bakteriální kultury se přenese na mikroskopické sklíčko a promíchá ve dvou kapkách roztoku KOH. Vyhodnocení výsledků: Gramnegativní bakterie mění roztok na vysoce viskózní a hlenovitý v průběhu 30 s a při odtažení kličky se vytváří vlákno (Obr. č. 10). Obr. č. 10 Positivní KOH test Katalasový test Enzym katalasa iniciuje štěpení peroxidu vodíku na vodu a kyslík. Většina organismů rostoucích aerobně na agarových plotnách obsahuje enzym katalasa, avšak v různé koncentraci v závislosti na druhu a kmenu. Některé bakterie, které aerobně nerespirují např. bakterie mléčného kvašení a anaeroby obvykle tento enzym neprodukují v detekovatelné koncentraci. Vyhodnocení výsledků: Tvorba bublinek plynu (uvolněný volný kyslík, Obr. č. 11) indikuje přítomnost enzymu katalasa. Obr. č. 11 Reakce testu na přitomnost katalasy - positivní výsledek 42

44 OF test Test na oxidaci/fermentaci Médium s glukosou a acidobazickým indikátorem bromthymolovou modří (Atlas, 2010), která je následně ve vzniklém kyselém prostředí žlutá, v zásaditém moodrá alkalizací a při neutrální reakci zelená. Postup: Pro jeden mikroorganismus se použijí dvě zkumavky s vysokou vrstvou polotuhého OF média s glukosou. Inokulum se očkuje vpichem. První zkumavka se kultivuje aerobně bez parafinu (důkaz oxidace, detekce respiračních enzymů), druhá anaerobně s jednocentimetrovou vrstvou parafínového oleje (důkaz fermentace). Výsledek se odečítá po 48 h kultivace, u pomalu rostoucích mikroorganismů po 3 až 5 dnech ( Vyhodnocení podle obr. č. 12. Obr. č. 12 Možné výsledky po kultivaci na O/F test Příklady mikroorganismů: a) Escherichia coli, b) Pseudomonas aeruginosa a c) Alcaligenes faecalis Test na přítomnost cytochromoxidasy Princip:Testem se zjišťuje, zda mikroorganismy jsou schopny oxidovat aromatické aminy (tetramethyl-p-phenylendiamindihydrochlorid). Test se používá na potvrzení přítomnosti koliformních bakterií po kultivaci na Endo agaru. Koliformní bakterie vykazují negativní reakci. Postup: Filtrační papír se nasytí roztokem a sterilním párátkem se na filtrační papír přenese část kolonie a rozetře. Po 10 až 30 sec se v místě zaočkování pozoruje změna barvy: Pozitivní reakce - tmavě modré až fialové zbarvení Negativní reakce bezbarvá 43

45 Stanovení celulolytické aktivity u neznámého mikroorganismu Cíl: Zjistěte, zda mikroorganismus hydrolyzuje celulosu. Pro zjištění hydrolytické aktivity použijte metodu podle Kasana et al. (2008). Princip: Po kultivaci mikroorganismů na agaru s karboxymethylcelulosou se detekuje produkce extracelulárních celulas přelitím agaru Lugolový roztokem. V místě růstu mikroorganismů produkujících celulasu vzniká ostrá vyjasněná zóna oranžového zbarvení. Celulosa, která není hydrolyzována, reaguje s Lugolovým roztokem za vzniku hnědočerného zbarvení. Metoda je použitelná pro bakterie, kvasinky i plísně. Materiál: 1 neznámý mikroorganismus 1 bakteriologická klička 1 agar s karboxymethylcelulosou Postup: Bakteriologickou kličkou se odebere suspenze bakterií a přenese se na předsušený agar a zaočkuje se ve tvaru hádku. Tento postup se zopakuje tak, aby mikroorganismus byl zaočkován celkem třikrát. Inkubace probíhá celkem 24 h až 72 h při doporučené teplotě (22 o C nebo 37 o C). Po kultivaci se popíše nárůst na agaru. Agar se přelije Lugolovým roztokem a po 5 min se pozoruje, zda se okolo místa nárůstu vytvořila vyjasněná zóna (Obr. č. 13). Obr. č. 13 Příklad výsledku stanovení celulolytické aktivity u vzorku skládkového výluhu. pozitivní reakce 44

46 Sledování vzájemné snášenlivosti mikroorganismů Při aplikaci kultur v dekontaminačních v technologiích je obvyklé používání mikrobiálního konsorcia. Složení těchto společenstev je závislé na složení živin a ostatních látek prostředí a na daných podmínkách. V těchto společenstvech jsou mikroorganismy v určitém vzájemném vztahu. Může se jednat o vztah symbiotický, synergický, antagonistický nebo např. parazitický. Metoda cross-streak Materiál: Dvě čisté kultury na agaru Živný agar Sterilní klička nebo sterilní párátka Postup: Na předsušené Petriho misky s agarem (zvrásněný povrch) se načárkuje středem agaru kultura mikroorganismu. Ponechá se 30 až 60 minut zaschnout. Poté se přes tuto čáru v úhlu 90 o načárkuje kmen v několika opakováních (4x až 5x). Misky se ponechají inkubovat při teplotě vhodné pro studované mikroorganismy. V průběhu kultivace se odečítají inhibiční zóny (přerušení nebo oslabení růstu v bodě křížení). Odečet se provádí po 24, 48 a 72 hod. Sleduje se citlivost jednotlivých kmenů a inhibiční aktivita. 45

47 Identifikace bakterií podle protokolu A na mikrodestičce Biolog GEN III MicroPlate Princip: Z čerstvě narostlé kultury na agaru se odeberou pomocí inokulátoru jednotlivé kolonie a převedou se do media, tak aby byla získána doporučená koncentrace buněk. Po přelití inokula do vaničky se naočkuje mikrotitrační destička. V průběhu kultivace dochází k specifickému zabarvení jednotlivých jamek podle typu mikroorganismu. Po kultivaci se destička vloží do čtečky a odečte se absorbance při dvou vlnových délkách 590 nm a 750 nm. Výsledky jsou srovnány s databází mikroorganismů a je určen druh. Pozn. Podle nárůstu na plotnách se domluvíme na identifikované kultuře a celkovém počtu bakterií na skupinu. Před analýzou obdržíte čerstvě narostlou kulturu tzn. že se začne s analýzou od bodu "Příprava inokula." Mikrodestička Biolog GEN III MicroPlate Testovací mikrodestička GEN III je určena pro identifikaci Gram-pozitivních a Gramnegativních bakterií. Při použití mikrodestičky GENIII je možné charakterizovat mikroorganismus 94 fenotypickými testy: 71 testů je založeno na detekci využití zdroje uhlíku a 23 testů na sledování citlivosti k chemickým látkám (Tab. 3). Všechny nezbytné živiny a chemikálie jsou nadávkovány v jamkách a vysušeny. Využití zdroje uhlíku nebo resistenci k inhibičním dávkám se indikuje změnou zbarvení tetrazoliových redoxních barviv. Barvivo trifenyltetrazolium (TTC) přijímá elektrony uvolněné ze substrátu, čímž se redukuje a dochází ke vzniku trifenylformazanu, který je doprovázen změnou barvy (z bezbarvé na fialovou). Bakterie mohou identifikovány pomocí několika protokolů. Jediný rozdíl je v použití inokulačního media (IF-A, IF-B, IF-C) a v buněčné hustotě pro inokulaci. Výběr protokolu probíhá na základě předpokládaného druhu mikroorganismu (Tab. 4). Pokud není zřejmé, jaký protokol je nutno použít, zvolí se protokol A. Jestli není možné mikroorganismus identifikovat z důvodu falešně pozitivních výsledků, potom se využije protokol B. Jestli se opět dosáhne nedostatečného množství pozitivních reakcí u zdrojů uhlíku, potom se použije protokol C1 a C2 (jednou inokulační medium (IF-C). 46

48 Tab. 3 Testy na mikrodestičce GEN III A1 je negativní kontrola pro zkoušky na využití uhlíku (sloupce 1-9). A10 je pozitivní kontrola pro zkoušky na testování citlivosti (sloupce 10-12) Tab. 4 Testovací protokoly Protokol IF medium Buněčná hustota Druhy (Turbidita) A A a Téměř všechny bakterie B B Silně redukující Grampozitivní a Gram-negativní bakterie tvořící kapsule C1 C Mikroaerofilní, kapnofilní b Gram-pozitivní bakterie C2 C Náročné, kapnofilní, citlivé ke kyslíku Gram-negativní bakterie a na základě školení doporučeno % T b vyžadují zvýšený obsah CO 2 Příklady Aeromonas, Bacillus, Brevibacillus Streptococcus, Lactobacillus, Corynebacterium, Pediococcus Haemophilus, Neisseria, Actinomyces, Aerococcus, Lactobacillus, Pediococcus 47

49 Materiál poloautomatický identifikační přístroj se specificky upraveným spektrofotometrem pro odečet testů PC s předinstalovaným softwarem (Omnilog Data Collection) a softwarem pro zpracování dat mikrotitrační destička Biolog GEN III MicroPlate Plotnový agar na Petriho miskách (Plate count agar) inokulační medium IF-A sterilní inokulační vatové tyčinky (Inokulator TM ) digitální multikanálová pipeta se špičkami turbidimetr standardy na kontrolu nastavení turbidity (85 % T, 65 % T) neznámý mikroorganismus preparát Etherdegrader nebo mikroorganismy testované na hydrolyzu celulosy Pozn. Destička a inokulační medium musí být předehřány na pokojovou teplotu. Jednotlivé kroky analýzy 1. Příprava kultury 2. Příprava inokula 3. Zaočkování mikrotitrační destičky 4. Kultivace 5. Odečet na zařízení Biolog a interpretace výsledků Příprava kultury Den před identifikací se zaočkuje kultura na Plotnový agar. Kultivace 4-24 h při 33 o C. Sporulující bakterie méně než 16 h, aby nedošlo ke sporulaci. Příprava inokula Příprava inokula se sestává z kalibrace turbidimetru, naočkování kultury a kontroly turbidity. Kalibrace turbidimetru Zkalibruje se turbidimetr (Obr. č. 14) na destilovanou vodu (turbidita 100 %). Poté se použijí pro kontrolu standardy (65 % T a 85 % T). Nastaví se turbidita nezaočkované zkumavky s IF- A na 100 % T. Připraví se inokulum na požadovanou turbiditu % (pro protokol A). Pozn. Všechny používané zkumavky je zapotřebí očistit od otisků prstů. Na zkumavku se napíše značka, aby se vkládala stejným způsobem do turbidimetru. 48

50 Obr. č. 14 Turbidimetr pro přípravu inokula Odběr inokula Jednotlivé kolonie se odeberou inokulátorem. Podle rychlosti růstu se odebírá potřebné množství z místa uvedeného na Obr. č. 15b (rychle rostoucí), č. 15c (středně rychle rostoucí) nebo č. 15d (pomalu rostoucí). Inokulum se setře o stěnu zkumavky (nenamáčí se do bujonu) a promíchá se pomalým převracením, aby nedošlo k tvorbě bublin. Pokud se vytvořily shluky, rozetřou se inokulátorem proti stěně zkumavky nebo se odstraní. Zkontroluje se turbidita. Pokud turbidita nedosáhla požadované hodnoty, přidá se inokulum. Pozn. Při měření pozor na tvorbu bublinek Obr. č. 15 Ukázka místa odběru bakterií z agaru. b) rychle rostoucí; c) středně rychle rostoucí; d) pomalu rostoucí. Zaočkování mikrotitrační destičky Buněčná suspenze se opatrně přelije do reservoáru. Do jednotlivých jamek se krokovací pipetou naočkuje po 100 µl suspenze (Obr. č. 16). Je zapotřebí aby nedošlo k přenosu suspenze z jedné jamky do druhé. Inokulační medium vyváří po zaočkování měkký gel. Destička se uzavře a popíše - jméno, mikroorganismus, datum, čas zaočkování. 49

51 Obr. č. 16 Očkování digitální mikropipetou na destičku. Kultivace Destička se vloží do termostatu na 33 o C na 3 až 36 h a v průběhu kultivace se odečítá nárůst mikroorganismů. Odečet na zařízení Biolog a interpretace výsledků Po odečtení nárůstů mikroorganismu v jamkách, software identifikuje mikroorganismus a uvede výsledky jako řadu po sobě jdoucích nejvíce se shodujících druhů (Obr. č. 17). Konečný identifikační výsledek je uveden v ID boxu. Obr. č. 17 Výsledek identifikace sbírkového kmene Escherichia coli ATCC ID box - identifikační box, ve kterém je uveden výsledek identifikace kmene (zelené zbarvení) PROB - umožňuje porovnat ID s ostatními systémy, které využívají tento typ výpočtu. Pokud je výsledek No ID, hodnota PROB se neukáže. SIM - index hodnoty podobnosti posuzuje, jak je vzorek dobře identifikován. Hodnota 1 znamená perfektní shodu, 0 není shody. DIST -indikuje přibližný počet rozdílů mezi našimi výsledky na mikrodestičce a výsledky uvedenými pro daný druh v databázi Výsledek stanovení v ID boxu vykazuje vysokou shodu (téměř 1) s navrženým druhem, jehož hodnoty jsou uloženy v databázi, pokud: 1) navržené druhy jsou stejného nebo blízkého rodu (Příklad na Obr. č. 18a a č. 18b), 2) SIM (index hodnoty podobnosti) je větší než 0,5, 3) Vzdálenost DIST mezi dvěma navrženými druhy je větší než 1. Jestliže není zaznamenána shoda v ID boxu, může se ukázat např. No ID nebo No ID Yet - Continue Incubation. 50

52 Obr. 18 Příklad identifikace Escherichia coli ATCC pomocí zařízení Biolog: a) po 7 h kultivace, b) po 8 h kultivace a) 7 h kutivace 51

53 b) 8 h kultivace 52