Bc. Tomáš Chum. Proteomická analýza lysozymu a lysozyme-like proteinů synantropních roztočů

Transkript

1 Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Studijní program: Biologie Studijní obor: Buněčná a vývojová biologie Bc. Tomáš Chum Proteomická analýza lysozymu a lysozyme-like proteinů synantropních roztočů Proteomic analysis of lysozyme and lysozyme-like proteins of synantropic mites Diplomová práce Školitel: Mgr. Tomáš Erban Praha, 2012

2

3 Prohlášení: Prohlašuji, že jsem závěrečnou práci s názvem Proteomická analýza lysozymu a lysozyme-like proteinů synantropních roztočů zpracoval samostatně a že jsem uvedl všechny použité informační zdroje a literaturu. Tato práce ani její podstatná část nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu. V Praze dne 2. května 2012 Tomáš Chum

4 Poděkování V první řadě bych chtěl poděkovat svému školiteli Tomášovi Erbanovi za jeho nadlidské nasazení během vzniku této diplomové práce a za jeho odbornou pomoc při práci v laboratoři. V druhé řadě bych rád poděkoval Janu Hubertovi za poskytnutí laboratorního zázemí, bez kterého by nebylo možné na projektu pracovat. Za pomoc při sběru a chovu roztočů, bych chtěl poděkovat Martě Nesvorné V neposlední řadě patří mé díky Petru Jedelskému a Mirce Šedinové z laboratoře hmotnostní spektrometrie PřF UK za jejich analýzy a vyhotovení pro mne přehledných výsledků. Díky i Vojtovi Khodlovi za asistenci při vzniku AJ abstraktu. Za nekonečnou a neutuchající oporu během vzniku této práce děkuji Zuzce Khodlové a celé mé rodině. Především si vážím obětavého nasazení babiček a ostatních členů rodiny při hlídání našeho synka, aby bylo možné ve chvílích klidu intenzivně pracovat. Poslední díky patří právě Kubíkovi za vkládání jakýchkoliv nesmyslů a překlepů do textu celé práce, což napomohlo udržet mou neustálou pozornost. Diplomová práce byla financována z projektů OC09034 (MŠMT - COST FA0701) a GA525/09/1872 (GAČR).

5 Abstrakt Tato diplomová práce byla zaměřena na studium lysozymu a lysozymu funkčně (antibakteriální) nebo hmotnostně (14-17 kda) podobných (lysozyme-like) proteinů synantropních akarodidních roztočů. Obecně jsou lysozymy živočichy využívány k obranným (antimikrobiálním) účelům, ale mohou plnit i trávící funkci. Podobně mohou být využívány i chitinázy, které jsou u prachových roztočů identifikované alergeny, nebo jiné enzymy s příbuznou aktivitou. U roztočů jsou jedněmi ze známých významných alergenů tzv. lysozyme-like proteiny, jejichž název je spíše historický a souvisí s velikostí podobnou lysozymu. Bakteriolytickou aktivitu má u roztočů také 14,5 kda protein (UniprotKB Q8MWR6). Do studie byli zahrnuti domácí roztoči Dermatophagoides farinae a D. pteronyssinus a Lepidoglyphus destructor. Přítomnost lysozymu byla prokázána přímou detekcí imunohistochemicky a pomocí dot blotů anti lysozymovou protilátkou. Imunohistochemická analýza prokázala přítomnost lysozymových epitopů v exkrementech D. farinae, D. pteronyssinus a L. destructor. Dot-blot analýza prokázala lysozymovou imunoreaktivitu ve zbytkovém růstovém médiu (SGME) všech třech testovaných druhů. Toto naznačuje, že by lysozym mohl být produkován ve střevě roztočů. Dvourozměrnou proteinovou elektroforézou a identifikací MALDI TOF/TOF byla analyzována přítomnost lysozymů a lysozymu podobných proteinů. Analýza nepotvrdila přítomnost lysozymu v exkrementech ani v jednom ze zkoumaných vzorků, ale identifikovala řadu významných alergenů ve 2D mapě extraktů ze SGME. Mimo jiné byly identifikovány Der f 2, Der p 2 a Lep d 2(lysozyme-like nebo NCP2 proteiny) a chitinázy odpovídající 15. a 18. skupině alergenů. Významnými výsledky jsou identifikace alergenů z řad cysteinových proteáz (Der f 1, Der p 1, Lep d 1), trypsinů (Der f 3, Der p 3), chymotrypsinů (Der f 6) a -amyláz (Der p 4). Proteomy analyzovaného SGME se pro jednotlivé druhy liší. Zejména je zajímavé, že u D pteronyssinus nebyl identifikován chymotrypsin, zatímco u D. farinae ano. Výsledky práce obohacují naše znalosti o biologii ekonomicky a medicinálně velmi významných roztočů. Proteomickou analýzou se podařilo získat mnoho informací, které jsou multidisciplinárně využitelné. Nové optimalizované metody budou využity při dalším výzkumu. Klíčová slova: alergen, alergie, Dermatophagoides farinae, Dermatophagoides pteronyssinus, Lepidoglyphus destructor, lysozym, lysozyme-like protein, synantropní roztoč

6 Abstract This diploma thesis was focused on the study of lysozyme and lysozyme-like proteins, either of similar function (antibacterial) or molecular weight (14 17 kda), of synanthropic acaroid mites. In general, animals utilize lysozymes for defensive (antimicrobial) or digestive purposes but also as a digestive enzyme. Some chitinases or other enzymes that act similarly to lysozyme can be utilized for similar purposes. Chitinases belong to house dust mite allergens. One of major mite are historically named lysozyme-like proteins which name relates to their size similar to lysozyme. Bacteriolytic activity has also 14.5 kda (UniprotKB Q8MWR6) protein. The species selected for the study were domestic mites Dermatophagoides farinae, D. pteronyssinus and Lepidoglyphus destructor. Presence of lysozyme was detected by direct detection with polyclonal antibody using immunohistochemistry and dot blots. Immunohistochemistry proved presence of lysozyme epitopes in the feces of D. farinae, D pteronyssinus a L. destructor. Dot blot analysis demonstrated the presence of imunoreactivity of antibody in spent growth medium extracts (SGME) of all three species. This implies that lysozyme is synthesized in the midgut. The presence of lysozyme and lysozyme-like proteins was proved using 2D electrophoresis and MALDI TOF/TOF analysis. Lysozyme was not identified in any sample analysed, but many other important proteins were identified. For the study, the most important identified proteins in SGME were: Der f 2, Der p 2 a Lep d 2 (lysozymelike or NCP2 proteins) and group 15 and 18 mite allergens which are chitinases. Important results are identification of cysteine (Der f 1, Der p 1, Lep d 1), trypsine (Der f 3, Der p 3), chymotrypsine (Der f 6) and alpha amylase (Der p 4) allergens. Proteome of analysed SGME differed varied between species. Very interresting the event that chymotrypsin pattern was absent in D. pteronyssinus, while in D. farinae is presented. Results of the work raise our knowledge about mites of high medical and economical importance. Proteomic analysis showed novel multidisciplinary useful information. Newly optimized methods will be used in further research. Keywords: allergen, allergy, Dermatophagoides farinae, Dermatophagoides pteronyssinus, Lepidoglyphus destructor, lysozyme, lysozyme-like protein, synanthropic mite

7 OBSAH 1. Úvod Literární přehled Alergie Průběh alergické reakce Projevy alergií Původ alergie Nejčastější alergeny Roztočové alergeny Roztoči Synantropní roztoči Ekonomický a medicinální význam skladištních a prachových roztočů Lysozym Dělení rodiny lysozymů Vlastnosti lysozymů Bakteriální obrana proti lysozymu Studium lysozymů u roztočů Materiál a metodika Modelové druhy roztočů Růstové médium Chovné boxy a komůrky Příprava celotělních homogenátů (WME whole mite extract) Příprava homogenátů ze zbytkového růstového média (SGME spent growth medium extract) Měření obsahu proteinů Elektroforetické dělení Dvourozměrná (2D) proteinová elektroforéza SDS-PAGE (sodium dodecylsulfat polyacrylamid gel electrophoresis) Western blot Dot Blot Imunolokalizace Analýza proteinů pomocí hmotnostní spektrometrie Výsledky Dot bloty Western bloty Imunolokalizace lysozymu v exkrementech roztočů Dvourozměrné elektroforézy Diskuze Závěr Použité zdroje Přílohy... 68

8 1. Úvod Roztoči jsou všudypřítomné mikroskopické organizmy. Díky své přizpůsobivosti obsadili téměř všechny představitelné ekosystémy. Některé druhy se začaly spontánně přizpůsobovat životu v blízkosti člověka a uměle vytvořenému lidskému prostředí. Tyto skupiny jsou proto označovány jako synantropní roztoči. Jedná se hlavně o skupiny tzv. prachových a skladištních roztočů. Ti invadovali především lidská obydlí, domácnosti a sklady se zásobami potravin (Erban & Hubert 2008; OConnor 1979). Nejčastěji se setkáváme s tvrzením, že člověku škodí především žírem. Vzhledem k jejich velikosti ale není tento dopad příliš významný. Mnohem větší pozornost si zaslouží znehodnocení napadených potravin a bezprostředního okolí člověka, jež roztoči zamořují produkovanými pro člověka potenciálně nebezpečnými látkami (Erban et al. 2009; Erban & Hubert 2008). Tyto látky zahrnují především různé roztoči produkované hydrolytické enzymy (Erban & Hubert 2010) a proteinové patogeny z různých plísní a bakterií přenášených na tělech roztočů (Hubert et al. 2003, 2004; Smrž & Čatská 1987). Při vdechnutí či spolknutí takového proteinu dojde k vyvolání přirozené imunitní reakce, která se u citlivějších jedinců může změnit v prudkou alergickou reakci (Arlian 2002; Janeway et al. 2001). Některé takto roznesené proteiny jsou prokázanými alergeny (Arlian 2002), u jiných je alergenicita předpokládána. Předkládaná diplomová práce se zaměřuje především na studium lysozymu (EC ) a lysozymu velikostně (většinou kda), popřípadě funkčně podobných tzv. lysozyme-like proteinů. Tento termín má u roztočů historický původ pocházející z mylných předpokladů, že 2. hlavní skupina alergenů (Grp 2) prachových roztočů má vlastnosti podobné lysozymu. Nedávno byly Grp 2 alergeny (roztočové lysozyme-like proteiny) identifikovány díky strukturním studiím jako NPC2 proteiny (Ichikawa et al. 2005). Nicméně skupina lysozyme-like proteinů nezanikla. Spadají sem další proteiny, které jsou potvrzenými slabšími alergeny, či jejich alergenicita ještě nebyla potvrzena. Mezi ně patří i bakteriolytický protein s původně prokaryotickým původem (Mathaba et al. 2002), jehož přítomnost byla recentně potvrzena i v genomu samotných roztočů (Erban et al. 2012). Lysozym je hydrolytický enzym katalyzující štěpení peptidoglykanu, který je základní složkou bakteriální buněčné stěny. Díky své pevnosti bakteriální buňce napomáhá odolat vnitrobuněčnému turgoru. Jakmile je narušena celistvost buněčné stěny, dojde ihned 1

9 ke smrti způsobené buněčnou lyzí. Proto je lysozym hojně využíván živočichy jako obrana proti bakteriím (Callewaert & Michiels 2010). Přítomnost různých druhů lysozymů je potvrzena u nejrozličnějších druhů obratlovců, hmyzu a dalších bezobratlých. Lysozym byl detekován v tělech i exkrementech mnohých druhů roztočů (Podboronov et al. 1972; Podboronov 1982, 1983; Childs & Bowman 1981; Erban & Hubert 2008). Ty jej nejspíše využívají pro trávení bakterií, anebo k obraně proti bakteriální infekci (Childs & Bowman 1981; Erban & Hubert 2008). Naše pozornost se soustředila na tři druhy synantropních roztočů z podřádu Acaridida. Prachové roztoče prezentovaly druhy Dermatophagoides farinae (Hughes) (americký druh prachového roztoče) a D. pteronyssinus (Trouessart) (evropský druh prachového roztoče). Jako zástupce skladištních roztočů byl vybrán druh Lepidoglyphus destructor (Schrank), který se však mimo jiné vyskytuje v prachu domácností. Studie potvrzující přítomnost lysozymu byly doposud založeny na enzymatických experimentech a nepřímé detekci bakteriolytické aktivity lysozymu ( lysozyme-like aktivita) (Childs & Bowman 1981; Erban & Hubert 2008). Tyto poznatky nás vedly k několika otázkám, kterým se věnuje tato práce: (i) Je možné lysozym u roztočů detekovat přímo pomocí protilátek? (ii) Jak moc se liší množství lysozymu v tělech, exkrementech a v prostředí, kde roztoči žijí? (iii) Budeme schopni přítomnost lysozymu potvrdit i následnou analýzou hmotnostní spektrometrií? (iv) Je možno lysozym roztočů uvažovat jako případný alergen? Dříve se ve spojitosti s alergenní povahou vaječného lysozymu předpokládalo, že se jedná o jeden z předních roztočových alergenů. Pozornost od jeho studia se postupně přesunula směrem k lysozymu podobným proteinům. Ty jsou mnohdy již potvrzenými silnými roztočovými alergeny (Arlian et al. 1997; Arlian 2002). Změna zaměření studia ovšem nevyvrací hypotézu, že roztočový lysozym sám o sobě alergenem je, byť to nebylo stále potvrzeno (Stewart et al. 1991). Definitivnímu vyvrácení, či potvrzení alergenní povahy lysozymu může pomoci jeho přímá fyzická lokalizace. Proto se předkládaná diplomová práce zabývá prvními třemi výše uvedenými otázkami. Oproti dosud prezentovaným studiím jsme zvolili metodu přímé detekce lysozymu pomocí protilátek proti lysozymu z vaječného bílku (HEWL hen egg white lysozyme). Přítomnost proteinu jsme potvrzovali na proteinových extraktech získaných z těl 2

10 a zbytkového růstového média roztočů. Tělní homogenáty D. farinae a homogenáty zbytkového růstového média (SGME) všech druhů byly následně použity pro analýzu dvourozměrnou elektroforézou. Rozdělené a následně detekované proteinové spoty byly v posledním kroku analyzovány hmotnostním spektrometrem. Pro dosažení odpovědí na zmíněné otázky byly pro práci stanoveny dílčí cíle: ověřit reaktivitu polyklonální protilátky pomocí metody dot blot celotělních homogenátů (WME) ověřit reaktivitu protilátky na dot blotech extraktů ze zbytkového růstového média (SGME) prokázat reaktivitu protilátky pomocí metody western blot pomocí protilátky lokalizovat lysozym pomocí imunohistochemické metody analyzovat SGME a WME na přítomnost lysozymu pomocí proteomických metod analyzovat SGME a WME na přítomnost lysozymu velikostí nebo i funkčně podobných proteinů pomocí proteomických metod. Poznatky z této diplomové práce obohatí naše znalosti o fyziologii domácích roztočů. Přinese též informace o medicinálním významu jimi produkovaných enzymů s antimikrobiální aktivitou. 2. Literární přehled 2.1. Alergie Alergie je slovo původně pocházející z řeckých slov allos (jiný, změněný stav) a ergon (práce, reakce, reaktivita). Prvně jej použili lékaři Clemens von Pirquet a Béla Schick v roce 1906 (von Pirquet 1927). Pojmenovali tak přecitlivělost některých svých dětských pacientů na běžně neškodné přírodní látky jako jsou prach, pyl, či některé složky potravin. Všechny hypersenzitivní stavy špatně fungujícího imunitního systému byly od této doby nesprávně označovány jako alergie (Kay 2006). Průběh některých nemocí byl následně dán do souvislostí s nesprávnou imunitní odpovědí. Na základě těchto poznatků definovali v roce 1963 Philip Gell a Robin Coombs 4 základní kategorie imunopatologických reakcí (Janeway et al. 2001) (na následující straně): 3

11 I -Imunopatologické reakce s účastí protilátek IgE - ATOPIE II - Imunopatologické reakce s účastí protilátek IgG a IgM III - Imunopatologické reakce s tvorbou imunokomplexů IV - Imunopatologické reakce oddáleného typu. Podle tohoto řazení spadají alergie do kategorie I, všeobecně označované jako atopie. Imunitní reakce organizmu proběhne několik minut po kontaktu s dráždivou látkou (alergenem). Díky rychlosti průběhu je označována jako přecitlivělost časného typu. Přesto, že se mnohdy nejedná o život ohrožující onemocnění, je nejvíce znepokojující množství lidí s IgE přecitlivělostí, dosahující asi 40 % obyvatel v rozvinutých zemích. Navíc číslo všech alergiků dramaticky stoupá (Janeway et al. 2001) Průběh alergické reakce Alergeny nejčastěji vstupují do těla přes narušený kožní povrch, sliznici dýchacího sytému a střevní výstelku. Proběhne fyziologická reakce stejná jako při kontaktu s mnohobuněčnými parazity, kteří se mohou dostat do stejných míst. Imunitní systém přecitlivělého jedince je při prvním kontaktu s alergenem tzv. aktivován. Dendritické buňky velice rychle pohltí a zpracují proteiny ze slizničního povrchu. Přesunou se do lymfatických uzlin, kde napomáhají dozrávání specifického klonu pomocných CD4+ T-lymfocytů (T H 2-lymfocyty) produkujících interleukiny-4 (IL-4) a IL-13. Tyto interleukiny aktivují dozrávání plazmatických buněk uvolňujících protilátky z rodiny imunoglobulinů IgE. Zároveň svou aktivitou inhibují odpověď zprostředkovanou T H 1-lymfocyty. Uvolněné protilátky typu IgE jsou následně vychytávány na povrchové IgE-receptory žírných, bazofilních a aktivovaných eozinofilních buněk. Dojde-li ke druhému kontaktu s alergenem, přemostí se imunoglobuliny IgE navázané na receptorech buněk. Takto hyperaktivované receptory způsobí degranulaci těchto buněk a uvolnění mediátorů histaminu a heparinu (obrázek 1 na následující straně). Spustí se první akutní fáze alergické reakce, která nastává do několika minut. Taktéž se spustí další produkce IL-4, čímž se podpoří isotypový přesmyk B-lymfocytů na plazmatické buňky produkující IgE. Po akutní fázi alergické reakce následuje fáze pozdní, jejíž průběh je analogický známým projevům alergií. Ty mohou nastat a trvat až několik hodin po kontaktu s alergenem. Jejich průběh je stále závislý na podpoře T H 2-lymfocytů ve spolupráci s žírnými buňkami a eozinofyly (Janeway et al. 2001). 4

12 Obrázek 1.: Vznik alergické reakce. Alergen spustí produkci protilátek z rodiny IgE. Imunoglobuliny E jsou navázány na povrchové receptory bazofilních lymfocytů a žírných buněk, čímž jsou tyto buňky sensitizovány. Při dalším kontaktu s alergenem dojde k uvolnění histaminu a dalších zánětlivých mediátorů z intracelulárních granulí. Převzato a upraveno z Taylor & Hefle (2001) Projevy alergií Projevy alergických reakcí zahrnují široké spektrum. Průběh se liší v závislosti na místě vniku alergenu do organizmu a spuštění zánětlivé reakce. Alergie se dělí proto na 3 základní kategorie: (i) alergie kožní, kdy dojde vlivem zvýšeného průtoku krve a propustností cév k rozvoji atopické dermatitidy a ke vzniku zánětlivých otoků pod kůží, (ii) alergie potravinové, při které nadprodukce tekutiny do trávicího traktu vede k průjmům a zvracení a (iii) alergie horních cest dýchacích, jež má jako důsledek zúžení horních cest dýchacích a nadprodukci hlenu vedoucí k dráždivému kašli a astma bronchiale. V podstatě se jedná o reakce organizmu analogické snaze zbavit se parazita. Zmíněné projevy se dají označit jako lehčí (Janeway et al. 2001; Rusznak & Davies 1998). Alergie není onemocnění pouze omezující kvalitu života. Mnohem nebezpečnější situace nastává, pokud je senzibilizovaný jedinec vystaven velkému množství alergenu najednou. To může nastat při vniknutí alergenu přímo do krevního řečiště, např. při bodnutí hmyzem, podáním léku atd. Při této expozici se spustí silná alergická systémová 5

13 reakce, kdy dojde k hromadnému uvolnění mediátorů. Může nastat život ohrožující anafylaktický šok. Rapidní pokles krevního tlaku a vazodilatace postupně vede k dalším důsledkům, jako jsou otoky plic, ischémie mozku až multiorgánové selhání (Golden 2007) Původ alergie Vývoj budoucí alergie je ovlivněn především genetickými predispozicemi jedince, jeho pohlavím, původem a věkem. Kazuistiky udávají, že jednovaječná dvojčata vykazují sklony k identickým alergiím asi v 70 % případů, oproti tomu u neidentických dvojčat dosahuje tato hodnota asi 40 % (Galli 2000). Děti často dědí alergie svých rodičů. Pokud se u nich alergie vyvine, má nejednou mnohem vážnější průběh, než u rodičů. Proti tomu se stává, že jsou děti přecitlivělé na jiný alergen, než rodiče. Soudí se proto, že se geneticky přenáší spíše predispozice k alergiím (De Swert 1999). Vývoj alergie souvisí s velkým množstvím nesourodých genů, které se u jednotlivých jedinců prosazují s různou intenzitou. Ne všechny geny související s rozvojem atopie kódují pouze molekuly imunitního systému. Přesto byly vytipovány oblasti na chromosomu 11, kde jsou kódovány geny pro β podjednotku vysokoafinitního IgE receptoru. Svoji roli nejspíše hraje i promotor genového klastru na chromozomu 5 kódujícího IL-3, IL-4, IL-5, IL-9, IL-12, IL-13 a GM-CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), tedy cytokiny nutné pro podporu IgE odpovědi (Janeway et al. 2001). Studium alergií naznačuje spíše důležitější vliv prostředí v rozvoji alergie než genetické predispozice jedince. Hlavní účinek má expozice predisponovaného jedince alergenům a klimatické faktory. Velice významnou roli hraje i dieta během kojeneckého věku (mateřské mléko vs. náhrady) a také prodělané infekce, či přítomnost kuřáka v nejbližším okolí. Časté virové nákazy cest dýchacích vedou později k bronchiální hypersenzitivitě, která ovlivňuje reakci na vdechnutí neškodného antigenu. Naopak se ukazuje, že absence určitých vnitřních parazitů v civilizovaných zemích vede k rozvoji reaktivity IgE. Tento fenomén je součástí tzv. hygienické hypotézy vzniku alergií (Folkerts et al. 2000). Dalším novým jevem, se kterým se stýkáme čím dál častěji, jsou tzv. pracovní alergie. Vyskytují se specificky u pracovníků, kteří pracují v prostředí s přímým kontaktem nějakému alergenu. Například proteáza papain, která se využívá jako stabilizátor masných výrobků, bývá příčinou astmatických potíží. V některých prádelnách se začalo mezi zaměstnanci šířit astma po styku s bakteriálním subtilisinem, který se přidává do pracích 6

14 prášků (Janeway et al. 2001). Narůstá podíl zdravotnických pracovníků, u nichž se postupem času a pravidelným kontaktem s latexem vyvinula příslušná přecitlivělost (Sussman & Beezholt 1995). Roste i citlivost zemědělců a pracovníků na farmách, kteří jsou v pravidelném kontaktu s roztoči kontaminovanými zásobami. Nejčastějšími původci alergií jsou zde skladištní roztoči Lepidoglyphus destructor, Accarus siro, Tyrophagus putrescentiae a Glycyphagus domesticus. Nezanedbatelný podíl na alergiích v zemědělství zabírají i mikroskopické houby Cladosporium a Aspergillus (van Hage-Hamsten et al. 1985; Marx et al. 1993), které bývají roztoči roznášeny (Hubert et al. 2003, 2004; Smrž & Čatská 1987). Dosud není známo, proč určité epitopy rostlinného a živočišného původu vedou k produkci IgE a jiné nikoliv, přičemž vstupují do organizmu společně. Typickou charakteristikou vdechovaných alergenů je proteinový původ s malou molekulovou hmotností a často s enzymatickou schopností (mnohdy se jedná o proteázy). Alergenní proteiny se vyskytují v nepatrných množstvích a vykazují vysokou stabilitu a rozpustnost. Mimo to obsahují na svém povrchu peptidy schopné silně vázat hostitelské MHC II receptory. Možnou souvislost těchto vlastností můžeme hledat v evoluci samotné IgE imunitní odpovědi na parazity, kteří po kontaktu s tkání uvolňují na povrch sliznice silné proteolytické enzymy (Janeway et al. 2001). Neblahým faktem je každoročně stoupající počet alergiků. Může za to moderním člověkem znečišťované prostředí, ovlivněné jeho civilizačním rozmachem. Člověk svými aktivitami produkuje množství polutantů, uvrhuje se do trvalého stresu a působí na svůj organizmus dalšími neblahými faktory. Tyto vlivy oslabují jeho vlastní imunitní systém, který se nedokáže bránit správným způsobem. Nebo naopak reaguje přecitlivěle na neškodné látky. Narůstající míra znečištění může mít zároveň za následek evoluci alergenových epitopů. Například pylová zrna prochází změnami struktury povrchu navázáním polutantů z dopravy (především produkty naftových motorů). Tato vazba nejspíše zvyšuje alergenní potenciál takto modifikovaného pylu (Hořejší & Bartůňková 2005; Gibson et al. 2003) Nejčastější alergeny Alergeny se dle svého původu dají rozdělit do 6 základních skupin: vdechované, potravinové, kontaktní, bakteriální a virové, lékové a hmyzí. Nejčastější vdechované alergeny, se kterými se setkáváme mimo domov, jsou nejrůznější rostlinné pyly, složky 7

15 sena aj. Důsledkem kvetení rostlin je pro většinu alergiků jaro obdobím neustálé chronické rýmy, jejíž projevy bývají utlumovány medikamenty (Thompson et al. 2000). Dnes alergickou rýmou trpí přibližně 23 % Britů, 26 % Američanů a 36 % Japonců (Sly 1999). V domácnostech jsou nejvíce zastoupeny alergeny ze zvířecí srsti a roztočů. Potravinové alergie bývají vyvolány přítomností jednoho alergenního proteinu ve stravě (např. lysozymem ve vaječném bílku (Järvinen et al. 2007)) a trápí přibližně 4 % dospělé a 6 8 % dětské populace. Mezi alergické odpovědi nepatří další nepříznivé reakce spojené s potravinami, jako jsou intolerance, farmakologické reakce a otrava jedy. Nejčastějšími alergenními potravinami jsou arašídy, ořechy, mléko, vajíčka, ryby, korýši, sója a pšenice (Ronchetti et al. 2007). Neúměrná reakce na tyto potraviny může vést až k vyvolání anafylaktického šoku organizmu (Lee & Vadas 2011). Dle informací amerického národního institutu pro alergie a infekční nemoci (National Institute of Allergy and Infection Diseases - NIAID) mají tyto potraviny na svědomí až 90 % všech vyvolaných alergií. Samozřejmě se setkáváme i s alergiemi na ovoce, jako jsou jablka, hrušky, broskve, jahody, banány a další (Ronchetti et al. 2007). Známé alergeny obsahují také semena olejnatých rostlin, jako je mák, sezam aj. (Taylor & Hefle 2001). Alergenicita některých složek potravin se potvrzuje velice těžko. Jejich příměsi jsou v moderní stravě takřka všudypřítomné. Za všechny jsou nelepším příkladem kukuřice (Parker 1980) a další potravinové doplňky včetně různých aditiv a chemických barviv, které mnohdy nebývají výrobci ani uvedeny (Ronchetti et al. 2007). Poměrně specifické pro potravinové alergie bývá jejich cross-reaktivita, kdy jedinec alergický na jednu složku potravy vykazuje přecitlivělost na další látku. Typickými příklady je přecitlivělost na složky sóji u dětí alergických na kravské mléko, což vedlo až k vývoji hypoalergenních náhražek potravy, obsahujících degradované sojové a mléčné proteiny. Častá je také citlivost na banány, kiwi, avokádo a další potraviny u lidí alergických na latex (Ronchetti et al. 2007). Na rozdíl od ostatních alergií je u potravinových skrytá jistá naděje dětských pacientů a jejich rodičů, že se alergie zbaví. Během školního věku odrostou děti přibližně v 50 % alergiím na mléko, vejce, sóju a pšenici. Alergií na arašídy a ořechy se zbaví až 20 % resp. 9 % dětských pacientů (Sicherer & Leung 2007). Silnými alergeny, které mohou často dokonce ohrozit lidský život, jsou některé léky. Jejich nebezpečnost tkví hlavně v rychlé a silné expozici imunitnímu systému po vniknutí do organizmu. Nejčastějšími původci alergického anafylaktického šoku jsou v první řadě antibiotika (především obsahující β-lactamový kruh penicilin), následovaná 8

16 aspirinem a nesteroidními antipyretiky (ibuprofen), chemoterapeutiky, očkovacími vakcínami, protaminem a bylinnými přípravky (Simons 2009, 2010; Volcheck 2009). Míra reaktivity léčivých látek souvisí s rozsahem užívání a jejich vlastnostmi. Reakce na penicilin se dostavuje pouze po vazbě na specifické tělní proteiny u jednoho z 2000 až použití. Ke smrti vyvolané šokem při podání penicilinu dochází dokonce i dnes až při jedné z aplikací. Aspirin či nesteroidní antipyretika vyvolávají nežádoucí anafylaktické reakce u jednoho z pacientů (Marx 2010). Imunologickou reaktivitu pacientů může ovlivnit mimo jiné i vývoj samotných léčiv. Dřívější radiokontrastní látky vyvolávaly nežádoucí reakci ve více než 1 % případů. Látky používané dnes jsou přijímány bezproblémově v 99,96 % (Drein & Volcheck 2001). Nejnebezpečnější hmyzí alergeny jsou obsažené v hmyzím jedu bodavého (včela, vosa, sršeň, mravenec) a savého hmyzu (klíště, komár). Jed je vypuštěn do organizmu ihned po vpichu do pokožky. Imunitní systém většiny lidské populace vyvolá bezprostředně po bodnutí lokální reakci v místě vniku. Udává se však, že u 5 10 % populace dochází k vyvolání celkové systémové reakce, jejíž projevy se pohybují v rozmezí od lehké kopřivky a dráždivého kašle až po život ohrožující anafylaktický šok. Nebezpečná anafylaxe se dostavuje u přibližně 3 % dospělé a 0,4 0,8 % dětské populace. Během 80. let minulého století na šok z hmyzího bodnutí umíralo ročně přibližně asi 40 obyvatel USA (Golden 1989). Další hmyzí alergeny spadají do skupiny kontaktních a inhalovaných alergenů, kam patří i alergeny roztočové. Tyto kategorie vyvolávají všeobecně mírnější alergickou odpověď Roztočové alergeny Nárůst počtu alergiků vedl vědu k postupné honbě za poznáním co největšího množství nejagresivnějších alergenů. Výzkumy se z velké části zaměřily i na všudypřítomné roztoče, kteří jsou pro člověka nebezpeční hlavně z hlediska roznášení nejrůznějších alergenů. Roztoči nešíří do svého okolí jen složky svých těl a exkrementů, ale velmi často specificky přenáší i různé druhy bakterií a plísní tedy další potenciální zdroje alergenů (Hubert et al. 2003, 2004; Smrž & Čatská 1987). Dříve se na základě alergenní povahy vaječného lysozymu předpokládalo, že jedním z nejvýznamnějších roztočových alergenů bude taktéž lysozym, či jemu podobný protein, uvolňovaný do prostředí. Lysozymová baktericidní aktivita byla doposud biochemicky nalezena u některých zástupců rodu Acaridida (Dermatophagoides farinae, 9

17 D. pteronyssinus, Lepidoglyphus destructor, Glycyphagus destructor, G. domesticus, Rhizoglyphus callae, R. robini a Tyrophagus iongitor) (Childs & Bowman 1981; Stewart et al. 1998). Alergenicita objeveného lysozymu však nebyla prokázána (Stewart et al. 1991). Vzhledem k tomuto faktu se začalo studium roztočových alergenů soustředit na proteiny s vysokou alergenní schopností, tedy vysokou mírou IgE reaktivity sér RAST (Ratio Allergen Sorbent Test) pozitivně reagujících jedinců (Arlian et al. 1997; Arlian 2002). Dodnes je biochemicky charakterizováno 14 skupin izolovaných alergenů s reaktivitou vyšší než 5 % (Grp 1 Grp 14) (Arlian 2002). Zástupci nejvýznamnějších alergenů spadají do skupin Grp 1 a Grp 2 vykazující reaktivitu vyšší dokonce než v 90 %. Skupinu Grp 1 tvoří nejčastěji různé druhy proteáz, které jsou roztoči využívány k trávení bílkovinné složky potravy (Erban & Hubert 2010). Do Grp 2 spadají proteiny s většinovou velikostí blízkou 14 kda, kterou sdílejí s lysozymem. Přesto, že nemají stejné baktericidní vlastnosti a mnohdy neznámé funkce, bývaly označovány jako tzv. lysozyme-like proteiny, mezi které spadají i alergeny s nižší alergenicitou (Arlian 2002; Smith et al. 2001). Podle novějších strukturálních studií je dnes celá skupina Grp 2 alergenů řazena mezi NPC2 proteiny (Niemann-Pick C protein 2) (Ichikawa et al. 2005). Dalšími silně alergizujícími proteiny uvolňovanými do prostředí jsou mnohé hydrolytické enzymy využívané k trávení jednotlivých složek potravy. Těmito proteiny jsou trypsiny (trávení bílkovin) tvořící skupinu Grp 3 s reaktivitou mezi %, α-amylázy (trávení škrobů) ze skupiny Grp 4 s reaktivitou % a chymotrypsiny (trávení bílkovin) skupiny Grp 6 s reaktivitou % (Arlian 2002). Mezi slabší, přesto ne nevýznamné alergeny tvořící skupiny Grp 10 s reaktivitou menší než 60 %, resp. Grp 11, patří i svalové tropomyoziny a paramyoziny (Arlian 2002; Erban 2011). Samostatné skupiny roztočových alergenů Grp 15 a Grp 18 tvoří chitinázy, jež jsou potřebné pro trávení odolných buněk mikroskopických hub obsahujících chitin (Siepel & de Ruiter-Dijkman 1993). Přítomnost těchto hydrolytických enzymů je u roztočů i podmínkou jejich samotného růstu. Tyto organizmy spadající mezi pavoukovce mají stejně jako korýši a hmyz chitinózní exoskelet (Li et al. 2005). Během svého růstu musí vždy rozrušit a odložit starý svrchní obal a vytvořit si nový. Právě během této etapy než ztvrdne nový exoskelet, může dojít ke zvětšení těla organizmu (Hughes 1976). Přítomnost chitináz byla potvrzena i u prachových synantropních roztočů D. farinae a D. pteronyssinus. Zda právě tito roztoči využívají chitinázy i k trávení mikroskopických hub, není jisté, i když byly imunohistologicky lokalizovány ve střevě roztočů (O Neil et al. 2006; Weber et al. 2003; McCall et al. 2001). Byla však potvrzena vysoká míra 10

18 alergenicity chitináz jak pro člověka, tak například i pro psa. Nepříjemné projevy alergií, jako jsou třeba astmatické potíže, způsobené přítomností všech těchto alergenů, se projevují dokonce i po déletrvající izolaci alergika od infestovaného prostředí. Vyplývá z toho, že zdravotní důsledky přítomnosti roztočů mohou být i dlouhodobějšího rázu, jak bylo potvrzeno studií skladištního roztoče L. destructor (Alvarez et al. 1999). Informace o všech objevených alergenech, které jsou do detailu popsány a schváleny, jsou evidovány a shromažďovány do databáze Mezinárodní unie imunologických společností (IUIS). Unie následně zveřejňuje informace na stránkách kde se dají jednotlivé alergeny dohledat podle jejich původu. Přehled dosud známých 24 skupin alergenů synantropních roztočů rozdělených dle jejich reaktivity je uveden v tabulce 1 na následující straně. 11

19 Tabulka 1.: Alergeny synantropních roztočů. Seznam dosud objevených a popsaných alergenů synantropních roztočů. Převzato a upraveno z Alergen Biochemický název MW(SDS-PAGE) Alergen Biochemický název MW(SDS-PAGE) Acarus siro (skladištní roztoč) Dermatophagoides pteronyssinus (evropský prachový roztoč) Aca s 13 Fatty acid-binding protein 15 Blomia tropicalis (roztoč) Der p 1 Cysteine protease 24 Blo t 1 Cysteine protease 39 Der p 2 NPC2 family 15 Blo t 2 Unknown fuction Der p 3 Trypsin 31 Blo t 3 Trypsin Der p 4 Alpha amylase 60 Blo t 4 Alpha amylase 56 Der p 5 Unknown fuction 14 Blo t 5 Unknown fuction 14 Der p 6 Chymotrypsin 25 Blo t 6 Chymotrypsin 25 Der p 7 Unknown fuction 26, 30 & 31 Blo t 10 Tropomyosin 33 Der p 8 Glutathione S-transferase 27 Blo t 11 Paramyosin 110 Der p 9 Collagenolytic serine protease 29 Blo t 12 Unknown fuction 14 Der p 10 Tropomyosin 36 Blo t 13 Fatty acid-binding protein Der p 11 Paramyosin 103 Blo t 19 Anti-microbial peptide homologue 7 Der p 14 Apolipophorin 177 Blo t 21 Unknown fuction Der p 15 Chitinase 59/61 Dermatophagoides farinae (americký domácí prachový roztoč) Der p 18 Chitinase 50 Der p 20 Arginine kinase Der f 1 Cysteine protease 27 Der p 21 Unknown fuction Der f 2 NPC2 family 15 Unknown function, homology Der p 23 to peritrophin-a domain 14 kda Der f 3 Trypsin 29 (PF01607) Der f 6 Chymotrypsin 25 Euroglyphus maynei (domácí prachový roztoč) Der f 7 Unknown fuction Eur m 1 Cysteine protease Der f 10 Tropomyosin 37 Eur m 2 NPC2 family Der f 11 Paramyosin 98 Eur m 3 Trypsin Der f 13 Fatty acid binding protein Eur m 4 Alpha-amylase Der f 14 Apolipophorin 177 Eur m 14 Apolipophorin 177 Der f 15 Chitinase 98/109 Glycyphagus domesticus (skladištní roztoč) Der f 16 Gelsolin/villin 53 Gly d 2 Unknown fuction 15 Der f 17 Calcium binding protein 53 Lepidoglyphus destructor (Skladištní roztoč) Der f 18 Chitinase 60 Lep d 1 Cysteine protease Der f 22 Unknown fuction Lep d 2 NPC2 family 16 (14 non-red) Dermatophagoides microceras (domácí prachový roztoč) Lep d 5 Der m 1 Cysteine protease 25 Lep d 7 Tyrophagus putrescentiae (skladištní roztoč) Lep d 10 Tropomyosin Tyr p 2 NPC2 family 16 Lep d 13 Fatty acid-binding protein Tyr p 3 Trypsin 26 kda Tyr p 10 Tropomyosin Tyr p 13 Fatty-acid binding protein 15 Tyr p 24 Troponin C 18 kda 12

20 2.2. Roztoči Roztoči (Acari) jsou nejpočetnější skupina volně žijících a parazitických forem pavoukovců (Arachnida), kam spadá přibližně doposud popsaných druhů (Halliday et al. 2000). Přesto se odhaduje, že více jak 95 % všech druhů roztočů ještě neznáme. Zástupci roztočů dosahují velikostí mezi 0,09 30 mm. Tyto nepatrné rozměry jim poskytují nemalou evoluční výhodu. Proto byli roztoči schopni obsadit téměř všechny myslitelné ekosystémy a ekologické niky. Těmito ekosystémy nejsou pouze přirozená prostředí, ale i habitaty specificky přizpůsobené jinými živočichy. Rozšířené je obydlování hnízd, nor, skladů potravin a povrchu živočichů. Roztoči jsou schopni obsadit dokonce i různé kolonie mikroskopických hub. Ze všech druhů roztočů se nejvíce rozšířily volně žijící, které se živí nejrůznějšími způsoby (OConnor 1982; Kranz & Walter 2009; Halliday et al. 2000; Walter et al. 2011). Snadnému rozšíření a přežití nepříznivých vlivů některých roztočů napomohla kromě malé velikosti ještě jedna evoluční výhoda stádium hypopa. Běžný cyklus vývoje roztoče začíná vylíhnutím z vajíčka a prochází přes šestinohou larvu, osminohou nymfu a končí dospělým jedincem. Stádium nymfy může být navíc rozděleno do třech po sobě jdoucích fází: (i) protonymfa, (ii) deuteronymfa a (iii) tritonymfa. Jednotlivá stádia nymfy jsou proložena klidovou fází (diapauza) (Hughes 1976). V případě nepříznivých podmínek, kdy nemají dostatek potravy, dokáže vývoj z protonymfy odbočit do stádia hypopa. Hypopus je analogií deuteronymfy a je od dospělce morfologicky odlišný v mnoha směrech. Jedná se o klidové stádium, nepřijímá potravu z důvodu neprůchodné trávicí soustavy. Tělo je dorzoventrálně zploštělé se silně sklerotizovaným povrchem a krátkými končetinami. Je proto vysoce odolné vůči vnějším faktorům. Pro přesun je hypopus vybaven dlouhými sety a přísavkou na anální destičce, což mu umožňuje uchytit se na těle jiných živočichů, které využívají pro transport na delší vzdálenosti (Kranz & Walter 2009; OConnor 1982). Například bylo popsáno, že druhy Acarus využívají k šíření blechy. Avšak všechny druhy žijící ve skladech potravin často schopnost tvorby hypopa ztratily (OConnor 1982; Hughes 1976). 13

21 Celá infratřída Acari je složitá a jeho systematika nejednotná. Nejčastěji se dnes setkáváme s dělením na 2 skupiny (Kranz & Walter 2009): Skupina: Parasitiformes (Anactinotrichida) Podřád: Opilionacarida (Notostigmata) Holothyrida (Tetrastigmata) Ixodida (Metastigmata) Mesostigmata (Gamasida) Skupina: Acariformes (Actinotrichida) Podřád: Trombidiformes (Actinedida) Sarcoptiformes Řád: Endeostigmata Oribatida (Cryptostigmata) Astigmata (Acaridida) Synantropní roztoči Synantropní roztoči spadají do podřádu Acaridida. Ten je dnes považován za velkou monofyletickou skupinu, do které spadá kolem 5000 popsaných druhů rozdělených do 800 rodů a 70 čeledí. Jednotliví zástupci jsou 0,2 1,8 mm velcí roztoči s málo sklerotizovaným křehkým tělem. První myšlenky o evoluci tohoto podřádu pochází již z konce 19. stol., kdy Berlese navrhl teorii vývoje podřádu pancířníků (Oribatida) z rodu Acaridida (Berlese 1897). Dnešní systematika se drží teorie Zachvatkina z roku 1953, která je protikladem této myšlenky a staví jako původní evoluční skupinu právě Oribatida, z nichž se postupně vyvinula Acaridida (Zachvatkin 1953; Norton 1998). Specifické stěhování roztočů do blízkosti člověka počalo tzv. neolitickou revolucí lidstva. Tato pomalá změna společnosti probíhala mezi 10. a 8. tisíciletím př. n. l. v oblastech středního východu (OConnor 1979; Halliday et al. 2000; Erban & Hubert 2008). Lidé se v tomto období postupně usadili a začali domestikovat zvířata. Z náhodných sběračů a lovců se stali účeloví chovatelé dobytka a zemědělci. Lidstvo začalo produkovat více, než dokázalo najednou spotřebovat. Začalo tedy nadbytky potravin shromažďovat na jedno místo. Nevědomky tak připravilo více než vhodné prostředí pro různé škůdce. Tomuto připravenému prostředí se postupně přizpůsobili i synantropní roztoči. Tato zvláštní skupina roztočů se pravděpodobně vyvinula z fungivorních předků. Předci 14

22 dnešních synantropních roztočů, kteří invadovali uskladněné potraviny a domácí prach, jsou dle jejich původu rozděleni do 4 skupin (OConnor 1979): (i) roztoči asociovaní se specifickými potravními zdroji, (ii) roztoči asociovaní s polními zdroji, (iii) roztoči asociovaní s obydlími savců a (iv) roztoči asociovaní s hnízdy ptáků. Skladištní roztoči rodu Lepidoglyphus se do lidských obydlí pravděpodobně rozšířili přes příbytky nejrůznějších savců. Prachoví roztoči rodu Dermatophagoides se k člověku dostali přes ptačí hnízda (OConnor 1982). Navíc se z některých prachových roztočů postupně vyvinuly i různorodé parazitické formy. Takovým druhem je například Psoroptes ovis parazitující na kůži ovcí (Hamilton et al. 2003) Ekonomický a medicinální význam skladištních a prachových roztočů Mikroskopické rozměry podpořily velmi rychlé a snadné rozšíření roztočů. Dá se říci, že jsou všudypřítomní (Kranz & Walter 2009). Během tohoto šíření začali spontánně osidlovat lidská obydlí (OConnor 1979; Halliday et al. 2000; Erban & Hubert 2008). Některé druhy se dokonce na nové potravně bohaté prostředí specializovaly. V lidských domácnostech se živí především organickými zbytky, mezi které patří i stále se olupující lidská kůže. Tyto zbytky postupně tvoří součást domácího prachu (Halliday et al. 2000). Jiné druhy obsadily lidské zásobárny potravin. Zde požírají uskladněné zpracované i nezpracované zásoby. Díky těmto skutečnostem se udávalo, že roztoči škodí člověku především žírem. Kromě extrémně přemnožených kolonií roztočů je tento dopad na člověka takřka zanedbatelný. Mnohem větší vliv má znečištění zásob exkrementy, exuviemi (svlečka) a mrtvými jedinci. Skladované produkty rychle ztrácí svoji kvalitu a stávají se pro zdraví člověka a zvířat nebezpečné. Při značném napadení potravin a krmiv ztratí svoji jakost do stavu, kdy jsou vhodné pouze jako zdroj biopaliva (Rosický et al. 1979; Stejskal & Hubert 2008; Erban et al. 2008; Erban et al. 2009). Domácí prach kontaminovaný nejčastěji druhy Dermatophagoides farinae a D. pteronyssinus se stává zdrojem roztočových alergenů (Arlian 2002), přičemž dle lékařských studií je právě na tyto druhy roztočů citlivých % obyvatel. Screening provedený v 90. letech minulého století potvrdil přítomnost smíšených populací těchto roztočů v 82 % amerických domácností (Arlian et al. 1992). Výskyt těchto zástupců dosahuje svého vrcholu za vlhkých teplých dnů s relativní vlhkostí vyšší než 70 %. Během zimních měsíců s vlhkostí vzduchu kolem 50 % jejich počty rapidně klesají (Arlian 2002). 15

23 Pokud je prach mikroorganizmy kontaminován, může dojít i ke vdechnutí či spolknutí jedince, exkrementu, nebo svlečky. Někteří roztoči dokonce přežijí v lidských plicích, pokud se zde usadí (van Woerden et al. 2004). Druh Caloglyphus (syn. Sancassania) berlesei (Acari, Acaridida) byl označen za původce specifické parazitické nákazy sluchové trubice vnějšího sluchového orgánu člověka (Cho et al. 1999). Roztoči jsou nejrozšířenější skladištní škůdci. Napadají uskladněné obilí v silech a podlahových skladech v Česku. Takové hodnocení vyplynulo z průzkumu 379 vzorků obsahujících 1 kg potravinářského obilí. Z celkového objemu bylo 243 vzorků napadeno roztoči, 73 pisivkami a 114 brouky. Průměrná roztočí populace v tomto množství obilí dosahovala 308 jedinců. Více než 22 % dodaných odběrů bylo napadeno populací čítající přes 100 jedinců roztočů. Alarmující bylo zjištění, že 4 % ze vzorků byla napadena více než 1000 jedinci roztočů. Nejčastěji infestovaly obilné sklady druhy Lepidoglyphus destructor, Accarus siro, Tyrophagus putrescentiae aj. (Hubert et al. 2002; Stejskal et al. 2003). Podobně nelichotivých výsledků dosáhla další kontrolní studie v roce 2008, která proběhla na 514 vzorcích (Stejskal & Hubert 2008). Roztočí zamoření potravin se netýká pouze velkých skladů obilí. Přítomnost roztoče druhu Carpoglyphus lactis byla zjištěna v mnoha sušených ovocných produktech, které jsou obyvatelům běžně dostupné v supermarketech a velkých obchodních řetězcích. Bohužel se o tomto napadení potravin dovídáme z moderních sdělovacích prostředků čím dál častěji (Hubert et al. 2011). Roztoči jsou známi jako přenašeči mikroorganizmů, které jsou nebezpečné zdraví člověka. Nejčastěji k přenosu dochází, pokud roztoči žijí v plesnivém prostředí. Uvolňující se spory mikromycet jsou takto roznášené dále (Hubert et al. 2003, 2004). Houbové spory jsou šířeny i přes trávicí systém roztoče, kdy se dostávají do prostředí spolu s uvolňovanými exkrementy (Smrž & Čatská 1987). Šířené mikroskopické houby jsou, stejně jako roztoči, zdroje alergenů, ale i mnohem nebezpečnějších toxinů. Mezi tyto toxické látky patří hydrolytické, nehydrolytické enzymy a další organické látky. Mezi ty nejnebezpečnější patří karcinogenní mykotoxin aflatoxin B 1 a sterigmatocystin. Oba jsou produkované nechvalně proslulými rody hub Aspergillus. Nejčastěji je spojováno jejich jméno s aspergilózami, což je zánětlivé onemocnění dýchacích cest, rohovky, středního ucha aj. (Kalina & Váňa 2005). 16

24 2.3. Lysozym Lysozym (EC ) je enzym katalyzující hydrolytické reakce. Spadá tak do velké rodiny hydroláz, které využívají ke své katalytické štěpné funkci molekulu vody. Lysozym byl náhodou objeven Alexandrem Flemingem v roce 1922 jako pozoruhodný bakteriolytický prvek, když se mu dostal nosní hlen na bakterie nanesené na agaru. Postupem času se mu začaly bakteriální kolonie rozpouštět (Callewaert & Michiels 2010). Jedná se tedy o jeden z nejdéle známých a nejlépe probádaných živočišných enzymů. Krystalografická struktura lysozymu z vaječného bílku byla získána v roce 1965 skupinou Davida Phillipse (Phillipse 1966). Byl tak druhým proteinem, a dokonce prvním enzymem, zmapovaným při vysokém rozlišení (Voet & Voet 2004). Prvním plně sekvenovaným savčím zástupcem byl lidský lysozym (Peters et al. 1989; Prager & Jollés 1996). Oba tito zástupci se stali základními modelovými příklady z oborů enzymologie, krystalografie, proteinové a molekulární biologie (Voet & Voet 2004; Callewaert & Michiels 2010). Většina enzymů nese i alternativní názvy odvozené od jejich přímé funkce a průběhu katalytické reakce. Alternativní názvy pro lysozym jsou muramidáza nebo 1,4-beta-N-acetylmuramidáza. Vyplývá to ze struktury bakteriálního peptidoglykanu (obrázek 2), jehož štěpení katalyzuje. Peptidoglykan je stále se opakující řetězec jednotek β(1 4) N-acetylglukosaminu (NAG) a N-acetylmuramové kyseliny (NAM) (Alberts et al. 2002). Obrázek 2.: Základní jednotka peptidoglykanu. Struktura opakujících se jednotek peptidoglykanu bakteriální stěny. Zvýrazněná vazba je štěpena lysozymem. 17

25 Dělení rodiny lysozymů Dlouhodobé studium lysozymu vedlo k objevu členité rodiny. Tato rodina enzymů zahrnuje 3 základní typy odvozené od jejich prvně objevených zástupců: a) lysozymy typu-c (chicken, conventional-type) b) lysozymy typu-g (goose-type) c) lysozymy typu-i (invertebrate-type). Všechny tři typy jsou široce rozšířené mezi nejrůznějšími živočichy. Liší se hlavně primární strukturou, tedy sekvencí aminokyselin (AMK). Rozdíly v sekvenci AMK tak ovlivňují jejich biochemické a enzymatické vlastnosti (Callewaert & Michiels 2010). Distribuce jednotlivých typů lysozymů mezi živočichy na základě jejich sekvenční homologie je uvedena na obrázku 3. Obrázek 3.: Distribuce jednotlivých typů lysozymu napříč živočichy. Zjednodušený kladogram znázorňuje pouze větve obsahující druhy, kde byl lysozym detekován na základě dostupných DNA sekvencí, či funkčních studií. Převzato a upraveno z Callewaert & Michiels (2010). 18

26 Evoluce jednotlivých typů lysozymů je dosud nejasná. Všechny fylogenetické studie zatím naznačují, že prapůvodním typem lysozymu je typ-c, který nese nejvíce znaků lysozymového prapředka. Vše nasvědčuje tomu, že se typ-g a typ-i oddělily během vývoje společně. Tyto dva typy spolu proto tvoří poměrně těsný klastr a sdílí spolu značnou část homologie (Liu et al. 2006; Callewaert & Michiels 2010). Evoluční strom na základě fylogenetické analýzy je uveden na obrázku 4 (Liu et al. 2006; Callewaert & Michiels 2010). Obrázek 4.: Fylogenetická analýza proteinových sekvencí c-, g- a i-lysozymů. Původní fylogenetická studie Liu et al. (2006) obohacena o další data. Převzato z Callewaert & Michiels (2010) Lysozymy typu-c (c-lysozymy) Lysozym typu-c je reprezentován lysozymem ze slepičího vaječného bílku (HEWL - lysozyme from hen egg white). Primární struktura tohoto hlavního zástupce je složena ze 129 AMK a dosahuje molekulové hmotnosti asi 14,6 kda. Lysozymy typu-c jsou nejvíce rozšířeny v podkmenu obratlovci (Vertebrata) včetně savců (Mammalia). Jejich přítomnost 19

27 byla v těchto skupinách potvrzena alespoň přítomností c-lysozymového genu (Callewaert & Michiels 2010). Studium lysozymu typu-c vedlo k objevu dvou subtypů Ca 2+ vázající a Ca 2+ nevázající. C-lysozymy jsou strukturálně velice blízké α-laktalbuminům, se kterými sdílí asi 40 % primární sekvence. Společná homologie těchto dvou skupin proteinů se nese i přes jejich sekundární a terciární strukturu. Mají stejně konzervované disulfidické můstky a intron-exonovou organizaci genů (Phillips 1966; Acharya et al. 1991). Nejvíce se od sebe α-laktalbuminy a c-lysozymy liší funkcí a místem exprese. Lysozymy typu-c jsou široce rozšířené po celém organizmu. -laktalbuminy jsou přítomny pouze v savčím mléku a mlezivu, kde podle všeho nevykazují žádnou enzymatickou aktivitu. Jejich funkcí je vázat na sebe galaktosyltransferázu, a tím ovlivňovat syntézu laktózy. Přes značnou podobnost nesdílí spolu lysozymy a α-laktalbuminy svoje schopnosti. Lysozym není schopen žádným mechanizmem ovlivnit tvorbu laktózy a α-laktalbumin není schopen nabourávat bakteriální buněčné stěny (Qasba & Kumar 1997). Společný předek obou těchto proteinů byl potvrzen objevením neznámé bílkoviny v mléce ježury. Tento protein sdílí funkce α-laktalbuminů a lysozymů najednou. Je tedy schopen ovlivnit tvorbu laktózy pomocí vazby galaktosyltransferázy a vykazuje bakteriolytické vlastnosti jako lysozym (Hopper & McKenzie 1974). Lysozymy typu-c se podle dosavadních zjištění jeví jako nejpůvodnější zástupci pravých lysozymů. Rozporuplně proto působí jejich distribuce skrze jednotlivé zástupce živočichů. Kromě obratlovců byl nalezen i u bezlebečných (Cephalochordata), konkrétně u druhu kopinatce Branchiostoma belcheri tsingtauense (Liu et al. 2006). Ti jsou považováni, spolu s pláštěnci (Urochordata), u kterých nebyl c-lysozym zatím nalezen (Nilsen et al. 2003), za přechod mezi obratlovci a bezobratlými. Při nejnovějším prohledávání homologů HEWL v databázích v roce 2009 potvrdila přítomnost genu pro lysozym typu-c i v nejrůznějších zástupcích hmyzu (Insecta), pavoukovců (Arachnida) a korýšů (Crustacea), všechny spadající do kmenu členovci (Arthropoda). V žádných jiných primitivnějších organizmech jejich přítomnost potvrzena zatím nebyla (Callewaert & Michiels 2010) Lysozymy typu-g (g-lysozymy) Skupina lysozymů typu-g vznikla objevením a identifikací lysozymu v husím vaječném bílku (GEWL goose egg white lysozyme) roku 1967 (Canfield & McMurry 20

28 1967). Postupně byli další zástupci detekováni v mnoha jiných ptačích druzích z řádů vrubozobých (Anseriformes) (Simpson et al. 1980) a hrabavých (Galliformes) (Nakano & Graf 1991). Jeho přítomnost byla vždy doprovázena určitým množstvím c-lysozymu. Poměr obou zástupců lysozymů je druhově specifický a navíc souvisí se stádiem vývoje zárodku ve vajíčku (Simpson et al. 1980; Nakano & Graf 1991; Jollés et al. 1977). Výskyt lysozymu typu-g byl rozšířen na další skupinu obratlovců mimo ptáky v roce 2001, kdy byl objeven v těle platýze Paralichthys olivaceus (Hikima et al. 2001). Postupně byly geny lysozymu typu-g objevovány napříč obratlovci až po člověka (Irwin & Gong 2003). Při těchto analýzách byl objeven nečekaně i mimo obratlovce, a to v zástupcích vršenek Ciona intestinalis spadajících do podkmenu Urochordata (Irwin & Gong 2003; Nilsen et al. 2003). Existence g-lysozymu je potvrzena ještě u hřebenatky Chlamys farreri z kmene měkkýšů (Mollusca) (Zhao et al. 2007) Lysozymy typu-i (i-lysozymy) Existence třetího zástupce lysozymů byla předpovězena již v roce N-terminální sekvenace nově objeveného lysozymu z mořské hvězdice Asterias rubens (Echinodermata) nenalezla signifikantní podobnost s dalšími známými skupinami lysozymů (Jollés & Jollés 1975). Existence skutečně nové rodiny lysozymů byla však potvrzena až kompletní sekvenací primární struktury lysozymu z mořské škeble druhu Tapes japonica (TjL lysozyme from Tapes japonica) v roce 1999 (Ito et al. 1999). Všechen dosud známý výskyt lysozymů typu-i je potvrzen pouze u bezobratlých organizmů (Callewaert & Michiels 2010) Vlastnosti lysozymů Struktura lysozymů Všechny lysozymy spolu tvoří poměrně obsáhlou divergentní rodinu. Přesto je jejich podobnost poměrně malá. Homologie jednotlivých typů na základě primární struktury AMK dosahuje % (C- a I- asi 24 %, C- a G- 19 % a G- a I- 16 %). Tyto rozdíly ve struktuře ovlivňují především jejich velikost, bazicitu (pi) a hlavně aktivitu v nejrůznějších prostředích. Variabilita jednotlivých typů souvisí nejčastěji s různou lokalizací lysozymů do rozdílných tkání a prostředí. Jednotlivé odlišnosti předurčují i jejich alternativní enzymatické funkce (Nilsen et al. 2003; Xue et al. 2004; Yin et al. 2003). 21

29 Většina studií lysozymů vychází ze sekvenace lysozymových genů. Predikovaná forma získávaná z cdna jednotlivých organizmů často neodpovídá skutečné velikosti maturovaného proteinu. To nasvědčuje množství posttranslačních úprav, kterými enzymy prochází. Nejčastěji dochází k úpravám na N-koncích enzymů. Podle studií mají lysozymy c- a g- typu na tomto konci nejčastěji signály pro klasickou a neklasickou buněčnou sekretorickou dráhu, která je využívána například k nahromadění lysozymu do vaječného bílku, kde hraje antibakteriální ochrannou funkci vyvíjejícího se zárodku (Simpson & Morgan 1983; Nile et al. 2004). Výjimkou jsou některé g-lysozymy získané z ryb, které signální sekvence často postrádají (Irwin & Gong 2003; Kyomuhendo et al. 2007; Larsen et al. 2009). Přesto některé ryby, jako například Salmo salar a Danio rerio, kódují lysozym se sekretorickou značkou. Alternativním splicingem a využitím kodónů tak pokrývají svou potřebu po intracelulárním i extracelulárním lysozymu (Kyomuhendo et al. 2007; Larsen et al. 2009). Největší variabilitu různých forem mají i-lysozymy. Posttranslační úpravy u nich probíhají na C-konci i N-konci, dochází tak k produkci enzymů s různě dlouhými primárními řetězci. Nejznámější zástupce TjL je posttranslačně modifikován o 2 AMK na C-konci a 11 AMK na N-konci (Ito et al. 1999). Ostatní i-lysozymy jsou aktivovány proteolytickým odštěpením N-koncových úseků z jejich sekretované inaktivní pro-formy (Olsen et al. 2003; Bachali et al. 2004; Paskewitz et al. 2008). Srovnání základních vlastností vyplývajících z primární struktury nedůležitějších zástupců jednotlivých typů lysozymů je uvedeno v tabulce 2. Tabulka 2.: Charakteristiky základních zástupců jednotlivých typů lysozymů. Délka proteinu, délka vypočtené signální sekvence, vypočtená molekulová hmotnost (MW), vypočítaný izoelektrický bod a počet cysteinových (Cys) zbytků. Hodnoty jsou uvedeny pro maturovaný protein. Převzato a upraveno z Callewaert & Michiels (2010). Lysozym Délka (AMK) Délka odštěpované sekvence (AMK) MW (Da) Vypočítaný izoelektrický bod Počet Cys HEWL GEWL TjL Přes značné rozdíly v primárních sekvencích mají všechny lysozymy společnou silně konzervovanou trojrozměrnou strukturu. Základní stavbu tvoří dvě oddělené domény. Jedna je složena především z α-helixů, druhá je formovaná několika β-listy. Obě tyto domény mezi sebou utváří jakési kleště kolem katalytického místa, v jehož centru je skryta 22

30 aktivní AMK Glu. Zástupci c-lysozymů a i-lysozymů mají v aktivním místě ještě AMK Asp (Phillips 1966; Weaver et al. 1995; Goto et al. 2007). Porovnání terciární struktury významných zástupců jednotlivých typů lysozymů je uvedeno na obrázku 5. Obrázek 5.: 3D struktura lysozymů. Richardsonovy diagramy 3D struktury HEWL (A), GEWL (B) a dimeru TjL (C) s odpovídajícím molekulovým modelem (D), (E) a zobrazením monomeru TjL (F). Orientace Richardsonových diagramů je totožná s orientací modelů. Spirální struktury představují α-helixy a šipky znázorňují β-listy. Červeně jsou znázorněné katalytické zbytky Glu, zeleně Asp a fialově jsou znázorněné dimerizační zbytky TjL (C). Převzato a upraveno z Callewaert & Michiels (2010). Esenciální pro řádnou funkci lysozymů po zaujetí terciární struktury molekuly jsou disulfidické můstky mezi dvěma atomy Cys. Tyto můstky mají především stabilizující charakter, a nijak nepřispívají tvorbě základní trojrozměrné struktury (Touch et al. 2004; Kawamura et al. 2008). Jednotlivé typy lysozymů se počtem disulfidických můstků značně liší. Nejvíce konzervované jsou 4 vazby mezi 8 molekulami Cys u c-lysozymů. Redukce těchto 4 disulfidických můstků vede ke značnému poklesu lysozymové enzymatické aktivity (Proctor & Cunningham 1988; Touch et al. 2004). Přítomnost a funkce Cys v g-lysozymech se značně liší dle organizmu, ze kterého pochází. Ptáci a savci spolu sdílí jednu intramolekulární konzervovanou dvojici mezi 4 atomy Cys (Thammasirirak et al. 2002; Pooart et al. 2004; Irwin & Gong 2003). Savčí molekuly ve své struktuře nesou až 23

31 3 další Cys zbytky. Jedna dvojice bývá schopna utvořit intramolekulární vazbu. Zbylá molekula je na povrchu umístěna tak, že dokáže poskytnout jeden mezimolekulární disulfidický můstek v dimeru g-lysozymů, či při interakci s jiným proteinem (Irwin & Gong 2003). Rybí g-lysozymy obsahem Cys značně varírují: platýs a kanic nemá žádné (Hikima et al. 2001; Yin et al. 2003), jeden mají kapr a losos (Savan et al. 2003; Kyomuhendo et al. 2007) a dva jsou ve struktuře molekul g-lysozymu dania (Irwin & Gong 2003). Při přítomnosti dvojice molekul Cys nedochází k jejich intramolekulární interakci (Irwin & Gong 2003). Lysozymy typu-g z bezobratlých organizmů kódují 6 až 16 molekul Cys, schopných i intramolekulárních interakcí (Nilsen et al. 2003; Zhao et al. 2007). Lysozymy typu-i jsou typické velkým obsahem Cys až do 14 atomů, jako v molekule TjL. Většina z těchto Cys tvoří intramolekulární vazby (Goto et al. 2007), chránící terciární strukturu před vysokou osmolaritou solného vodního prostředí (Ito et al. 1999). Zbylé jsou důležité pro mezimolekulární interakce pomáhající tvořit dimery. TjL se za nízkých koncentrací soli vyskytuje nejčastěji ve formě homodimeru dvou molekul spojených přes α-helix 6 (Goto et al. 2007). Během zvyšující se koncentrace solí až do 500 mm NaCl se dimery s nižší bakteriolytickou aktivitou postupně rozpadají na vysoce aktivní monomery i-lysozymu (Olsen et al. 2003; Xue et al. 2004, 2007). Jde o jednoduchý mechanizmus regulace aktivity ve slaném vodním prostředí. Během poškození tkáně může takto dojít k rychlé reakci na vniknutí vody s bakteriemi do organizmu. Zda jsou intramolekulární a mezimolekulární disulfidické můstky nezbytné pro správnou enzymatickou funkci i-lysozymů, zatím není úplně jasné (Goto et al. 2007) Biologické funkce lysozymů Většina organizmů, u nichž byly geny pro lysozymy objeveny, tvoří více typů najednou. Některé typy lysozymů jsou živočichy tvořeny i v různých varietách, s lehce rozdílnými vlastnostmi. Takto široké spektrum lysozymů předurčuje jejich využití při různých funkcích organizmu. Některé z těchto funkcí jsou prozkoumány detailně, jako například bakteriolytické působení, jiné, kupříkladu chitinázová aktivita, nejsou dosud podrobně známy. Biologická funkce lysozymů se dá poměrně dobře odvodit od jejich genové regulace a funkční adaptace konkrétního enzymu. Živočichové majoritně využívají nejprozkoumanějších bakteriolytických vlastností lysozymů. Staví na jejich působení svoji nespecifickou imunitu. Antibakteriální lysozymy jsou proto nejčastěji produkovány v tkáních a tekutinách přímo vystavených vnějšímu prostředí, kde slouží k přímé likvidaci 24

32 bakterií a zabraňují vzniku infekce. Adaptací lysozymů pro toto prostředí je neutrální ph optimum katalytického působení a hodnota pi od 8,0 výše. Jejich produkce navíc bývá indukována bezprostřední přítomností bakterií. Pomalá evoluce vedla i k využívání lysozymů během trávicího procesu. Tyto enzymy byly adaptovány nehostinnému kyselému působení trávící soustavy zvýšenou přítomností D-AMK. Jsou tak odolnější i vůči proteázám v trávicí soustavě. Vývojové změny měly za následek pokles aktivity lysozymů (Callewaert & Michiels 2010). Vzhledem k podobnosti struktury chitinu a peptidoglykanu byla u HEWL pozorována i slabá chitinázová aktivita (Voet & Voet 2004). Mimo tuto sekundární enzymatickou aktivitu byla objevena ještě isopeptidázová funkce některých i-lysozymů (Zavalova et al. 2000; Takeshita et al. 2003). Antibakteriální aktivita Lysozymy jsou důležité hlavně proto, že dokážou katalyzovat hydrolytické štěpení peptidoglykanu, jak je znázorněno na obrázku 6 na následující straně. Peptidoglykan je základní konstrukční kámen bakteriálních buněčných stěn. Díky své pevnosti zvyšuje odolnost vůči buněčnému turgoru. Ztráta integrity peptidoglykanové vrstvy vede k bezprostřední rychlé buněčné lyzi následované nevyhnutelnou buněčnou smrtí. Podle organizace buněčné stěny jsou bakterie rozděleny do dvou základních kategorií, jak je uvedeno na obrázku 7 na další straně. Gram-pozitivní (G + ) vystavují svůj povrchový peptidoglykan přímému kontaktu s okolním prostředím. Je proto snáze dostupný působení lysozymu. Gram-negativní (G - ) bakterie oproti tomu budují nad vrstvou peptidoglykanu ještě další vnější membránu z lipopolysacharidů, které tvoří bariéru vůči lysozymovému působení (Masschalck & Michiels 2003). Membrána z lipopolysacharidů je substrátem pro lactoferrin, defensiny aj., které tvoří další složky nespecifické imunity (Boman 1998; Bulet et al. 1999; Vollmer 2008). HEWL nenapadá bakteriální stěny pouze enzymatickým štěpením peptidoglykanu. Molekula tohoto proteinu se dokáže navázat přímo na bakteriální buněčnou stěnu či cytoplazmatickou membránu, a tím vyvolat neenzymatickou buněčnou lyzí (Laible & Germaine 1985; Ibrahim et al. 2001; Masschalck et al. 2002). Různé druhy lysozymů se poměrně liší svými bakteriolytickými schopnostmi jak vůči G +, tak vůči G - bakteriím. Překvapivě jedny z bakteriolyticky nejúčinnějších forem enzymů produkují ryby a mořské 25

33 organizmy (Abraham et al. 1995; Hikima et al. 2001, 2003; Grinde 1988, 1989; Dautigny et al. 1991). Obrázek 6.: Mechanizmus účinku lysozymu. Navázáním substrátu je protonizována 4-OH skupina NAG a je odstraněna pomocí COOH skupiny Glu-35 (donor protonů během katalýzy). Pak dochází ke vzniku meziproduktu (INT). Ve skutečnosti je přítomna jen jedna z přerušovaných exo (x) a endo (n) vazeb INT, a to je podstata mechanizmu. Reakce může probíhat dvěma mechanizmy: (i) n-vazba chybí, (ii) x-vazba chybí (SN1 mechanizmus). Na schématu (i) Asp-52 (stabilizuje tranzitní oxoniový stav) zahajuje první krok jako nukleofil (mechanizmus SN2) a vzniká INT glykosyl-enzym. Ve druhém kroku je tento komplex nahrazen molekulou vody. Skupiny enzymu jsou obarveny zeleně, elektronové přesuny, vazby vytvářející klíč a náboje červeně, atak vody na INT modře. Převzato z Kirby (2001). Obrázek 7.: Porovnání struktury buněčné stěny G + (A) a G - (B) bakterie. G + bakteriální stěna dosahuje tloušťky asi 25 nm. G - bakteriální stěna je tenčí (asi 3 nm), je navíc obklopena vnější buněčnou membránou z lipopolysacharidů. Převzato a upraveno z Callewaert & Michiels (2010). 26

34 Lysozymová nespecifická imunita Bylo již zmíněno výše, že antibakteriální aktivita lysozymu je základním kamenem živočišné nespecifické imunity. Imunitní systém částečně založený na lysozymové reakci mají již bezobratlé organizmy. Ty postrádají složité mechanizmy adaptivní imunity obratlovců, což však neznamená, že by jejich imunitní systém nebyl účinný. Tvorba lysozymů se značně liší v závislosti na druhu a na vývojovém stádiu organizmu. Kmeny hlístice (Nematoda) a mlži (Molusca) například nejčastěji využívají k obraně silné i-lysozymy (Nilsen et al. 1999; McHenery et al. 1986), které jsou pro životaschopnost organizmu mnohdy esenciální. Háďátko (Nematoda) Caenorhabditis elegans bez i-lysozymu není schopné přežít bakteriální infekce (Mallo et al. 2002; O Rourke et al. 2008). Mlž Chlamys farreri brání své tělo i nově objeveným g-lysozymem v žábrách a hemocytech, které jsou zodpovědné za přímou likvidaci bakterií po fagocytóze (Callewaert & Michiels 2010). Jedna z reakcí imunitního systému hmyzu je založena na rychlé indukci syntézy potřebných baktericidních látek. Uvolnění těchto látek do hemolymfy živočicha je založeno na kontaktu peptidoglykan recognition protein (PGRP) s fragmentem bakteriálního peptidoglykanu. Vniknutím bakterie do těla živočicha se tak spustí zpětnovazebná produkce obranného c-lysozymu se silným baktericidním působením proti oběma skupinám bakterií (Dziarski & Gupta 2006; Park et al. 2007). Největší množství lysozymů bez přímé bakteriální indukce produkuje hmyz během své proměny mezi jednotlivými stádii. Největší koncentrace dosahuje hemolymfatický lysozym před metamorfózou hmyzu s přeměnou dokonalou (Holometabola) (Daffre et al. 1994; Russel & Dunn 1991; Yu et al. 2002) a během svlékání u hmyzu s přeměnou nedokonalou (Hemimetabola) (Kopáček et al. 1999; Kollien et al. 2003). Nejpřekvapivější je nepřítomnost lysozymů v hmyzích hemocytech, které jsou základní buněčnou složkou imunitního systému (Daffre et al. 1994). Imunita obratlovců je založena na komplexní spolupráci buněčné složky se složkou molekulární. Podstatnou komponentou molekulární nespecifické imunity jsou lysozymy. Přítomnost c-lysozymu můžeme proto detekovat v granulách neutrofilních granulocytů a makrofágů, v slzách, slinách, mléku, moči, séru a v dalších tekutinách zvlhčujících například dýchací cesty, trávicí trakt aj. (Brouwer et al. 1984; Cole et al. 2002; Song & Hou 2003; Dommett et al. 2005; Sariri & Ghafoori 2008). Účinnost bakteriolytického 27

35 působení těchto lysozymů se liší v závislosti na složení obklopujících tekutin. Při změně fyziologických podmínek totiž dochází k rapidnímu poklesu jejich katalytických schopností (Deckers et al. 2008; Cole et al. 2002). Nejdůležitější roli hrají lysozymy v obranyschopnosti ryb. Ty produkují ve značném množství g- a c-lysozymy. Obě skupiny vykazují poměrně silnou bakteriolytickou aktivitu v porovnání například s HEWL (Hikima et al. 2001; Grinde 1988, 1989; Dautigny et al. 1991). Jedná se nejspíše o adaptaci celého imunitního systému na bakterie bohaté vodní prostředí (Hikima et al. 2001). Jako hlavní obranný mechanizmus proti bakteriím jsou lysozymy hojně obsaženy ve vaječném bílku plazů a ptáků. U plazů se zatím jejich přítomnost v jiných tkáních nepotvrdila (Thammasirirak et al. 2006). Stanovit převládající typ lysozymu u ptáků se jeví jako nemožné. Poměry a přítomnost g- a c-lysozymů se liší jak mezidruhově, tak dokonce v závislosti na vývojovém stádiu ptáka (Simpson et al. 1980; Nakano & Graf 1991; Jollés et al. 1977). Kuře má 8 dní po vylíhnutí ve svém traktu převládající přítomnost vaječného c-lysozymu (HEWL), který je časem nahrazen typem-g (Nile et al. 2004). Savci mají imunitu na přítomnosti lysozymů přímo závislou. Není využívána pouze jejich baktericidní schopnost. Lysozymy jsou s to přizpůsobovat vnitřní prostředí celého organizmu. Rozštěpením bakteriálního peptidoglykanu nepřímo spouští zánětlivou imunitní reakci. Probíhající bouřlivou reakci nejspíše dokážou i zpětně regulovat. Byly vypozorovány protizánětlivé vlastnosti HEWL, což z lysozymů rázem dělá imunoregulátory (Lee et al. 2009). Vývoj imunitního systému v souvislosti s přítomností lysozymu je prezentován i na prasatech kojených mlékem transgenních koz s lidským lysozymem. Tato prasata měla v pozdějším věku úplně jiné složení střevní mikroflóry. Změnila se hlavně jejich náchylnost k prasečí enteropatogenní Escherichia coli (Maga et al. 2006; Brundige et al. 2008). Správně pracující savčí imunita potřebuje ke své funkci všechny formy přítomných lysozymů přesto, že se jejich funkce překrývají (Ganz et al. 2003; Shimada et al. 2008). Například myš produkuje dva subtypy lysozymu typu-c. Jeden je označován jako P lysozym a je přítomný hlavně v zažívacím traktu. Druhý, označovaný jako M, produkují leukocyty a epiteliální buňky (Cross et al. 1988; Obita et al. 2003; Markart et al. 2004a, 2004b). Oba subtypy c-lysozymu mají srovnatelnou účinnost vůči G +, proti G - bakteriím se jeví lysozym M účinnější (Markart et al. 2004a). Přesto je při nedostatku jednoho či druhého myš náchylnější ke specifickým patogenům v částech těla, kde nastává nedostatek přirozeně převažujícího subtypu (Ganz et al. 2003; Shimada et al. 2008; Cole et al. 2005). 28

36 Lysozymy jako trávicí enzymy Během evolučního vývoje začali některé organizmy využívat všudypřítomné bakterie jako potravního zdroje. Pro takto specifickou funkci si přizpůsobili některé zástupce svých lysozymů. Trávicí lysozymy, jak jsou dnes označovány, prošly značnými úpravami, které vedly až k poklesu jejich aktivity. AMK labilní v kyselém prostředí byly nahrazeny stabilnějšími (Prager & Jollés 1996), čímž získal i celkový povrch enzymu negativní náboj (Nonaka et al. 2009). Optimální ph pro aktivitu lysozymů se posunulo z neutrálního na kyselé a pokleslo i jejich pi (Prager & Jollés 1996). AMK vazby náchylné vůči působení proteáz byly nahrazeny, aby nedocházelo k předčasné destrukci aktivního enzymu (Nonaka et al. 2009). Zatímco využití lysozymů k trávení bakterií se předpokládalo u obratlovců již před 25 lety, u bezobratlých organizmů se studuje krátkou dobu (Fujita 2004). Těmto úpravám a využití se nevyhnula žádná rodina lysozymů adaptovaných k trávení, včetně neobvyklého i-lysozymu (Nilsen et al. 1999; Bachali et al. 2002; Takeshita et al. 2004; Matsumoto et al. 2006; Itoh & Takahashi 2007; Xue et al. 2007). Lysozymy jsou využívány k trávení bakterií pocházejících z nejrůznějších zdrojů. Bakteriolytická aktivita často stoupá v trávicím traktu krátce po příjmu potravy. Takto reagují komáři (DeMaio et al. 1996; Li et al. 2005; Paskewitz et al. 2008) a klíšťák Ornitodoros moubata (Ixodida, Argasidea) po nasátí krve bezprostřední produkcí trávicích lysozymů (Kopáček et al. 1999; Grunclová et al. 2003). Tyto enzymy slouží nejspíše k trávení bakterií, které rostou v prostředí bohatém na živiny, tedy v nasáté krvi. Během trávení může dojít i k využití možné lysozymové isopeptidázové aktivity, která brání rychlému srážení vysáté krve (Paskewitz et al. 2008). Sestava přítomných lysozymů se liší v závislosti na složení přijímané potravy. Pokud je komárům změněna krvavá dieta na nektar, dojde k výměně trávících lysozymů z typu-i na typ-c, který je analogický trávicím lysozymům larev Drosophila melanogaster (Diptera) (Kang et al. 1996). Ty se živí především saprofágně, stejně jako larvy mušek Musca domestica (Diptera). Touto potravní strategií dostávají do svého trávicího ústrojí množství bakterií, které mohou být využity jako další zdroj potřebných látek (Terra 1990). Složení jednotlivých trávicích lysozymů se mění v závislosti na zdrojích potravy a vývojovém stádiu mušky (Daffre et al. 1994; Hultmark 1996; Regel et al. 1998). Přítomnost trávicích lysozymů byla prokázána i v trávicím traktu synantropních roztočů. Jejich kolonie pěstované na bakteriemi obohacené potravě vykazují mnohem větší vitalitu, než kolonie bez bakterií (Erban 29

37 & Hubert 2008). Specializace na trávení bakterií se nevyhnula ani sociálnímu hmyzu. Termiti si tímto způsobem dopomáhají k dostatku dusíku, na který je jejich přirozená potrava poměrně chudá. Předávají si mezi sebou symbiotické bakterie, které váží vzdušný dusík a po strávení jsou tedy jeho bohatým zdrojem (Tayasu et al. 1997; Fujita et al. 2001). Obratlovci nejsou za normálních okolností schopni trávit všudypřítomnou celulózu. Přitom se jedná o velice bohatý zdroj energie a biogenních prvků. Přesto jsou skupiny živočichů, jež se přizpůsobily získávání energie spásáním rostlin. Nejvýznamnější jsou zástupci přežvýkavců (Ruminantia) (Dobson et al. 1984), králíků (Leporidae) (Camara & Prieur 1984; Ito et al. 1994), folivorních (listožravých) opic (Cercopithecidae, Colobinae) (Stewart et al. 1987), a dokonce folivorních ptáků (Opisthocomidae) (Kornegay et al. 1994). Jejich trávicí systém se adaptoval na zpracování rostlinné potravy přítomností symbiotických bakterií. Tyto bakterie fermentují dodanou potravu a štěpí celulózu na jednodušší stravitelné cukry. Část takto získaných jednoduchých cukrů využívají k nárůstu vlastní biomasy. Rozštěpená celulóza a biomasa bakterií je následně využita vlastním hostitelem. K tomu, aby hostitelé získali ze symbiontů ještě více živin, využívají modifikovaný c-lysozym. Většina býložravců tráví bakterie v přední části trávicího traktu (žaludek a proximální část tenkého střeva). Získané složky z potravy a strávené bakterie jsou poté vstřebávány následným průchodem dále (Dobson et al. 1984). Králíci proti tomu mají své symbiotické bakterie usídlené v tlustém střevě, nemůže tedy docházet k dostatečně efektnímu využití všech živin a bakteriální biomasy. Prvně vyloučené částečně natrávené exkrementy jsou znovu pozřeny (koprofágie). Během druhého průchodu trávicí trubicí jsou potřebné složky vstřebány do organizmu (Camara & Prieur 1984). Podle nových poznatků využívají trávicí lysozymy i ryby, které se živí korýši. Nejspíše je nasazují během trávení korýších chitinových krunýřů (Jiménez-Cantizano et al. 2008). Další funkce lysozymů Isopeptidázová aktivita Lysozymy typu-i jsou nejvíce atypickou skupinou lysozymů. Kromě toho, že jejich geny dosud nebyly objeveny ve složitějších organizmech, než jsou někteří zástupci bezobratlých, mají schopnost hydrolyticky poměrně účinně štěpit i isopeptidové vazby mezi γ-carboxamidovou skupinou glutaminu a ε-amino skupinou lysinu (Zavalova et al. 2000; Takeshita et al. 2003). Díky destabilizaci těchto vazeb bývají enzymy katalyzující 30

38 jejich rozpad označovány také jako destabilázy. Hrají poměrně významnou roli v inhibici tvorby krevních sraženin (Takahashi et al. 1986; Baskova & Nikonov 1991; Fradkov et al. 1996; Zavalova et al. 1996). Enzymy s potvrzenou, či předpokládanou isopeptidázovou aktivitou, využívají organizmy živící se krví, aby mohlo vůbec dojít k jejímu nasátí z hostitele. Destabilázy jsou obsažené ve slinných žlázách pijavic (Baskova & Nikonov 1991), lysozymy typu-i jsou detekovány v trávicím traktu komárů po nasátí krve (DeMaio et al. 1996; Li et al. 2005). Lysozymová baktericidní aktivita destabiláz pijavic byla objevena až později (Zavalova et al. 2000). Mechanizmus isopeptidázové aktivity proteinů s destabilázovou doménou (PF05497) zatím není detailně znám. Nicméně její přítomnost byla detekována i v dalších lysozymech typu-i (Takeshita et al. 2003). Chitinolytická aktivita Chitin je spolu s peptidoglykanem a celulózou nejčastější přírodní polymer. Setkáme se s ním ve vnějších kostrách některých bezobratlých živočichů a v buňkách hub. Jeho základní strukturu tvoří opakující se jednotky NAG, který je, jak bylo zmíněno výše, i jedním ze základních kamenů tvořících bakteriální peptidoglykan (Alberts et al. 2002). Díky této podobnosti je chitin stejně vhodným substrátem lysozymu jako peptidoglykan (Voet & Voet 2004). Mechanizmus průběhu hydrolytické štěpné reakce je podobný. Jen jako nukleofilní činidlo je využita cukerná N-acetylová skupina (van Aalten et al. 2001). Předpokládá se, že lysozymy napomáhají ve spolupráci s pravými chitinázami při svlékání exoskeletu hmyzu, korýšů a pavoukovců (Li et al. 2005) Bakteriální obrana proti lysozymu Evoluce je založena z části na hledání nových účinnějších zbraní proti patogenním organizmům a zároveň hledání nových obranných mechanizmů vůči těmto zbraním. Mnohobuněčné organizmy vyvíjejí stále účinnější lysozymy a spolupracující složky imunitního systému. Patogenní bakterie (např. Streptococcus pneumoniae, S. aureus, Listeria monocytogenes, Bacillus anthracis, Neisseria meningitidis, Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori), které jsou životně závislé na napadání jiných organizmů, si během vývoje vytvořily několik základních mechanizmů, kterým se lysozymové aktivitě brání. Převládajícím mechanizmem jsou nezvyklé kovalentní úpravy ve struktuře peptidoglykanu. Nejčastěji se jedná o N-deacetylace, N-glykosylace a O-acetylace, či 31

39 tvorbu vazeb se složkami buněčné stěny, jako je kyselina teichoová (Clarke & Dupont 1992; Raymond et al. 2005; Bera et al. 2007, Vollmer 2008). Tyto úpravy vedou až k vývoji úplné lysozymové rezistence jako u druhů L. monocytogenes a S. aureus (Boneca et al. 2007, Bera et al. 2006). Druhý mechanizmus, který byl doposud objeven pouze u E. coli, je tvorba c-lysozymových inhibitorů z rodiny Ivy a PliC/MliC. Existence inhibitorů lysozymů typu-g a -i zatím nebyla potvrzena, i když je předpokládána (Callewaert et al. 2009; Vanderkelen et al. 2008; Van Herreweghe et al. 2010) Studium lysozymů u roztočů Prvotní objevy roztočových lysozymů se datují již do 50. let 20. století, byly omezeny na skupinu Ixodida (Podboronov et al. 1972; Podboronov 1982, 1983). Detailně charakterizován je lysozym z trávicího systému Ornithodoros moubata (Ixodida, Argasidae), který je ve zvýšené míře tvořen ihned po příjmu potravy. Vykazuje velmi vysokou lytickou aktivitu vůči G + bakterii Micrococcus luteus (syn. M. lysodeikticus). Spojuje v sobě vlastnosti několika dosud známých trávicích lysozymů. Jeho N-koncová sekvence AMK je podobná lysozymům z trávicího systému některých savců a zároveň sdílí motivy specifické pro enzymy některých zástupců dvoukřídlého hmyzu (Kopáček et al. 1999). Prachovým synantropním roztočům z rodu Dermatophagoides je nejbližším příbuzným roztoč Psoroptes ovis (Acari, Acaridida, Psoroptidae) (Stewart & Fisher 1986; Lee et al. 2002; Hamilton et al. 2003). Ten parazituje na ovčí kůži, přičemž podstatnou částí jeho potravy jsou bakterie získávané z povrchu narušené tkáně. Během trávení částečně bakteriální potravy může nejspíše využívat trávících lysozymů (Hogg & Lehane 1999; Hogg & Lehane 2001; Hamilton et al. 2003). Lysozymová aktivita byla identifikovaná v 6 druzích skladištních roztočů Acarus siro, Lepidoglyphus destructor, Glycyphagus domesticus, G. destructor, Rhizoglyphus callae, R. robini a Tyrophagus longior (Childs & Bowman 1981). U 8 druhů synantropních roztočů byla prokázána spojitost přítomnosti bakteriolytické aktivity lysozymu v trávicím traktu se schopností roztočí bakteriofagie (Erban & Hubert 2008). Všechny druhy synantropních roztočů samozřejmě nemají lysozymy stejně účinné. Mezidruhově se velice liší bakteriolytická aktivita enzymů z D. farinae, D. pteronyssinus a L. destructor (Stewart et al. 1998; Mathaba et al. 2002). 32

40 3. Materiál a metodika 3.1. Modelové druhy roztočů Jako modelové organizmy pro práci jsme použili 3 druhy synantropních roztočů. Všechny tři druhy spadají do skupiny Acariformes podřádu Acaridida. Prachoví roztoči Dermatophagoides farinae (Hughes), který bývá v literatuře označován jako americký prachový roztoč a Dermatophagoides pteronyssinus (Trouessart) označovaný za evropského prachového roztoče patří do čeledi Pyroglyphidae. Oba zástupci se v určitém poměru vyskytují ve většině domácností, kde se živí organickými součástmi prachu. Třetím modelovým organizmem je skladištní roztoč z čeledi Glycyphagidae Lepidoglyphus destructor (Schrank), se kterým se můžeme setkat v napadených potravinách i prachu domácností. Všechny tři druhy pochází z kmenů pokusných roztočů chovaných v laboratoři oddělení ochrany zásob VÚRV v.v.i Růstové médium Vzhledem k podobným potřebám všech tří druhů byli roztoči chováni na stejném růstovém médiu. Hlavní složku potravy tvořilo krmivo pro psy (Ontario-pet, Placek, Poděbrady, CZ) a pšeničné klíčky. Tyto složky byly obohaceny sušeným vločkovaným krmivem pro akvarijní rybičky (LonBio, AquaTropicLonsky, Praha, CZ), pangaminem a gelatinem (Serva Electorphoresis GmbH, Heidelberg, DE). Zmíněné složky byly smíchány v poměru 10:10:3:2:1 a namlety najemno. Smíchaná potrava byla následně proseta a sterilizována při 70 C po dobu 30 minut, pro denaturaci enzymové aktivity. Bylo ověřeno, že samotná dieta nevykazovala žádnou bakteriolytickou aktivitu (Erban & Hubert 2008) Chovné boxy a komůrky Chovné podmínky pro dané druhy roztočů byly již dříve optimalizovány. Chovaní roztoči byli umístěni do kultivačních lahví pro tkáňové kultury IWAKI vybavených perforovaným víčkem s papírovým filtrem (P-Lab, Praha, CZ). Do chovných komůrek bylo vloženo růstové médium a kolonie roztočů. Takto připravené chovy jednotlivých druhů byly umístěny v boxech Secador (P-Lab, Praha, CZ), které byly vybaveny teploměry 33

41 a vlhkoměry pro kontrolu fyzikálních podmínek. Relativní vlhkost vzduchu v boxech byla udržována při 25 C na 75 % nasyceným roztokem NaCl (Lach-Ner s.r.o., Neratovice, CZ), či KCl (Penta, Chrudim, CZ). Po celou dobu chovů byly pravidelně každý týden kontrolovány fyzikální podmínky, nárůst kolonií a případné kontaminace chovných prostor. Po dnech byli dostatečně namnožení roztoči odebráni, přečištěni a rychle zamraženi pro pozdější přípravu tělních homogenátů. Pro získání extraktů z exkrementů byli roztoči ponecháni do úplného vymření kolonie a zbytkové růstové médium bylo použito pro extrakci exkrementových proteinů Příprava celotělních homogenátů (WME whole mite extract) Celotělní homogenáty (WME) byly získán pouze z druhů D. farinae a L. destructor. Příprava WME: 0,1 g čištěných těl roztočů bylo homogenizováno v přibližně 3 ml ultračisté vody vychlazené na 0 C s obsahem detergentu (0,1 % w/w TRITON X 100 (Serva Electorphoresis GmbH, Heidelberg, DE)) a inhibitory proteáz (Protease inhibitor mix - Cat No , GE healthcare, Uppsala, S). Potřebné množství vody bylo stanoveno na základě savosti materiálu. Rozpuštěný materiál byl inkubován na ledu po dobu 15 minut. Poté probíhala trojnásobně opakovaná homogenizace pomocí Potter-Elvehjem skleněného homogenizéru (Kavalier, Sázava, CZ). Mezi jednotlivými opakováními byla vždy 5 minutová inkubace na ledu. Získaný homogenát byl přenesen do 15 ml centrifugačních zkumavek typu Falcon (P-Lab, Praha, CZ) a odstřeďován v předchlazené centrifuze po dobu 10 minut při g 4 C (Jouan Industries S.A.S., F). Supernatant byl odebrán bez rozrušení pelety a nasátí hladiny s tukem a kutikulami a následně byl opět centrifugován za stejných podmínek. Postup čištění byl opakován dle potřeby do odstranění všech sedimentárních částic.vyčištěný extrakt byl rozpipetován po 2 ml, či 5 ml do 15 ml zkumavek typu Falcon a lyofilizován pomocí přístroje PowerDry LL3000 (Thermo elektron CZ as., Mukařov, CZ). Získaný extrakt byl posléze uchováván v mrazicím boxu. Jeden alikvot byl rozpuštěn v 1 ml ultračisté vody pro měření obsahu celkových proteinů Příprava homogenátů ze zbytkového růstového média (SGME spent growth medium extract) Extrakt ze zbytkového růstového média (SGME) byl získán následovně: Zbytkové růstové médium z komůrek bylo vsypáno do 500 ml skleněné Erlenmayerovy baňky 34

42 umístěné na ledu. Exktrakce byla provedena ultračistou vodou předchlazenou na 4 C s přidanými inhibitory proteáz. Obsah baňky byl posléze dle potřeby naředěn vodou. Baňka byla poté třepána na ledu na kývačce (Labnet International, Inc., Woodbridge, NJ, USA) po dobu 30 minut. Extrakt byl přenesen do 50 ml centrifugačních zkumavek typu Falcon a stáčen ve vychlazené centrifuze po dobu 10 minut při g 4 C. Postup získání supernatantu je shodný s čistícím postupem WME. Pročištěné extrakty byly rozpipetovány po 20 ml do 50 ml centrifugačních zkumavek a následně lyofilizovány do vysušení. Vysušené vzorky byly uchovávány v mrazicím boxu. Jeden alikvot byl rozpuštěn v 1 ml ultračisté vody pro měření proteinů Měření obsahu proteinů Koncentrace proteinů ve všech homogenátech byla změřena pomocí Bradfordovy metody. Do 96 jamkových mikrotitračních destiček bylo pipetováno vždy 50 l extraktu a 250 l Bradfordova činidla (Cat No. B ML Sigma-Aldrich, Sant Louis, USA) ve třech opakováních. Absorbance byla měřena na Elisa-readeru (Thermo Electron Corporation, Shanghai, PRC) při vlnové délce 595 nm. S vysokou spolehlivostí jsme schopni měřit koncentraci proteinů do cca 0,5 mg.ml -1. Při vyšší koncentraci byl měřený vzorek naředěn ultračistou vodou a následně přepočítán Elektroforetické dělení Dvourozměrná (2D) proteinová elektroforéza Metoda isoelektrické fokusace pomocí přístroje Ettan IPGphor 3 (GE healthcare Piscataway NJ, USA) byla v této pilotní studii využita u nás poprvé. Sérií pokusů bylo stanoveno optimální množství 250 µg proteinů na doporučené množství 250 µl rehydratačního pufru (přidáno 0,2 % ph 3 10 amfolytů) (Cat No , GE Healthcare, Uppsala, S), který byl nanášen do 13 cm keramických holderů (Cat No , GE healthcare, Uppsala, S). Celá optimalizace probíhala bez jakékoliv úpravy vzorků. Finální vzorky pro hmotnostní analýzy byly před samotnou IEF ještě přečištěny pomocí 2D Clean-Up kitu (Cat No , GE Healthcare, Piscataway NJ, USA) s následnou kontrolou případné ztráty proteinů během čistícího procesu. Průběh samotné isoelektrické fokusace na 13 cm stripech s rozsahem ph 3 10 (Cat No , GE Healthcare, Uppsala, S) převrstvených minerálním olejem (Cat No , GE healthcare, Uppsala, S) byl nastaven jak je uvedeno v tabulce 3 na následující straně: 35

43 Tabulka 3.: Nastavení programu pro běh IEF. Nastavení kroku programu, zvolené napětí (V) a doba běhu (hod, Vhod). Nastavení Napětí (V) Čas běhu Step hod. Step Vhod. Grad Vhod. Grad Vhod. Step Vhod. Stripy po dokončení programu byly opláchnuty od oleje a ekvilibrovány 15 minut v ekvilibračním roztoku (6 M urea, 2 % SDS, 0,05 M Tris-HCl ph 8.8, 20 % glycerol) s DTT (100 mg/ 10 ml) (Sigma-Aldrich 43817, Sant Louis, USA) a následně dalších 15 minut s iodacetamidem (Sigma-Aldrich 57670, Sant Louis, USA) (400 mg/ 10 ml). Destilovanou vodou opláchnuté stripy byly umístěny na vrchní část gelu pro druhý rozměr SDS-PAGE (sodium dodecylsulfat polyacrylamid gel electrophoresis) Pro separaci vzorků pomocí SDS-PAGE, či pro druhý rozměr byly použity dva různé druhy pufračních systémů pro SDS PAGE. První byl klasický tris-glycinový systém (Laemmli 1970) upravený dle protokolu k dodávanému akrylamidu (Cat No A ML, Sigma-Aldrich). Tris-glycinová elektroforéza s 12% gelem běžela na 50 V přes noc. Druhým systémem byl tris-tricinový pufrační systém pro proteiny menších molekulových hmotností (Schägger 2006). Tris-tricinová elektroforéza s 16% gelem běžela na 80 V přes noc. Proteiny byly následně vizualizovány pomocí coomassie brilliant blue (Cat No , GE Healthcare, Uppsala, S). Jako hmotnostní marker byl použit Full Range Rainbow Marker (Cat No RPN 800 E, GE Healthcare, Uppsala, S). Během optimalizace metody byl pro vizualizaci rozdělených proteinů použit PlusOne Silver Staining Kit (Cat No , GE Healthcare, Piscataway NJ, USA) dle instrukcí od výrobce Western blot Proteiny rozdělené na gelové elektroforéze Mini VE complete (Amersham Bioscience, Piscataway, USA) byly imobilizovány na 0,2 m ECL Hybond 36

44 nitocelulózovou membránu (Cat No. RPN203D, GE Healthcare, Germany). Přenos proteinů pomocí semi dry blotteru TE 77 PWR (GE Healthcare, Piscataway, USA) probíhal v 10 mm ph 11 CAPS pufrovacím systému (Cat No. C G, Sigma-Aldrich Sant Louis, USA) při 0,4 ma/cm 2 po dobu 2 hodin. Během prvních pokusů byla kvalita přenosu kontrolně značena pomocí sypro ruby protein blot stain (Cat No. S-11791, Invitrogen, Eugene, USA) a metoda následně upravena. Membrány byly inaktivovány pomocí 3% roztoku BSA (Cat No , Carl Roth GmbH + Co, KG, Karlsruhe, DE) v PBS po dobu 1 hodiny na kývačce. Poté byly membrány inkubovány na kývačce přes noc v lednici (Liebherr profi-line) s polyklonální králičí protilátkou proti HEWL (Cat No. ABIN116776, Antibodies-online GmbH, Aachen, DE) rozpuštěných v poměru 1:1000 v PBS se 3% BSA). Protilátky byly odmyty (3 5 minut) pomocí PBS s 0,1% w/w obsahem Tween 20 (Serva Electorphoresis GmbH 37470, Heidelberg, DE) (PBST). Následně byly membrány inkubovány na třepačce v chladničce 1 hodinu se sekundárními protilátkami rozředěnými v poměru 1:1000 v PBS se 3 % BSA. Sekundární protilátky s navázanou peroxidázou (Cat No. A6667; Sigma-Aldrich) byly odmyty (5 5 minut) pomocí PBST a následně vizualizovány pomocí TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidin) peroxidázového substrátu (Cat No , KPL, Gaithersburg, USA) dle instrukcí výrobce. Jako pozitivní kontrola reakce byl nanesen vzorek čistého ve vodě rozpuštěného lysozymu ze slepičího vaječného bílku (Sigma-Aldrich Sant Louis, USA) Dot Blot Proteiny WME získaných z druhů L. destructor a D. farinae byly vzhledem k jejich vyšší proteinové koncentraci rozpuštěny v 10 l vody v množství 0,5 5 g. Rozpuštěné vzorky byly nanášeny na nitrocelulózovou membránu. Po zaschnutí nanášek byla membrána následně blokována pomocí 3% roztoku BSA v PBS po dobu 1 hodiny na kývačce. Dále se postupovalo stejně jako u Western blotů. Jako pozitivní kontrola byl použit rozpuštěný lysozym ze slepičího bílku. Proteiny SGME byly rozpuštěny v 10 l vody v množství 1 10 g. Rozpuštěné vzorky o koncentracích proteinů 0,1 g/ l 1 g/ l byly postupně nanášeny na nitrocelulózovou membránu. Dále se postupovalo stejně jako u dot blotů WME a Western blotů. Jako negativní kontrola reakce sekundární protilátky byl použit tentýž vzorek, pouze inkubován bez primární protilátky. 37

45 3.10. Imunolokalizace Pomocí štětečku byly nabrány exkrementy z komůrek a přeneseny na poly-l-lysinová sklíčka pro imunohistologii (Cat No. J2800AMNZ, Thermo scientific, Braunschweig, DE), která byla pokrytá destilovanou vodou. Voda ze sklíček se nechala zaschnout na ploténce (~45 C). Jedna sada vzorků byla vždy ještě na 5 minut překryta 2% H 2 O 2 (Cat No , Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA) v metanolu (Cat No. P717.1, Carl Roth GmbH + Co, KG, Karlsruhe, D) pro inhibici endogenních peroxidáz. Všechna skla byla blokována pomocí normal goat séra (součást kitu HistoMark, Cat No , KPL, Gaithersburg, USA) po dobu 15 minut ve vlhké komůrce. Po odstranění séra byly vzorky převrstveny primární protilátkou zředěnou v poměru 1:400 s PBS se 3 % BSA a inkubovány po dobu 30 minut ve vlhké komůrce. Protilátky byly odmyty trojnásobným oplachem pomocí PBST. Po odstranění oplachovacího pufru byla skla převrstvena sekundární protilátkou a inkubována 30 minut ve vlhké komůrce. Sekundární protilátky byly odmyty trojnásobným oplachem pomocí PBST. Pro sledování skel pod mikroskopem Axioskop (Carl Zeis) vybaveným digitální kamerou Powershot A620 (Canon Inc., Tokyo, J) byly protilátky vizualizovány pomocí TMB peroxidázového substrátu. Jako negativní kontrola reaktivity sekundární protilátky byly použity vzorky bez inkubace s primární protilátkou Analýza proteinů pomocí hmotnostní spektrometrie Nejlepší gely po dvourozměrné elektroforéze byly využity na vyřezání spotů z gelu. Takto získané spoty byly odeslány na PřF UK k servisní analýze na hmotnostním spektrometru. Vzorky získané z gelu barveného coomassie byly nejprve kompletně odbarveny. Imobilizované proteiny byly naštěpeny pomocí trypsinu přes noc. Vzorky s matricí byly vybuzeny pomocí Nd:YAG laseru (355 nm, frekvence 200 Hz). Hmotnostní spektra byla měřena v rozmezí m/z na přístroji 4800 Plus MALDI TOF/TOF (AB Sciex, USA). Získané hmotnostní spektrogramy byly generovány pomocí programu 4000 Series Explorer V (AB Sciex, USA) (nastavení: vyhlazování vypnuto, automatický výběr vrcholů s odstupem signál-šum > 5). Vrcholy nejsilnějšího signálu byly automaticky vybírány pro tandemovou analýzu s kolizní energií 1 kv a s tlakem v kolizní komoře 10-6 Torr. Tandemová spektra byla generována pomocí programu 4000 Series 38

46 Explorer (nastavení: povolena funkce automatického odpočtu základní hladiny (výška vrcholu: 50), povolena funkce Gaussova vyhlazování se sílou filtru: 5, minimální odstup signál-šum 8, lokální šířka okna 250 m/z, minimální síla signálu v celé polovině 2.9 bins, povolena funkce optimalizace signál-šum v lokálního klastru (práh citlivosti 15), povolena funkce značení monoizotopického vrcholu). Získaná spektra byla porovnávána s databází GenBank pomocí programu Mascot v. 2.1 (Matrix Science, USA) (nastavení: enzym trypsin, taxon metazoa, fixní modifikace karbamidomethylace, variabilní modifikace oxidace metioninu, tolerance měření 80 ppm, povoleno jedno vynechané štěpení, tolerance MS/MS 0.3 Da. Uváděny jsou pouze vzorky se signifikantní shodou (p 0.05). Výsledky analýz byly následně převedeny do tabulkové podoby bez hmotnostních spektrogramů, které jsou k dispozici v laboratoři hmotnostní spektrometrie. 39

47 4. Výsledky 4.1. Dot bloty Pomocí metody dot blot byla prokázána reaktivita polyklonální protilátky proti HEWL na nativních proteinových vzorcích. Přítomnost lysozymu, či proteinů se stejným epitopem byla detekována v celotělních homogenátech (WME) (obrázek 8) druhů Lepidoglyphus destructor a Dermatophagoides farinae. Následně byla reaktivita potvrzena i na homogenátech ze zbytkového růstového média (SGME) druhu L. destructor (obrázek 9 na následující straně) a druhů D. farinae a D. pteronyssinus (obrázek 10 na následující straně). Protilátka vykazovala poměrně vysokou afinitu k proteinům v WME i SGME. Její reaktivita v SGME byla detekovatelná již u nanášky 1 µg celkových proteinů u všech pokusů. Největšího vrcholu dosahovala reaktivita již někde mezi 2 a 3 µg celkových proteinů a odtud již dále nestoupala. Obrázek 8.: Dot blot WME Dermatophagoides farinae (DF) a Lepidoglyphus destructor (LD). WME značené polyklonální primární protilátkou a barvené TMB peroxidázovým substrátem. Hodnoty udávají nanášku proteinů. PK - nanáška HEWL. Špatná kvalita snímku je způsobena vypálenou lampou skeneru. 40

48 Obrázek 9.: Dot blot SGME Lepidoglyphus destructor. SGME značené polyklonální primární protilátkou a barvené TMB peroxidázovým substrátem. Hodnoty udávají nanášku proteinů. PK - nanáška HEWL. NK SGME bez primárních protilátek. Obrázek 10.: Dot bloty SGME Dermatophagoides farinae (DF) a D. pteronyssinus (DP). SGME značené polyklonální primární protilátkou a barvené TMB peroxidázovým substrátem. Hodnoty udávají nanášku proteinů. PK - nanáška HEWL. NK - SGME bez primárních protilátek. 41

49 4.2. Western bloty Polyklonální protilátka, jejíž reaktivita byla potvrzena na nativních dot blotech WME D. farinae a L. destructor a SGME všech tří druhů, byla použita i pro lokalizaci rozdělených proteinů WME a SGME pomocí metody western blot. Bloty byly získány jak z jednorozměrné, tak dvourozměrné elektroforézy. Pro jednorozměrnou kontrolu byly odzkoušeny jak redukující, tak neredukující vzorkové pufry. Metoda neposkytla uspokojující výsledky a protilátka nedetekovala přítomnost lysozymu ani v jediném vzorku. Stejných výsledků bylo dosaženo při 4 různých opakováních jak jednorozměrných, tak dvourozměrných blotů. Pro ilustraci je uveden obrázek z jednorozměrného blotu SGME všech tří roztočů za použití redukujícího i neredukujícícho vzorkového pufru (obrázek 11). A B Obrázek 11.: Western bloty SGME L. destructor (LD), D. farinae (DF), D. pteronyssinus (DP). Naneseno bylo 40 µg proteinů SGME. (A) neredukující vzorkový pufr; (B) redukující vzorkový pufr; (M) marker full range rainbow; (PK) nanáška 5 µg HEWL. Pozadí je způsobeno dlouhým působením peroxidázového substrátu. 42

50 4.3. Imunolokalizace lysozymu v exkrementech roztočů Protilátka vykazovala poměrně vysokou reaktivitu vůči nativním proteinům v SGME. Byla proto následně použita pro imunolokalizaci lysozymu v exkrementech všech tří druhů. Přítomnost lysozymu, nebo jeho epitopů, byla potvrzena na povrchu exkrementů D. farinae (obrázek 12), L. destructor (obrázek 13 na str. 44) i D. pteronyssinus (obrázek 14 na str. 45). Nikdy nedošlo k pozitivnímu značení vnitřního obsahu prasklého exkrementu, či povrchu zbytků potravního média. Obrázek 12.: Imunolokalizace lysozymu v exkrementech Dermatophagoides farinae. (A, B) - exkrementy značené anti-lysozym polyklonální protilátkou a barvené TMB peroxidázovým substrátem; (C) kontrola bez primární protilátky; (D) - exkrementy po acidifikaci. Měřítko - 50 µm. 43

51 Obrázek 13.: Imunolokalizace lysozymu v exkrementech Lepidoglyphus destructor. (E, F) - exkrementy značené anti-lysozym polyklonální protilátkou a barvené TMB peroxidázovým substrátem; (G, H) - exkrementy po acidifikaci. Měřítko - 50 µm. 44

52 Obrázek 14.: Imunolokalizace lysozymu v exkrementech Dermatophagoides pteronyssinus. (I, J, L) - exkrementy značené anti-lysozym polyklonální protilátkou a barvené TMB peroxidázovým substrátem; (K) kontrola bez primární protilátky. Měřítko - 50 µm. 45

53 4.4. Dvourozměrné elektroforézy Vzorky proteinových homogenátů WME D. farinae a SGME všech tří druhů obsahujících 250 µg čistých proteinů byly rozděleny pomocí isoelektrické fokusace na dvourozměrné elektroforéze. Pro prvotní hmotnostní analýzy byly vybrány proteiny z WME D. farinae s velikostí mezi kda (obrázek 15 na následující straně). Výsledky potvrdily náš předpoklad o nedostatečnosti podpory synantropních roztočů ze strany databází dosud sekvenovaných proteinů, a bylo identifikováno pouze 7 proteinů: Der f 13, Der f 2, Der f 22, Der f 13 řetězec A, nukleosid difosfát kináza, superoxidbizmutáza a těžký řetězec ferritinu. Následné hmotnostní analýzy byly již prováděny na všech proteinech SGME. Pro ilustraci byl vybrán vždy jeden obrázek gelu pro každý druh, na němž jsou zvýrazněny potvrzené alergeny. Počet všech objevených proteinů z analýz se lišil druhově podle toho, jak je který druh popsán a kolik informací o něm lze nalézt v dostupných proteinových databázích. Nejméně je popsán druh L. destructor. Ve vzorcích tohoto druhu byly s dostatečnou podporou identifikovány tyto alergeny: Lep d 1, Lep d 2 a jejich prekurzory zástupci nejdůležitějších skupin alergenů Grp 1 a Grp 2, a Lep d 13 (fatty acid binding protein) zástupce méně agresivnějších alergenů skupiny Grp 13 (obrázek 16 na str. 48). Ostatní rozpoznané sekvence byly přiřazeny proteinům z jiných organizmů. Druh D. farinae má databáze sekvenovaných proteinů obsáhlejší. Byly u něj identifikovány alergeny: Der f 1, Der f 2, Der f 3, Der f 7 a proteiny popsané jako 98 kda HDM allergen (tedy chitinázy Der f 15). Dalšími identifikovanými proteiny byla cysteinová proteáza tedy další alergen a chymotrypsin (obrázek 17 na str. 49). Nejvíce informací o proteinech lze získat pro druh D. pteronyssinus. Během analýz u něho byly nalezeny tyto alergeny: Der p 1, Der p 2, Der p 3, Der p 13, Der p 15, Der p 18 a Der p 20. Navíc byly identifikovány další alergeny -amylázy, cysteinové proteázy a serinové proteázy podobné trypsinu (obrázek 18 na str. 50). 46

54 Obrázek 15.: 2D elektroforéza celotělních roztočových extraktů (WME) Dermatophagoides farinae. Prvotní gel pro hmotnostní analýzu. Zvýrazněné jsou proteiny: (F) - Der f 13, (M) Der f 2, (O) - Der f 22, (I) Der f 13 - těžký řetězec, (Q) nukleotid difosfát kináza, (E) Superoxid-bizmutáza, (C) Těžký řetězec ferritinu. Ostatní nebylo identifikováno. Tris tricin 16% gel. 47

55 Obrázek 16.: 2D elektroforéza proteinů extrahovaných ze zbytkového růstového média (SGME) Lepidoglyphus destructor. Zvýrazněné jsou alergeny: (A) Lep d 2, (B) Lep d 13 a (C) Lep d 1. Tris tricin 16% gel. 48

56 Obrázek 17.: 2D elektroforéza proteinů extrahovaných ze zbytkového růstového média (SGME) Dermatophagoides farinae. Zvýrazněné jsou alergeny: (A) cysteinové proteázy, (B) Der f 1, (C) Der f 2, (D) Der f 7, (E) Der f 3, (F) Der f 15, (G) chymotripsin. Tris-glycin 12% gel. 49

57 Obrázek 18.: 2D elektroforéza proteinů extrahovaných ze zbytkového růstového média (SGME) D. pteronissynus. Zvýrazněné jsou: (A) Der p 2, (B) Der p 13, (C) - cysteinové proteázy, (D) Der p 1, (E) - Der p 3, (F) trypsinu podobná serinová proteáza, (G) prekurzory alergenu Der p 1, (H) Der p 20, (I) Der p 18, (J) -amylázy, (K) Der p 15. Tris-glycin 12% gel. 50