Ektomykorhizní symbióza

Transkript

1 Ektomykorhizní symbióza

2 Co to je ektomykorhiza? Symbiotické spojení mezi houbou a rostlinou Formuje se na fyziologicky aktivních laterálních kořínkách dřevin Ektomykorhiza je morfologická formace, na jejímž vzhledu se podílí jak rostlina tak houba Houbový plášť Střední válec kořene Kolonizace laterálních kořínků kortex endodermis Hartigova síť

3 Houba kolonizuje úsek laterálního kořínku tak, že hyfami proniká do primární kůry kořene a v mezibuněčných prostorách tvoří myceliární sít nazývanou Hartigova síť. Hartigova síť: u gymnospermních rostlin se formuje kolem a mezi buňkami kortexu (ale nepenetrují), angiospermních rostlin i u epidermálních buněk. Na povrchu kořene se z hyf utvoří kompaktní povlak hyfový plášť, který změní morfologii, anatomii a celkový vzhled kolonizovaného kořínku. Ostatní struktury: extramatrikální hyfy, sklerocia, rhizomorfy, laktifery, cystidia Vyskytuje se, až na vyjímky, výhradně u dřevin

4 Je známo: cca: druhů rostlin, které tvoří ektomykorhizu (Betulaceae, Dipterocarpaceae, Fagaceae, Myrtaceae, Pinaceae, Salicaceae) Cca druhů hub, které tvoří ektomykorhizu Odd: Basidiomycota Agaricales: Russulales: Boletales: Gomphales: Cantharellales: Polyporoid: Hymenochaetales: Thelephorales: Odd: Ascomycota příklad: Amanita sp. Russula sp, Lactarius sp. Boletus sp., Paxillus sp. Ramaria sp. Cantharellus sp. Polyporus sp,, Sistotrema sp., Coltricia sp. Thelephora sp. Tuberales: Tuber sp, Terfezia sp. Pezizales: Morchella sp., Genea sp., Helvella sp, Gyromitra sp. Elaphomycetales: Elaphomycetales sp. Deuteromycetes: Mycelia sterila: Coenococcum sp.

5 Proč? Rostlina poskytuje houbě: sacharidy: udává se, že rostliny investují až 10% fotosyntetických produktů do svého mykobionta glukóza je enzymaticky houbou přeměněna na trehalozu, manitol a glykogen pro houby jsou to zásobní látky a látky nezbytné ke klíčení spór Houba poskytuje rostlině: fosfor, vápník, draslík, mikroprvky vodu ochrana proti půdním patogenům Zvyšuje aktivní povrch kořenů Produkuje auxiny a gibereliny (rostlinné hormony)

6 Jak se ektomykorhiza utvoří? Vztah mezi houbou a rostlinou je dán geneticky, podílely se na něm evoluční procesy vztah je založen na synchronizovaném růstu kořenů a houby tj. na růstu a diferenciaci hyfy Rhizopogon sp.

7

8 Ze spór vyklíčí monokaryotické mycelium (Basidiomycety), které se mění (fúze a přezky) na dikaryotické (morfogeneze) aktivní mycelium, které aktivně (růstové tropismy)vyhledává hostitele, čerstvé aktivní kořínky. Hyfa kontaktuje povrch, enzymaticky a mechanicky rozrušuje povrchové buňky a tvoří hyfální plášť. Tento proces je doprovázen řadou biochemických reakcí, jak ze strany houby tak ze strany rostliny. Z hyfálního pláště se pak pojí množství externích hyf s půdním okolím kořínku vytváří tzv. aktivní zónu (několik mmm kolem kořínku) Hyfa penetruje a kolonizuje prostor kortexu (jehličnany) a epidermálních buněk (listnáče) a formuje Hartigovu síť Rostliny po dobu formace ektomykorhizního spojení produkují polyfenoly a sekundární metabolity, jenž zvyšují jejich rezistenci proti půdním patogenům houbám, bakteriím i hmyzu. Houba sama o sobě má ještě tzv. bakteriální pomocníky (helper bacteria), které usnadňují kolonizaci kořene Ektomykorhizní spojení na 1 laterálním kořínku je časově i prostorově omezené. Závisí na stáří a fyziologii laterálního kořínku. Hartigova sít postupně odumírá a hyfální plášť mění na základě metabolitů barvu a postupně odumírá (jedná se ale o jeden jediný morfotyp a současně se vždy tvoří mnoho nových současně s růstem dalších laterálních kořínků).

9 Výsledkem je: že na kořeni 1 stromu se tvoří, je a odumírá množství ektomykorhiz, tvořené rozmanitými druhy hub Kořínek může houbu přerůst a často bývá kolonizován více druhy ECMf Na základě toho, jak jsou ECM houby dominantní v prostoru a čase rozlišujeme Ranně sukcesní druhy, pozdně sukcesní druhy a multisukcesní (early, late, & multistage) Tvorba plodnic nesouvisí s tvorbou ECM, nemusí ovlivňovat dominanci druhu na kořenech dané dřeviny Na základě biologické specifičnosti druhu (metabolity, biochemické aktivity, morfologie) je ektomykorhiza formovaná každým konkrétním rodem morfologicky odlišná pozměňuje tvar a barvu kořínku ektomykorhizní morfotypy

10 Na čem závisí druhové spektrum ektomykorhizních hub? 1. Rostlina- druh, věk, fyziologický stav 2. Houba druh, specifická vazba na hostitele, nutriční požadavky 3. Prostředí- typ půdy (moder - ektomykorhizní, mor ekto, ektendo-, erikoidní), okolní vlivy hnojení, sešlap, spady.. Etc. Počasí období vegetačního klidu pro dřeviny omezená tvorba ektomykorhizních špiček, tenčí hyfální plášť apod. R H čas prostředí

11 Jak určím o kterou ektomykorhizní houbu se jedná? Plodnice Morfologické charakteristiky Anatomické charakteristiky Molekulární metody Hebeloma crustuliniforme

12 Řád: Theleophorales (plesňákotvaré) Plodnice mohou být resupinátní až pileátní Hymenofór hladký, zubaté, porovité Monomitický systém Hyfy jsou tmavé, pigmentované Zástupci jsou lignikolní druhy nebo mykorhizní

13 Metody identifikace ektomykorhiz a. Binolupa + mikroskop Kvalitativní určení rod (druh) houby Kvantitativní určení procentické zastoupení druhu na celkové mykorhizaci, frekvence 1 druhu na definovanou délku kořene

14 Morfologie ECM špiček morfotypy:určujeme pod binolupou, propláchnuté kořínky jsou zcela ponořené ve vodě v Petriho misce! 1. Větvení, délka, abundance, průměr mykorhizních špiček Nevětvené solitérní špičky (Coenococcum sp.) Monopodiálně pinátní (Russula nigricans)

15 Nepravidelně větvené (Thelephora sp.) Koraloidní (Rhizopogon sp.)

16 2. Zakončení nevětvených částí morfotypů: rovné ohnuté vlnité kroucené smáčknuté mezi mladší a starší částí

17 3. Povrch houbového pláště + barva Hustě zrnatý nebo bradavičnatý Silně vlnatý ochmýřený Hladký lesklý Tomentella sp.

18 4. Přítomnost ostatních struktur rhizomorfy, extramatrikální hyfy (morfologie), cystidia, sklerocia, laktifery. Amphinema byssoides: Thelephorales

19 5. Anatomie morfotypu: Hartigova síť a uspořádání buněk hyfálního pláště. mikroskop

20 Anatomie pláště a Hartigovy sítě 1. Celková anatomie mykorhizy 2. Anatomie laktifer, hyf (přítomnost přezek, anatomóz, napojení hyf etc.) 3. Jednotlivých vrstev houbového pláště 4. Tvar a uspořádání buněk (parenchymatické,pseudo parenchymatické) 1. Přítomnost chlamydospór, haustorií Paxillus involutus - Hartigova síť

21 Hyfa s přezkou

22 Scleroderma citrinum (Basidiomycota: Sclerodermatales) rhizomorfa

23 Laccaria sp. Basidiomycota: Agaricales (Quercus robur) Rhizomorfy

24 Paxillus involutus Boletales: Homobasidiomycetes:Basidiomycota (Quercus robur)

25 Coenococcum geophillum: Ř: Mycelia sterila: č: Deuteromycetes: Kmen: Ascomycota (melanizovaný povrch, R- strategové)

26 6. Využití autofluorescence v určité vlnové délce (UV filtr) 7. Chemické reakce (Fuchsin, anilin, síran železitý, Melzerovo reagens, sulfovanilin etc.)

27 c. Molekulární metody používané k identifikaci ECM hub a jejich populací Něco málo o DNA hub. U většiny ECM hub je DNA vysoce polymorfní výhodné a strategické Polymorfní úseky s neznámou funkcí - anonymní loci Polymorfní úseky se vyskytují v určité frekvenci ITS (interspecific transcribed spacer) repetitivní úseky) Pro ECM: ITS1 ITS2 ITS 1F ITS 4 (reverse)

28 1. PCR-rITS- RFLP metoda analýzy restrikčních fragmentů genetické markery = značky, ukazatele se silnou genetickou kontrolou, neovlivněnou prostředím morfologické markery biochemické markery markery (barva HO) markery (přítomnost určitých látek v HO podmiňují geny -> > přítomnost látky dokazuje přítomnost genu) markery (analýzy DNA ) molekulární markery DNA markery.molekulární markery 2. Metoda přímé sekvenace 3. Metoda hybridizace PCR produktu, klonování a sekvenace 4. Metoda mikrosatelitních markerů, ssr- markery (single sequence repeat markers) (velmi krátké motivy (velmi krátké motivy 2-6 bp,, opakující se v DNA s určitou pravidelností v rámci rodu, druhu) 5. DGGE (denaturating gradient gel electrophoresis)

29 Molekulární markery: umožňují identifikaci organizmu stanoví příbuzenské vztahy Výhoda DNA markerů: rychlá a spolehlivá determinace základní princip metody PCR ITS RFLP I. štěpení celkové DNA (s amplifikovanými ITS úseky) na fragmenty pomocí restrikčních endonukleáz II. III. IV. elektroforetické rozdělení fragmentů dle délky přenos fragmentů na membránu hybridizace DNA

30 Zdrojem DNA v případě ECM bude: Kořenová špička - očištěná In vitro kultura (y) získaná (é) z kořenové špičky

31 PCR Polymerase Chain Reaction (polymerázová řetězová reakce) - vyvinuto v 80. letech 20. století - jedna z nejpoužívanějších metod molekulárně genetické diagnostiky základní princip metody in vitro syntéza vybraného úseku DNA, která probíhá v mnoha opakujících se cyklech fragmenty nasyntetizované během reakce lze pozorovat na agarózovém gelu možno analyzovat i velmi malé množství DNA

32 PCR - teplotní fáze 1. teplotní fáze 95 C - denaturace zvýšením teploty dojde k oddělení obou řetězců dvoušroubovice od sebe (řetězce jsou k sobě poutány vodíkovými můstky, dodání energie zapříčiní zánik těchto vazebných interakcí) 2. teplotní fáze C annealing ochlazení umožní přisednutí primerů k homologním místům a vytvoření krátkých dvoušroubovic DNA 3. teplotní fáze 72 C polymerace upravením teploty (zvýšením) na hodnotu vhodnou pro působení DNA polymerázy dochází k prodlužování dvoušroubovice DNA (5 3 ) až po začátek další denaturace (nového cyklu)

33 Průběh PCR daný fragment DNA přibývá exponenciální rychlostí (2 n = počet fragmentů po n cyklech) v praxi se používá cca 30 cyklů, při nichž dojde k vyčerpání reakčních složek a růst se zastavuje poznámka: billion je v češtině miliarda

34 Výsledkem je PCR produkt s amplifikovanými ITS úseky Nejčastěji: ITS 1, ITS2, ITS 4, ITS 1-F (nespecifické markery) Specifické markery: syntetizované pro daný konkrétní druh Vizuální efekt: elektroforetický produkt s rozdílným bp (páry bazí) (rozdílná délka produktů vzhledem k rozdílnosti analyzovaných morfotypů) rozdíly zatím neříkají vůbec nic o druhovém složení Další krok: stěpíme!!!

35 Štěpení celkové DNA na fragmenty pomocí restrikčních endonukleáz restrikční endonukleázy - enzymy izolované z bakterií jméno podle názvu bakterie, z které byl izolován (např.: EcoRI - Escherischia coli, AluI - Arthrobacter luteus) rozeznávají určitou sekvenci DNA a podle ní DNA specificky štěpí tato sekvence DNA tvoří palindrom - je symetrická kolem centrálního bodu sekvence sestává nejčastěji z 4 bp (base pair - pár bází) nebo 6 bp EcoRI - AluI -

36 Elektroforetické rozdělení fragmentů DNA podle jejich délky elektroforéza obecně metoda pomocí níž lze rozdělit makromolekuly, resp. fragmenty DNA, podle jejich délky princip - makromolekuly s elektrickým nábojem se v elektrickém poli pohybují k jedné z elektrod v závislosti na své relativní molekulové hmotnosti, celkovém náboji a tvaru stejně dlouhé fragmenty DNA se v elektrickém poli pohybují stejně rychle a vytvoří proužek

37 ITS/RFLP pattern obtained by using EcoRI and Hinf 1 endonuclease PCR produkt neštěpený Eco RI Hinf I

38 Marker (bp) LAK12 LAK13 LAK14 NR EcoRI HinfI NR EcoRI HinfI NR EcoRI HinfI 1,517 0,615 0,369 0,283 0,495 0,290 0,277 0,523 (0,373)* 0,277 1,200 0,277 0,271 0,241 0,247 0,290 0,245 1,000 0,105 0,237 0,020 0,900 0,100 0,615 0,646 0,614 0,495 0,531 0,524 0,523 (0,900)* 0,542 0,527

39 RFLP metoda sama o sobě vykazuje variabilitu v závislosti na a. Přístupu pracovníka a pořádku v laboratoři b. Použitých chemikáliích a metodických přístupech c. ECM špička může být více než jedním houbových organismem d. ECM špička je tvořena jedním houbovým organismem vykazující variabilní polymorfismus v rámci jedné genety e. Takže rozhodneme se pro 1. přímou sekvenaci (rychlejší, ale nezaručuji kvalitní výsledek) 2. Hybridizaci, zaklonování do sekvence bakteriální klonované buňky a sekvenaci (zdlouhavější, kvalitnější, ale závisí na kvalitě práce)

40 Výsledkem sekvenace by měla být jasně identifikovaná DNA v rámci amplifikovaného ITS úseku, která na základě NCBI náleží konkrétnímu houbovému organismu (databáze). 17B.zeller 11S.bovist 24L.quietu 18L.quietu 20T.myomy Optimální je pro identifikaci mykorhiz kombinovat metodu morfologického popisu a metodu molekulární identifikace. 10L.laccat 23T.sublil 3T.terrest 12T.terres