RCD s.r.o. Americká Dob!ichovice DI": CZ !!!!!!!!!!!!!! VLIV PREPARÁTU BIOCOL NA R!ST LIDSKÉHO KARCINOMU COLON (LINIE HCT 116) U

Transkript

1 RCD s.r.o. Americká Dobichovice DI": CZ VLIV PREPARÁTU BIOCOL NA RST LIDSKÉHO KARCINOMU COLON (LINIE HCT 116) U NU/NU MY"Í Zadavatel: ASCOLOR-BIOTEC s.r.o. #ídící pracovník studie: Doc. RNDr. Pavla Pou$ková, CSc Vedoucí pokusu: RNDr. Marie Zadinová Technická spolupráce: Eleonora Wenclová, Milena Altnerová, Olga Tachecí Kontrolovala: Ing. Jiina Polívková, CSc Zprávu vypracovaly: Doc. RNDr. Pavla Pou$ková, CSc RNDr. Marie Zadinová Provedeno v RCD s.r.o. ve dnech

2 VLIV PREPARÁTU BIOCOL NA RST LIDSKÉHO KARCINOMU COLON (LINIE HCT 116) U NU/NU MY"Í 1. Cíl studie: Cílem pedkládané studie bylo stanovit protinádorov% ú$inek preparátu BIOCOL na r&st lidského karcinomu colon (linie HCT 116) subkutánn' (s.c.) transplantovaného do podko(í nu/nu my)í. 2. Materiál a metody 2.1. Testovaná látka: BIOCOL #$%&'()#'*+*$,'-./+012%1' ,45+60$7&89 :)#' ;.*2,' 6+*#.,$-+*8 *+*',45+ <'*'-'%.#.19 =6#>&+-',? 6;>60'-+-'# (.<60+@%;.*,2 6;.* &'A*+8 '6#>&'BCD ()# ;.*2, 6>%,+8 -+*+8D '6#>&+-$,()#*.,,26.0+0$#,2E69+9F-*$-B."GH1IJ&IDEG1IJ"HIFD-+(K.18HD" 1#J"HIELH1#J&IF%2#.@,451+%,+@%>9 ()# '6#>&+-$, *.,,2 D +(K.1 6>%,4 -+*) EHD"1#J"HIDLH1#J&I%2#.@,451+%,+@%>F Nádorové linie M 6+&8@8 ()#' 6+8A>%' #>*@&$,$*+0+-$ #>,>. &'0B>,+18 B+#+, ENOPQLLRFD ()#' 60>1$0,2<C@&$,'<S-0+6@&4,$*+0+-4(',&)SO=OOES80+6.',O+##.B%>+,+/O.## O8#%80.@DO=TUDV'#>@('0)DW>#%@5>0.VXYZ[\D],>%.*M>,I*+1F9^%&$_+-4&8#%8;. ()#' %'%+,$*+0+-$ #>,>.,'1,+A.,' ',8J,8 1)7C1 '6#>&+-$,+ #`#Z a,$*+0+-?b5(8,2&@6+#.3,2@hd#1#t'%0>i.#8q,'60'-?(+&1)7> Laboratorní zví#ata K pokusu byly pou(ity outbrední nu/nu my)i kmene CD-1, samice, t'lesné hmotnosti 18-20g, celkem 32 ks, 16 my)í pokusn%ch a 16 my)í kontrolních (Dodavatel: AnLab s.r.o. Praha). My)i byly chovány v air laminal flow boxech KAT- F/SZ-1000 (AnLab s.r.o.), podest%lány radia$n' sterilizovanou podest%lkou (SAWI Research Bedding, AnLab s.r.o.praha), krmeny radia$n' sterilizovanou dietou ST-1 (AnLab s.r.o. Praha) a napájeny autoklávovanou vodou ad libitum. "

3 2.4. Vlastní postup Den ped zahájením podávání terapeutické látky BIOCOL (den 0) byla 3 my)ím odebrána krev z o$ního plexu a byl stanoven v%chozí krevní obraz. Za 24 hodin po odb'ru bylo nu/nu my)ím CD-I zahájeno perorální podávání preparátu BIOCOL po dobu 10 dní. (Pokusn%m my)ím bylo peroráln' sondou aplikováno 250 mg/kg preparátu BIOCOL), 11. den byly nu/nu my)ím s.c. inokulovány nádorové bu*ky, na prav% bok my)i, a to v po$tu 1 x 107/my). Po inokulaci nádorov%ch bun'k bylo plynule pokra$ováno v terapii preparátem BIOCOL u pokusné skupiny, kontrolním my)ím byl po stejnou dobu sondou podáván shodn% objem pitné vody. Pokus byl ukon$en 36. den po zahájení perorálního podání preparátu BIOCOL. Pokusná skupina: P1 16 outbredních nu/nu my)í kmene CD-I, s.c. ca colon- linie HCT116 + p.o. 250 mg/kg látky BIOCOL. Kontrolní skupina: K1 16 outbredních nu/nu my)í kmene CD-I, s.c. ca colon - linie HCT p.o. pitná voda Rostoucí nádory byly v pr&b'hu pokusu ka(d% den m'eny a byl kalkulován objem rostoucího nádoru podle vzorce V= a x b2 x Jt/6, kde a = délka tumoru, b = )íka tumoru. Sou$asn' byly my)i ka(d% den vá(eny. Pokus byl ukon$en 36. den po zahájení terapie Hodnocení pokusu Hodnocení pokusu bylo provedeno na základ' porovnám r&stov%ch kivek tumor& u pokusné skupiny - ve srovnání se skupinou kontrolní. V pr&b'hu a na konci pokusu bylo spo$ítáno % inhibice r&stu nádoru - %TGI (tumor growth inhibition), pro pr&m'rn% objem tumoru, (%TGI = (1 -(pr&m'rn% objem tumoru v lé$ené skupin'/pr&m'm% objem tumoru v kontrolní skupin')) x 100. Získané v%sledky byly statisticky hodnoceny neparametrick%m oboustrann%m Studentov%m t-testem. V pr&b'hu pokusu a na konci pokusu byla provedena fotodokumentace ú$innosti terapie ve srovnání s kontrolní skupinou. b

4 3. V$sledky a diskuze Získané v%sledky jsou uvedeny v tabulkách $ a na grafech $. 1-9 Pokusná skupina: 16 outbredních nu/nu myí kmene CD-I, s.c. ca colon - linie HCT116 + p.o. 250 mg/kg látky BIOCOL Kontrolní skupina: 16 outbredních nu/nu myi kmene CD-I, s.c. ca colon - linie HCT pitná voda Preparát BIOCOL po preventivním perorálním podání 10 dní ped s.c. aplikací nádorov%ch bun'k a následn' denn' podávan% i po jejich aplikaci - prodlu(oval statisticky v%znamn' dobu latence nár&st& ca colonu (HCT -116) u pokusn%ch nu/nu my)í, v pr&m'ru o 7,93 dne na 18,56 dne (o 74%) na 174,6% proti kontrolní - nelé$ené skupin', v které byl nár&st tumoru zji)t'n za 10,63 dne (100%) (Tab. 1,2, grafy 1,2) Preparát BIOCOL $áste$n' inhiboval r&st lidského karcinomu colon, linie HCT- 116 na nu/nu my)ích. Dosa(ená inhibice byla statisticky v%znamná od 18. do 36. dne pokusu, a to na 1% hladin' v%znamnosti. Dosa(ené % inhibice r&stu tumoru proti kontrolní skupin' bylo (%TGI) 18. den pokusu 64,4%, 22. den pokusu 56,1%, 25. den 53,8%, 29. den 47,04%, 32. den 39,53%, 36. den 31,61%. (Tab. 3,4,5,6,7 grafy 3,4,5,6) V pípad' sledování vlivu preparátu BIOCOL na hmotnost nu/nu my)í, dávka 250 mg/kg vyvolávala ztrátu t'lesné hmotnosti pokusn%ch nu/nu my)í a po 5. t%dnu podávání i r&(ov'- $ervené zbarvení poko(ky nu/nu my)í. Ztráta t'lesné hmotnosti nu/nu my)í byla statisticky v%znamná na 1% hladin' v%znamnosti od 11. dne do 36. dne terapie (Tab.8,9,10,11 grafy 7,8,9) Z v"sledku je z#ejmé, $e preparát BIOCOL %áste%n& inhiboval r'st lidského karcinomu colon u nu/nu myí, zvlát& p#ízniv& se projevil efekt preventivního podávání preparátu od prvního dne pokusu jet& p#ed transplantací nádorov"ch bun&k. S p#ib"vající dobou podávání preparátu se % dosa$ené inhibice inhibice r'stu tumoru postupn& sni$ovalo. Podle vzhledu myí p#edpokládáme, $e dolo k p#edávkování podávaného preparátu (viz foto). Y

5 4. Záv%ry a) Preventivní podávání preparátu BIOCOL 10 dní ped s,c. inokulací nádorov%ch bun'k (následn' denn' podávan% i po jejich aplikaci), statisticky v%znamn' prodlu(ovalo dobu latence s.c. nár&st& ca colon - linie HCT-116 u pokusn%ch nu/nu my)í proti kontrolní skupin', a to o 74%. (o 7,93 dne). b) Preparát BIOCOL m'l statisticky v%znamn% inhibi$ní ú$inek na s.c. r&st lidského ca colon linie HCT 116 u nu/nu my)í kmene CD-I. 18. den pokusu bylo dosa(eno 64,4% inhibice r&stu tumoru proti kontrolní skupin' c) S pib%vající dobou podávání preparátu BIOCOL se % dosa(ené inhibice r&stu tumoru postupn' sni(ovalo, 36. den bylo dosa(eno 31,61% inhibice tumoru proti kontrolní skupin'. d) Preparát BIOCOL v podávané denní perorální dávce 250 mg/kg statisticky v%znamn' sni(oval t'lesnou hmotnost pokusn%ch my)í. V Praze dne Doc. RNDr. Pavla Pou$ková, CSc. RCD spol. s r.o. G

6 my doba latence (dny) ": kontroly pokusné pr#m$r. hodnota 10,63 18,56 sm$rodat. odchylka 2,5 1,8 vyjád%ení In % ,6 Tab. 1 : asov" interval mezi transplantací nádorov"ch bun#k (den 1) a nár$stem m#%iteln"ch nádor$. Testovan" preparát BIOCOL se za&al aplikovat 10 days p%ed transplatací nádorov"ch bun#k karcinomu colon HCT 116

7 vypo&ítaná hodnota doba latence hladina v"znamnosti kontroly: pokusné 1,31 x Tab. 2 : Statistické hodnocení doby latence po transplantaci nádorov"ch bun#k. Pokusn"m my'ím byl podáván testovan" preparát BIOCOL. Student$v t test. Colon HCT = 1% hladina v"znamnosti

8 den pokusu - 3 ) ,113 0,132 0,15 0,256 0,397 0, ,087 0,132 0,192 0,265 0,445 0, ,118 0,144 0,192 0,294 0,572 0, ,085 0,103 0,16 0,218 0,285 0, ,087 0,132 0,205 0,23 0, ,103 0,144 0,245 0,346 0,472 0, ,132 0,232 0,268 0,302 0,429 0, ,095 0,155 0,205 0,34 0,47 0, ,079 0,122 0,205 0,268 0,403 0, ,111 0,192 0,279 0,445 0, ,118 0,155 0,218 0,302 0,445 0, ,113 0,144 0,23 0,366 0,543 0, ,126 0,15 0,199 0,279 0,323 0, ,119 0,177 0,23 0,575 0,98 1, ,085 0,132 0,23 0,319 0,397 0,488 0, ,122 0,192 0,319 0,436 0,551 hodnota ,05 0,089 0,148 0,209 0,313 0,462 0,649 odchylka 0,045 0,039 0,045 0,087 0,164 0,192 Tab. 3: BIOCOL. HCT 116.

9 den pokusu - 3 ") ,132 0,199 0,302 0,352 0,466 0,706 0, ,132 0,177 0,23 0,265 0,416 0,68 0, ,095 0,142 0,221 0,279 0,359 0,403 0,466 0, ,103 0,235 0,302 0,466 0,601 0,796 0,98 1, ,087 0,179 0,221 0,359 0,523 0,728 0,934 1,238 1, ,113 0,192 0,205 0,285 0,359 0,466 0,721 0, ,072 0,132 0,155 0,179 0,221 0,285 0,359 0,488 0, ,132 0,192 0,256 0,282 0,359 0,488 0,551 0,692 0, ,095 0,141 0,177 0,279 0,403 0,466 0,523 0, ,141 0,235 0,302 0,378 0,454 0,635 0,83 1,023 1, ,111 0,188 0,199 0,235 0,382 0,466 0, ,092 0,179 0,294 0,338 0,473 0,732 0,886 1,149 1, ,113 0,205 0,268 0,321 0,435 0,575 0,791 0, ,087 0,179 0,268 0,285 0,382 0,472 0,606 0, ,111 0,177 0,205 0,268 0,403 0,523 0,728 0,855 1, ,132 0,198 0,319 0,448 0,728 0,83 0,98 hodnota 0 0 0,106 0,138 0,19 0,25 0,337 0,452 0,591 0,764 0,949 odchylka 0,025 0,046 0,058 0,065 0,096 0,15 0,188 0,231 0,304 Tab. 4: HCT 116.

10 "#$%&'()(* +,-. / :91 9:903 9:./1 9:293 9:+.+ 9:/42 9:4/3 )56&"786 9:9/1 9:9+3 9:9/1 9:904 9:.4/ 9:.32 '&$;<&=>?56&" :9/ 9:91+ 9:..2 9:940 9:.3 9:910 9:21 9:941 9:++@ 9:/129:.1 9:13.9:.009:@4+9:2+.9:3/39:+9/ 9:934 ABC61DEFGHGI"# 7&=&$$%&''("

11 hodnoty den pokusu ,8x ,2x10-5 3,7x10' 5 0,0003 0,0034 den pokusu Tab. 6: BIOCOL. colon HCT =1%

12 "#$ $ %$ %$ &'()*)$ $ ('#+,'-.$ /01$ 23$ 45436$ 7859$ 9:59$ ;;$ 452:3$ :756$ 8952$ ;8$ 45;46$ :95;$ 8753$ ;6$ 45727$ 8;569$ :<54:$ 7;$ 45:9;$ 945:<$ 76587$ 79$ 459:6$ 93576$ 72592$ /=>?$<$@$$$$$$$$$$$$$A>B"C$&'()*$=$%$'>B"C)$ $ $

13

14 "#$%&'()(* +, // /. /0 1/ 12 + //3. //32 //3- //30 /13/ /13. /132 /13- /, /,3/ /,3/ / /13/ /131 /13. /134 /, /,3+ /,31 /,3. /,32 /,3- /. 1 //30 /1 /13+ /131 /13. /13. /134 /, /,3/ /,31 /,3,, //3, //32 //3- /1 /131 /13. /13- /,3+ /,3/ /,3. /,54. //32 //34 /1 /13/ /13. /132 /13- /, /,5+ /,31 /,3. 2 /13- /, /,3/ /,3. /,32 /,3- /,30 /.3/ /.3. /.54 /.30 4 //32 //32 //3- //30 /13+ /131 /13, /132 /130 //,3/ /,3. - //3. //32 //3- /1 /13/ /13. /132 /13- /,5+ /,31 /,32 0 /13/ /13, /132 /130 /,3/ /,3. /,32 /,3- /. /.3/ /.3, +6 //3/ //3/ //31 //3, //32 //3- /13+ /131 /13. /13- /,3+ ++ /13/ /13, /132 /130 /,3+ /,3, /,32 /,32 /,3- /.3+ /.3/ +/ //3, //32 //3- /1 /131 /13. /132 /13- /, /,5/ /,3. +1 // //31 //3. //32 //3- /1 /131 /13, /132 /130 /,5+ +, //3+ //31 //3, //34 //3- /1 /1 /13/ /13. /134 / //3. //32 //34 //30 /13+ /131 /13. /13- /130 /, /,31 +2 /132 /13, /13. /13- /130 /,3+ /,31 /,3. /,34 /,30 /.3/ "#$%#&' (()*+ ((),- (+).- (+)(+ (+)/- (+)0* (+)0, (/).0 (/)/1 (/)// (/)00 #$2"345'.)/,.)/1.)-.)--.)--.)-0.)--.)--.)--.)-/.) :

15 "#$%&'()(* )34&"564 +, // /. /0 1/ 12 // // // // //7,2 97./ // // , / / /+78, 97./ / / , '&$:;&<= )34&"564 //781 97,- //7-. 97,0 / /17/ /17, / / /, /,7, /,7,, 97., /, "#$%&'("#$#% )*+,-.#%/# &$'())*%

16 "#$%#&' $(%)#*+,+- " #" $" " %" $" &&" &%" &'" (&" ()" *+'&%%" *,##(&" *,*-#%" *,**&(" %" ("."*/-",".*/'" &",(."01(",".*1%" #,)."01-" 234"567898":"" " #" $" " %" $" &&" &%" &'" (&" ()" " " " #" #" #" #" #" #" #" #" "./01223"#$#% 4#5#%&$'())*1 2 +

17 % "#$%&% "#$%&$'()*(+),-%

18 " " *$%&'$(+","-../" "#$%&'$()" kontroly 0'+1"2"

19 Graf 3

20 "#$%&

21 "#$%&% r

22 " #$%"" '()"*+,-.-" "#$%&% "#$%"&"""

23 "#$%$&' "#$%&

24 Graf 8

25 "#$%&

26 "#$%&'%%%%%%%%%"#$%%&'$()%&*% (% "#$%+'%%%%%%"#$%%&($ %

27 HCT 116. HCT 116.

28 "#$%&'