v diagnostice infekčních onemocnění

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "v diagnostice infekčních onemocnění"

Michal Navrátil
před 9 lety
Počet zobrazení:

1 Postavení sekvenační analýzy v diagnostice infekčních onemocnění Bolehovská R., Plíš íšková L., Ryškov ková L. ÚKBD a ÚKM LF a FN Hradec Králov lové FONS

2 Význam určen ení původce infekce základní cíl l mikrobiologie (molekulárn extrahumánn nní genom) správn vná identifikace původce infekce rní biologie - etiologie infekčního onemocnění,, zánětuz volba antibiotické terapie, její délky 20 aža 25 % antibiotické empirické terapie je nasazeno nesprávn vně negativní důsledek pro prognózu pacienta urychlení dg. infekce rozhodnutí,, zda nalezená bakterie je skutečnou příčinou p zánětu, z onemocnění nebo je pouze kolonizujícím či i kontaminujícím mikroorganizmem

antibiotické empirické terapie je nasazeno nesprávn vně negativní důsledek pro prognózu pacienta urychlení dg.

3 specifické PCR Metodické přístupy - cílená diagnostika, využit ití specifických primerů, event.. sond pro detekci konkrétn tní bakterie, houby, viru - využit ití specifických primerů (PCR) s následnou n sekvenací pro hledání mutací (precore mutanta HBV, rezistence u HBV, CMV ) broad-range range PCR - primery z univerzáln lních oblastí - bakterie - 16S rrna,, ITS (16S a 23S rrna), 23S rrna - fungi 18S rrna,, ITS (ITS1 18S rrna a 5.8S rrna; ; ITS2 5.8S rrna a S rrna), 28S rrna

pro hledání mutací (precore mutanta HBV, rezistence u HBV, CMV ) broad-range range PCR - primery z univerzáln lních

4 Specifické PCR klinik (event( event.. mikrobiolog) očeko ekává určit itého původcevodce rychlejší ší,, lacinější ší,, citlivější - diagnostika původcp vodců bakteriáln lních meningitid NM, SP, SA, LM - průkaz DNA Mycobacterium TBC komplex - pneumonie (obraz HRCT) cílená detekce ASP, PC atd. Metody PCR (+ modifikace), rtpcr, multiplex PCR často komerční panely pro detekci původců BM, atyp.. pneumonií apod.

diagnostika původcp vodců bakteriáln lních meningitid NM, SP, SA, LM - průkaz DNA Mycobacterium TBC

5 Specifické PCR Př. bakteriáln lní meningitidy proč? - rychlost, event.. změna ATB - negativní mikrobiologický výsledek - konfirmace nejasného výsledku 7 nejčast astějších původcp vodců: Streptococcus pneumoniae (asi 37 %) Neisseria meningitidis (asi 32 %) Haemophilus influenzae b Listeria monocytogenes (asi 10 %) Staphylococcus aureus (asi 5 %) Escherichia coli Streptococcus agalactiae

astějších původcp vodců: Streptococcus pneumoniae (asi 37 %) Neisseria meningitidis (asi 32 %)

6 - 70 % BM objasněno no (kultivačně nalezen původce) - 30 % ne, vyšet etření PCR objasnění další ších 11 % infekcí

7 Diagnostika infekcí průkaz bakteriáln lní, fungáln lní DNA X virová DNA nelze - možnost detekce živý i mrtvých (event( event. dezintegrovaných) ) mikroorganizmů - hledání bakteriáln lního, fungáln lního původcevodce využit ití PCR metod - rychlost (BM, sepse,..) - pomalu nebo obtížně kultivovatelné bakterie (Mycobacterium, Tropheryma whippeli, ) - infekce s negativní kultivací nebo růst r bakterií potlačený ATB terapií hledání původce vodce při p zaléčených komunitních infekcích ch (artritidy) - bakterie rostoucí na cizorodém m materiálu (biofilmy)

.) - pomalu nebo obtížně kultivovatelné bakterie (Mycobacterium, Tropheryma whippeli, ) - infekce s negativní kultivací nebo růst r

8 Broad-range range PCR - ÚKBD izolace DNA amplifikace bakteriáln lní DNA (primery( z oblasti 16S rrna) ) nebo fungáln lní DNA (primery( z oblasti 18S rrna (event.. ITS) nebezpečí kontaminace - rozdělen lení prostorů a vybavení laboratoře, provedení izolace (lamin( laminár.. box, dezinfekce, UV světlo) - edukace personálu (rukavice, oblečen ení) - kontrola a ochrana činidel před p kontaminací (tzv. čisté chemikálie, zejm. polymerázy Molzym) - příprava prava PCR směsí box, UV světlo

. ITS) nebezpečí kontaminace - rozdělen lení prostorů a vybavení laboratoře, provedení izolace (lamin( laminár.

9 Broad-range range PCR - ÚKBD ELFO při i pozitivitě sekvenační analýza (detekční prostor) - čištění PCR produktu - sekvenační PCR (s F nebo R primerem) - čištění po sekvenační PCR - sekvenace přístroj stroj ABI vyhodnocení

11 Vyhodnocení Vyhodnocení zjištěné sekvence automaticky pomocí 3 databází přístupných na internetu - BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) - RDPII (Ribosomal( Database Project) - SepsiTest BLAST (Identification( by 16S/18S rdna Sequence Analysis) Nezastupitelná role mikrobiologa!!! FASTA formát: TCTGGTATCCCCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGACCCGGGAACGTAT TCACCGCAGTATGCTGACCTGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGCACTCGAGTTGCA GAGTGCAATCCGGACTACGATCGGTTTTCTGGGATTGGCTCCACCTCGCGGCTTGGCTA CCCTCTGTACCGACCATTGTATGACGTGTGAAGCCCTGGTCATAAGGGCCATGAGGACT TGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCATTAGAGTGCCCAACTA AATGATGGCAACTAATGACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGG

!! FASTA formát: TCTGGTATCCCCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGACCCGGGAACGTAT TCACCGCAGTATGCTGACCTGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGCACTCGAGTTGCA

12 Broad-range range PCR krevní sepse přibl.. 25 bakteriáln lních a fungáln lních původců je zodpovědných dných za 90 % sepsí - hemokultivace zlatý standard, nižší cena - PCR rychlost, ale krev je velmi problematickým materiálem (načasov asování odběru!!) - komerčních testů - (SeptiFast Roche, Sepsis ID (1-5) Seeplex,, atd.) multiplex PCR - broad-range range PCR - bakteriáln lní DNA ANO/NE, poté dourčen ení původce vodce sekvenační analýzou (komerční SepsiTest Molzym nebo in-house metoda)

cena - PCR rychlost, ale krev je velmi problematickým materiálem (načasov asování odběru!

13 Kazuistika č letý pacient v odpol.. hod. přijat p ijat na infekční kliniku dg. A399 meningokokové infekce, odběr r krve PCR, HK + aglutinace (negat( negat.. NM, HI, SP) dopoledne překlad p eklad na KARIM, dg. A403 septikémie CRP 322 (6h), 364 (12h), odběr r moči - specif.. PCR NM, SP - negativní - provedena detekce bakteriáln lní DNA v krvi, moči pozitivní,, provedena sekvenace s výsl. Streptococcus suis, nasazena cílenc lená ATB - kultivace obtížná,, později narostlo několik n kolonií Str. suis propuštěn

A403 septikémie CRP 322 (6h), 364 (12h), odběr r moči - specif.

14 Broad-range range PCR biofilmy - často dlouhodobá ATB terapie PCR diagnostika zásadnz sadní pro nalezení původcevodce - dg. endokarditid na chlopenních náhradn hradách - periprotetické infekce - infekce drenážních likvorových systémů další vhodné materiály punktáty ty kolene, plodové vody atd. - při i podezřen ení na určitou bakterii specifická PCR - neví se, jakého původce p vodce očeko ekávat - bakteriáln lní DNA, při i pozitivitě následná sekvenační analýza

endokarditid na chlopenních náhradn hradách - periprotetické infekce - infekce drenážních likvorových systémů další

15 Kazuistika č.. 2, 3 68-letý pacient - dg. I330 akutní a subakutn - materiál: aortáln lní chlopeň (9.3.) - ÚKM kultivace - aerobní negativn a subakutní infekční endokarditida negativní,, anaerobní kmen k doručen ení (Enterococcus faecalis) - PCR + sekvenace mat. na vyšet etření z ÚKM výsledek: Enterococcus faecalis 69-letý pacient (překlad eklad z Nem.. Chrudim) - dg. I339 akutní endokarditida - materiál: aortáln lní chlopeň (2. 9.) - ÚKM- kultivace negativní - PCR + sekvenace duáln lní infekce, specif.. PCR SA; pravděp. enterokok

. Chrudim) - dg. I339 akutní endokarditida - materiál: aortáln lní chlopeň (2. 9.

16 41-let letá pacientka Kazuistika č od 11/09 bolesti v lateráln lní části levého stehna bez úrazu, od vánoc v zhoršov ování,, výrazná bolestivost Nem.. Litomyšl - MRI suspekce na tumor odeslána na ortop.. kliniku FN HK (2M od začátku obtíží) CRP 554 mg/l, zhoršen ení stavu, sepse - provedena revize nález mohutných abscesů okolo femuru a osteomyelitidy, provedena trepanace, proplachová drenáž,, nasazena ATB - 1. den po operaci přelop eložena ena na KARIM (zhoršen ení vitál. fcí) - kultivace (17.1.) G- vláknit knité tyče, změna ATB (i na anaeroby) - gynekolog. vyšet etření dlouhodobě přesluhující nitrodělo ložní tělísko extrakce neúsp spěšná

. kliniku FN HK (2M od začátku obtíží) CRP 554 mg/l, zhoršen ení stavu, sepse - provedena revize nález mohutných abscesů okolo femuru a osteomyelitidy, provedena

17 Kazuistika č let letá pacientka - stomatol.. vyšet etření vešker kerá dentice kariézn zní extrakce zubů - komplikace hluboká žilní trombóza - progrese septického stavu materiál l absces (+ hnis) - ÚKM - nepotvrzeny nokardie a aktinomycety,, kult. 3 kolonie, které dále nerostou, nelze dourčit - PCR TBC + atyp. negat., PCR+sekvenace Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum změna ATB, zlepšen ení stavu, překlad p na chir.. JIP Litomyšl, stav se postupně upravil - konec 08/10 zpět t na ortop. klin. zlomenina femuru v místm stě pův.. trepanace z femuru odebrány vzorky ÚKM kult. negat., PCR + sekvenace Fusobact. nucleatum ATB

- nepotvrzeny nokardie a aktinomycety,, kult. 3 kolonie, které dále nerostou, nelze dourčit - PCR TBC + atyp. negat.

18 Kazuistika č letý pacient - příjem jem na ortop.. kliniku s dg. M0080 artr.. a polyartritida způsoben sobená jinými urč.. bakteriemi, mnohočetn etné lokalizace odběr r materiálu hnis z rány, r punktát t kolene ÚKM anaerobní negat., aerobní kultivace pozitivní (netypické růst, st, obtížné dourčen ení bakterie pravděpodobn podobně Eikenella nebo Kingella) kmen zaslán n na PCR+sekvenace dourčena Eikenella corrodens - původ vod infekce poúrazov razová artritida infekčního původu skákání na trampolíně,, kdy si chlapec zarazil zuby do kolene

, aerobní kultivace pozitivní (netypické růst, st, obtížné dourčen ení bakterie pravděpodobn podobně Eikenella nebo Kingella) kmen zaslán

19 Závěr Využit ití širokospektrých PCR se sekvenační analýzou v průkazu bakteriáln lních nebo fungáln lních původců infekcí má/bude mít m t své opodstatněné zastoupení,, které se ale nesmí přeceňovat limitace (identifikace klinicky významného patogena???) Při i využit ití těchto technik hraje velmi důled ležitou roli správn vná interpretace výsledků,, kde svou nezastupitelnou roli mám mezioborová spolupráce zejména s mikrobiologem, event.. klinikem.

(identifikace klinicky významného patogena?

20 Děkuji za pozornost

Podobné dokumenty

Význam sekvenační analýzy v mikrobiologické diagnostice

Význam sekvenační analýzy v mikrobiologické diagnostice Plíšková L., Kutová R., Bolehovská R., Ryšková L. ÚKBD, ÚKM FN Hradec Králové FONS 2012 Široké použití v mikrobiologii Identifikace mikroorganizmů