UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA FARMACEUTICKÉ BOTANIKY A EKOLOGIE RIGORÓZNÍ PRÁCE

Transkript

1 UNIVERZITA KARLVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLVÉ KATEDRA FARMACEUTICKÉ BTANIKY A EKLGIE RIGRÓZNÍ PRÁCE Biologicky aktivní metabolity rostlin II. Alkaloidy Corydalis cava (L.) Shweigg. & Körte (Fumariaceae) a screening jejich biologických vlastností. Biological Active Plant Metabolites II. Alkaloids of Corydalis cava (L.) Schweigg. & Körte (Fumariaceae) and Screening of Their Biological Properties. Školitel: Ing. Lucie Cahlíková, Ph.D Mgr. Jan Průša

2 PRHLÁŠENÍ Prohlašuji, že tato diplomová práce je mým původním autorským dílem, které jsem vypracoval samostatně. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpal, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. V Hradci Králové, 15. ledna 2010 Mgr. Jan Průša 1

3 PDĚKVÁNÍ Chtěl bych poděkovat paní Ing. Lucii Cahlíkové, Ph.D. za veškerou pomoc, trpělivost, cenné odborné rady, za změření a interpretaci MS spekter, poznámky k NMR spektrům, veškeré poskytnuté materiály a vedení během vypracovávání mé diplomové práce. Dále bych chtěl poděkovat Prof. RNDr. Janu Schramlovi, DrSc., Ing. Milanovi Kurfürstovi, Ph.D. z Ústavu chemických procesů AV ČR v Praze za změření NMR spekter a také Ing. Kateřině Macákové za stanovení biologických vlastností izolovaných látek. Dále kolektivu katedry farmaceutické botaniky a ekologie za příjemné prostředí a pomoc při řešení technických a teoretických problémů. A také svým rodičům a kamarádům, kteří mi byli vždy oporou. 2 Mgr. Jan Průša

4 BSAH 1

5 bsah Úvod Cíl práce Teoretická část Kritéria výběru rostliny pro fytochemický výzkum Corydalis cava (L.) Schweigg. & Köerte - Dymnivka dutá Synonyma Systematické zařazení Botanický popis Botanický popis čeledi Botanický popis rostliny Ekologie Areál rozšíření Celkové rozšíření Rozšíření v České republice Popis drogy bsahové látky Corydalis cava (L.) Schweigg. & Köerte Isochinolinové alkaloidy z Corydalis cava (L.) Schweigg. & Köerte statní sekundární metabolity izolované z Corydalis cava (L.) Schweigg. & Köerte Alzheimerova choroba její etiopatogeneze a možnosti terapie Charekteristika Alzheimerovy choroby Acetylcholinesteráza a butyrylcholinesteráza a jejich inhibice Inhibice AChE a BuChE alkaloidy z Corydalis cava a dalších rostlin rodu Corydalis statní biologické aktivity alkaloidů z Corydalis cava Fytochemické a biologické studie dalších druhů rodu Corydalis Corydalis yanhusuo Corydalis solida Experimentální část Všeobecné postupy Destilace a odpařování Chromatografie Tenkovrstvá chromatografie Sloupcová chromatografie Materiál a vybavení Rozpouštědla Chemikálie Chemikálie a materiál ke stanovení účinku AChE a BuChE (IC 50 ) Chemikálie ke stanovení antioxidační a antiprotozoální aktivity Přístroje použité při stanovení biologických účinků izolovaných látek Detekční činidla Chromatografické desky a absorbenty Vyvíjecí soustavy pro analytickou tenkovrstvou chromatografii Vyvíjecí soustavy pro preparativní tenkovrstvou chromatografii Zpracování chloroformového výtřepku B z Corydalis cava Příprava a čištění výtřepku Corydalis cava/b/chcl Sloupcová chromatografie výtřepku Corydalis cava/b/chcl Zpracování spojených frakcí 7 a

6 Čištění a separace minoritních alkaloidů z F Izolace alkaloidů z podfrakce F Určení struktury izolované látky Měření hmotnostního spektra Měření NMR spektra Stanovení účinku alkaloidu na lidskou HuAChE a sérovou HuBuChE (IC 50 ) Stanovení antioxidační aktivity Stanovení antiprotozoální aktivity Výsledky Strukturní studie izolované látky Hmotnostní spektrum izolované látky NMR studie izolované látky H NMR spektrum izolované látky C NMR spektrum izolované látky Strukturní studie izolované látky Hmotnostní spektrum izolované látky NMR studie izolované látky H NMR spektrum izolované látky C NMR spektrum izolované látky Antioxidační aktivita alkaloidů Inhibiční aktivita vůči AChE a BuChE Antiprotozoální aktivita alkaloidů Diskuze Literatura Seznam zkratek..66 3

7 1 ÚVD 4

8 V současné době mají přírodní léčiva nezastupitelné místo v medicíně. Moderní výzkum nových léčiv se po určité době opět vrací k rostlinnému materiálu, který je v dnešní době ekonomicky výhodnější a mnohdy levnějším zdrojem biologicky aktivních látek. Velká pozornost je v současnosti věnována rostlinám tradiční čínské medicíny, která využívá asi 5000 léčivých rostlin, u nás nepříliš známých nebo terapeuticky nevyužívaných 1,2. Do popředí se také dostávají rostliny dříve považované za okrasné. Jednou ze skupin látek přírodního původu, které jsou již delší dobu sledovány tvoří alkaloidy. Alkaloidy se vyskytují především ve vyšších rostlinách. dhaduje se, že % všech rostlin obsahují alkaloidy. Biogeneticky jsou tyto látky odvozené od aminokyselin. Podle původní aminokyseliny se dělí na základní strukturní typy (tropanové, isochinolinové, chinolinové atd.), které se dále dělí na podstruktury 3. Jedna z nejvýznamnějších a nejrozšířenějších skupin alkaloidů je skupina isochinolinových alkaloidů. Tyto látky se vyznačují širokým spektrem výskytu, struktur a biologických účinků. Jsou soustředěny především do čeledí Papaveraceae, Berberidaceae, Ranunculaceae, Fumariaceae a Amarylidaceae 4-6. Isochinolinovým alkaloidům je v současné době věnována velká pozornost pro jejich schopnost inhibovat cholinesterázy, které se podílejí na vzniku neurodegenerativních onemocnění. Mezi tyto nemoci patří především Alzheimerova choroba, která je zodpovědná za cca % všech demencí. Tímto onemocněním trpí každý desátý člověk starší 65 let a až každý druhý starší 85 let. Tato choroba se v současné době nedá vyléčit, pouze zmírnit a zpomalit její příznaky. Jednou z terapeutických možností zpomalení progrese Alzheimerovy choroby je podávání inhibitorů acetylcholinesterázy (AChE). Na základě posledních studií bylo zjištěno, že při této chorobě určitou roli hraje i enzym butyrylcholinesteráza (BuChE) a bylo by potřeba blokovat i tento enzym. Jedním z nejrozšířenějších terapeutik používaných při léčbě Alzheimerovy choroby je isochinolinový alkaloid galanthamin, který specificky inhibuje pouze AChE a vůči BuChE je prakticky neúčinný 7. V současné době se hledají především látky, které 5

9 budou schopny inhibovat oba typy cholinesteráz. Vzhledem k celosvětovému stárnutí populace se neurodegenerativní choroby a jejich terapie stávají velkým sociálním problémem a hledání nových potencionálních léčiv, jak přírodního tak i syntetického původu, se věnuje řada pracovních skupin po celém světě 8,9. Jedním z rostlinných druhů obsahujících isochinolinové alkaloidy je rod Corydalis, který se v Asii, ale i v Evropě a Americe široce používá nejen v lidovém léčitelství. Z tohoto rodu byla doposud izolována celá řada isochinolinových alkaloidů, ale jejich biologické aktivitě většiny z nich nebyla doposud věnována velká pozornost 10,11. 6

10 2 CÍL PRÁCE 7

11 Cílem mé rigorózní práce bylo: 1. Provést preparativní tenkovrstvou chromatografii podfrakce F 1-3, získané v rámci diplomové práce Získání minimálně jedné látky v čistém stavu, určení jejích základních fyzikálněchemických charakteristik. 3. Příprava vzorků na biologické testování. 4. Podílet se na stanovení biologických aktivit (inhibice AChE, BuChE, antioxidační a antiprotozoální aktivita) izolovaných látek. 8

12 3 TERETICKÁ ČÁST 9

13 3.1 Kritéria výběru rostliny pro fytochemický výzkum Na základě screeningu biologických vlastností sumárních ethanolových extraktů alkaloidních rostlin provedených v roce 2007 na pracovišti KFBE doc. RNDr. Lubomírem pletalem, CSc. a literární rešerše, byla pro fytochemickou studii vybrána rostlina Corydalis cava (L.) Corydalis cava (Dymnivka dutá) je vytrvalá bylina, patřící do čeledi Fumariaceae a je bohatým zdrojem isochinolinových alkaloidů. Tato rostlina je široce rozšířena a využívána především v Asii v lidovém léčitelství na zmírnění bolesti hlavy, kloubů, při gastrointestinálních obtížích a při léčbě chorob CNS 16,17. Do rodu Corydalis patří celá řada dymnivek, které jsou rozšířené po celém světě. Mnoho z nich bylo podrobeno fytochemickému výzkumu a screeningu biologických vlastností jejich sumárních extraktů isolovaných látek (C. cava, speciosa, nobilis, solida, yanhusuo, sempervirens atd.) Corydalis cava (L.) SCHWEIGG. & KÖERTE - Dymnivka dutá Synonyma 22 : Fumaria bulbosa a cava L., Fumaria cava (L.) Mill., Pistolochia cava (L.) Bernh., Corydalis tuberosa DC. 10

14 br. 1. Corydalis cava (L.) Schweigg. & Köerte celá rostlina Systematické zařazení Tab. I. Systematické zařazení Corydalis cava 24 Říše Rostliny Plantae Podříše vyšší rostliny Cormobionta ddělení rostliny krytosemenné Magnoliophyta Třída vyšší dvouděložné rostliny Rosopsida Řád pryskyřníkotvaré Ranunculales Čeleď zemědýmovité Fumariaceae Rod dymnivka Corydalis Botanický popis Botanický popis čeledi Jednoleté až vytrvalé byliny bez mléčnic se střídavými listy. Trojčetné nebo zpeřené listy jsou řapíkaté, bez palistů, vyrůstají střídavě. boupohlavné souměrné květy se skládají do hroznů 11

15 nebo do lat. Kalich je tvořen dvěma malými lístky, které jsou opadavé nebo chybí. Korunu tvoří čtyři plátky ve dvou kruzích. V květu jsou dvě tyčinky na širokých nitkách, nahoře se dělí na tři části. Prostřední část tyčinky nese dvoupouzdré prašníky, okrajové části mají prašníky jednopouzdré. Svrchní semeník srůstá ze dvou plodolistů. Plody jsou nažky nebo tobolky, které mají dvě chlopně. Řadí se sem asi 18 rodů se 450 druhy. blast rozšíření hlavně v mírném pásmu na severní polokouli. Čeleď Fumariaceae je příbuzná s čeledí mákovitých (Papaveraceae). d čeledi Papaveraceae se liší několika znaky. Čeleď Fumariaceae nemá ve svých pletivech mléčnice, ale jen idioblasty obsahující alkaloidy. Semeník u čeledi Papaveraceae může srůstat z většího počtu plodolistů (až z devatenácti) Botanický popis rostliny Vytrvalá bylina dorůstající výšky cm. Z velké a duté podzemní hlízy vyrůstá lysá, přímá lodyha, která není pokrytá šupinami. Silná lodyha nese pouze dva listy, které mají sivozelenou barvu. Vyrůstají na krátkých řapících, v obrysu mají tvar široce trojboký. Listy jsou 2 trojčetné. Lístky mají v obrysu tvar klínovitě obvejčitý, jsou nepravidelně laločnaté, někdy až dělené do zašpičatělých podlouhlých úkrojků. boupohlavné souměrné květy, které vyrůstají v úžlabí celokrajných a vejčitých listenů, se skládají do přímého a bohatého hroznu. Šupinkatý kalich je tvořen dvěma volnými lístky, je prchavý. Koruna je tvořena čtyřmi plátky. Vnější horní plátek se protahuje v ostruhu, ale vnější dolní plátek se na vzniku ostruhy nepodílí. Dva vnitřní plátky mají podlouhlý tvar, v přední části jsou černé. Barva koruny bývá růžová se šedým nádechem nebo žlutavě bílá. struha je dlouhá, na konci dolů ohnutá. Celý květ i s ostruhou pak měří mm. V květech se nacházejí pouze dvě tyčinky, svrchní semeník srůstá ze dvou plodolistů. Plody jsou tobolky, které se zužují v přímý zobánek a dosahují délky až 25 mm. Semena jsou lesklá a mají černou barvu. Rostlina kvete od března do května

16 br. 2. Corydalis cava (L.) Schweigg. & Köerte květ Ekologie Dymnivku dutou najdeme v lužních lesích, smíšených listnatých lesích a humózních hájích, někdy i na loukách. Roste na vlhčích, humózních, na minerály bohatších kyprých půdách. Přednost dává teplejším stanovištím a roste za příznivých podmínek většinou pospolitě Areál rozšíření Celkové rozšíření ASIE Západní Asie: Írán, Turecko Kavkaz: Ázerbájdžán, Georgie, Rusko EVRPA Severní Evropa: Dánsko, Švédsko Střední Evropa: Rakousko, Belgie, Česká Republika, Slovensko, Německo, Maďarsko, Polsko, Švýcarsko Východní Evropa: Lotyšsko, Litva, Rusko, Ukrajina 13

17 Jihovýchodní Evropa: Albánie, Bulharsko, bývalá Jugoslávie, Řecko, Itálie, Rumunsko Jihozápadní Evropa: Francie, Portugalsko, Španělsko Rostlina je rozšířená od nížin do podhůří. Vyskytuje se hlavně ve střední Evropě. Na území České republiky roste hojně. Zavlečena byla i do Anglie Rozšíření v České republice br.3. blasti výskytu Corydalis cava v České republice Popis drogy Celá droga chutná hořce a je bez zápachu. Hlízy jsou kuželovité až nepravidelnělaločnaté, šedohnědé barvy, v terminální se zbytky stonku, bazální část má dovnitř zahnutou dutinu opatřenou obrubou, hladkou, jakoby zalomenou rovinou zelenožluté barvy bsahové látky Corydalis cava (L.) Schweigg. & Köerte Z fytochemického hlediska byla Corydalis cava intenzivně studována hlavně v minulém století. Z různých částí rostliny (hlízy, kořeny, nadzemní části) bylo izolováno velké množství terciárních a kvartérních isochinolinových alkaloidů patřících do několika strukturních typů 17,31. 14

18 Pomocí moderních analytických metod (GC-MS, HPLC-MS, CE-MS) 11 bylo v poslední době identifikováno mnoho minoritních alkaloidů, které nebyly doposud izolovány v čistém stavu. Velice intenzivně se studiu isochinolinových alkaloidů věnoval v 60. až 80.-tých letech minulého století český chemik J. Slavík, který izoloval a strukturně popsal řadu látek z rostlin řádu Papaverales 17,32, Isochinolinové alkaloidy z Corydalis cava (L.) Schweigg. & Köerte Doposud izolované alkaloidy z Corydalis cava lze rozdělit do několika strukturních typů. V následující přehledu jsou shrnuty nejvíce zastoupené alkaloidy, izolované z různých částí rostliny Corydalis cava. 1) aporfinové alkaloidy: (+)-bulbokapnin isolován z hlíz, kořenů i nadzemních částí rostliny 17,31 Me H H N Me (+)-domesticin isolován z nadzemní části rostliny 31 Me H H N Me 15

19 (+)-glaucin isolován z nadzemní části rostliny 17,31 Me Me Me Me H N Me (+)-isoboldin isolován z hlíz a nadzemních částí rostliny 17,31 H Me Me H H N Me (+)-korydin - isolován z hlíz 16,17 Me H Me Me (+)-korytuberin - izolován z hlíz 17 H N Me Me H Me Me H N Me 16

20 (+)-magnoflorin izolován z hlíz 17 Me H H Me N + H Me Me (+)- nantenin izolován z hlíz a nadzemních částí rostliny 17,31,34 Me Me H N Me (+)-predicentrin isolován z nadzemních částí rostliny 17,31,34 Me H Me Me H N Me 17

21 2) ftalylisochinolinové alkaloidy: (-) kapnoidin izolován z hlíz a nadzemních částí rostliny 31,34 Me H N H 3) protoberberinové a berberinové alkaloidy: apokavidin izolován z hlíz 31 N Me H Me berberin izolován z hlíz, kořenů i nadzemních částí rostliny 31,33 Me Me N + 18

22 (+)-kanadin - izolován z hlíz 31 H Me Me N kolumbamin - izolován z hlíz 31 H Me Me Me N + koptisin - - izolován z hlíz a nadzemních částí rostliny 17,31 N + (+)-korydalin - izolován z hlíz 31 Me H Me Me Me Me N 19

23 (+)-korybulbin - izolován z hlíz 17 Me H Me H Me palmatin - izolován z hlíz 17 Me N Me Me Me Me N + (+)-stylopin - izolován z hlíz a nadzemních částí rostliny 17,31 H N tetrahydropalmatin - izolován z hlíz 17,31 Me Me Me Me N 20

24 4) protopinové alkaloidy: allokryptopin izolován z hlíz i nadzemních části rostlin 17 Me Me N Me korykavin izolován z hlíz 17 Me N Me (+)-korykavidin izolován z hlíz 17,31 Me Me N Me Me protopin izolován z hlíz i nadzemních částí 17,34 N Me 21

25 5) morfinanové alkaloidy: Sinoakutin 34 Me N Me Me H 6) sekoberinové alkaloidy: (-)-kanadalin izolován z hlíz 35 H N Me H Me Me statní sekundární metabolity izolované z Corydalis cava (L.) Schweigg. & Köerte Další látka izolovaná z Corydalis cava byla kyselina fumarová 31. Jiným sekundárním metabolitům přítomným v Corydalis cava nebyla doposud věnována významná pozornost. HC CH br. 4. Kyselina fumarová 22

26 3.4 Alzheimerova choroba její etiopatogeneze a možnosti terapie Charekteristika Alzheimerovy choroby Alzheimerova choroba patří mezi neurodegenerativní onemocnění a tvoří 50-60% veškerých demencí. Porucha paměti a prostorová desorientace, ztráta intelektu i sociálních dovedností a výkyvy emocionálního charakteru jako je agitovanost, deprese, úzkost nebo agresivita, jsou příznaky postihující pacienty s tímto onemocněním. Dochází k ubývání neuronů a celkové atrofii mozkové nervové tkáně. Předpokládá se, že dysfunkce a úbytek neuronů je způsoben zejména narušením metabolické a iontové homeostázy a oxidačním poškozením. Postižena je zejména cholinergní aktivita. Dochází ke snížení aktivity cholinacetyltransferázy, enzymu který syntetizuje acetylcholin, je omezen vstup prekurzorů (cholin, acetyl-koenzym A) a zpětné vychytávání acetylcholinu i jeho uvolnění z presynaptického zakončení. Dalším ovlivněným systémem je systém serotoninergní, je snížena hladina somatostatinu. S věkem klesá i syntéza dopaminu a stoupá jeho inaktivace monoaminooxidázami (MA) 36. Významnou roli při Alzheimerově chorobě hrají dva enzymy, a to acetylcholinesteráza a butyrylcholinesteráza Acetylcholinesteráza a butyrylcholinesteráza a jejich inhibice Acetylcholinesteráza (AChE) je vysoce specifický a výkonný enzym vyskytující se především v cholinergních neuronech a v okolí cholinergních synapsí (ve vysokých koncentracích se nachází na nervosvalovém spojení). Hydrolyzuje zejména acetylcholin, uvolněný nervovou stimulací do synaptické štěrbiny a uvnitř nervových zakončení zodpovídá za rozklad cytoplazmatického acetylcholinu na cholin a acetát. Jeho inhibicí, ať už reverzibilní nebo ireverzibilní, dochází k nahromadění ACh na muskarinových respektive nikotinových receptorech a tím k jejich hyperstimulaci

27 Je několik různých forem acetylcholinesteráz. V mozku zdravého člověka převládá tetramerní G4 forma a pouze minoritní je forma monomerní G1. U Alzheimerovy choroby vzrůstá podíl formy G1 a klesá podíl G4 41. Důležitou částí AChE, která napomáhá při štěpení ACh, je anionické centrum. ACh se váže k anionickému centru enzymu kvartérním dusíkem a poté je rozložen deprotonizovaným hydroxylem aminokyseliny serinu esteratického centra. Strukturně podobné látky obsahující kvartérní dusík, vykazují rovněž zvýšenou afinitu k AChE. Jejich navázáním k enzymu dochází k reverzibilní, nejčastěji kompetitivní inhibici enzymu 42. Inhibitory AChE jsou v současnosti užívány jako pesticidy (parathion, malathion), léčiva Alzheimerovy choroby (takrin, donepezil, rivastigmin, galanthamin), k léčbě myastenia gravis (neostigmin, pyridostigmin), k premedikaci před otravou nervově paralytickými látkami (SAD-128) či v oftalmologii. Butyrylcholinesteráza (též pseudocholinesteráza, BuChE) je substrátově méně specifický enzym, který přednostně rozkládá jiné substráty než acetylcholin (např. butyrylcholin, prokain, suxamethonium apod.). Je přítomna např. v plazmě, játrech a pouze v omezeném rozsahu v neuronech periferního a centrálního nervového systému 37. Při vypuknutí Alzheimerovy choroby však její aktivita dramaticky roste a při hledání nových potenciálních terapeutik, je nutno věnovat pozornost i této skutečnosti. Za posledních několik let znalosti o struktuře, vlastnostech či mechanismu inhibice a reaktivace AChE a BuChE, značně pokročily. Rychlý vývoj výkonných počítačů a nových metod teoretické chemie, umožnil studovat chování látek bez toho, aby se uskutečnil jediný experiment 43. V současnosti je dostupné velké množství softwarových systémů, s jejichž pomocí je možné objasnit jednotlivé detaily chemických reakcí, vypočítat vlastnosti látek či studovat interakci potencionálních léčiv s receptory nebo jinými makromolekulami

28 3.4.3 Inhibice AChE a BuChE alkaloidy z Corydalis cava a dalších rostlin rodu Corydalis V literatuře je dostupná řada prací, týkajících se izolace isochinolinových alkaloidů z Corydalis cava a následné stanovení jejich inhibičních aktivit vůči AChE a BuChE. Ve studii publikované v roce 2007 byla stanovována in vitro inhibiční aktivita vůči AChE a BuChE tří látek izolovaných z Corydalis cava (bulbokapnin, korydin, korydalin). Acetylcholinesteráza, která byla použitá pro stanovení inhibice byla původem z elektrického úhoře (typ VI-S) a zdrojem butyrylcholineterázy bylo koňské sérum 16. Výsledky této studie jsou shrnuty společně s hodnotami standartu (galantamin) v následující tabulce (Tab. II.). Tab. II. In vitro aktivita alkaloidů z Corydalis cava vůči AChE a BuChE IC 50 (10-6 M) Alkaloid AChE BuChE Bulbokapnin 40 ± 2 83 ± 3 Korydalin 15 ± 3 >100 Korydin > ± 4 Galantamin (standart) 1,4 ± 0,2 4,0 ± 1,4 Nejvýznamnější inhibiční aktivitu vůči acetylcholinesteráze ze tří testovaných látek vykazoval korydalin a vůči butyrylcholinesteráze korydin. Bulbokapnin byl ale schopen inhibovat obě cholinesterazy v μm množství.. Inhibiční aktivita byla studována také u dalších alkaloidů identifikovaných v Corydalis cava. Pro příslušné testy byly látky izolovány z jiného druhu Corydalis. Zdroje acetylcholinesterázy či butyrylcholinesterázy byly často odlišné v různých studiích. Z tohoto důvodu je nevhodné vzájemně porovnávat zjištěné hodnoty IC 50 izolovaných látek. Získané hodnoty lze považovat pouze za předběžné a v dalších testech je nutné pracovat pouze na jednom biologickém modelu, z důvodu vzájemného porovnání a vytipování potenciálně aktivních látek. 25

29 V práci publikované v roce 2008 bylo z rostliny Corydalis turtschaninovii izolováno 16 isochinolinových alkaloidů protoberberinového a aporfinového typu 45. U všech látek byla stanovena hodnota IC 50 vůči AChE, která byla získána z myších mozků. Jako pozitivní standart byl použit takrin. Výsledky této studie jsou shrnuty v následující tabulce (Tab.III.). Některé alkaloidy vykázaly zajímavou inhibiční aktivitu, ale ani jedna z testovaných látek se nepřiblížila inhibiční aktivitě pozitivního standartu. Tab. III. In vitro aktivita alkaloidů z Corydalis turtschaninovii vůči AChE Alkaloid IC50 (μm) AChE xoglaucidalin 27,1 ± 1,8 xoglaucin 48,7 ± 1,8 Glaucin 50 Protopin 14,5 ± 0,5 Korytenchin 50 Palmatin 10,4 ± 0,4 Berberin 4,7 ± 0,2 Korydalin 30,7 ± 1,5 Xylopinin 38,1 ± 1,8 Stylopin 15,8 ± 1,2 xypseudopalmatin 50 Tetrahydropalmatin 41,3 ± 2,2 Epiberberin 6,5 ± 0,5 Pseudodehydrokorydalin 8,4 ± 0,5 Pseudokoptistin 4,3 ± 0,3 Pseudoberberin 4,5 ± 0,2 Takrin (standart) 0,17 ± 0,02 Protopin, palmatin, berberin a korynoxidin byly v roce 2004 izolovány z Corydalis speciosa a podrobeny studii jejich inhibiční activity vůči acetylcholinesteráze 46. Acetylcholinesteréza pro studii byla získána z mozků myších samců. Jako standart byl opět 26

30 použit takrin. Získané hodnoty IC 50 testovaných látek jsou uvedeny v následující tabulce (Tab. IV.) Tab. IV. In vitro aktivita alkaloidů z Corydalis speciosa vůči AChE Alkaloid IC50 (μm) AChE Protopin 16,1 Korynoxidin 89,0 Palmatin 5,8 Berberin 3,3 Takrin (standart) 0,2 Z tabulky plyne, že nejvyšší inhibiční aktivitu na acetylcholinesterázu z testovaných látek vykázal kvartérní alkaloid berberin, nedosáhl ale aktivity standartu. Ve studii publikované v roce 2002 byl z Corydalis incisa izolován protoberberinový alkaloid korynolin, pro který byla stanovena hodnota IC 50 pro acetylcholinesterázu 30,6 μm statní biologické aktivity alkaloidů z Corydalis cava Protoberberinové alkaloidy hlíz Corydalis cava byly podrobeny studii jejich vlivu na GABA A receptor. Zatímco terciární protoberberinové alkaloidy isoapokavidin, korydalin, tetrahydropalmatin, skoulerin a isokorypalmin zvyšovaly specifickou afinitu [ 3 H]bikukulin methylchloridu (BMC - GABA A antagonista) ke GABA A receptoru v rozsahu %, tak kvarterní protoberberinové alkaloidy zahrnující mimo jiné palmatin, koptisin, dehydroapokavidin a dehydrokorydalin žádný účinek na změnu afinity BMC ke GABA A receptoru neměly 48. V odborných publikacích můžeme nalézt také studie, které se zabývají vlivem různých obsahových poměrů extraktů Corydalis cava a Eschscholtzia californica na CNS. První z nich zkoumala vliv na endorfiny a enkefaliny. Endorfiny a enkefaliny jsou látky peptidové povahy, které jsou všeobecně známé jako endogenní peptidy. Tyto látky jsou u lidí považovány za hlavní fyziologické modulátory bolesti. Tyto endogenní látky se vážou na opiátové receptory a tlumí 27

31 tím vnímání bolesti. Zajímavé je, že právě výtažky z Corydalis cava a Eschscholtzia californica prokazatelně zpomalují procesy degradace těchto endogenních peptidů.. V rámci této studie bylo zjištěno, že extrakt z Corydalis cava má větší vliv na inhibici degradace endogenních peptidů nežli extrakt Eschschotlzia californica 49. Kromě inhibičního efektu na degradaci endogenních peptidů, byl u výše zmíněných rostlin prokázán i aditivní účinek obou bylin na udržení zvýšené hladiny katecholaminů v mozku. Studie uvádí, že extrakt Corydalis cava spolu s extraktem z Eschscholtzia californica, inhibují oxidativní degradaci katecholaminů. Extrakt z Corydalis cava měl desetkrát větší aktivtu nežli extrakt Eschscholtzia californica. Extrakt z Eschscholtzia californica rovněž inhiboval monoaminooxidázu (MA-B). Výsledky této studie mohou být interpretovány jako společná součinnost dvou rostlinných preparátů pro udržení a ochránění vysoké hladiny katecholaminů, což vysvětluje jejich sedativní, antidepresivní a hypnotickou aktivitu 50. Další vědecká studie byla zaměřena na zjištění biologické aktivity protopinu, respektive mechanismu jeho antiagregačního působení. Bylo zjištěno, že protopin inhibuje agregaci krevních destiček, která je fyziologicky vyvolávána působením ADP, arachidonové kyseliny, PAF a kolagenu. Ačkoli je proces agregace krevních destiček ovlivňován hlavně trombinem, který protopinem inhibován nebyl, tak proces agregace byl zčásti potlačen. Bylo to způsobeno inhibiční aktivitou protopinu na účinky tromboxanu B 2. Protopin inhiboval taktéž intracelulární uvolňování vápníku způsobeného arachidonovou kyselinou. Studií bylo tedy zjištěno, že antiagregační efekt protopinu je tedy způsobený inhibicí tromboxanu B 2 a také následným snížením intracelulární koncentrace vápníku Fytochemické a biologické studie dalších druhů rodu Corydalis V literatuře je z fytochemického i biologického hlediska popsána celá řada dalších druhů z rodu Corydalis. V následující části je uvedena stručná charakteristika rostlin Corydalis yanhusuo a Corydalis solida a přehled izolovaných isochinolinových alkaloidů. Kompletní 28

32 přehled izolovaných látek a jejich biologických vlastností z různých druhů Corydalis by byl velmi rozsáhlý a lze ho nalézt v diplomové práci Kateřiny Salačové (2008) Corydalis yanhusuo Tato rostlina je velmi dobře známa v tradiční čínské medicíně, kde je používána především pro zlepšení krevního oběhu a tišení bolestí, jako jsou bolesti hlavy, hrudníku, zad atd. Ukázala se jako účinná při léčení srdečních arytmií, žaludečních a jícnových vředů, menoralgie a má prokazatelné sedativní a hypnotické účinky 52. br. 5. Corydalis yanhusuo 53 V různých částech této rostliny bylo doposud identifikováno kolem 20 isochinolinových alkaloidů jak terciárního, tak kvartérního typu. Isolované alkaloidy lze rozdělit do několika strukturních typů. Pro tuto rostlinu jsou charakteristické především isochinolinové alkaloidy protoberberinového typu. Přehled hlavních alkaloidů nalezených v Corydalis yanhusuo je uveden v následující tabulce (Tab. V.)

33 Tab. V. Hlavní alkaloidy izolované z Corydalis yanhusuo Strukrurní typ Alkaloid Vzorec Lit. Protopinový typ protopin 53,54 N Me Protoberberinový berberin 53,54 Me Me N + (-)-kanadin 53,54 H Me Me N (+)-korydalin Me 53,54 Me H Me Me Me N 30

34 tetrahydrokoptistin H Me Me 53,54 Me Me N tetrahydrokolumbamin H H Me 53,54 Me Me N palmatin Me 53,54 Me Me Me N + tetrahydropalmatin Me Me 53,54 Me Me N 31

35 dehydrokorydalin Me 53,54 Me Me Me Me N (-)-stylopin 53,54 H N Aporfinový typ (+)-glaucin Me 53,54 Me Me Me H N Me Corydalis solida Rostlina Corydalis solida obsahuje (±)-tetrahydrokorysamin, (-)-stylopin, (-)-kanadin, (±)-sinaktin, nantenin, bulbokapnin, (-)-tetrahydropalmatin, protopin, (+)-isokorydin, domesticin, (+)-korydin, predicentrin, α-allokryptopin, (+)-isoboldin, berberin a aurotensin 57,58. Celkový obsah alkaloidů v této rostlině je velmi nízký, a to kolem 0,06%. Složením alkaloidů je Corydalis solida velmi podobná rostlině Corydalis ambigua

36 br. 6. Corydalis solida 59 33

37 4 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 34

38 4.1 Všeobecné postupy Destilace, odpařování a chromatografie Rozpouštědla byla před použitím destilována, nejprve byl zachycen předek (asi 5 %; většinou s vodným azeotropem), poté bylo vydestilováno zbylých cca 90 % rozpouštědla. Rozpouštědla byla uchovávána v hnědých nádobách. dpařování chromatografických frakcí bylo prováděno na vakuové odparce při 40 C za sníženého tlaku Tenkovrstvá chromatografie Chromatografie na tenké vrstvě byla použita v systému normálních komor. Komory byly nasycené mobilní fází (20 minut). V případě použití malých komor (válcových), průměr 10 cm, sycení trvalo asi 30 minut. U klasických komor pak asi hodinu. Chromatografie byla prováděná vzestupně Sloupcová chromatografie Sloupcová chromatografie byla prováděna systémem gradientové eluce na silikagelu L, 0,1-0,2 mm, desaktivovaném 10 % vody. Sloupec byl plněn obvyklým způsobem nalitím suspenze adsorbentu v rozpouštědle do sloupce. Vzorek byl po vysušení v exsikátoru nanesen na roztěru s malým množstvím silikagelu. 35

39 4.2 Materiál a vybavení Rozpouštědla Rozpouštědla: Benzen, p. a. Cyklohexan, p.a. Diethylamin, p. a. Diethylether, p.a. bez stabilizátoru Ethanol 95%, denaturovaný methanolem n-hexan, p. a. Chloroform, p. a. Toluen, p. a Chemikálie Chemikálie: Dusičnan bismutitý zásaditý, p. a. Hydroxid sodný, p. a. Kyselina sírová 96%, p. a. Kyselina vinná, p. a. Vodný roztok chlorovodíku 36%, p. a Chemikálie a materiál ke stanovení účinku AChE a BuChE (IC 50 ) Chemikálie: M acetylcholin jodid M butyrylcholin jodid M 5,5 -dithiobis-2-nitrobenzoová kyselina 36

40 DMS použitý pro ředění vzorků 0,1 M fosfátový pufr ph 7,4 fysostigmin (eserin) galanthamin Materiál: Hemolyzát lidských erytrocytů, který sloužil jako zdroj acetylcholinesterasy: plná krev byla odstředěna po dobu 15 minut při ot./min, získaná erytrocytarní masa byla 3 promyta 0,1 M fosfátovým pufrem, ph 7,4 aby byly odstraněny zbytky plazmy; 10% (v/v) hemolyzát byl připraven ve vodě. Jako zdroj butyrylcholinesterasy posloužila lidská plazma Jednorázové semimikro-polystyrenové kyvety 1,5 ml, PLASTIBRAND Chemikálie ke stanovení antioxidační a antiprotozoální aktivity Chemikálie: 2,2 -diphenyl-1-pikrylhydrazyl radikál (DPPH) (3-[4,5-dimethyl-thiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium-bromide) Přístroje použité při stanovení biologických účinků izolovaných látek Centrifuga typ MPW-340 (Mechanika precyzyjna, Polsko) ph metr Ф 72 METER (Beckmann, USA) Spektrofotometr UV-1601 CE SHIMADZU FIAlab 3000 analyser (FIAlab Instruments Inc., Bellevue, WA, USA) USB2000-UV/VIS spektrofotometr se zdrojem světla LS-1 (cean ptics, USA) SMA-Z průtoková cela (1-cm délka) Detekční činidla D 1: Dragendorffovo činidlo modifikované podle Muniera 60 37

41 - pro alkaloidy a ostatní sloučeniny obsahující dusík. - roztok A: byl připraven rozpuštěním 1,7 g zásaditého dusičnanu bismutitého a 20 g kyseliny vinné v 80 ml vody. - roztok B: byl připraven rozpuštěním 16 g jodidu draselného ve 40 ml vody. - zásobní roztok: byl připraven smísením roztoků A a B v poměru 1:1. Ten může být uložený i několik měsíců v lednici. - činidlo pro analýzu: bylo připravené tak, že se k roztoku 5 ml kyseliny vinné rozpuštěné v 50 ml vody přidalo 5 ml zásobního roztoku Chromatografické desky a adsorbenty A 1: Kieselgel 60 F 254, Merck, 5 10 cm Hliníková deska s vrstvou silikagelu pro tenkovrstvou chromatografii. Silikagel 60 F 254, tloušťka vrstvy 0,2 mm. A 2: Silufol UV 254, Kavalier Votice, cm A 3: Silikagel L, komerčni adsorbent LACHEMA Brno pro chromatografii, zrnitost 0,2-0,4 mm A 4: xid hlinitý neutrální, komerční adsorbent pro chromatografii ACRÓS, zrnitost 0,05-0,2 mm Vyvíjecí soustavy pro analytickou tenkovrstvou chromatografii S 1: Toluen+CHCl 3 +EtH+Et 2 NH 70:20:10:3 S 2: Toluen+Et 2 NH 9:1 S 3: Benzen+Et 2 NH 9: Vyvíjecí soustavy pro preparativní tenkovrstvou chromatografii S 4: Benzen+Et 2 NH 95:5 S 5: Cyklohexan+Et 2 NH 9:1 38

42 4.3 Zpracování chloroformového výtřepku B z Corydalis cava Dodavatelem drogy byla firma Megafyt s. r. o., Vrané nad Vltavou, 04/2006, droga (hlízy) pochází ze sběru v Chorvatsku, dodáno firmou Jugodrvo Příprava a čištění výtřepku Corydalis cava/b/chcl 3 Zpracovávaný extrakt B-chloroform byl získán mimo rámec diplomové práce, stejně tak kontrolní TLC. Příprava extraktu: Extrakt byl připraven z 11,3 kg suchých hlíz, které byly nejprve extrahovány 95% etanolem, po běžném čištění byly nejprve odstraněny terciární baze při ph 9-10 (extrakt A- diethylether), dále terciární baze při ph 12 (extrakt B-diethylether). Inkriminovaný výtřepek B-chloroform byl připraven vytřepáním zbylého vodného extraktu; přešly do něho alkaloidy málo rozpustné v diethyletheru (80 g tmavě hnědého, velmi viskózního odparku). Čištění výtřepku B-chloroform: 80 g odparku bylo rozpuštěno v 800 ml 1% kyseliny sírové, vyloučily se pryskyřičnaté podíly, roztok byl zfiltrován, zalkalizován na ph 12 20% NaH a vytřepán ml chloroformu, organické výtřepky byly spojeny, vysušeny bezvodým síranem sodným a roztok odpařen.vzniklo 68,6 g hnědého, velmi viskózního odparku. 39

43 br. 8. Detekce výtřepků z Corydalis cava rhizoma (Kieselgel UV 254 Merck, 10 cm (dráha 8,5 cm), To+Chf+EtH+Et 2 NH - 70:20:10:3, komora nasycená, vyvíjení 1, detekce D 1) L - výtřepek éterem z kyselého roztoku alkaloidů - primárního extraktu A - vyčištěný éterový výtřepek (alkalizace 25% amoniakem, ph 9), B-Et 2 - surový výtřepek éterem (alkalizace 50% louhem, ph 12) B-Chf - surový výtřepek chloroformem (po vytřepání éterem, ph 12) J - kvartérní jodidy po vytřepání silných bazí (okyselení HCl, ph 3) Sloupcová chromatografie výtřepku Corydalis cava/b/chcl 3 68,6 g výtřepku B-chloroform (viz obr. 5, sloupec 4) bylo rozpuštěno v chloroformu a chromatografováno na sloupci silikagelu za účelem získání čistých alkaloidů. (Bližší popis viz tab. 3 a 4) Tab. VIII. Sloupcová chromatografie výtřepku Corydalis cava/b/chcl 3 značení vzorku Hmotnost vzorku Druh a množství adsorbentu Vrstva s extraktem Dělicí vrstva Frakce (ml)/doba toku B-Chf, předčištěný. 68,0 g, temně hnědý, velmi viskózní Silikagel L, 0,2-0,4 mm, 1880 g, desaktivovaný 10 % vody 7,4 10 cm 7,4 92 cm 500 ml/35-40 minut 40

44 Tab. IX. Výsledky sloupcové chromatografie výtřepku Corydalis cava/b/chcl 3 Spoj. Frakce Eluční systém značení Popis Hmotn. (g) fr. na TLC Chf 1 Hnědý, s náznakem 0,15 krystalů Chf 2 Zelenobělavý, práškovitý 1,88 (drobně kryst.) Chf 3 Zelený, velmi viskózní 0, Chf Chf + 2 % EtH 4 Hnědý, krystalický 0, Chf + 2 % EtH 25 Chf + 5 % EtH 5 Hnědý, velmi viskózní 1, Chf + 5 % EtH 6 Černý, velmi viskózní 6, Chf + 5 % EtH 7 Černý, velmi viskózní 0, Chf + 5 % EtH Chf + 10 % EtH 8 Černý, velmi viskózní 9, Chf + 25 % EtH Chf + 25 % EtH 9 Černý, velmi viskózní 0, Chf + 25 % EtH 10 Černý, velmi viskózní 4, Chf + 25 % EtH Chf + 50 % EtH 11 Černý, velmi viskózní 9,02 br. 9. TLC jednotlivých frakcí z Corydalis cava/b/chcl 3 (popis viz tab. 4) (Pozn. Kieselgel UV 254 Merck, 10 cm (dráha 8,5 cm), Toluen+CHCl 3 +EtH+Et 2 NH-70:20:10:3, komora nasycená, vyvíjení 2, detekce D1) 41

45 4.3.3 Zpracování spojených frakcí 7 a 8 Spojené frakce 7 a 8 (viz tab. 4 a obr. 6) byly chromatografovány na sloupci s adsorbentem A 2. Tab. X. Sloupcová chromatografie odparku Corydalis cava/b/7+8 značení vzorku Hmotnost vzorku Druh a množství adsorbentu Vrstva s extraktem Dělicí vrstva Frakce (ml)/doba toku Corydalis cava/b/7+8 10,16 g, temně černý, velmi viskózní xid hlinitý neutrální 0,1-0,2 mm, desaktivovaný 5 % vody, 281 g 6.2 3,2 cm 54,5 3,2 cm 100 ml/20 minut Tab. XI. Výsledky sloupcové chromatografie výtřepku Corydalis cava/b/7+8 Spoj. fr. Frakce Eluční systém znače ní na TLC Popis Benzin+70%Chf F 1 Téměř Hmotn. (g) 9-12 Benzin+90%Chf černý,nafouklý Benzin+90%Chf F 2 Černý,práškovitý 0, Chf 4,7 br. 10. Kontrolní vyvíjení F 1 a F 2 (F 1 - levá skrvna, F 2 - pravá skvrna) (Kieselgel UV 254 Merck, 10 cm (dráha 8,5 cm), Toluen+Et 2 NH-9:1, komora nasycená, vyvíjení 2, detekce D 1) 42

46 4.3.4 Čištění a separace minoritních alkaloidů z F 1 Na sloupec o průměru 11 cm byl nanesen roztěr frakce F 1 s 25 g Silpearlu. Sloupec byl promývan mobilní fází S 4 a posléze čistým chloroformem. Frakce F1 byla rozdělena na jednotlivé 3 podfrakce (viz. obrázek). Tab. XII. Výsledky sloupcové chromatografie frakce F 1 Hmotn. Vzorku (g) Hmotn. Adsorbe ntu (g) Složení eluentu dparek značeni Toluen+Nhexan+Et 2 NH=45:45:10 (2000ml) CHCl 3 (2000ml) 1,765g (červenožlutý,olejovitý) 068g (hnědý,velmi viskózní) 2,58g (hnědožlutý, velmi viskózní) F1-1 F1-2 F1-3 br. 11. TLC sloupcové chromatografieodparku F 1 (soustava Benzen+Et 2 NH=9:1, Kieselgel UV 254 Merck, 10 cm (dráha 8,5 cm),detekce Dragendorffovým činidlem podle Muniera). 43

47 4.3.5 Izolace alkaloidů z podfrakce F 1-3 Podfrakce F 1-3 (0,8g) byla rozpuštěna v chloroformu a přefiltrována přes vrstvu (5cm, 50g) Al23. Vrstva AL23 byla promyta 150 ml chloroformu a rozpouštědlo bylo odpařeno. Na chromatografické desky Silufol 20x10 cm, tloušťka vrstvy 0,1 mm bylo nanášeno 20mg přefiltrované podfrakce F1-3. Desky byly vyvíjeny v mobilní fázi S 4. Každá deska byla vyvinuta čtyřikrát. Pod UV lampou byly detekovány 2 zóny obsahující alkaloidy (br. 12.). Zóny byly označeny a izolovány společně s adsorbentem z chromatografických desek. Izolované látky byly vymyty z adsorbentu chloroformem a odpařeny. Byly získány dva odparky označené jako M-A (120 mg,) a M-B (160 mg). dparek M-A byl překrystalizován z ethanolu a bylo získáno 90 mg lehce nažloutlých krystalů označených jako látka 1. dparek M-B byl získán ve formě lehce nažloutlé pěny a označen jako látka 2. br. 12. Preparativní TLC podfrakce F 1-3 (soustava Benzen+Et 2 NH=95:5, Silufol 10x20 cm,, (dráha 10 cm). Izolované látky byly podrobeny studiím (MS, NMR) za účelem stanovení jejich struktury. Poté byl proveden screening biologických vlastností. 44

48 4.4 Určení struktury izolované látky Měření hmotnostního spektra Spektra byla měřena na LC/MS Thermo Finningan LCQDuo iontová past, ionizace elektrosprejem v kladném módu (ESI+). MS/MS spektra byla měřena při kolizní energii 40 ev Měření NMR spektra Spektra byla měřena na spektrometru Varian Inova 500 s pracovní frekvencí MHz pro 1 H a MHz pro 13 C jádra. 13 C NMR spektra byla měřena v 5mm SW širokopásmové sondě, 1 H a všechna 2D spektra v inverzní 5mm ID PFG sondě s využitím standardních pulsních sekvencí. Experimenty byly měřeny v deuterochloroformu při 25 C. Hodnoty chemických posunů jsou v ppm a jsou vztaženy k internímu standardu (hexamethyldisilan, 0,04 ppm, v 1 H spektrech) nebo signálu solventu (76,99 ppm, v 13 C spektrech) (Dr. M. Kurfürst, Ph.D., Ústav chemických procesů, AV ČR, Praha). 4.5 Stanovení účinku alkaloidu na lidskou HuAChE a sérovou HuBuChE (IC 50 ) Pro stanovení inhibiční aktivity látek byla použita Ellmanova spektrofotometrická metoda s použitím 5,5 -dithiobis-2-nitrobenzoové kyseliny (DTNB). Jako substráty se používají estery thiocholinu, které jsou cholinesterázami štěpeny na thiocholin a příslušnou kyselinu. Stanovuje se SH- skupina thiocholinu, která se naváže na DTNB. Výsledkem je žlutě zbarvený produkt, který se stanovuje spektrofotometricky při vlnové délce 436 nm. Sleduje se nárůst absorbance za 1 minutu. Hodnoty IC 50 byly vypočítány z naměřených hodnot poklesu aktivity acetylcholinesterasy nebo butyrylcholinesterasy nelineární regresí v programu GraphPaD Prism (verze 3.02 pro Windows; výrobce Graph PaD Software, San 45

49 Diego, CA, USA). Výsledky byly porovnány s hodnotami IC 50 známých inhibitorů cholinesteráz: galathaminem (IC 50 AChE = 6,898 μm, BuChE = 156 μm), eserinem (IC 50 AChE = 2,168 μm, BuChE = 1,616 μm) a huperzinem A (IC 50 AChE = 0,252 μm, BuChE >1000 μm). 4.6 Stanovení antioxidační aktivity Antioxidační aktivita byla testována in vitro DPPH testem. Metoda je založena na reakci stabilního 2,2 -diphenyl-1-pikrylhydrazyl (DPPH) se vzorkem. Snížení absorbance DPPH měřené při 525 nm je závislé na koncentraci antioxidantu ve sledovaném vzorku. Byly použity FIAlab pro Windows software, FIAlab 3000 analyser (FIAlab Instruments Inc., Bellevue, WA, USA), 2,5-ml syringe pump, USB2000-UV/VIS spektrofotometr se zdrojem světla LS-1 (cean ptics, USA) a SMA-Z průtoková cela (1-cm délka). Antiradikálová aktivita vzorků byla vyjádřena jako 50% účinná koncentrace (EC 50 ), která byla vypočítána pomocí programu GraphPad Prism 3.02, a byla porovnána se známými antioxidanty: kvercetinem EC 50 = 25,3μM a troloxem EC 50 = 27,8μM. 4.7 Stanovení antiprotozoální aktivity Pro stanovení antiprotozoální aktivity byla použita spektrofotometrická metoda využívající redukci MTT barviva (3-[4,5-dimethyl-thiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide) - ukazatel mitochondriální aktivity a viability prvoků Tetrahymena pyriformis, na fialově zbarvený formazan, který se stanovuje při vlnové délce 562 nm. Hodnoty EC 50 byly vypočítány nelineární regresí v programu GraphPaD Prism (verze 3.02 pro Windows; výrobce Graph PaD Software, San Diego, CA, USA) a porovnány se standardem dichromanem draselným (EC 50 = 4,095 μm) 46

50 5 VÝSLEDKY 47

51 Na základě MS a NMR studií a porovnání dat s literaturou byly izolované látky identifikovány jako sinoakutin (5,6,8,14-tetradehydro-4-hydroxy-3,6-dimethoxy-17-methylmorphinan-7-one) a sebiferin (5,6,8,14-tetradehydro-2,3,6-trimethoxy-17-methyl-morphinan- 7-one). 5.1 Strukturní studie izolované látky Hmotnostní spektrum izolované látky 1 ESI-MS m/z 328,5 [M+H] + (100). MS/MS m/z 313 [M-CH 3 ] + (10), 297 [M-CH 3 ] + (48), 265 (100), 239 (67). br. 13. MS spektrum izolované látky 48

52 br. 14. MS/MS spektrum izolované látky 49

53 5.1.2 NMR studie izolované látky N H 3a 6a br. 15. Sinoakutin H NMR spektrum izolované látky H NMR (CDCl 3, 25 C): 1-H 6,67 d; 2-H 6,76 d; 5-H 7,54 s; 8-H 6,33 s; 9-H 3,71 d; 10 -H 3,35 d; 10-H 3,00 dd; 15 - H 2,37 dd; 15-H 1,78 ddd; 16 -H 2,63 dd; 16-H 2,50 ddd; 18-H 2,46 s; 4a-H (H) 6,22 s; 3a- H (CH 3 ) 3,89 s; 6a-H (CH 3 ) 3,76 s. 50

54 br H-NMR spektrum sinoakutinu C NMR spektrum izolované látky 1 13 C NMR (CDCl 3, 25 C): 1-C 119,22; 2-C 109,80; 3-C 145,60; 3a-C 56,60; 4-C 143,60; 5-C 120,66; 6-C 151,31; 6a-C 55,12; 7-C 181,54; 8-C 122,59; 9-C 61,31;10-C 33,00; 11-C 129,99; 12-C 124,20; 13-C 43,91; 14-C 161,44; 15-C 37,90; 16-C 47,28; 17a-C 44,94. 51

55 br C-NMR spektrum sinoakutinu Na základě MS a NMR studií a porovnání dat s literaturou byla izolovaná látka identifikovaná jako sinoakutin (5,6,8,14-tetradehydro-4-hydroxy-3,6-dimethoxy-17-methylmorphinan-7-one) Strukturní studie izolované látky Hmotnostní spektrum izolované látky 2 ESI-MS m/z [M+H] + (100). MS/MS m/z 311 [M-CH 3 ] + (75), 285 (92), 279 (65), 191 (100). 52

56 br. 18. MS spektrum izolované látky br. 19. MS/MS spektrum izolované látky 53

57 5.2.2 NMR studie izolované látky N 17 2a a 6a br. 20. Sebiferin H NMR spektrum izolované látky 2 1 H NMR (CDCl 3, 25 C): 1.67 dt ( 1 J H =12.6 Hz, 3 J H-16 =2.4 Hz), 1H, H-15 ; 1.95 ddd ( 1 J H =12.6 Hz, 3 J H-16 =12.8 Hz, 3 J H-16 =5.8 Hz), 1H, H-15; 2.46 s, 3H, H-18; 2.57 m, 1H, H-16 ; 2.59 m, 1H, H-16; 3.04 dd ( 1 J H =17.7 Hz, 3 J H =6.0 Hz), 1H, H-10 ; 3.35 d ( 1 J H =17.7 Hz), 1H, H-10; 3.71 d ( 3 J H =6.0Hz), 1H, H-9; 3.80 s, 3H, H-6a; 3.86 s, 3H, H-2a; 3.88 s, 3H, H-3a; 6.33 s, 1H, H-8; 6.35 s, 1H, H-5; 6.63 s, 1H, H-1; 6.81 s, 1H, H-4; 54

58 br H-NMR spektrum sebiferinu C NMR spektrum izolované látky 2 13 C NMR (CDCl 3, 25 C): 32.93, C-10; 41.39, C-15; 44.96, C-18; 42.51, C-13; 45.93, C-16; 55.34, C-6a; 56.13, C-2a; 56.55, C-3a; 61.12, C-9; , C-4; , C-1; , C-5; , C-8; , C-11; , C-12; , C-3; , C-2; , C-6; , C-14; , C-7; 55

59 br C-NMR spektrum sebiferinu Na základě MS a NMR studií a porovnání dat s literaturou byla izolovaná látka identifikovaná jako sebiferin (5,6,8,14-tetradehydro-2,3,6-trimethoxy-17-methyl-morphinan- 7-one)

60 5.3 Antioxidační aktivita alkaloidů Pro sebiferin byla stanovena antioxidační aktivita EC 50 > 10 mm (EC 50 = 12,78 mm). Pro sinoakutin byla stanovena antioxidační aktivita EC 50 = 0,209 mm. 5.4 Inhibiční aktivita vůči AChE a BuChE Pro sebiferin byla stanovena inhibiční aktivita vůči AChE a vůči BuChE AChE IC 50 > 1 mm a vůči BuChE IC 50 > 1 mm. Pro sinoakutin byla stanovena inhibiční aktivita vůči AChE IC 50 > 1 mm a vůči BuChE IC 50 > 1 mm. 5.5 Antiprotozoální aktivita alkaloidů Pro sebiferin byla stanovena antiprotozoální aktivita IC 50 71,1 μm. Experimenty stanovení antiprotozoální aktivity jsou poměrně časově náročné a experiment pro stanovení antiprotozoální aktivity sinoakutinu je ve fázi měření. 57

61 6 DISKUZE 58

62 Látky frakce F1-3, izolované z Corydalis cava, byly na základě MS, NMR studií a porovnání dat s literaturou, identifikovány jako sinoakutin (5,6,8,14-tetradehydro-4-hydroxy- 3,6-dimethoxy-17-methyl-morphinan-7-one) a sebiferin (5,6,8,14-tetradehydro-2,3,6- trimethoxy-17-methyl-morphinan-7-one). Jedná se o isochinolinové alkaloidy, které již byly v minulosti popsány a identifikovány v této rostlině. Jelikož u těchto alkaloidů nebylo provedeno testování jejich inhibičních aktivit vůči cholinesterázám, byly tyto látky podrobeny naší studii. Pro stanovení inhibiční aktivity látek byla použita Ellmanova spektrofotometrická metoda s použitím 5,5 -dithiobis-2-nitrobenzoové kyseliny (DTNB). Výsledky byly porovnány s hodnotami IC 50 známých inhibitorů cholinesteráz: galathaminem, eserinem a huperzinem. Tato měření probíhala na acetylcholinesteráze a butyrylcholinesteráze humánního původu a díky této skutečnosti jsou získané výsledky daleko signifikantnější a směrodatnější, nežli výsledky získávané na nehumánních modelech. Získané hodnoty IC 50 pro inhibici humánní erytrocytární acetylcholinesterázy a humánní sérové butyrylcholinesterázy pro sinoakutin jsou AChE IC 50 > 1 mm, BuChE IC 50 > 1 mm a pro sebiferin AChE IC 50 > 1 mm, BuChE IC 50 > 1 mm. Zvýsledků je patrné, že izolované látky neovlivňují zmíněné cholinesterázy. Z tohoto důvodu nejsou využitelné jako potenciální inhibitory cholinesteráz. Jelikož v patogenezi Alzheimerovy choroby hraje určitou roli i vliv volných kyslíkových radikálů, byly u izolovaných látek stanoveny i hodnoty antioxidačních aktivit. Pro sebiferin byla stanovena antioxidační aktivita EC 50 > 10 mm (EC 50 = 12,78 mm). Pro sinoakutin byla stanovena antioxidační aktivita EC 50 = 0,209 mm. Z těchto výsledků je znatelné, že se látky nevyznačují významnou antioxidační aktivitou. Z důvodu neznalosti toxicity těchto látek byly provedeny i testy na antiprotozoální aktivitu. Pro sebiferin byla stanovena antiprotozoální aktivita IC 50 71,1 μm. Antiprotozoální aktivita sinoakutinu je stále ve fázi měření. 59

63 7 LITERATURA 60

64 1. Tang, W., Eisenbrand, G.: Chinese Drugs of plant origin, Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York, Berlin Huang, K. Ch.: The pharmacology of Chinese herbs, Second edition, CRC Press Boca Raton London New York Washington D.C., Crozier, A., Clifford, M. N., Ashihara, H.: Plant secondary metabolites, Blackwell Publishing Ltd, Preininger, V. Chemotaxonomy of the Papaveraceae alkaloids. Chem. Biol. Isoquinoline Alkaloids, 23-37, Wildman, W.C. Amaryllidaceae alkaloids. Chem. Alkaloids, , Bentley, K. W. β-phenethylamines and the isoquinoline alkaloids. Nat. Prod. Rep., 21, , Greig, N. H., Lahiri, D. K. and Sambamurti, K. Butyrylcholinesterase: an important new target in Alzheimer s disease therapy. Int. Psychoger., 14, (2002). 8. Berkov, S., Bastida, J., Nikolova, M., Viladomat, F.and Codina, C. Rapid TLC/GC-MS identification of acetylcholinesterase inhibitors in alkaloid extracts. Phytochem. Anal., 19, (2008). 9. Hostettmann, K., Borloz, A., Urbain, A. and Marston, A. Natural product inhibitors of acetylcholinesterase. Curr. rg. Chem., 10, (2006). 10. Kiryakov, K., Daskalova, E., Georgieva, A., Kuzmanov B. and Evstatieva, L. Alkaloids from Corydalis solida (L.) Schwarz. Fol. Med., 24 (4), 19-22, Ding, B., Zhou, T., Fan, G., Hong, Z., and Wu, Y. Qualitative and quantitative determinativ of ten alkaloids in traditional Chinese medicine Corydalis yanhusuo W.T. Wang by LC-MS/MS and LC-DAD. J. Pharm. Biomed. Anal., 45, , Průša, J.: Biologická aktivita obsahových látek rostlin X. Alkaloidy Corydalis cava Schweigg & Körte (Fumariaceae) a jejich účinek na acetylcholinesterasu. UK v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, Hr. Králové 2009, 52 s. 13. Sturm, S., Seger, Ch., Stuppner, H. Analysis of central european Corydalis species by nonaqueous capillary electrophoresis -electrospray ion trap mass spectrometry. J. Chrom. A, 1159, 42-50,

65 14. Berkov, S., Bastida, J., Nikolovova, M., Viladomat, F., Codina, C. Rapid TLC/GC-MS identification of acetylcholinesterase inhibitors in alkaloid extracts. Phytochem. Anal,. 19, , Marston, A., Kissling, J., Hostettmann, K., A rapid TLC bioautographic method for the detection of Acetylcholinesterase and Butyrylcholinesterase inhibitors in plants. Phytochem. Anal., 13, 51-54, Adsersen, A., Kjoelbye, A., Dall, le., Jaeger, A.-K. Acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase inhibitory compounds from Corydalis cava Schweigg. & Körte. J.Ethnopharm., 113(1), , Slavík, J., Slavíková, L. Alkaloids of the Papaveraceae. LXVII. Alkaloids from Corydalis cava (L.) Schweigg & Köerte. Coll. Czech.Chem. Comm., 44(7), , Jha, R.N., Pandey, M.B., Singh, A.K., Singh, S., Singh, V.P. New alkaloids from Corydalis species. Nat.Prod.Res., 23(3), , Wu, Y-R., Zhao, Y-X., Liu, Y-Q., Zhou, J. Isoquinoline alkaloids from Corydalis taliensis. Z. Natuturforsch. B, 62(9), , Li, H-L., Zhang, W-D., Han, T., Zhang, Ch., Liu, R-H., Chen, H-S. Tetrahydroprotoberberine alkaloids from Corydalis saxicola. Chem. Nat. Comp., 43(2), , Salačová, K.: Biologická aktivita obsahových látek rostlin XII. Alkaloidy rodu Corydalis DC. (Fumariaceae) a jejich biologické účinky. UK v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, Hr. Králové 2009, 80 s vystaveno vystaveno vystaveno vystaveno vystaveno Hejný S., Slavík B.: Květena ČSR 1. Díl, Academia Praha: 497 (1988). 28. Tutin, T. G. et al., eds.: Flora europaea, second edition. (F Eur ed2)