Mikrobiologie ovčích sýrů Bakalářská práce

Transkript

1 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výţivy rostlin Mikrobiologie ovčích sýrů Bakalářská práce Vedoucí práce: Ing. Libor Kalhotka, Ph.D. Vypracovala: Eva Doleţalová Brno 2011

2 ZADÁNÍ BAKALÁŘSKÉ PRÁCE

3 PODĚKOVÁNÍ Děkuji Ing. Liborovi Kalhotkovi PhD. za odborné vedení a cenné rady při tvorbě bakalářské práce i při mikrobiologických rozborech. Můj velký dík patří téţ rodině a blízkým za psychickou i finanční podporu během celého studia.

4 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, ţe jsem bakalářskou práci na téma Mikrobiologie ovčích sýrů vypracovala samostatně a pouţila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloţeném seznamu citované literatury. Bakalářská práce je školním dílem a můţe být pouţita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne... podpis bakaláře

5 ABSTRAKT Bakalářská práce pojednává o mikrobiologii ovčích sýrů. Jsou zde charakterizovány vybrané skupiny mikroorganismů ţádoucí i neţádoucí, a boj proti nim. Vybrané skupiny mikroorganismů celkový počet mikroorganismů, bakterie mléčného kysání, psychrotrofní mikroorganismy, koliformní bakterie, enterokoky a plísně a kvasinky, byly stanoveny kultivačními metodami ve vzorcích ovčích sýrů. Výsledky jsou shrnuty ve výsledcích a závěru. Klíčová slova: mikroorganismy, mléko, sýr, plísně, kvasinky ABSTRACT The bachelor s work deals with sheep cheese microbiology. They are characterized by a selected group of microorganisms - both desirable and undesirable, and the fight against them. Selected groups of microorganisms - the total number of microorganisms, lactic acid bacteria, psychrotrophic microorganisms, coliform bacteria, enterococci and moulds and yeasts were identified by cultivation methods in samples of sheep cheese. The results are summarized in the chapter The Results and the Conclusion. Keywords: microorganisms, milk, cheese, moulds, yeasts

6 OBSAH 1 ÚVOD CÍL PRÁCE LITERÁRNÍ PŘEHLED Historie sýrařství Ovčí mléko Ovce Vlastnosti mléka Sloţení ovčího mléka Rozdělení sýrů Výroba sýrů Produkty z ovčího mléka Ovčí hrudkový sýr Oštiepky a parenice Bryndza Mikroorganismy Mikroorganismy v mlékárenské výrobě Čisté mlékařské kultury Mikroorganismy zúčastňující se zrání sýrů Neţádoucí mikroorganismy Bakterie Plísně Kvasinky Toxiny biogenní aminy a mykotoxiny Vady sýrů Vady sýrů způsobené mikroorganismy Hygiena a sanitace v mlékárnách Příčiny kontaminace syrového mléka Hygiena výroby ovčího mléka a výrobků z něho Sanitace v mlékárnách Boj proti neţádoucím mikroorganismům Mechanické prostředky Fyzikální prostředky... 32

7 3.9.3 Chemické prostředky MATERIÁL A METODIKA Charakteristika materiálu Příprava laboratorních pomůcek Sloţení ţivných půd Úprava vzorku Stanovení mikroorganismů Vyjádření výsledků VÝSLEDKY A DISKUZE ZÁVĚR CITOVANÁ LITERATURA SEZNAM TABULEK, OBRÁZKŮ A GRAFŮ... 52

8 1 ÚVOD Mléko se definuje jako sekret mléčné ţlázy savců, jeho primární funkcí je přirozená výţiva mláďat. Mléko některých zvířat, především krav, buvolů, koz a ovcí, se také vyuţívá pro lidskou spotřebu, a to buď jako takové nebo ve formě řady mléčných výrobků. Mléko je vzhledem ke svému chemickému sloţení vhodným prostředím pro růst a rozvoj mikroorganismů. Bílkoviny mléka jsou zdrojem dusíku, mléčný cukr zdrojem uhlíku a energie. Minerální látky se podílejí na stavbě buněčné hmoty, podílejí se na látkovém metabolismu, osmotickém tlaku, enzymatické činnosti aj. Mikroorganismy, které se nacházejí v mléce podmiňují nejen kvalitu a trvanlivost mléka dodávaného do mlékárny, ale i kvalitu mléčných výrobků z něho vyráběných. Některá odvětví mlékárenského průmyslu, jako sýrařství, jsou přímo závislá na činnosti mikroorganismů. Chuťové vlastnosti sýrů stejně jako všechny změny jednotlivých sloţek mléka jsou vyvolávány enzymatickou činností mikroorganismů. Výroba sýrů je nejstarším odvětvím zpracování mléka. Patří také mezi technologicky nejnáročnější. V podstatě se jedná o koncentraci mléčných bílkovin, které jsou společně s tukem, laktózou a minerálními látkami nejpodstatnějšími sloţkami sýrů. Tyto změny postihují chuť, aroma a konzistenci finálních výrobků. Sýry jsou důleţitým zdrojem pro lidský organismus nepostradatelných bílkovin. Obsahují všechny esenciální aminokyseliny nezbytné pro lidskou výţivu, zvláště lysin, který chybí v rostlinných bílkovinách. Potraviny nesmějí obsahovat mikroorganismy, jejich toxiny a/nebo metabolické produkty, které představují nepřijatelné riziko pro lidské zdraví. Obecnou zásadou je, ţe potravina nesmí být uvedena na trh, není li bezpečná nebo existuje nebezpečí, ţe by mohlo dojít k ohroţení zdraví spotřebitele. Provozovatelé potravinářských podniků jsou povinni potravinu, která není bezpečná, stáhnout z trhu. 8

9 2 CÍL PRÁCE Cílem práce bylo prostudovat literaturu a shrnout poznatky o mikrobiologii ovčích sýrů, charakterizovat ţádoucí a neţádoucí mikroorganismy a charakterizovat opatření v boji proti neţádoucím mikroorganismům. V praktické části stanovit vybrané skupiny mikroorganismů ve vzorcích ovčích sýrů. 9

10 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Historie sýrařství Nejstarší záznam dokumentující vyuţití mléka je let stará mozaika objevená v chrámu v údolí řeky Eufrat nedaleko Babylonu. Znázorňuje muţe, který přelévá mléko do kamenné nádoby (HEREDIA et al., 2009). Kdo a kdy vynalezl sýr, to uţ nikdy přesně nezjistíme. Jedno je ale jisté sýr lidé objevili náhodou, a to ve stejné době, kdy se začali usazovat a domestikovat dobytek (IBURG, 2003). Výroba této dnes tak ceněné potraviny, kterou máme k dispozici v téměř nepřeberném mnoţství druhů, spočívá na třech základních objevech z doby před mnoha tisíci lety, v nezměněné podobě však platí dodnes (TEUBNER, MAIR WALDBURG, 1990). Za prvé je to vyuţití mléka. Více neţ deset tisíc let je pro člověka hlavním zdrojem výţivy, poté co přišel na myšlenku zvířata nejen lovit, ale také je ochočit a vyuţívat pro sebe, dojit a pít jejich mléko, zabíjet je, kdyţ potřeboval maso. Dávné jsou i vědomosti lidí o vlastnostech mléka. Moţná ţe předkládali mléko jako obětinu svým boţstvům a povšimli si, ţe se po nějaké době srazilo bakterie mléčného kysání existovaly vţdy a všude. Vliv teploty při tomto procesu nezůstal lidem dlouho utajen ve vyhřáté jeskyni, blízko ohně, rovněţ v teplejším ročním období se mléko srazilo rychleji neţ v chladu byla to vlastně první zkušenost s výrobní technikou sýra, k níţ se brzy přidruţila další kdyţ se sraţené mléko nechalo ustát, vlhkost se odpařila, sraţenina byla pevnější. Později byl tento proces podporován tím, ţe se sraţené mléko nalilo do košů nebo jiných nádob s otvory a syrovátka se nechala odtéct. Tak vznikla pevná bílá hmota první kyselý sýr, který se dodnes vyrábí podle naprosto stejného principu (TEUBNER, MAIR WALDBURG, 1990). Třetí objev, pokud jde o sýr, je syřidlo. Pravděpodobně nějaký pravěký lovec nalezl v ţaludku skoleného mláděte, které předtím sálo mateřské mléko, bílou hmotu, coţ nebylo nic jiného neţ mléko sraţené kyselinou a syřidlem. Tak přišel na to, ţe obsah ţaludku způsobuje sráţení, a jistě netrvalo dlouho a člověk vyuţil i tuto náhodnou zkušenost ke svému uţitku. Aţ do dnešního dne setrváváme u tohoto optimálního prostředku ke sráţení mléka, ţádný lepší nebyl dosud vynalezen (TEUBNER, MAIR WALDBURG, 1990). 10

11 3.2 Ovčí mléko Ovce (FOX et al., 2004) uvádějí, ţe ovce patří mezi první domestikovaná zvířata. K jejich domestikaci došlo v Přední Asii jiţ cca v 9. tisíciletí před naším letopočtem. Vzhledem ke skutečnosti, ţe ovce patří k relativně nenáročným zvířatům, postupně dochází k rozšiřování jejich chovů v podstatě do všech zeměpisných oblastí, přičemţ na našem území se ovce chovají od cca 9. století (KUCHTÍK, 2007). Ovce se chovají většinou na maso nebo vlnu. Chov ovcí na mléko není tak industrializován jako odvětví chovu krav na mléko. Ovce se stále chovají v horských oblastech, v horách, na náhorních rovinách nebo v relativně suchých oblastech. Na rozdíl od krav lze ovce dojit jen po relativně krátké období v roce a rovněţ výnos je poměrně nízký (CALLEC, 2001). Ovce jsou v současnosti druhým nejrozšířenějším hospodářským zvířetem na světě, nicméně pouze 10 % se jich dojí, kdyţ podíl ovčího mléka na celosvětové produkci mléka činí cca 1,3 % (KUCHTÍK et al., 2011) Vlastnosti mléka Chemické sloţení mléka podmiňuje i jeho další vlastnosti. Jde především o vlastnosti: smyslové barva, vůně, chuť, fyzikální měrná hmotnost (hustota), bod mrznutí, bod varu, refrakce, viskozita, povrchové napětí a elektrická vodivost. Barva ovčího mléka je bílá se slabým odstínem do ţluta. Odstín je výraznější koncem laktace a souvisí s obsahem karotenoidů v mléce. Bílá barva je podmíněná bílkovinami i tukovými kuličkami, mlezivo má barvu ţlutou, u některých ovcí s nádechem do pomerančova aţ hnědavého odstínu, u jiných do šedoţluta. Vůně mléka získaného od ostříhaných ovcí v hygienických speciálních dojírnách je příjemná, specifická. Při dojení v nevyhovujícím prostředí, ve špatně větraných ovčínech, na hluboké podestýlce s mnoţstvím amoniaku a různých pachů mléko tyto pachy přijímá. Chuť ovčího mléka je příjemná, nepatrně sladká, připomíná chuť oříšků. V podmínkách nehygienického dojení a nevyhovujícího ošetření přibírá mléko nejen pachy, ale i jeho chuť se mění, stává se ostřejší, nepříjemnou (KERESTEŠ, 2008). 11

12 Z fyzikálních vlastností se nejčastěji zjišťuje měrná hmotnost. V pokusech v průběhu laktace byly zjištěny hodnoty od 1,049 1,0310 (průměr 1,03675). Měrná hmotnost je závislá na jednotlivých sloţkách mléka, přičemţ tuk jako lehčí ji sniţuje, ostatní sloţky ji zvyšují (KERESTEŠ, 2008). Bod mrznutí je niţší neţ u vody vlivem soli a laktózy. Za základ byla určena hodnota 0,585 C. Bod varu ovčího mléka je 100,2 C. Viskozita je závislá především na obsahu tuku a bílkovin. Čerstvě nadojené mléko má menší viskozitu. Povrchové napětí mléka je menší neţ u vody, pohybuje se od 0,044 0,49 N/m. Z dalších vlastností je důleţitá jeho kyselost. Ovčí mléko má vyšší titrační kyselost neţ kravské pro vyšší obsah bílkovin a fosforečnanů. V pokusech byla zjištěna kyselost od 6,46 SH do 10,20 SH (KERESTEŠ, 2008) Sloţení ovčího mléka Sloţení ovčího mléka závisí zejména na individualitě ovcí, laktačním období, zdravotním stavu, krmení a na jiných vnějších vlivech. Obsah sušiny je v ovčím mléce vyšší neţ v kravském mléce. Její kolísaní souvisí zejména s kolísáním obsahu tuku a bílkovin (GRIEGER, HOLEC, 1990). Mléčný tuk se nachází v ovčím mléce ve formě kuliček, které jsou větší neţ tukové kuličky v kravském mléce. Dosahují průměrně 4 6 μm. Zvýšený obsah kaprinové a kaprylové kyseliny dává tuku z ovčího mléka jeho specifickou vůni. Bílkoviny ovčího mléka tvoří z % kasein. Průměrně 0,9 % tvoří albumin, který se nesráţí ani kyselinami ani syřidlem, a proto přechází při výrobě sýrů z větší části do syrovátky. Při teplotě C se však sráţí ve formě bílých vloček a stává se nerozpustným ve vodě, čehoţ se vyuţívá při výrobě tzv. urdy. V malém mnoţství se v ovčím mléce nachází i globulin a některé dusíkaté nebílkovinné látky. Mléčného cukru se v ovčím mléce nachází méně neţ v kravském, ale má stejné vlastnosti a význam. Přítomnost minerálních látek, zejména vápníku, v ovčím mléce je velmi důleţitá pro sráţení mléka syřidlem. Na konci laktace má mléko sníţenou syřitelnost, protoţe následkem zvýšeného obsahu kaseinu se porušuje rovnováha mezi kaseinem a vápníkem. Při mastitidách je v mléce zvýšený obsah chloridů (GRIEGER, HOLEC, 1990). 12

13 Pokud jde o obsah vitaminů, v ovčím mléce je obsah karotenů niţší, ale obsah vitaminu A vyšší neţ v kravském mléce. Obsah vitaminů B 1 a B 2 se od jejich obsahu v kravském mléce výrazně neliší (GRIEGER, HOLEC, 1990). Ovčí mléko je vzhledem k vysokému obsahu sušiny velmi vhodné pro zpracování na nejrůznější zakysané výrobky (první jogurt v historii byl vyroben právě z ovčího mléka). Ovčí mléko je surovinou pro výrobu bryndzy, parenice, měkkých zrajících sýrů aj. (ZADRAŢIL, 2002). Tab. 1 Sloţení ovčího mléka (PARK et al., 2006) Sloţení (%) Tuk 7,9 TPS 12,0 Laktóza 4,9 Protein 6,2 Kasein 4,2 Albumin, globulin 1,0 3.3 Rozdělení sýrů Podle Vyhlášky 77/2003 Sb. v aktualizovaném znění, která stanovuje poţadavky pro mléko, mléčné výrobky, se sýrem rozumí mléčný výrobek vyrobený vysráţením mléčné bílkoviny z mléka působením syřidla nebo jiných vhodných koagulačních činidel, prokysáním a oddělením podílu syrovátky. Sýry se svým sloţením, hlavně obsahem plnohodnotných bílkovin ţivočišného původu, vysokým obsahem minerálních látek a vitaminů, řadí mezi nejcennější potraviny. Mléko a z něho vyrobené sýry obsahují téměř vše, co lidský organismus potřebuje ke své stavbě a k udrţení ţivota (KNĚZ, SEDLÁČKOVÁ, 1991). Podle způsobu sráţení mléka a dalšího technologického postupu rozdělujeme všechny sýry do tří hlavních skupin: sýry kyselé (tvarohové), sýry sladké (sýřené), sýry tavené (KNĚZ, SEDLÁČKOVÁ, 1991). 13

14 Kyselé sýry jsou nejstarší vyráběné sýry. Lidé jiţ dávno poznali, ţe mléko samovolně kysne a sráţí se v tuhou sraţeninu. Tu je moţné rozdělit na dvě části pevnou, zvanou tvaroh, a tekutou, tzv. syrovátku. Z tvarohu se vyráběly kyselé sýry (tvarůţky, syrečky apod.). Do této skupiny patří i některé čerstvé sýry tvarohové, které se připravují z různě tučného měkkého tvarohu, vyrobeného za malého přídavku syřidla. Sladké sýry (sýřené) vznikaly později a patří k nim většina dnes vyráběných druhů sýrů. U všech druhů sladkých sýrů neprobíhá jen čisté sráţení enzymové (syřidlem), nýbrţ v různém stupni spolupůsobí i vytvářející se kyselina mléčná, která ovlivňuje charakter vzniklé sraţeniny. Sladké a kyselé sýry jsou tzv. sýry přírodní, které jsou základní surovinou k výrobě tavených sýrů. Tavené sýry se vyrábějí z přírodních sýrů a dalších přísad za pouţití vyšších teplot a tavicích solí (emulgačních prostředků) (KNĚZ, SEDLÁČKOVÁ, 1991). Dalšími důleţitými kritérii pro charakteristiku dělení sýrů je obsah sušiny sýrů a obsahu tuku v sušině. Podle obsahu tuku v sušině rozdělujeme sýry takto (v závorce je uveden nejmenší obsah tuku v sušině): vysokotučné (60 % a více), smetanové (50 55 %), plnotučné (45 %), tučné (40 %), třičtvrtětučné (30 %), polotučné (20 %), čtvrttučné (10 %), hubené (méně neţ 10 %) (KNĚZ, SEDLÁČKOVÁ, 1991). Výraz obsah tuku v sušině, zkratka t.v suš., je kontrolní hodnota, která se nemění, i kdyţ sýr vyschne (neúměrně se zvýší jeho obsah sušiny) nebo třeba zvlhne (sníţí se obsah sušiny sýra). Tato hodnota je uváděna na obalech a etiketách a slouţí ke kontrole výrobce, zda nepouţil méně tučné mléko. Čím více tuku sýry obsahují, tím jemnější je jejich chuť a konzistence sýrového těsta (KNĚZ, SEDLÁČKOVÁ, 1991). 14

15 Podle obsahu sušiny rozdělujeme sladké sýry na: sýry měkké obsah vody je vyšší neţ 45 %, nejvyšší obsah sušiny 55 %, sýry tvrdé obsah vody nejvýše 45 %, obsah sušiny 55 % a vyšší (KNĚZ, SEDLÁČKOVÁ, 1991). Rozdělení podle typu mléka Jedná se o pravděpodobně nejjednodušší dělení. Sýry se vyrábějí z mléka kravského, kozího nebo ovčího či z jejich kombinace (CALLEC, 2001). 3.4 Výroba sýrů Mikrobiologická čistota mléka pro výrobu sýrů by měla být co nejlepší. Rozhodující není jen nízký celkový počet zárodků, ale zejména nepřítomnost bakterií máselného kysání, hnilobných a plynotvorných bakterií. Na mikrobiologické čistotě mléka se významně podílí hygiena získávání a ošetřování mléka (SIMEONOVOVÁ et al., 2003). Výroba sýrů můţe zahrnovat mnoho různých kroků, některé jsou nezbytné pro všechny druhy sýrů: sráţení mléka pomocí enzymů nebo kyseliny, odtok syrovátky, přeměna laktózy na kyselinu mléčnou pomocí bakterií mléčného kysání, solení, formování, zrání. Poslední dva kroky jsou typické pro zrající sýry (WALSTRA, 1999). 3.5 Produkty z ovčího mléka Ovčí sýry se rozdělují na sýry: s neformovanou sýřeninou - představitelem je bryndza, s formovanou sýřeninou představiteli jsou na našem trhu oštiepok a parenica, svým charakterem jsou to uzené měkké pařené sýry (KAVINA, 1996). Ovčí mléko je pouţíváno pro výrobu speciálních druhů sýrů v některých částech Evropy např. Roquefort ve Francii, Brinsen v Maďarsku (OKAFOR, 2007). 15

16 Ovčí sýry mají specifickou chuť, velmi odlišnou od sýrů vyrobených z mléka kravského. Rozdíly ve sloţení mezi ovčím a kravským mlékem, především v obsahu tuku a proteinů, jsou hlavními příčinami v rozdílných senzorických vlastnostech (FOX et al., 2004) Ovčí hrudkový sýr Výroba ovčího hrudkového sýra byla zaloţena na empírii a zkušenosti byly přenášeny z pokolení na pokolení. Tato výroba však měla velké nedostatky, především v různé kvalitě výrobků. Částečné zlepšení nastalo po úpravě technologie výroby na jednotný technologický postup, který se skládá z těchto hlavních úkonů: sýření mléka, zpracování sýřeniny, formování hrudky, odkapávání hrudky, formování hrudky, odkapávání hrudky, ukládání na police a zrání, doprava hrudky do brynzárny (GRIEGER, HOLEC, 1990) Oštiepky a parenice Oštiepky a parenice jsou typické slovenské výrobky. Získávají se osobitým výrobním postupem z ovčího mléka přímo na salaši nebo v mlékárně (GRIEGER, HOLEC, 1990). K výrobě oštiepků se pouţívá neodkapaný hrudkový sýr. Mléko se sýří při vyšší teplotě (kolem 35 C). Z rozkrájené hrudky se sýr o velikosti asi 6 krát 6 cm vezme do rukou a opatrně se formuje do tvaru šišky. Takto se zpracuje všechna sýřenina. Při formování šišky se na několik vteřin ponoří do 60 C teplé vody nebo syrovátky (asi 3krát). Tvar a objem se upraví dřevěnou formou (VANĚK, ŠTOLC, 2002). Zpracované oštiepky se ukládají na hodin do studeného převařeného solného roztoku, ve kterém se občas převracejí. Vysolené oštiěpky se utřou, zavěsí se do lýkových závěsů (řemínky nebo polyetylenové závěsy) a suší se hodin. Potom se znovu utřou a vloţí se do nepouţitých závěsů a udí v chladném bezprašném kouři do zlatoţluté aţ červenohnědé barvy. Při uzení je třeba oštiepky pravidelně obracet (VANĚK, ŠTOLC, 2002). 16

17 Technologický postup výroby parenic je aţ po formování stejný jako výroba oštiepků. Zformovaná hrudka se nechá asi 3 dny zrát, aby dobře prokysala a získala správnou konzistenci. Potom se pokrájí na plátky, které se vloţí do vody teplé 70 C. Ve vodě se sýřenina dobře rozmísí, aţ se rozpustí a na deskách se vytahuje na pásy dlouhé 6 7 m a široké 5 6 cm. Pásy se potom 5 10 minut solí v 20% solném roztoku a na desce se z obou stran zavinou, aţ se k sobě přiblíţí. Oba kotouče se potom sváţí řetízky upletenými z tenkých nití sýřeniny a udí se podobně jako oštiepky. Parenica nemá velkou trvanlivost, ale je velmi chutná (GRIEGER, HOLEC, 1990) Bryndza Bryndza jako fermentovaný mléčný produkt, je vydatným zdrojem kvalitních bílkovin, tuků, minerálů a vitaminů B-komplexu (riboflavin, niacin, vitamin B 6, vitamin B 12 ) a bohatého spektra uţitečných mikroorganismů: Lactobacillus brevis, L. collinoides, L. fermentum, L. paracasei, L. buchneri, L. collinoides, L. curvatus, L. delbrueckii, L. acidophilus, L. rhamnosus, L.helveticus, Enterococcus faecium, E. faecalis, E. durans, E. hirae, Lactococcus lactis, Leuconostoc lactis, Galactomyces geotrichum, Kluyveromyces lactis, Mucor circinelloides (KERESTEŠ, 2008). Slovenská bryndza obsahuje aţ 1 miliardu mikroorganismů v 1 gramu se širokým spektrem inhibičních a probiotických účinků, je určitě jedinečným, unikátním a neopakovatelným výrobkem ve světě vůbec (KERESTEŠ, 2008). Technologický postup výroby bryndzy zahrnuje tyto úkony: ošetření a třídění hrudkového sýra, zrání hrudkového sýra, lisování hrudkového sýra, drcení, míchání a solení směsi, mletí směsi, balení bryndzy (GRIEGER, HOLEC, 1990). Druhy bryndzy: ovčí bryndza je vyrobená výlučně z ovčího hrudkového sýra, letná bryndza vyrábí se ze směsi ovčího hrudkového sýra a kravského hrudkového sýra, zimná bryndza se vyrábí ze směsi skladovaného ovčího sýra a kravského hrudkového sýra (KOPÁČEK, 2010). 17

18 Bylo potvrzené a klinicky prokázané, ţe Slovenská bryndza je unikátní, mikrobiální širokospektrální a jinde neopakovatelný přírodní měkký zrající sýr a v tomto vnímaný jako mikrobiální fenomén (KERESTEŠ, 2008). 3.6 Mikroorganismy Mikroorganismy v mlékárenské výrobě Mikroorganismy jsou základní součástí všech přírodních sýrů a hrají důleţitou roli při jejich výrobě a zrání (BERESFOR et al., 2001). Mikroorganismy v sýru lze rozdělit do 2 skupin: záměrně přidané, kontaminanty (MARTH, STEELE, 2001). Mikroorganismy mají v mlékárenském průmyslu mimořádný význam; negativní mikroorganismy syrového mléka jak patogenní, tak technologicky škodlivé, pozitivní vyuţívání ušlechtilých mikroorganismů mlékařských kultur. Tepelným, popř. i jiným ošetřením syrového mléka jako základní suroviny se mléko nejdříve zbaví všech patogenních mikroorganismů a pokud moţno i všech ostatních technologicky škodlivých mikroorganismů. Po této operaci, směřující ke zničení, resp. k potlačení činnosti neţádoucích mikroorganismů, nastupuje operace druhá, při níţ se v hlavních oborech mlékárenské výroby do tepelně ošetřeného mléka vědomě zavádějí mikroorganismy ušlechtilé (TEPLÝ, 1984). Mikroorganismy se dostávají do mléka cestou primární nebo sekundární kontaminace. Primární kontaminaci představuje přestup mikroorganismů ze sekreční tkáně, resp. z vývodných mléčných cest mléčné ţlázy, můţe zde dojít i k ascendentnímu (vzestupnému) vstupu svěračem strukového kanálku. Z alimentárně přenosných patogenů můţe být mléko takto kontaminováno např. druhem Staphylococcus aureus (KOMPRDA, 2000). Zdrojem sekundární kontaminace můţe být vemeno (nemyté, umyté nečistou vodou, utřené nečistou utěrkou), tělo dojnic (při zanedbání hygieny podestýlání), stájové prostředí, ruce a oděv personálu, dojicí zařízení, nádrţe a zařízení na chlazení a uchovávání mléka (KOMPRDA, 2000). 18

19 Mléko je po nadojení vystaveno sekundární kontaminaci (počty somatických buněk, celkové počty mikroorganismů, koliformní bakterie, aj.). Jejími hlavními zdroji jsou znečištěné povrchy mléčné ţlázy i jejího okolí, ruce, oblečení dojičů, prostředí stáje nebo dojírny, dojicí zařízení, voda a také další manipulace s mlékem. V rouně ovcí se zachycují a dlouhodobě uchovávají nečistoty vnějšího prostředí, dochází k pomnoţení mikroorganismů, které mohou následně infikovat mléčnou ţlázu (MALÁ et al., 2009). Mezi faktory ovlivňující růst mikroorganismů patří: vlhkost, obsah soli, ph většina bakterií roste optimálně při neutrálním ph, výjimkou jsou laktobacily, kvasinky a plísně, které dobře rostou při ph 4,5. obsah dusičnanu dusičnan není přidáván vţdy, pouze u některých sýrů solených v nálevu se pouţívá ke kontrole růstu Clostridium tyrobutyricum, oxidačně redukční potenciál (redox potenciál) je míra schopnosti chemické látky ztrácet (oxidace) nebo získávat (redukce) elektrony, teplota zrání (McSWEENEY, 2007) Čisté mlékařské kultury Čisté mlékařské (startovací) kultury (ČMK) jsou popisovány jako specifické bakterie mléčného kysání, které jsou pouţívány k inokulaci mléka a jejich metabolismus vede k charakteristickým mléčným produktům. ČMK jsou v podstatě izolované kultury uţitečných mikroorganismů a neoznačují tedy pouze jejich absolutní druhovou čistotu. Zahrnují jednak klasické přírodní kultury obsahující komplex nedostatečně definované směsi mikroorganismů a jednak dţinové nebo selektované kultury, obsahující jeden nebo více identifikovaných a definovaných rodů, druhů, příp. kmenů mikroorganismů se specificky známými vlastnostmi. Specifická kriteria pro selekci bakterií mléčného kysání včetně rychlosti produkce kyseliny mléčné, jsou pak jejich kapacita pro produkci polysacharidů, jejich limitovaná proteolýza (která by mohla vést i ke vzniku hořkých látek) a jejich produkce aromatických (chuťových) komponent (GAJDŮŠEK, 2002). 19

20 Mikroorganismy zúčastňující se zrání sýrů Zrání sýrů se zúčastňují: zákysové bakterie mléčného kysání, nezákysové bakterie mléčného kysání, propionové bakterie, bakterie sýrového mazu, ušlechtilé plísně, kvasinky (GÖRNER, VALÍK, 2004). Zákysové bakterie Základní úlohou zákysových bakterií při zrání sýrů je produkce kyselin, hlavně kyseliny mléčné z disacharidu mléka, laktózy a jejích sloţek, glukózy a galaktózy. Zákysové bakterie se zúčastňují i vlastního zrání sýrů pomocí jejich proteolytických enzymů při štěpení (GÖRNER, VALÍK, 2004). Podle druhu vyráběných sýrů se pouţívají mezofilní nebo termofilní zákysové kultury nebo oba dva druhy. Mezofilní kultury bakterií mléčného kysání se pouţívají při výrobě sýrů s nízkodohřívanou sýřeninou nebo sýřeninou nedohřívanou. Termofilní zákysové kultury se pouţívají při výrobě sýrů s vysokodohřívanou sýřeninou (GÖRNER, VALÍK, 2004). Sloţkami mezofilních kultur bakterií mléčného kysání bývají nejčastěji druhy rodů Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc a Enterococcus. Termofilní zákysové kultury bývají vícedruhové nebo směsné a jednodruhové. Jsou to jednokmenové nebo vícekmenové druhy Streptococcus thermophilus a termofilní laktobacily L. delbrueckii ssp. delbrueckii, L, delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii ssp. lactis nebo L. helveticus (GÖRNER, VALÍK, 2004). Nezákysové bakterie mléčného kysání Nezákysové bakterie mléčného kysání jsou mezofilní laktobacily a pediokoky. Tvoří značné mnoţství mikrobiální flóry mnohých druhů sýrů v průběhu jejich zrání a obyčejně nejsou sloţkou zákysových kultur. V mléce rostou zpravidla neochotně, a proto se ani nezúčastňují kysání sýrařského mléka (GÖRNER, VALÍK, 2004). 20

21 Laktobacily jsou dělené na tři skupiny: obligátně homofermentativní, fakultativně heterofermentativní, obligátně heterofermentativní. Nezákysové bakterie mléčného kysání nejlépe odpovídají kritériím fakultativně heterofermentativní skupiny. Z druhů mezofilních laktobacilů byly ze sýrů často izolovány L. casei, L. paracasei, L. plantarum, L. rhamnosus a L. curvatus. Z pediokoků byly nejčastěji izolovány P. acidilactici a P. pentosaceus (GÖRNER, VALÍK, 2004). Nezákysové bakterie mléčného kysání, ale i jiné bakterie, především v sýrech vyráběných ze syrového mléka, pocházejí z mléka samotného. V sýrech vyráběných z pasterovaného mléka můţe být jejich zdrojem rekontaminace pasterizovaného mléka z nářadí a zařízení, s kterým pasterované mléko přichází do styku (GÖRNER, VALÍK, 2004). Propionové bakterie Z rodu Propionibacterium jsou to Propionibacterium shermanii a Propionibacterium freudenreichii. Účastní se na tvorbě typických chuťových látek v sýrech ementálského typu a oxid uhličitý vznikající při kvašení tvoří typická oka (ATLAS, 1995). Mazové kultury Z dalších mikroorganismů důleţitých při zrání některých sýrů, třeba uvést Bacterium linens (nově Brevibacterium linens), zvanou bakterie sýrové červeně, která tvoří důleţitou sloţku mikroflóry v mazu měkkých sýrů a kyselých sýrů; působí téţ při zrání plísňových sýrů typu camembertu, kde tvoří na povrchu červenavé skvrny. B. linens je pro svou silnou proteolytickou činnost nezbytná při zrání měkkých sýrů zrajících pod mazem (DOLEŢÁLEK, 1962). Ušlechtilé plísně Plísňové sýry se rozdělují do dvou skupin a to s plísní v těstě a s plísní na povrchu, popř. s plísní v těstě i na povrchu. Oba dva druhy se vyrábějí z mléka zakysaného kulturou Lactococcus lactis a Lactococcus cremoris. V dalším stadiu se naočkují sýry buď zevnitř kulturou Penicillium roqueforti nebo na povrchu kulturou Penicillium camemberti a Penicillium caseicolum (případně obojí) (CEMPÍRKOVÁ et al., 1997). 21

22 Kvasinky Některé kvasinky napomáhají startovacím kulturám svou proteolytickou a lipolytickou aktivitou, tvorbou aroma a účastí v procesu zrání. Pozitivní vliv kvasinek je především při povrchovém zrání sýrů (QUEROL, FLEET, 2006). Nejčastěji se vyskytují kvasinky rodů Candida, Cryptococcus, Debaryomyces, Kluyveromyces, Pichia, Rhodotorula, Saccharomyces, Yarovia a Zygosaccharomyces (GÖRNER, VALÍK, 2004) Neţádoucí mikroorganismy Bakterie Bacillus cereus Je saprofyt, který roste na rozkládajících se zbytcích rostlin v půdě, v hnoji a v krmivech. Z těchto zdrojů jsou kontaminovány cereálie během vegetační doby, nejintenzivněji při sklizni. Ke kontaminaci syrového mléka dochází nejčastěji při dojení ze znečištěných vemen řetězcem postupných kontaminací: půda krmiva zaţívací trakt dojnice hnůj vemeno dojení mléko. Campylobacter ssp. Ke kontaminaci syrového mléka patrně dochází buď nepřímo při dojení fekálním znečištěním z prostředí, nebo přímo z kampylobakteriových zánětů vemene (JIČÍNSKÁ, HAVLOVÁ, 1995). Ačkoli hlavním rezervoárem kampylobakterů jsou zřejmě chovy jatečné drůbeţe, většina epidemiologicky charakterizovaných kampylobakteriových enteritid byla způsobena syrovým nebo málo pasterovaným mlékem nebo jen šetrně tepelně ošetřenými výrobky (KALHOTKA, 2009). Clostridium botulinum Vyskytuje se v lesní, polní i neobdělané půdě, v bahnité vodě, v bahně, v mokrých, zahnívajících krmivech (mokré seno), na povrchu listů, zeleniny a plodů. Normálně není přítomen ve střevním traktu člověka a hospodářských zvířat (JIČÍNSKÁ, HAVLOVÁ,1995). 22

23 Clostridium perfringens Je rozšířen ve stejných lokalitách jako C. botulinum, ale na rozdíl od C. botulinum (a většiny jiných klostridií) je to kohabitant ve střevech člověka i hospodářských zvířat a vyskytuje se tedy i ve stolici a ve hnoji. Escherichia coli Je součástí normální střevní mikroflóry člověka a teplokrevných zvířat. Protoţe hlavním rezervoárem E. coli v prostředí prvovýroby je zaţívací trakt a stolice hospodářských zvířat, je E. coli v prvovýrobě a v mlékárenském prostředí povaţována za součást mikroflóry prostředí. Její přítomnost v provozech, v mléce i v mléčných výrobcích se pokládá za celkem neškodný indikátor fekálního znečištění, tedy za ukazatel špatné úrovně hygieny a sanitačního reţimu (JIČÍNSKÁ, HAVLOVÁ, 1995). Listeria monocytogenes Byla izolována z vegetace, z vodních zdrojů, z odpadních vod, z půdy, hnoje, krmiv. Nedostatečně prokysané siláţe jsou vhodným médiem pro pomnoţení listeriií a jsou povaţovány za nejdůleţitější zdroj infekce hospodářských zvířat a s tím spojené kontaminace mléka. Méně časté je vylučování listerií do mléka při chronických mastitidách. Salmonella ssp. Rezervoárem salmonelové kontaminace mléka v prvovýrobě jsou zvířecí bacilonosiči hospodářská i volně ţijící zvířata a ptáci méně často lidé. K přímému vylučování salmonel do mléka můţe docházet při (nepříliš častých) salmonelových mastitidách (JIČÍNSKÁ, HAVLOVÁ, 1995). Shigella ssp. Shigely mohou být přítomny v případě fekálního znečištění potravin a vody. Do potravin se vţdy dostávají sekundárně. Zkvašují sice glukózu, ale bez tvorby plynu (KLABAN, 2005). Staphylococcus aureus Je v sýrech častěji zjišťován neţ ostatní patogeny. Příčinou je častý výskyt stafylokokových mastitid dojnic a moţnost kontaminace mléka pracovníky mlékáren. Stafylokoky se rozmnoţují v počátečních stadiích sýření, kdy ph nedosahuje nízkých 23

24 hodnot. V pozdějším stadiu a během dalšího zpracování a zrání sýrů dochází k zastavení růstu a produkce enterotoxinu a postupnému hynutí buněk (LUKÁŠOVÁ, 2001). Yersinia enterocolitica Je rozšířena v přírodních lokalitách i ve vodě. Byla izolována z různých volně ţijících druhů savců i z hospodářských zvířat, která nejevila známky onemocnění. Nejčastější příčinou přenosu yersinií do mléka je zřejmě fekální znečištění při dojení nebo voda, pouţívaná k mytí dojicích aparátů a zařízení v mléčnicích (JIČÍNSKÁ, HAVLOVÁ, 1995) Plísně Vzdušné plísně, nebo spóry plísní jsou všudypřítomné, ale k vyklíčení potřebují kyslík. Nejčastěji se vyskytují Penicillium ssp., Cladosporium ssp., Aspergillus, Fusarium, Scopulariopsis a Verticillium (MARTH, STEELE, 2001). Dalším nebezpečím zracích sklepů jsou plísně. Především Mucor a Rhizopus, které mohou způsobit černání sýrů (DRAGOUNOVÁ, 2003) Kvasinky Některé kvasinky jsou uţitečné, dokonce nepostradatelné mikroorganismy při zrání některých sýrů, u jiných jsou neţádoucí (GÖRNER, VALÍK, 2004). Růst kvasinek na povrchu sýra není překvapivý vzhledem k nízkému ph, relativně nízké vlhkosti, nízké teplotě skladování a vysokému obsahu soli na povrchu sýra (FOX, et al, 2004). Významným zdrojem kontaminujících kvasinek jsou solné koupele. Po solení sýrů v solných koupelích se povrch sýru musí osušit. Vlhké sýry podporují růst kontaminujících kvasinek pocházejících ze solných koupelí (GÖRNER, VALÍK, 2004). Nejčastěji se vyskytují Candida, Debaryomyces, Geotrichum, Torulaspora a Yarrowia (FOX et al., 2004) Toxiny biogenní aminy a mykotoxiny Obě třídy sloučenin jsou přítomny v sýrech a vznikají v důsledku činnosti mikroorganismů, hub a bakterií, v surovém materiálu pouţitém při výrobě sýrů nebo při výrobě, skladování a procesu zrání (FOX et al., 2004) 24

25 Biogenní aminy V sýru jsou biogenní aminy produkovány při dekarboxylaci aminokyselin v průběhu zrání. Hlavní biogenní aminy detekované v sýrech jsou histamin, tyramin, tryptamin, putrescin, kadaverin a fenylehylamin. Poţití biogenních aminů obsaţených v potravině můţe způsobit neţádoucí toxické účinky (FOX et al., 2004). Mykotoxiny Mykotoxiny jsou sekundární metabolity plísní, jsou vylučovány do prostředí a při konzumaci zvířaty nebo člověkem mohou způsobit onemocnění. Mezi nejčastější producenty mykotoxinů patří rody Aspergillus, Fusarium a Penicillium. Mykotoxiny se mohou v mléce a mléčných výrobcích vyskytnout nepřímým přenosem z krmiv nebo přímým přenosem, tj. růstem plísní na mléčných výrobcích (FRATAMICO et al., 2005). Sýry jsou optimálním substrátem pro růst plísní a produkci mykotoxinů. I sotva viditelný porost divoké plísně můţe mít za následek značnou tvorbu toxinů (GÖRNER, VALÍK, 2004). Tab. 2 Výskyt významných mykotoxinů (MALÍŘ, OSTRÝ, 2003) Mykotoxiny Aflatoxin M 1 Kyselina cyklopiazonová Potravina sýry sýry camembertského typu, měkké plísňové sýry francouzského typu, gouda, čedar, mléko ovcí (pouze experimentálně) Stanovené koncentrace jednotky aţ desítky µg/kg jednotky µg/kg aţ stovky µg/kg 3.7 Vady sýrů K nejčastějším příčinám vad sýrů je moţno zařadit: nevhodnou jakost zpracovaného mléka, nedodrţení technologických postupů, pouţívání nekvalitních přísad, nedodrţení zásad hygieny (GRIEGER, HOLEC, 1990). 25

26 Jakost mléka můţe být narušena mikrobiologicky (např. vysokým počtem sporulujících mikroorganismů), fyzikálně chemicky (např. kyselostí niţší neţ 6,0 SH), organolepticky (např. hnilobnou vůní). Nedodrţení technologických postupů je při výrobě sýrů velmi závaţnou příčinou vad, protoţe ve většině případů je technologie výroby sloţitá a chyba jednoho úseku se přenáší nebo znásobuje na dalších úsecích. Přísady mají významnou úlohu při tvorbě typických vlastností sýrů (GRIEGER, HOLEC, 1990) Vady sýrů způsobené mikroorganismy Vady sýrů mohou být způsobeny: plísněmi, kvasinkami, neţádoucí tvorbou plynů, neţádoucím zbarvením sýrů (GÖRNER, VALÍK, 2004). Kdyţ se přijme názor, ţe příčinou příslušné vady mohou být mikroorganismy, je třeba najít jejich zdroj a v zásadě uplatňovat následující opatření: vyloučit neţádoucí mikroorganismy z mléka dodrţováním hygienických podmínek a hygienického stavu při jeho získání na mléčných hospodářstvích rychlým a účinným chlazením mléka po jeho nadojení nebo zkrácením času mezi nadojením mléka a jeho zpracováním na sýry, kdyţ se nepředpokládá výroba sýrů ze syrového mléka, zabezpečit jeho účinnou pasterizaci, zabránit dekontaminaci pasterizovaného mléka a vytvořit hygienické podmínky a stav při výrobě sýrů podle poţadavků správné výrobní a hygienické praxe, při výrobě sýrů zabezpečit také podmínky, které zaručí optimální mnoţení a metabolismus poţadovaných kultur (zákysů) a zabránit rozmnoţování a metabolismu neţádoucích mikroorganismů dodrţováním přiměřených teplot, poţadovaných hodnot ph, správného obsahu soli, zabezpečením fermentace veškeré laktózy v mladých sýrech za vhodný čas, realizovat účinné sanitační opatření výrobního nářadí a zařízení a účinné preventivní ovládání nebezpečí v systému HACCP. Jedním z cílů je téţ zamezit vzniku neţádoucího biofilmu na příslušném nářadí a zařízení (GÖRNER, VALÍK, 2004). 26

27 Změna barvy kůry. Hnědé skvrny na povrchu tvrdých sýrů způsobuje přítomnost vysokého obsahu dusičnanů v mléce, v soli nebo v solné koupeli. Černé skvrny můţe zapříčinit porost plísní, působení ţeleza a mědi. Červené zbarvení je mikrobiální chybou, kterou vyvolává Micrococcus chromoflavus, na sýru Niva Geotrichum aurantiacum (GRIEGER, HOLEC, 1990). Rakovina kůry. Na povrchu kůry sýra se nejprve objeví světlé aţ bílé místo, poté se vytvoří kašovitá a mazlavá hmota. Tato chyba se vyskytuje poměrně často a vyvolává ji plíseň Penicillium brevicante. Roztočivost sýrů. Tato chyba se vyskytuje u tvrdých, dlouho skladovaných sýrů. Projevuje se ve formě sýrového prachu na povrchu sýra nebo na polici. Roztoči Tyroglyphus siro, Corpoglyphus passularum aj. vytváří na povrchu kůry malý otvor, ale ve vnitřku kůry bývají větší díry (s větším průměrem neţ 1 cm), ve kterých je velký počet roztočů (GRIEGER, HOLEC, 1990). Bílá hniloba. V těstě ementálských sýrů se po dvou aţ třech měsících od výroby tvoří místa bílé barvy, která jsou měkká, bahnitá a odporně zapáchají po výkalech. Původcem vady je Clostridium sporogenes. Zrzavé aţ tmavohnědě skvrny. Skvrny jsou poměrně malé (1 2 mm) a vyvolávají je mikroorganismy. U holandských sýrů je to Lactobacillus plantarum var. rudensis, u ementálských sýrů některé bakterie propionového kvašení. Slepý sýr. Je to chyba tvrdých sýrů, ve kterých se nevytvoří očekávaná oka, takţe sýr je bez ok (slepý). Příčinou je buď nedostatek bakterií propionového kvašení, nebo tyto bakterie nemají vhodné podmínky růstu (GRIEGER, HOLEC, 1990). Hořký sýr. Vzniká u rychle solených a zrajících sýrů následkem rozvoje nevhodné mikroflóry (peptonizující mikroby, kvasinky), při zpracování hořkého mléka a následkem vysokého obsahu syrovátky. Mýdlová chuť. Objevuje se u přezrálých sýrů jako důsledek sníţeného počtu nebo činnosti bakterií mléčného kysání a převládající činnosti jiné mikroflóry, např. plísní, alkaligenních mikroorganismů. Způsobují ji i čisticí prostředky v mléce (GRIEGER, HOLEC, 1990). 27

28 Další vadou způsobenou mikroorganismy je neţádoucí tvorba plynů vedoucí k duření a trhání sýrů. Duření sýrů lze rozdělit na časné a pozdní. U sýrů s nízkodohřívanou sýřeninou je časné duření způsobeno zejména koliformními bakteriemi, Enterobacter aerogenes a Escherichia coli. Zdrojem těchto bakterií je prostředí, vyskytují se v mléce i po jejich devitalizaci. Za normálních okolností jsou plynotvorné bakterie potlačeny bakteriemi zákysu, pokud ale tyto nejsou dostatečně aktivní, začnou koliformní bakterie intenzivně růst a zkvašovat laktózu za vzniku oxidu uhličitého a vodíku, které způsobují neţádoucí oka a trhliny (VLKOVÁ et al., 2009). Pozdní duření sýrů se vyskytuje většinou u sýrů, jejichţ sýřenina se dohřívá na teploty C po dobu asi 45 minut. Při těchto teplotách jsou plynotvorné koliformní bakterie natolik oslabené, ţe nejsou schopny mnoţení. Na pozdním duření sýrů se podílejí většinou sporogenní bakterie rodu Clostridium (Cl. tyrobutyricum a Cl. butyricum), které jsou schopny přeţívat jak pasterační teploty, tak teploty dohřívání. Laktóza je jiţ většinou rozloţena zákysovými bakteriemi a klostridie jsou schopny vyuţívat jako zdroj energie vznikající kyselinu mléčnou za vzniku oxidu uhličitého a vodíku. Duření způsobené sporulujícími bakteriemi se projevuje aţ za několik týdnů, protoţe spóry potřebují určitý čas k vyklíčení (VLKOVÁ et al., 2009). K zamezení časného a částečně i pozdního duření se do mléka přidává dusičnan draselný. Dusičnany jsou enzymovou činností redukovány na dusitany, které působí inhibičně na koliformní bakterie, méně jiţ na klostridie. K potlačení klostridií máselného kvašení, a tím i pozdního duření sýrů lze vyuţít antibiotika nisinu, především u sýrů s nízkodohřívanou sýřeninou. Pouţije-li se k potlačení pozdního duření přímo antibiotikum nisin, potom se přidává před pasterací, aby působil jiţ při zvýšené pasterační teplotě. Při pouţití čisté kultury Streptococcus lactis produkující nisin je třeba kulturu přidat do mléka před sýřením (TEPLÝ, 1984). 3.8 Hygiena a sanitace v mlékárnách Hygienickou jakost sýrů ovlivňuje v první řadě kvalita suroviny. Závaţné nedostatky mohou být způsobeny krmením dojnic nekvalitním krmivem (plesnivé siláţe, senáţe), přítomností inhibičních látek v mléce, příměsí mléka od mastitidních krav (KOMPRDA, 2000). Kontrola mikroorganismů v mlékárenských závodech je nezbytná pro výrobu bezpečného výrobku co nejvyšší kvality (MARTH, STEELE, 2001). 28

29 3.8.1 Příčiny kontaminace syrového mléka Prvním technologickým postupem při dojení, omezujícím kontaminaci mléka mikroorganismy, je oddělování prvních střiků mléka do speciálních nádobek. Tím je kontrolována nejen přítomnost mastitidního mléka, ale současně se v prvních střicích oddělují kontaminující mikroorganismy. Během dojení mohou mikroorganismy z půdy, podestýlky a exkrementů dojnic, přítomné na strucích, silně kontaminovat mléko. V jednom gramu výkalů nebo konzervovaných objemových krmiv jsou miliardy mikroorganismů. Proto je třeba zajistit důkladné očištění vemene, zejména struků a kořene struků, které přicházejí do styku s mlékem. Podmínkou čistoty vemene je jeho osušení, které má vliv na sekundární kontaminaci mléka. Na sušení je nejvhodnější pouţívat jednorázové utěrky. Čistota dojiče, hlavně jeho rukou a oděvu je rovněţ ovlivňujícím faktorem. Zoohygienické podmínky. Dojírny špatně konstruované, nedostatečně udrţované, špatně větrané bývají zdrojem kontaminace bakteriemi nebo plísněmi ze vzduchu. Významným zdrojem kontaminace mléka můţe být filtr na mléko. Účelem filtrace je odstranit hrubé nečistoty společně s kontaminujícími mikroorganismy. Není vhodné vyvíjet filtry, přes které je moţno filtrovat velká mnoţství mléka, ale naopak pouţívat levnější filtry, které se budou častěji vyměňovat i během dojení. Kvalita vody. K napájení dojnic, omývání vemen a téţ k proplachu dojicího zařízení musí být pouţívána výhradně pitná voda. Jedním z významných zdrojů kontaminace mléka je nedostatečně vyčištěné a vydezinfikované dojicí zařízení od strukových násadců aţ po úchovné nádrţe. Podmínkou dokonalého vyčištění je optimální koncentrace čisticího prostředku, dostatečná teplota sanitačního roztoku, dostatečná turbulence v celém čištěném profilu a smáčení povrchu všech čištěných míst (SOVJAK, REISNEROVÁ, 2001). 29

30 3.8.2 Hygiena výroby ovčího mléka a výrobků z něho Podmínky při získávání ovčího mléka v porovnání se získáváním kravského mléka jsou odlišné. Dojení ovcí se převáţně uskutečňuje v přírodních podmínkách, které jsou v období suchého slunečného počasí hygienicky vyhovující, ale v období déle trvajících dešťů jsou hygienicky problematické (LUKÁŠOVÁ, 2001). Bahnice se dojí ručně (jen výjimečně strojově), coţ vyţaduje věnovat zvýšenou pozornost hygieně dojičů, hygieně vemene a hygieně celého procesu dojení. Často je závaţným problémem otázka dostatku pitné vody, která v místě salaše ne vţdy splňuje poţadavky na pitnou vodu. Závaţným hygienickým problémem je skutečnost, ţe dominantní mikroflórou při mastitidách ovcí je Staphylococcus aureus, jakoţ i jeho přítomnost při poraněních a různých hnisavých procesech na rukou personálu, podílejících se na dojení a ručním zpracování hrudky (LUKÁŠOVÁ, 2001). Důleţitým momentem při sniţování neţádoucí mikroflóry v ovčím hrudkovém sýru je zabezpečit správný proces zrání, při kterém dochází k redukci hygienicky neţádoucí mikroflóry, jako je Staphylococcus aureus, Salmonella aj. Další podmínkou je nízký počet těchto mikroorganismů na začátku zrání, dodrţení správných teplot při zracím procesu, aby se mohla uplatnit mikroflóra sloţená z bakterií mléčného kysání. Dalším poţadavkem je zabezpečit účinné čištění a dezinfekci všech zařízení, pouţívaných při zpracování ovčího mléka (LUKÁŠOVÁ, 2001). Při svozu hrudky do bryndzárny na zpracování je třeba zabezpečit šetrný svoz, aby nedocházelo k poškození, deformaci, zvlhnutí a tím narušení fermentačního procesu, který musí pokračovat ještě v bryndzárně. Významné místo veterinárně-hygienického dozoru spočívá nejen v souhlasu na provozování salaše, ale veterinární lékař musí před začátkem ovčácké sezóny posoudit, případně vyšetřit: lokalitu salaše, vybavení salaše, hygienické podmínky na výrobu a zpracování ovčího mléka, zdravotní stav ovcí, vyšetření vzorku mléka, vyšetření vody na salaši, 30

31 platnost zdravotních průkazů, poţadovat odčervení stáda a ovčáckých psů před začátkem ovčácké sezóny, odebrat vzorky hrudkového sýra na vyšetření po dobu ovčácké sezóny aj. (LUKÁŠOVÁ, 2001) Sanitace v mlékárnách Sanitační a hygienické opatření v mlékárnách je jeden z nejdůleţitějších úkonů. Je nutno, aby se stalo částí technologického procesu. Jeho úkolem je vytvořit v mlékárnách na jednotlivých odděleních takové podmínky, aby byla zaručena zdravotní nezávadnost mléka a všech mlékárenských výrobků, aby jejich jakost a trvanlivost byla co největší a nedocházelo k jejich zkáze a tím i k národohospodářským ztrátám. Je nutno si uvědomit, ţe mléko a mléčné výrobky jsou pravidelnou stravou všech lidí (OLŠANSKÝ, 1958). Hlavní sanitační a hygienické úkony v mlékárnách jsou řádné mytí a sterilace. Mytí a sterilace všech potrubí a nářadí patří mezi nejdůleţitější úkony v mlékárnách vůbec, protoţe je na nich přímo závislá trvanlivost a jakost mléka a mléčných výrobků. Prostředky, kterých se pouţívá při těchto úkonech, se dělí na dvě skupiny prostředky mycí a sterilační (OLŠANSKÝ, 1958). Mytím se čištěný předmět zbaví z velké části mikroorganismů a zbytků organických látek, čímţ jsou mikroorganismům odebrány moţnosti výţivy. Sterilací jsou zbývající mikroorganismy na očištěných plochách usmrcovány. Odstranění nečistot z předmětů, strojů a nářadí, které přicházejí do přímého styku s mlékem a mléčnými výrobky, není samo o sobě cílem čištění. V mlékárnách jde v první řadě o mikrobiologickou čistotu, to znamená o odstranění zdrojů infekce a reinfekce. To se provádí sterilací (OLŠANSKÝ, 1958). 3.9 Boj proti neţádoucím mikroorganismům Mechanické prostředky K mechanickým prostředkům boje proti mikroorganismům náleţí odstraňování prachu, nečistot a zbytků organického materiálu z provozoven, tj. ze strojů a ostatního zařízení, stěn i podlah. Důleţité je dokonalé odstraňování zbytků organického materiálu také z méněpřístupných míst (např. z ohybů potrubí), aby se tam nevytvořila loţiska, v nichţ by se mikroorganismy silně pomnoţovaly, a odtud distribuovaly do ostatních 31

32 míst. Mechanické zákroky se kombinují s fyzikálními a chemickými prostředky při omývání horkou vodou se pouţívají detergenční prostředky (tenzidy), které mají vysokou smáčivost, emulgují odstraňované zbytky a ničí přítomné mikroorganismy. U mikrobiologicky zvlášť choulostivých provozů se před vstupem do provozních místností umísťují rohoţe napuštěné roztokem dezinfekčního prostředku (ŠILHÁNKOVÁ, 2008). Důleţitým mechanickým prostředkem je také ventilace provozních místností, jeţ odstraňuje zvířený prach nebo páru, která by jinak kondenzovala na stěnách, stropech i zařízeních a poskytovala moţnost rozvoje mikroorganismů, zvláště plísní. Nejvhodnější je klimatizace, při níţ do provozu přichází mikrobiologicky čistý vzduch, upravený na ţádanou teplotu a vlhkost, za současného odsávání vzduchu znečištěného parami a prachem (ŠILHÁNKOVÁ, 2008) Fyzikální prostředky Filtrace slouţí hlavně k odstranění mikroorganismů ze vzduchu pouţívaného pro klimatizaci a také pro sterilaci vzduchu určeného k aeraci při fermentačních výrobách. Ultrafialové záření se pouţívá především pro povrchovou sterilaci a sterilaci prostorů, jeţ jsou z mikrobiologického hlediska zvlášť choulostivé, jako jsou očkovací boxy, prostory aseptického balení potravin aj. Zdroje záření musí být umístěny tak, aby neohroţovaly zrak pracovníků. K fyzikálním prostředkům boje proti činnosti mikroorganismů v potravinářském průmyslu náleţí také uchovávání potravin a jejich surovin za nízkých teplot (ŠILHÁNKOVÁ, 2008) Chemické prostředky Chemické prostředky pouţívané v potravinářském průmyslu v boji proti neţádoucím mikroorganismům nesmějí nepříznivě ovlivňovat chuť potravin, výrobní prostředí (např. zápachem), zdraví zaměstnanců nebo konzumentů ani poškozovat výrobní zařízení. Jejich účinnost má mít co nejširší spektrum a nemá klesat během uchovávání (ŠILHÁNKOVÁ, 2008). 32

33 4 MATERIÁL A METODIKA 4.1 Charakteristika materiálu Vzorek č. 1: Zimná bryndza Sloţení: ovčí sýr z nepasterovaného ovčího mléka min. 51 %, mlékárenská hrudka max. 49 %, jedlá sůl, pitná voda Vzorek č. 2: Čerstvý sýr solený Sloţení: ovčí hrudkový sýr z nepasterovaného ovčího mléka, jedlá sůl Vzorek č. 3: Čerstvý sýr nesolený Vzorek č. 4: Oštiepok uzený polotvrdý, nezrající, pařený sýr Sloţení: ovčí hrudkový sýr, jedlá sůl Vzorek č. 5: Kaškaval sýr pařený, polotvrdý Sloţení: ovčí mléko, mlékařské kultury, sůl Vzorek č. 6: Bryndza termizovaná Sloţení: skladovaný ovčí hrudkový sýr, hrudkový sýr mlékárenský, pitná voda, jedlá sůl 33

34 4.2 Příprava laboratorních pomůcek Laboratorní sklo pouţívané při rozborech bylo sterilováno v horkovzdušném sterilizátoru při 165 C 60 minut. Erlenmayerovy baňky s ţivnými půdami a zkumavky s destilovanou vodou byly sterilizovány v parním sterilizátoru při 121 C 20 minut. 4.3 Sloţení ţivných půd Chloramphenicol Glucose Agar Kvasniční extrakt 5,0 g Glukóza 20,0 g Chloramfenikol 0,1 g Bakteriologický agar 15,0 g Destilovaná voda 1000 ml Výrobce: Biokar Diagnostics, Francie MRS Agar Polypepton 10,0 g Masový extrakt 10,0 g Kvasniční extrakt 5,0 g Glukóza 20,0 g Tween 80 1,08 g Hydrogenfosforečnan draselný 2,0 g Octan sodný 5,0 g Citrát sodný 2,0 g Síran hořečnatý 0,2 g Síran manganatý 0,05 g Bakteriologický agar 15,0 g Destilovaná voda 1000 ml Výrobce: Biokar Diagnostics, Francie 34

35 Plate Count Agar with skimmed milk Trypton 5,0 g Kvasniční extrakt 2,5 g Glukóza 1,0 g Sušené mléko 1,0 g Bakteriologický agar 12,0 g Destilovaná voda 1000 ml Výrobce: Biokar Diagnostics, Francie Compass Enterococcus Agar Pepton 27,5 g Kvasniční extrakt 5,0 g Octan sodný 5,0 g Tween 80 1,0 g Selektivní činidla 0,3 g X glykosid 0,1 g Agar 14,0 g Destilovaná voda 1000 ml Výrobce: Biokar Diagnostics, Francie VRBL Pepton 7,0 g Kvasniční extrakt 3,0 g Laktóza 10,0 g Chlorid sodný 5,0 g Ţlučové soli 1,5 g Neutrální červeň 0,03 g Krystalová violeť 0,002 g Agar 12,0 g Destilovaná voda 1000 ml Výrobce: Biokar Diagnostics, Francie 35

36 4.4 Úprava vzorku Naváţka 10 g sýra byla smíchána s 90 ml destilované vody a homogenizována v homogenizátoru typu STOMACHER po dobu 1 minuty. Poté bylo provedeno desetinné ředění, kdy se 1 ml potřebného desetinného ředění očkoval na sterilní Petriho misky. Od kaţdého ředění byly současně naočkovány 2 misky. Inokulum se v Petriho miskách přelilo agarovou půdou, pečlivě promíchalo krouţivým pohybem a směs se ponechala ztuhnout na vodorovné ploše. Po úplném ztuhnutí se plotny obrátily, aby na povrch půdy nestékaly kondenzované páry, a nechaly se inkubovat v termostatu při daném čase a teplotě. Po uplynutí doby inkubace byly spočítány jednotlivé kolonie. 4.5 Stanovení mikroorganismů U vybraných sýrů byly stanovovány tyto skupiny mikroorganismů celkový počet mikroorganismů, bakterie mléčného kysání, psychrotrofní mikroorganismy, koliformní bakterie, enterokoky, plísně a kvasinky. Celkový počet mikroorganismů byla pouţita půda PCA se sušeným mlékem. Misky se nechaly inkubovat v termostatu při teplotě 30 C 72 hodin. Obr. 1 Celkový počet mikroorganismů Bakterie mléčného kysání byla pouţita půda MRS. Misky se inkubovaly při teplotě 30 C po dobu 72 hodin. Obr. 2 Bakterie mléčného kysání 36

37 Psychrotrofní mikroorganismy byla pouţita půda PCA se sušeným mlékem. Inkubace probíhala při 6,5 C po dobu 10 dní. Obr. 3 Psychrotrofní mikroorganismy Koliformní bakterie byla pouţita půda VRBL. Kultivace při 37 C po dobu 24 hodin. Obr. 4 Koliformní bakterie Enterokoky byl pouţit Compass Enterococcus Agar. Misky se inkubovaly při 45 C 24 hodin. Obr. 5 Enterokoky 37

38 Plísně a kvasinky byl pouţit Chloramphenicol Glucose Agar. Inkubace trvala 120 hodin při 25 C. Obr. 6 Plísně a kvasinky 4.6 Vyjádření výsledků Po ukončení kultivace se na miskách odečetly kolonie tvořící jednotky (KTJ). Výsledné výpočty MO jsou uvedeny v KTJ/g vzorku dle rovnice: N = n 1 n 2 d V C je součet kolonií spočítaných na Petriho miskách je počet Petriho misek pouţitých z 1. ředění je počet Petriho misek pouţitých z 2. ředění první pro výpočet pouţité ředění objem inokula v ml 38

39 5 VÝSLEDKY A DISKUZE Výsledné počty sledovaných skupin mikroorganismů jsou uvedeny jako průměrné hodnoty ze dvou opakovaných stanovení v KTJ na 1 gram vzorku. Tab. 3: Vzorek č. 1: Zimná bryndza počty mikroorganismů v KTJ/g Celkový počet mikroorganismů 5, Bakterie mléčného kysání 3, Psychrotrofní mikroorganismy 1, Koliformní bakterie 3, Enterokoky 4, Plísně a kvasinky 3, Tab. 4: Vzorek č. 2: Čerstvý sýr solený počty mikroorganismů v KTJ/g Celkový počet mikroorganismů 6, Bakterie mléčného kysání 2, Psychrotrofní mikroorganismy 1, Koliformní bakterie 6, Enterokoky 3, Plísně a kvasinky 1, Tab. 5: Vzorek č. 3: Čerstvý sýr nesolený počty mikroorganismů v KTJ/g Celkový počet mikroorganismů 1, Bakterie mléčného kysání 3, Psychrotrofní mikroorganismy 2, Koliformní bakterie 5, Enterokoky 2, Plísně a kvasinky 1,

40 Tab. 6: Vzorek č. 4: Oštiepok počty mikroorganismů v KTJ/g Celkový počet mikroorganismů 6, Bakterie mléčného kysání 3, Psychrotrofní mikroorganismy 5, Koliformní bakterie 2, Enterokoky 1, Plísně a kvasinky 3, Tab. 7: Vzorek č. 5: Kaškaval počty mikroorganismů v KTJ/g Celkový počet mikroorganismů 5, Bakterie mléčného kysání 3, Psychrotrofní mikroorganismy 6, Koliformní bakterie 1, Enterokoky 2, Plísně a kvasinky 2, Tab. 8: Vzorek č. 6: Bryndza termizovaná počty mikroorganismů v KTJ/g Celkový počet mikroorganismů 2, Bakterie mléčného kysání 2, Psychrotrofní mikroorganismy 0 Koliformní bakterie 8, Enterokoky 0 Plísně a kvasinky 0 40

41 Graf 1: Celkový počet mikroorganismů Z výsledků mikrobiologických analýz je patrné, ţe celkový počet mikroorganismů se u sýrů pohyboval v rozmezí 2, KTJ/g u termizované bryndzy po 1, KTJ/g u čerstvého nesoleného sýra. Hranice pro celkové počty mikroorganismů u sýrů dle Nařízení komise č. 2073/2005 o mikrobiologických kritériích pro potraviny nejsou uvedeny. (BURDYCHOVÁ, SLÁDKOVÁ, 2007) uvádějí, ţe CPM poskytuje základní informace o stupni mikrobiální kontaminace a rekontaminace surovin, hotových výrobků a prostředí provozoven. Z výsledků lze usuzovat na úroveň technologie a dodrţování hygienických směrnic při výrobě, přepravě a uskladnění. Tato skupina se nejvíce přibliţuje absolutnímu celkovému počtu a nejlépe vystihuje stupeň mikrobiálního znečištění daného substrátu. Rozborem se nestanoví termofilní mikroorganismy, psychrotrofní mikroorganismy, striktní anaeroby, kultivačně náročné druhy a některé kvasinky a plísně (BURDYCHOVÁ, SLÁDKOVÁ, 2007). U sýrů se běţně tato skupina nestanovuje, neboť do celkového počtu mikroorganismů se v tomto případě výrazně promítají počty bakterií mléčného kysání a jiných mikroorganismů pouţitých při výrobě sýrů. Tato hodnota byla pro nás pouze orientační a měla ukázat stupeň mikrobiálního osídlení jednotlivých sýrů. 41

42 Graf 2: Bakterie mléčného kysání Bakterie mléčného kysání mají konzervační vlastnosti díky fermentaci sacharidů a produkci kyseliny mléčné. Někteří zástupci bakterií mléčného kysání se přidávají do potravin jako kulturní či startovací mikroflóra (BURDYCHOVÁ, SLÁDKOVÁ, 2007). Jak je patrné z grafu 2 počet bakterií mléčného kysání se pohyboval od KTJ/g u termizované bryndzy po 3, KTJ/g u sýru Kaškaval. Vyšší hodnoty mohou být způsobeny delší dobou zrání. Bakterie mléčného kysání jsou přirozenou mikroflórou sýrů, proto nejsou jejich počty legislativně stanoveny. 42

43 Graf 3: Psychrotrofní mikroorganismy Nejvyšší počty vykazuje vzorek zimná bryndza, 1, KTJ/g, u termizované bryndzy nebyly zjištěny ţádné psychrotrofní mikroorganismy. Psychrotrofní mikroorganismy mají schopnost růst při teplotách do 5 C. Produkují tepelně stabilní enzymy bakteriální lipázy a proteinázy, které mohou zhoršovat kvalitu konečného produktu (WALSTRA et al., 2006). Tato skupina zahrnuje rody Pseudomonas, Acinetobacter, Moraxella, Aeromonas, Vibrio, Serratia a Bacillus. Celkový počet psychrotrofních mikroorganismů poskytuje základní informace o stupni mikrobiální kontaminace a rekontaminace surovin, hotových výrobků a prostředí provozoven. Z výsledků lze usuzovat na míru primární či sekundární kontaminace potravin z hlediska jejich chladírenského uchování (BURDYCHOVÁ, SLÁDKOVÁ, 2007). 43

44 Graf 4: Koliformní bakterie Nejniţší hodnoty koliformních bakterií vykazuje termizovaná bryndza 8, KTJ/g. Dle Nařízení Komise č. 2073/2005 o mikrobiologických kritériích pro potraviny nesmí E. coli u sýrů z tepelně ošetřeného mléka či tepelně ošetřené syrovátky překročit hodnotu 1000 KTJ/g. U čerstvého soleného sýru byla sice zjištěna hodnota 6, KTJ/g, ale tento sýr je vyroben z mléka nepasterovaného. V potravinářské mikrobiologii mají význam jako indikátorové mikroorganismy. Jsou indikátory sekundární kontaminace potravin, indikátory správné sanitace technologického zařízení a nářadí (BURDYCHOVÁ, SLÁDKOVÁ, 2007). 44

45 Graf 5: Enterokoky Nejvyšší hodnoty vykazuje vzorek zimná bryndza, 4, KTJ/g. Při posuzování obsahu enterokoků je nutné přihlédnout k materiálu, ve kterém jsou stanovovány. Jejich výskyt v potravinách nelze dávat do souvislosti s přímou kontaminací fekáliemi, protoţe se enterokoky nezávisle na fekálním znečištění nacházejí i v ţivotním prostředí. U některých potravin ukazuje jejich zvýšená přítomnost na nedostatečné zahřátí nebo kontaminaci z pracovních ploch, které nebyly dostatečně očištěny a dezinfikovány (BURDYCHOVÁ, SLÁDKOVÁ, 2007). Běţně se vyskytují v obsahu intestinálního traktu, proto jsou pouţívány jako indikátor fekálního znečištění. Jsou odolné vůči dezinfekčním prostředkům, např. chloru, proto dále indikují nedostatečnou dávku dezinfekčního prostředku (ŘÍHOVÁ, AMBROŢOVÁ, 2007). 45