Mikrobiologické riziko octových bakterií při výrobě syrovátkových nápojů

Transkript

1 Vysoká škola chemicko-technologická v Praze Fakulta potravinářské a biochemické technologie Ústav konzervace potravin Mikrobiologické riziko octových bakterií při výrobě syrovátkových nápojů Eva Šviráková Jakub Kyznar, Kateřina Loupancová 1 Workshop v rámci projektu QK (MZe/NAZV), VÚVeL v. v. i., Brno,

2 Kontrola hygieny prostředí a bezpečnosti výrobků v mlékárenských provozech Výroba syrovátkových ochucených nápojů Potenciální mikrobiologické riziko Výskyt neušlechtilých octových bakterií Octové bakterie (OC) Technologicky nežádoucí bakterie Některé rody/druhy potenciálně patogenní 2

3 Taxonomie octových bakterií (Acetic Acid Bacteria) Doména: Bacteria Oddělení: Proteobacteria Třída: Alphaproteobacteria Řád: Rhodospirilalles Čeleď: Acetobacteraceae Rod: Acetobacter, Asaia, Gluconoacetobacter, Gluconobacter, Kozakia aj. 3

4 Charakteristika octových bakterií Morfologie: - G krátké tyčinky, - 2,5 4,0 µm 0,5 1,5 µm Fyziologie: - optimální kultivační teplota: C Gluconobacter - optimální ph kultivačního média: 5,0 6,5 cerinus Biochemie: - oxidáza, kataláza +, - striktně aerobní metabolismus Patogeneze: - některé druhy podmíněně patogenní: Gluconobacter Acetobacter cibinongensis, Asaia borogensis oxydans Asaia lannensis, Gluconobacter frauterii 4

5 Výskyt octových bakterií 1 PŘÍRODNÍ ZDROJE Květiny, rostliny Ovoce (jablka, jahody, hroznové víno, manga, kokosy aj.) Rýže, káva (zrna), čaj (čajové extrakty) Proso ragi Hmyz (octomilka obecná, včela medonosná, komár, křísek révový aj.) LIDSKÉ ZDROJE Infikovaní pacienti Klinický materiál (tkáně pacientů: chronické nemoci/ endokarnitida, kontaminovaná krev) Komár (Anopheles stephensi) Křísek révový (Scaphoideus titanus) 5

6 Výskyt octových bakterií 2 POTRAVINÁŘSTVÍ / MLÉKÁRENSTVÍ Nežádoucí kontaminace výrobků octovými bakteriemi Ovocné mošty, fermentované nápoje (víno aj.) Cukr, cukerné sirupy (ovocné, bylinné, s kořením) Syrovátkové ochucené nápoje (aloe vera, brusinka, mango, maracuja, mandarinka, pomeranč aj.) 6

7 Nežádoucí kontaminace tekutých výrobků OB: senzorické defekty Fragmenty biofilmu Asaia sp.: závojnaté klky plovoucí ve vzorku kontaminovaného tekutého ochuceného nápoje Fragmenty biofilmu Asaia sp.: závojnaté klky plovoucí ve vzorku kontaminované vody 7

8 Nežádoucí kontaminace tekutých výrobků OB: tvorba biofilmů 1 Mikrobiální kapsy Potrubní cesty, dávkovací hlavice (plastové hadičky) aj. Obtížně sanitovatelná místa s opakovaným výskytem biofilmu Významný zdroj sekundární kontaminace! Kontaminované nealkoholické ochucené nápoje, vč. syrovátkových ochucených nápojů: Snížení zdravotní bezpečnosti a jakosti výrobků Vznik senzorických defektů Tvorba biofilmu r. Acetobacter, r. Asaia, r. Gluconoacetobacter, r. Gluconobacter, r. Kozakia aj. 8

9 Detekce biofilmů u octových bakterií Nežádoucí kontaminace tekutých výrobků OB: tvorba biofilmů 2 Použité metody Christensenova zkumavková metoda: modifikovaná v mikrotitračních destičkách Metoda s využitím agaru s kongo červení Sprejová metoda (Christeyns, SPE) Použité kmeny 9 sbírkových kmenů OB CCM Česká sbírka mikroorganismů, Přírodovědecká fakulta MU Brno, CZE 9

10 Nežádoucí kontaminace tekutých Testované kmeny octových bakterií výrobků OB: tvorba biofilmů 3 TESTOVANÉ OCTOVÉ BAKTERIE Gluconobacter albidus CCM 2365 Gluconobacter cerinus CCM 1860 T Gluconobacter cerinus CCM 1792 Gluconobacter oxydans CCM 1772 Gluconobacter oxydans CCM 3618 Gluconoacetobacter liquefaciens CCM 3621 Gluconoacetobacter xylinus CCM 3611 Gluconoacetobacter hansenii CCM 1808 Kozakia baliensis CCM

11 Nežádoucí kontaminace tekutých výrobků OB: tvorba biofilmů 4 Christensenova zkumavková metoda: modifikace v mikrotitračních destičkách (Olivares a kol., 2016) Kultivace OB: bujón BHI (30 C/48 h, aerobně), mikrotitrační destičky Promytí: destilovaná voda (5 ) Fixace a barvení: 0,1% krystalová violeť (150 µl) Vylití krystalové violeti Promytí: destilovaná voda (5 ) Hodnocení biofilmpozitivity (+++/++/+) a biofilmnegativity (-) Výsledek: součet bodů získaných ze 4 jamek (stupnice 0 12 bodů) 11

12 Nežádoucí kontaminace tekutých výrobků OB: tvorba biofilmů 5 Detekce biofilmu na agaru s kongo červení (Kaseir a kol., 2013) Médium: BHI (37 g/l) + sacharóza (5 %) + glukóza (4 %) Barvivo: kongo červeň (0,8 g/l) Sterilace (zvlášť): 121 C/15 min, poté smíchání složek při 55 C Inokulace PM: OB (100 μl, technika roztěru) Kultivace: Gluconoacetobater spp. (25 C/48 h), Gluconobacter spp. (30 C/48 h), Kozakia sp. (30 C/48 h) Hodnocení: biofilm negativita (červená či růžová barva) biofilm pozitivita (černá barva) Slepý pokus Gln. albidus CCM 2365 Gln. oxydans CCM 3611 Gla. liquefaciens CCM

13 Nežádoucí kontaminace tekutých výrobků OB: tvorba biofilmů 6 Detekce biofilmu s využitím spreje TBF 300 S (Christeyns, ESP) Kultivace OB: bujón BHI (30 C, 48 h, aerobně), zkumavky Promytí: destilovaná voda (2 ) Barvení: identifikační sprej TBF 300 S (Christeyns, ESP) Působení: 5 min Promytí: destilovaná voda Hodnocení: biofilm pozitivita (růžová barva) biofilm negativita (vymytí barvy) 13

14 Nežádoucí kontaminace tekutých výrobků OB: tvorba biofilmů 7 Bakteriální kmen Christensen. metoda Tvorba biofilmu Metoda agar+kongo červeň Sprejová metoda Gluconobacter albidus CCM 2365 Gluconobacter cerinus CCM 1860T Gluconobacter cerinus CCM Gluconobacter oxydans CCM Gluconobacter oxydans CCM 3618 Gluconoacetobacter liquefaciens CCM Gluconoacetobacter xylinus CCM Gluconoacetobacter hansenii CCM 1808 Kozakia baliensis CCM slabá tvorba biofilmu, ++ střední tvorba biofilmu, +++ silná tvorba biofilmu, žádná tvorba biofilmu 14

15 Specifická růstová rychlost OB: sladká syrovátka bez/s glukózou Specifická růstová rychlost (µ) Asaia lannensis 15E, Gluconacetobacter liquefaciens CCM 3621, Kozakia baliensis CCM 7137 Kultivace: sladká syrovátka bez/s přídavkem glukosy (4 hm. %), 25 C Specifická růstová rychlost: růstová rychlost na jednotku biomasy 1 5

16 Generační doba OB: sladká syrovátka bez/s glukózou Generační doba (g) Asaia lannensis 15E, Gluconacetobacter liquefaciens CCM 3621, Kozakia baliensis CCM 7137 Kultivace: sladká syrovátka bez/s přídavkem glukosy (4 hm. %), 25 C Generační doba: doba potřebná k vytvoření 1 generace buněk (mezi 2 děleními) 1 6

17 Růstové charakteristiky OB: zhodnocení výsledků 1. Octové bakterie (OB) nebyly schopny využívat pro svůj růst laktosu přirozeně obsaženou ve sladké, rekonstituované, pasterované syrovátce tak účinně, jako cíleně přidanou glukosu (4 hm. %) 2. Délka lag-fáze se u OB v syrovátce bez přídavku glukosy pohybovala v rozmezí 4-17 h a v syrovátce s přídavkem glukosy (4 hm. %) v rozmezí 9-31 h 3. Podle specifických růstových rychlostí a generačních dob OB bylo konstatováno, že pro OB byla vhodnějším substrátem syrovátka s přídavkem glukosy (4 hm. %), než syrovátka bez přídavku glukosy 1 7

18 ZÁVĚR Výsledky této práce mohou být využity při zvyšování zdravotní bezpečnosti, technologické nezávadnosti a jakosti ochucených i neochucených nápojů na bázi sladké syrovátky, které podléhají kontaminaci různými nežádoucími bakteriemi, vč. bakterií octového kvašení 18

19 LITERATURA Harrison, J.J., Turner, R.J., Marquez, L.L.R., Ceri, H. Biofilms. American Scientist 2005, 93: Kaiser, T.D.L., Pereira, E.M., dos Santos, K.R.N., Maciel, E.L.N., Schuenck, R.P., Nunes, A.P.F. Modification of the Congo red agar method to detect biofilm production by Staphylococcus epidermidis. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 2013, 75: Olivares, E., Badel-Berchoux, S., Provot, C., Jaulhac, B., Prévost, G., Bernardi, T., Jehl, F. The biofilm ring test: a rapid method for routine analysis of biofilm formation kinetics. Journal of Clinical Microbiology 2016, 54:

20 Poděkování Tato práce byla podpořena Ministerstvem zemědělství, Národní agenturou pro zemědělský výzkum, projektem QK ( , MZE/QK), v programu QK Program aplikovaného výzkumu Ministerstva zemědělství na období "ZEMĚ", s dobou řešení projektu: 02/ /

21 Děkuji za pozornost Workshop v rámci projektu QK (MZe/NAZV), VÚVeL v. v. i., Brno,