PERTUSE LABORATORNÍ DIAGNOSTIKA

HTML
DOWNLOAD

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "PERTUSE LABORATORNÍ DIAGNOSTIKA"

Romana Králová
před 9 lety
Počet zobrazení:

1 PERTUSE LABORATORNÍ DIAGNOSTIKA Jana Zavadilová Státn tní zdravotní ústav, Praha Konference Problematika Pertuse,

2 EU definice potvrzeného případu p padu pro pertusi vyhláš áška č.. 275/2010 Sb. Potvrzený případ p pad = klinické projevy + průkaz minimáln lně jednou z následujn sledujících ch třít laboratorních metod: Izolace B.pertussis z klinického materiálu Detekce nukleové kyseliny (PCR) Průkaz specifické protilátkov tkové odpovědi di MUSÍ SE VYŠET ETŘOVAT AKUTNÍ A REKONVALESCENTNÍ SÉRUM SOUČASN ASNĚ V JEDNÉ LABORATOŘI!!! sérologický průkaz je proto možný aža v rekonvalescenci Vyšet etření na základz kladě jednoho vzorku séra s i s vysokou hladinou protilátek tek NENÍ v souladu s EU definicí!!!! Laboratorní kritéria ria podle definice případu p padu jsou často nedodržov ována 2

pertussis z klinického materiálu Detekce nukleové kyseliny (PCR) Průkaz specifické protilátkov tkové odpovědi di MUSÍ SE VYŠET ETŘOVAT AKUTNÍ A REKONVALESCENTNÍ SÉRUM

3 Laboratorní metody Kultivace RT PCR Optimální načasování pro diagnostiku (týdny) Objevení příznaků-kašel Sérologie kultivace PCR Sérologie 3

4 Kultivace Standardní test Levná metoda 100% specifická Faktory ovlivňuj ující senzitivitu: načasov asování odběru ru- na počátku onemocnění před zahájen jením m ATB terapie na lačno odběr je obtížný, vyžaduje tréning, ideáln lně ORL specialista transport materiálu 4

onemocnění před zahájen jením m ATB terapie na lačno odběr je

5 Odběr r materiálu na kultivaci a PCR Odběr r ihned při p i podezřen ení na onemocnění, na lačno nebo tři t i hodiny po jídle j a pití,, nekouřit! Výtěr r z nasopharyngu Tampón n dacron, rayon, Pro PCR je vhodný i flocked swab Aspirát t z nasopharyngu zdroj: 5

Výtěr r z nasopharyngu Tampón n dacron, rayon, Pro PCR je vhodný i flocked

6 Nasofaryngeáln lní výtěr r pro kultivaci a PCR Tampón n jemně zasunout přes nosní průduch aža k zadní stěně nasofaryngu Ponechat několik n sekund za současn asného otáčen ení Opatrně vyjmout zdroj: 6

nasofaryngu Ponechat několik n sekund za současn asného

7 Transport vzorků pro kultivaci Optimáln lní je přímép naočkov kování vzorku na kultivační plotnu Tampón n po odběru ihned zanořit do transportního média (AMIES s aktivním m uhlím) Materiál l přepravovat p a uchovávat vat do zpracování při i pokojové teplotě NE V LEDNICI! Doba od odběru do zpracování materiálu max. 24 hodin 7

s aktivním m uhlím) Materiál l přepravovat p a uchovávat vat do zpracování při i

8 Transport vzorků pro PCR Tampón může být přepravován suchý Tampóny s Amies médiem Amies s aktivním uhlím neovlivňuje PCR Materiál přepravovat při pokojové teplotě V laboratoři okamžitě zpracovat nebo skladovat při -20 C do zpracování 8

PCR Materiál přepravovat při pokojové teplotě V laboratoři

9 Kultivační média Charcoal agar (Regan-Lowe) neselektivní selektivní (+ cephalexin 40mg/l) Bordet Gengou ph půdy p 7,4±0.2, půda p na kultivační plotně dostatečně vysoko vylitá Kultivační podmínky C, 7 dní,, denní odečítání ploten 9

10 Kultivace identifikace B. pertussis B. Pertussis vyrůst stá za 48 aža 72 hodin drobné stříbřit ité polokulovité kolonie, při p i doteku kličkou kou se rozetřou ou (nepohybují se), po dnech inkubace kolonie většív kapky rosy,, na Bordet-Gengou agaru slabá zóna hemolýzy zdroj: zdroj:faculty.matcmadison.edu/mljensen 10

p i doteku kličkou kou se rozetřou ou (nepohybují se), po 3-43 4 dnech inkubace

11 Kultivace identifikace B. parapertussis B. parapertussis vyrůst stá do 48 hodin kolonie jsou většív ší, šedostříbrné,, při p i delší inkubaci vpadlé do půdyp na Bordet-Gengou agaru výrazná zóna hemolýzy a černohnědý pigment, roste i na krevním m agaru zdroj: 11

šedostříbrné,, při p i delší inkubaci vpadlé do půdyp na Bordet-Gengou

12 Identifikace bakteriální kultury Po izolaci čisté kultury ne starší než 48 hodin se identifikace potvrdí sklíčkovou kovou aglutinací s diagnostickými sérys 12

13 Rychlá metoda RT PCR Vysoce citlivá Riziko kontaminace nižší než u klasického PCR Pozitivní výsledky i při p i ATB terapii (kultivace negativní) Jen v časné fázi onemocnění Riffelmann et al., 2005 J Clin Microbiol 43:

ATB terapii (kultivace negativní) Jen v časné fázi

14 RT PCR detekční formát Sekvenčně specifická detekce: - hybridizační próby (FRET) - TagMan próby - Molecular beacons Sekvenčně nespecifická detekce: - SYBR green 14

15 RT PCR sekvence B.pertussis IS481 v několika n kopiích u B.pertussis,, ale není specifická Tato sekvence se vyskytuje i u další ších Bordetel: B. holmesii, B. bronchiseptica Reischl et al., 2001 J Clin Microbiol 39: PT promoter (ptxp)- sekvence specifická pro B. pertussis,, ale mám nížší senzitivitu 15

Bordetel: B. holmesii, B. bronchiseptica Reischl et al.

16 RT PCR sekvence B.parapertussis IS1001 specifická pro B. parapertussis 16

17 RT PCR interpretace výsledků doporučen ení Pertussis Work Area 4 EUVAC.NET IS481 pozitivní a ptxp pozitivní - infekce způsoben sobená B.pertussis IS481 pozitivní - možná infekce způsoben sobená B.pertussis,, uzavřít jako infekce způsoben sobená Bordetellou sp. IS1001 pozitivní - infekce způsoben sobená B.parapertussis 17

pertussis IS481 pozitivní - možná infekce způsoben sobená B.

18 Sérologie ELISA, aglutinace Poskytuje pozdní, retrospektivní diagnózu Nelze odlišit protilátky postinfekční od postvakcinačních Vyžaduje 2 vzorky séra (akutní a rekonvalescentní) s odstupem 2 až 4 týdnů Séra se vyšetřují současně v jedné laboratoři! Průkaz signifikantního vzestupu nebo poklesu protilátek nebo sérokonverze z negativity do pozitivity 18

rekonvalescentní) s odstupem 2 až 4 týdnů Séra se vyšetřují současně v jedné laboratoři!

19 Sérologie Aglutinace - vyšet etření aglutinačních protilátek tek patří mezi tradiční,, osvědčen ená a levná vyšet etření v diagnostice infekce ELISA stanovení IgA, IgM, IgG protilátek tek nejčast astěji proti pertusovému toxinu (PT) a filamentózn znímu hemaglutininu (FHA) 19

diagnostice infekce ELISA stanovení IgA, IgM, IgG protilátek tek

20 Sérologie doporučen ení EU Pertstrain group Pouze protilátky tky proti PT jsou specifické pro B.pertussis! Protilátky tky proti další ším m antigenům: FHA, PRN, FIM, ACT jsou méně specifické,, zkřížen ená reaktivita s antigeny B. parapertussis, Haemophilus sp., M. pneumonie, Ch. pneumonie Není doporučeno používat komerční kity se směsnými snými antigeny Diagnostická sérologie nemůž ůže e být správn vně interpretována na po dobu 1 roku od očkovo kování acelulárn rní pertusovou vakcínou (ap) Riffelmann et al., 2010 J Clin Microbiol 13:4459- Guiso et al., 2010 Eur J Clin Microbiol Infect Dis 30:

parapertussis, Haemophilus sp., M. pneumonie, Ch.

21 Sérologie Pro správn vné hodnocení - vždy dva vzorky séra s + datum odběru - údaje o očkovo kování - datum narození Jakákoli koli hladina protilátek tek v jediném m vzorku není průkazem akutně probíhaj hajícího ho onemocnění 21

22 Přehled ELISA kitů Výrobce Dodavatel Antigeny Název kitu Genzyme Virotech Biomedica ČS PT Bordetella pertussis toxin IgG; IgA; IgM Serion Immundiagnostica Biovendor PT Bordetella pertussis toxin IgG Euroimmun Dynex PT Bordetella pertussis toxin IgG;IgA Genzyme Virotech Biomedica ČS PT a FHA Bordetella pertussis IgG/IgA Serion Immundiagnostica Biovendor PT a FHA Bordetella pertussis IgA;IgG NovaTec Laboserv PT a FHA Bordetella pertussis IgA;IgG Novagnost Biovendor PT a FHA Bordetella pertussis IgA;IgG;IgM R-Biopharm AG Immunolab MEDISCO Praha PT a FHA Bordetella IgA;IG;IgM MEDISCO Praha PT a FHA Bordetella pertussis IgA;IgG;IgM Savyon Diagnostics GALI s.r.o. PT a FHA Sero pertussis IgG; IgA/IgM MAST DIAGNOSTICA GALI s.r.o. PT a FHA Mastazyme Bordetella IgG;IgA;IgM

23 Problémy z praxe - kultivace Faktory, které se mohou podílet na neúspěchu kultivace: špatně provedený odběr (ne výtěr z krku, po léčbě nebo během léčby ATB) nedodržení transportních podmínek (nepřepravovat vzorek v chladícím boxu, nejkratší transport) špatná volba kultivační půdy použití kultivačního média jen s cefalosporinem (použít médium jak s cefalosporinem, tak bez) ph půdy (optimální 7,4±0,2) stará krev nedostatečně vylitá plotna vysychání při kultivaci 23

24 Transport izolátů do NRL V současné době zaznamenáváme zvyšující se výskyt pertuse U izolátů B. pertussis je žádoucí provádět genotypizaci (MLSTA,MLVA) přínos pro zkvalitnění surveillance a vakcinační strategie Žádáme mikrobiology o zvýšené úsilí při kultivačním průkazu pertuse a o posílání izolátů B. pertussis a B. parapertussis do NRL Transport izolátů do NRL Na kultivační plotně Tampón n s transportním m médiemm (AMIES, AMIES s aktivním m uhlím) 24

25 EHK-673/ 2010 Zařazena Bordetella parapertussis Vzorky rozeslány 120 laboratořím 111 laboratoří kmen určilo správně Nesprávně kmen identifikovalo 7 laboratoří Pouze 2 laboratoře kmen nedourčily a označily vzorek jako Bordetella sp. Kmen B. parapertussis byl zaslán v rámci EHK podruhé (EHK-78/ 1997) Je potěšující, že většina laboratoří (92,5%) vzorek určila správně 25

26 Laboratorní vyšetření v roce hlášených případů onemocnění pertusí Bylo provedeno pouze 48 kultivačních vyšetření, z toho bylo 28 pozitivních Do NRL bylo zasláno pouze 7 kmenů Metodou PCR bylo diagnostikováno 12 případů Většina případů onemocnění byla potvrzena sérologickým vyšetřením Zdroj: Fabiánová et al., 2011 Zprávy EM (SZÚ, Praha) 20(1):

27 Závěr Pro včasnou v DG Pertuse používat PCR a kultivační průkaz Odběr r ihned po vyslovení podezřen ení na onemocnění (kultivace, sérologie, PCR) Správná technika odběrů (kultivace, PCR) Co nejkratší doba mezi odběrem a zpracováním materiálu (odběrová místa blízko mikrobiologických laboratoří) U akutních případů provádět průkaz agens kultivačně, metodou PCR, sérologii používat k dourčení nejasných případů 27

28 Poděkování Za spolupráci všem laboratořím, které nám zasílají izoláty B.pertussis a B.parapertussis. 28

29 DĚKUJI ZA POZORNOST Mgr. Jana Zavadilová NRL pro pertusi a difterii SZÚ Šrobárova rova Praha 10 Tel.: jzavadilova@szu.cz 29

Podobné dokumenty

Současné možnosti a úskalí diagnostiky pertuse

Současné možnosti a úskalí diagnostiky pertuse Mgr. Jana Zavadilová NRL pro pertusi a difterii Státní zdravotní ústav Aktuality v diagnostice virových a bakteriálních infekcí, 26.5.2014, SZÚ Výběr vhodné