Optické mikroskopy. 1) Úvod + 2) použití

Transkript

1 Optické mikroskopy Osnova : 1) Úvod 2) Použití 3) Historie 4) Princip zobrazení 5) Složení optického mikroskopu 6) Základní používané pojmy 7) Vady čoček + typy objektivů 8) Seznam firem na trhu 1) Úvod + 2) použití Z knížky Mikroskop - přístroj určený k pozorování drobných předmětů n. k rozlišení podrobností na pozorovaném předmětu Druhy mikroskopů podle způsobu zobrazení předmětu elektronové (proud elektronů) tunelovací (kontakt jednoatomového hrotu s atomy povrchu vzorku rozdíl potenciálů vznik proudu) světelné (světelný paprsek) podle osvětlení objektu.. v procházejícím světle ( světlo prochází pozorovaným objektem).. v dopadajícím světle ( světlo dopadá na povrch objektu) podle osvětlení okolí objektu.. ve světlém poli (objekt má tmavý obrys a nalézá se ve světlém poli).. v temném poli (světlý objekt v temném poli, méně se používá) Adresa: ceg@fsv.cvut.cz Mikroskopické metody Optická mikroskopie Optická mikroskopie umožňuje pozorovat mikroskopické objekty a struktury do násobného zvětšení bez speciálních úprav mikroskopu a při běžné přípravě vzorků broušením a leštěním nebo rozložených na skleněné podložce. Pozorování neleštěných povrchů v odraženém světle je u běžných mikroskopů možné jen u malých zvětšení pokud je nerovnost povrchu menší než hloubka ostrosti použitého objektivu. Pozorování neleštěných povrchů při větším zvětšení umožňuje konfokální mikroskop, dosahující zvýšenou hloubku ostrosti speciální konstrukcí optické soustavy nebo speciální software SIS Extended Focal Imaging, který dosahuje zaostření snímku objektu digitální rekonstrukcí série snímků pořízených při rozdílném zaostření. Optická mikroskopie umožňuje pozorovat vzorky v přirozeném stavu včetně vlhkosti a s malými úpravami též při nižších nebo vyšších teplotách. 1

2 Mikroskopická laboratoř FSv ČVUT je vybavena optickými mikroskopy ZEISS Neophot 21, Metaval, Amplival s mikrotvrdoměrem PAAR a videomikroskopem OLYMPUS OVM 1000NM, majícím objektivy se zvýšenou hloubkou ostrosti. Optická mikroskopie a obrazová analýza Systém obrazové analýzy byl v laboratoři uveden do provozu na počátku roku Skládá se ze tří částí: z optického mikroskopu, makro soustavy a PC s obrazovou analýzou. Optický mikroskop s mikrofotografickým zařízením umožňuje pozorování mikroskopických preparátů v procházejícím i v odraženém světle při zvětšení 1000x a při použití zoomu pak ještě větším. K dalšímu příslušenství patří vybavení pro epifluorescenci, dále pro temné pole, polarizované světlo a Nomarského DIC v odraženém i procházejícím světle. Makro soustava je tvořena repro stativem s osvětlovací soustavou. Na stativ je možno připevnit barevnou CCD video kameru s makro video zoom objektivy, které umožňují vytváření dokumentačních snímků nebo obrazů s různým zvětšením a nahrazují tak částečně stereomikroskop. Obrazy z mikroskopu nebo z makrooptiky snímané barevnou TV 3 CCD kamerou nebo černobílou CCD kamerou mohou být archivovány, softwarově upravovány, proměřovány a dále matematicky zpracovávány. Využití v celních laboratořích Optický mikroskop ve spojení s obrazovou analýzou je využíván např. v analýze papíru pro zjištění přítomnosti anorganického nátěru a stanovení vlákninového složení. U keramických dlaždic se posuzuje glazování. U dřevin se podle buněčné stavby rozlišují jejich druhy. Dále tato technika nachází uplatnění při rozlišování druhů vláken, škrobů, měří se tloušťka tenkých vrstev apod. Makro soustava se používá k dokumentaci vzorků, při posuzování heterogenních směsí, měření velikosti částic u sypkých materiálů, při rozlišení dřevovláknitých desek apod. Rozsah aplikací celého systému je velký a dále se rozšiřuje podle problémů, které vyvstávají u nově analyzovaných vzorků. glazovaná dlaždice, polarizované odražené světlo, zvětšení 200x příčný řez tropickou dřevinou Seraya, procházející světlo, zvětšení 200x 2

3 Z knížky Na principu mikroskopu jsou založeny Stereomikroskopie (prostorové zobrazování objektu, přístroj - stereomikroskop) Mikrofotografie (znázornění objektu pomocí fotografie,přístroje - fotokamera, zaostřovací zařízení, expoziční automat ) Mikrokinematografie (filmování pohyblivých obrázků) Mikrofotometrie (měření světelných intenzit, fotometr spojený s mikroskopem, fotonásobič, ) Inverzní m. (pozorování objektů zespodu, přístroj inverzní mikroskop, objektiv má pod stolkem, kondensor nad ním ) Mikromanipulace, mikrokultivace, m. za speciálních podmínek řada dalších.. Adresa mikroskopy.cz Optická mikroskopie je základem mikrostrukturální analýzy už přes 100 let. Tvar a technika mikroskopu se během posledních 40 let změnily jen málo, přičemž k největšímu pokroku došlo v oblasti vícenásobných optických vrstev (multilayer coating) sloužících k redukci nežádoucích odrazů světla na povrchu skel. Co se ale opravdu změnilo, je přístup k přípravě povrchu pro mikrostrukturální analýzu. Ta dnes dosahuje celistvosti vzorku a povrchové planarity na úrovni, která dříve byla nedosažitelná. Pokud se povrchová planarita mezi fázemi složky pohybuje v rozsahu jednoho mikrometru (1µm), je možné plně využít interferenčních technik. Další dimenzi získává analýza vzorku v případě průsvitných materiálů připravených celistvě a zkoumaných na tmavém poli. Při přípravě drolivých materiálů pomocí drcení, které zamezuje obrušování povrchu, je možné optickou aktivitu zesílit pomocí polarizačních technik. Při pozorování přesného obrazu uhlíkových vláken můžeme pomocí potlačení barev určit jejich směrovou orientaci. Lze doložit, jak použití nesprávné techniky může vést k chybné analýze, a také že pro získání komplexního pohledu je důležité použít kombinované optické techniky. Tato přednáška se proto zaměřuje na vizuální stránku, přičemž používá řadu mikrofotografií, které dokumentují autorovy rozsáhlé zkušenosti jak v přípravě povrchů, tak v používání technik optické mikroskopie. Adresa - httpstaffold.vscht.czktkwwwrootstaffkratkabrno% htm Praktické využití mikroskopie v potravinářství J. Krátká, M. Maryška *, M. Voldřich, F. Kvasnička, R. Ševčík, P. Skálová, M. Dušek Ústav konzervace potravin a technologie masa * Ústav skla a keramiky Abstract: 3

4 Food processing is accompanied by various technological defects and faults, some of them are important for the quality of product or can influence its safety. The mentioned faults or technological defects can result from the technology or from external factors (work power, equipment, premises, hygiene, etc.). The faults and defect are prevented by the quality assurance systems, the food safety defect by HACCP. These systems need suitable monitoring, the optical macro and microscopy combined with computer image analysis could be a useful tool for this purpose (detection of clouds and sediments in drinks, identification of foreign bodies in food, etc.). Detection of authenticity of food products seems to be another perspective field of the use of the mentioned methods, especially evaluation of powdered products (spices, tea, coffee, addition of non permitted or undeclared additives into the powder products, etc.), detection of pulp particles in fruit juices, identification of botanical origin, etc. The presentation includes the examples of the use of these procedures for identification of clouds and sediments in spirits, detection of falsification of milled pepper, identification of foreign bodies in vine and others. Mikroskopie jako taková, je rychlá a jednoduchá metoda, pro kterou zpravidla není třeba složitě připravovat vzorky. Zároveň umožňuje ve spojení s digitálním fotoaparátem či digitální kamerou pořízení a uchování velkého množství dat. Tak je možné vytvořit širokou databázi zjištěných závad potravinářských komodit, doplněnou o souhrnné informace použitých metod izolace vzorků a jejich přípravy. Takto vytvořenou základní databázi je možné průběžně doplňovat výsledky příslušné chemické analýzy upřesňující vlastní mikroskopické stanovení. Kompletní a průběžně aktualizovanou informační databázi lze použít jak k rychlému určení problému a rozhodnutí o dalším postupu při rozboru vzorku, tak i k vyhledávání zpětných informací o již provedených nálezech. Při využití moderní techniky je archivace získaných dat nenáročná, levná a téměř bez nároků na skladovací prostor a údržbu dat. V současnosti tak lze uchovávat na poměrně malém disku nejen textové a datové soubory v podobě snímků, ale i ve formátu celých video sekvencí. V naší práci bylo používáno světelného mikroskopu s možností polarizace světla, digitálního fotoaparátu, kamery a softwaru Lucia, umožňujícího zpracování digitálních snímků. Při detekci různých složek zkoumaných vzorků potravinářských výrobků je někdy nezbytné použít metody mikroskopie v polarizovaném světle. Z izotropních a anizotropních vlastností látek lze potom odhadnout jejich iontovou a molekulární strukturu. Mezi anizotropní látky řadíme takové, které propouštějí polarizované světlo do určité roviny rychleji než světlo kmitající kolmo na tuto rovinu. Tato vlastnost se projevuje např. u škrobu, buněčných stěn, fibril, jaderné membrány, krystaly atd. Jsou to látky s pravidelnou orientací základních stavebních složek. Hlavním předmětem této práce je za prvé detekce příčin zákalů ve výrobě různých typů alkoholických a nealkoholických nápojů, za druhé pak detekce falšování potravin přidáváním levnějších a lehce dostupných příměsí. Detekci příčin zákalů v tekutých výrobcích lze rozdělit na dva směry. 4

5 Makroskopické zkoumání výrobků zahrnuje především určení mikrobiologické příčiny zákalu. Přitom sledujeme změnu barvy výrobku, vývoj plynů, vznik přípachů a pachuti, změnu konzistence a všeobecně změnu senzorických vlastností daného výrobku; Mikroskopické zkoumání navazuje na makroskopické a jeho cílem je dále prohloubit znalosti o původu zákalu. Sledujeme obsah nežádoucí mikrobiální kontaminace (obsah kvasinek, plísní a bakterií), popřípadě detekujeme obsah částic rostlinných pletiv, organických nebo anorganických přimísenin či sloučenin, vzniklých z přidaných činidel. V zásadě je možné rozdělit příčiny vzniku zákalů do několika skupin: 1. zákaly anorganického původu: Fe, Cu, Sn, Al, azbestová a celulózová vlákna 2. zákaly organického původu : vinný kámen, vápenaté soli kyseliny vinné, slizové a šťavelové, bílkoviny a jejich komplexy s polyfenoly a ionty kovů, třísloviny a jejich komplexy s pektiny, škrob 3. zákaly biologického původu: kvasinky, plísně a bakterie K potvrzení mikroskopického nálezu lze použít na příklad barevných reakcí zákalů s reagenčním činidlem. K dalším kvantitativním a kvalitativním stanovením lze pak využít některých instrumentálních metod. V našem případě bylo zpravidla používáno isotachoforetické stanovení kationtů. Druhým, neméně podstatným směrem našeho výzkumu, je využití mikroskopie k detekci falšování potravinářských výrobků. Zkoumaný vzorek lze opět prověřovat jak makroskopicky tak mikroskopicky. Lze tak ověřit botanické znaky specifické pro daný druh a prokázat identitu prověřovaného zboží. Zároveň lze mikroskopii použít pro sledování některých úseků technologických operací. Lze tak např. kontrolovat mletí kakaové hmoty či funkci emulgátorů a homogenizátorů. Mikroskopický rozbor vybraných komodit: 1. Med: Mikroskopickým zkoumáním jeho sedimentu lze určit podle druhu (velikosti, tvaru a specifických znaků) pylových zrn druh medu. Lze tedy bezpečně určit jeho botanický původ (akátový, lipový, luční, lesní). Zároveň lze, v návaznosti na předchozí stanovení, určit dobu květu a tak stanovit zda se jedná o med jarní, letní nebo podzimní. Stejně tak lze stanovit i geografický původ medu. Tento fakt je důležitý zejména při dokazování úmyslné deklarace medu jiného původu (např. pravého anglického medu s nálezem pylových zrn typické australské flóry). U zkaženého medu lze pak vždy detekovat zvýšený výskyt kvasinek, plísní nebo bakterií. 2. Výrobky z ovoce a zeleniny: Jedná se především o různé druhy marmelád a džemů. Jejich mikroskopickým rozborem a určením charakteristických biologických znaků jednotlivých druhů lze potvrdit nebo vyvrátit 5

6 pravost a množství deklarovaného ovocného základu. U sušených výrobků lze mikrobiologickou detekci využít k identifikaci povrchových roztočů a nedoporučit nebo vyloučit takový výrobek z distribuční sítě. 3. Koření: Při mikroskopickém rozboru koření lze zkoumat řadu parametrů typických pro daný botanický druh. Lze tak od sebe rozlišit kvalitní a nekvalitní zboží, co se týče kvality jednotlivých rostlinných druhů. Zároveň lze potvrdit či vyvrátit podezření z nastavení výrobku některou z dostupnějších a levnějších komodit ( nastavení pepře škrobem). Při rozboru koření se tak sledují především tvary a velikost buněk, trichomů, sekrečních kanálků, zásobních buněk a škrobových zrn. Dále se sleduje struktura povrchu listů a průduchů po obou jejich stranách, tvar a velikost pylových zrn, sklerenchymatických buněk. Mikroskopicky lze rovněž detekovat pro daný druh charakteristické sloučeniny (např. šťovan vápenatý ve vanilce, oxalát vápenatý v česneku). 4. Káva: Mikroskopickým rozborem kávy lze určit její pravost, tzn. botanický druh deklarovaného zboží. Dále lze ve výrobku detekovat možný obsah kávovinových náhražek, jako jsou fíky, čekanka, řepa, pampeliška, žito nebo ječmen. 5. Mlýnské výrobky: U mlýnských výrobků se mikroskopicky detekují především různé typy jednoduchých a složených škrobových zrn, aleuronových buněk a různě veliké úlomky oplodí a osemení. Lze tak u nich určit druh použitého základu a u směsí i přibližný poměr jednotlivých mouk. Cílem přednášky nebylo přinést vyčerpávající přehled možností, ale informovat o stavu projektu, na jehož řešení se v rámci postgraduálního studia podílím. Do budoucna předpokládám, že budeme rozvíjet především postupy identifikace technologických vad u potravin z ovoce, zeleniny, koření a dalších příbuzných produktů, rádi bychom pokračovali v přípravě databáze pro identifikaci fyzikálních nebezpečí ve vztahu k HACCP. Vzhledem k falšování potravin bude postup zřejmě doplňkem k analýzám autenticity prováděných na základě analýzy chemických markerů. 3) Historie Již od pradávna toužil člověk vidět věci menší než ty, které mohl vidět pouhým okem. Prvním krokem k tomu bylo zvládnutí techniky broušení čoček do brýlí italskými mnichy ve 14. století. Tato technika se rychle rozšířila po Evropě. Někteří optici začali upozorňovat, že pomocí dvou čoček lze vidět věci zvětšené. 6

7 Patrně jako prvý sestrojil použitelný mikroskop holandský brusič čoček a výrobce brýlí Zacharias Jansen někdy kolem roku Při jeho konstrukci použil jak konkávní (vyduté), tak konvexní (vypouklé) čočky. Italský astronom a matematik Galileo Galilei vylepšil Jansenův vynález a použil jej k vědeckým účelům, např. aby prozkoumal mravenčí oko. Ale teprve Anthony van Leeuwenhoek, holandský obchodník s látkami z Delftu, přispěl významnou měrou ke zdokonalení dosud primitivního přístroje Jeho koníčkem bylo foukání skla a jemná práce s kovem. Vymyslel, jak přesně vybrousit čočky a jak je sestavit a upevnit, aby vytvořily silný zvětšovací efekt. Díky svému mikroskopu mohl zkoumat strukturu vláken látek které prodával. Později začal také zkoumat listy, květiny a drobné organizmy, např. včely nebo vši. Studoval rovněž lidskou krev, kůži a vlasy. Jako první na světě viděl a popsal krevní buňky. Van Leeuwenhoek ( ) (převzato z Van Leeuwenhoek sice dokázal nedocenitelný přínos mikroskopu v mnoha oblastech vědy, jeho přístroj však byl jednočočkový. Tím byly možnosti mikroskopu značně omezeny (přestože jeho čočky zvětšovaly až 270x). V roce 1665 vynalezl anglický fyzik a chemik Robert Hooke tzv. složený mikroskop s více čočkami. Zkoumal jím slabé plátky korku, který byl vyhledávaným materiálem loďařského průmyslu. přitom zjistil, že živé látky jsou tvořeny buňkami. 7

8 Van Leeuwenhoekeův mikroskop (převzato z V lékařském světě použil mikroskop např. Francouz Luis Pasteur při objevu kvasinek nebo Robert Koch při objevu bacilů tuberkulozy a cholery. 8

9 Němec Carl Zeiss vyrobil první mikroskop ("Stand 1") v r (převzato z V 19. století prožívá mikroskop dramatický vývoj. Přispěli k tomu především Carl Zeiss, který věnoval významné úsilí výrobě mikroskopů, Ernst Abbe, jehož jména je spojováno s teoretickou studií optických principů a Otto Schott, který vedl výzkum optického skla. Zeissův mikroskop z roku 1934 (převzato z 9

10 Optický (paprskový) mikroskop dosáhl ve 30. letech své teoretické hranice. Ta je limitována 500násobným nebo 1000násobným (2000násobným) zvětšením a rozlišením 0,2 mikrometru. Vědci však chtěli vidět detaily buněk. To vyžadovalo zvětšení řádově násobné. Ernst Ruska (převzato z Bylo tedy nutno zkonstruovat mikroskop na jiném principu. Místo světelného paprsku se zde využívá elektronový paprsek (tok rychlých elektronů), místo skleněné čočky čočka magnetická. První mikroskop na tomto principu byl vyvinut v Německu v roce 1931 a zasloužili se o to především Max Knoll a Ernst Ruska. Byl to tzv. prozařovací elektronový mikroskop (TEM Transmission Electron Microscope), kdy elektronové paprsky procházely zkoumaným předmětem (urychlovací napětí až 20 kv) a vytvořily stínový obraz (jako např. při promítání diapozitivu). Druhý typ elektronového mikroskopu, tzv. skenovací (SEM Scanning Electron Microscope), se objevil v roce 1942, komerčně však byl požíván až kolem roku 1965, kdy se podařilo zvládnout skenování (postupné bombardování elektrony) vzorku (podobně jako např. při skenování fotografií). U tohoto typu mikroskopu je nutné urychlovací napětí pro elektrony 60 až 80 kv a jejich zvětšení je násobné a s kombinací s mikroskopem optickým až násobné. 10

11 Elektronový mikroskop z roku 1938 (převzato z Adresa zeiss.cz Robert Koch, Nobelpreis für Medizin Koch gilt als Begründer der modernen Bakteriologie. Der Landarzt entdeckte in den 80er Jahren des vorigen Jahrhunderts die Tuberkelbazillen und Choleraerreger. "Verdanke ich doch einen großen Teil meiner Erfolge Ihren ausgezeichneten Mikroskopen", schrieb Koch an Zeiss; 1904 erhielt er das ste Objektiv homogener Immersion zum Geschenk. 11

12 Richard Zsigmondy, Nobelpreis für Chemie Der Göttinger Professor führte bahnbrechende Arbeiten auf dem Gebiet der Kolloidchemie aus. Er erfand 1903 das Ultramikroskop, 1918 den Membranfilter und 1922 den Ultrafeinfilter. Die Spaltultramikroskopie (nach Siedentopf/Zsigmondy) läßt winzig kleine Teilchen sichtbar werden, deren Linearausdehnung unter der Auflösungsgrenze liegt. Frits Zernike, Nobelpreis für Physik Der niederländische Physiker entdeckte 1930 beim Experimentieren mit Reflektionsgittern, daß er die Phasenlage der einzelnen Lichtstrahlen beobachten konnte, und wollte diese Erkenntnis auf das Mikroskop übertragen. Zusammen mit Zeiss entwickelte er das erste Phasenkontrastmikroskop, 1936 als Prototyp hergestellt. Es ermöglichte ein Studium lebender Zellen, ohne sie durch chemische Färbung zu schädigen Manfred Eigen, Nobelpreis für Chemie Der Biophysiker und Gründer des Max-Planck-Instituts für Biophysikalische Chemie in Göttingen entwickelte ein Verfahren zum Einzelmolekül-Nachweis. Im Zusammenwirken mit seinem schwedischen Kollegen Rudolf Riegler sowie den Firmen EVOTEC und Carl Zeiss gelang 1995 die Herstellung des ersten kommerziell verfügbaren Fluoreszenz-Korrelations-Spektrometers ConfoCor. Erwin Neher, Nobelpreis für Medizin Zusammen mit Professor Sakmann entdeckte er am Max-Planck-Institut in Göttingen die grundlegenden Mechanismen der Kommunikation zwischen Zellen. Dabei wurden elektrophysiologische Untersuchungen an Ionenkanälen mit der Patch-Clamp Technik durchgeführt. 12

13 Bert Sakmann, Nobelpreis für Medizin Für die visuelle Kontrolle bei diesen versuchen benötigten die beiden Wissenschaftler Bilder mit ausgezeichnetem Kontrast und hoher optischer Auflösung. Es wurden speziell für diese Anwendungen konstruierte aufrechte Mikroskope eingesetzt - ausschließlich von Carl Zeiss. Die Grenzen brechen auf, die Grenzen verschwinden. Neue Dimensionen eröffnen sich, die noch vor Jahren als Science-fiction gegolten hätten. Und die technologischen Möglichkeiten ultramoderner Mikroskopie sind noch längst nicht ausgeschöpft. Telemikroskopie rund um den Erdball. Lichtschnelle digitale Kommunikation. Räumliche Bildserien, hochaufgelöst, kontrastreich, zeitecht... Screening-Technologie von Carl Zeiss ausgezeichnet Jena, Für seine herausragenden Leistungen bei der Entwicklung eines Systems zur automatisierten Wirkstoffsuche in der Pharmaforschung hat Dr. Klaus Mlejnek, Leiter des Geschäftsbereiches Molekulare Medizin bei Carl Zeiss Jena, den 2002 SBS Accomplishment Award erhalten. Mit diesem Preis zeichnet die Gesellschaft für Biomolecular Screening (SBS) in jedem Jahr Mitglieder aus, die sich um die Förderung der Wirkstoffsuche verdient gemacht haben. Nach den Worten des Präsidenten der SBS, Dr. Thomas D.Y. Chung, wird die Beteiligung Dr. Mlejneks "an der Entwicklung des innovativen modularen Zeiss Systems zum Proben-Screening als ein bedeutender Beitrag auf dem Gebiet der Medikamentenentwicklung anerkannt". Das Screening großer pharmazeutischer Substanzbibliotheken hat zum Ziel, schnell geeignete Wirkstoffe für die Medikamentenentwicklung zu finden. Mit dem UHTS-System plate::explorer von Carl Zeiss können mehrere Proben am Tag auf ihre Eignung als potenzielle Wirkstoffe untersucht werden. Herzstück des Systems ist der plate::vision Multimode Reader, der die vollautomatische Messung von Mikrotiterplatten mit höchster Datenqualität in extrem kurzer Zeit ermöglicht. Das System ist weltweit in der Pharmaindus-trie im Einsatz, so an allen Forschungsstandorten von F. Hoffmann-La Roche. Der mit 1000 US $ dotierte SBS Award wurde auf der 8. Jahrestagung der Gesellschaft für Biomolecular Screening in Den Haag, NL an Dr. Mlejnek übergeben. Die Gesellschaft ist 1994 als Forum des Wissens- und Informationsaustausches zwischen Spezialisten der Pharmaforschung und damit verbundener Disziplinen gegründet worden. Sie bietet ihren mehr als 2000 Mitgliedern verschiedene Publikationen, Veranstaltungen und Bildungsprogramme. 13

14 Z knížky Současnost Optický (paprskový) mikroskop dosáhl ve 30. letech své teoretické hranice. Ta je limitována 500násobným až 1000násobným zvětšením a rozlišením 0,2 mikrometru. Rozdělení Podle počtu okulárů: 1) Monokulární 2) Binokulární 3) Trinokulární 14

15 Podle výsledného obrazu: 1) Fluorescenční 2) Polarizační 3) Interferenční 4) Fázově kontrastní 5) + řada dalších (UV, Rtg, IČ) 4) Princip zobrazení Z knížky Pozorovaný předmět je postaven mezi jednoduchou a dvojitou ohniskovou vzdálenost objektivu tak, aby se zobrazil jako skutečný zvětšený a převrácený obraz obr.1. Obraz předmětu vzniká v přiměřené vzdálenosti za dvojitou ohniskovou vzdáleností zvanou optický interval (délka optického tubusu). Je určena mechanickou délkou tubusu, která se měří od dosedací plochy objektivu k dosedací ploše okuláru. Není pro všechny objektivy stejná a obvykle se pohybuje okolo 170 mm. Tento obraz pak pozorujeme okulárem jako lupou a získáme neskutečný a zvětšený obraz obr.2. Adresa mikroskopy.cz Diagram optické dráhy Na následujícím obrázku je znázorněn diagram optické dráhy s mikrofotografickým zařízením. 2. Princip zvětšení Činnost mikroskopu je založena na vhodném uspořádání dvou systémů s konvexními čočkami. Při tomto uspořádání dochází ke zvětšení vzorku. V blízkosti vzorku je systém konvexních čoček Lo, který se nazývá objektiv. Tento objektiv vytváří skutečný obraz A' B' se zvětšením 1 až 100. V blízkosti oka je systém čoček Le, který se nazývá okulár, má zvětšení 20 až 50 a vytváří neskutečný obraz A"B". Obrazový prostor je ve vzdálenosti asi 250 mm od oka. Člověk tedy pozoruje zvětšení odpovídající obrazu A"B". 15

16 Pozorovaný předmět je postaven mezi jednoduchou a dvojitou ohniskovou vzdálenost objektivu tak, aby se zobrazil jako skutečný zvětšený a převrácený obraz obr.1. Obraz předmětu vzniká v přiměřené vzdálenosti za dvojitou ohniskovou vzdáleností zvanou optický interval (délka optického tubusu). Je určena mechanickou délkou tubusu, která se měří od dosedací plochy objektivu k dosedací ploše okuláru. Není pro všechny objektivy stejná a obvykle se pohybuje okolo 170 mm. Tento obraz pak pozorujeme okulárem jako lupou a získáme neskutečný a zvětšený obraz obr Aperturní clona kondenzoru Tato clona je připevněna k čočce kondenzoru a používá se k řízení rozlišení, kontrastu a hloubky ostrosti. Tyto parametry však nelze nastavit nezávisle. Rozlišení Kontrast Hloubka ostrosti Jas Aperturní clona kondenzoru zcela otevřená Velké Malý Malá Velký Aperturní clona kondenzoru zcela zacloněná Malé Velký Velká Malý Obecně lze říci, že optimální nastavení aperturní clony kondenzoru je 70-80% numerické 16

17 apertury objektivu. Pokud je tato clona zacloněná více než na 70%, pak dochází ke snížení jasu. Současně se však zvětšuje kontrast a hloubka ostrosti se zvětší dvakrát. Adresa - httpwww.physics.muni.cz~kubenaoptika1sld001.htm httpwww.physics.muni.cz~kubenamoderni%20metody31_souboryframe.htm a mnoho dalších... 17

18 Z knížky Pro přesměrování světla do fotografického přístroje nebo televizní kamery jsou určeny trinokulární tubusy. Mikroskop však může mít pro fotografický přístroj nebo televizní kameru jeden i více samostatných výstupů. Jednoduché trinokuláry dělí světelné paprsky zrcadly, lepší jsou vybavené hranoly. 5) Složení optického mikroskopu + 6) Základní používané pojmy Adresa - httpwww.arid.cznikcovite.htm Víte všechno o světelných mikroskopech? Rádi bychom Vám pomohli osvěžit a rozšířit si znalosti o mikroskopech. Nabízíme Vám krátký souhrn poznámek o světelných mikroskopech, používaných převážně v biologii a medicíně. Přivítáme Vaše připomínky a přání k textu, který Vám předkládáme. Světelný mikroskop je optická soustava, určená k pozorování drobných - mikroskopických - objektů při velkém zvětšení až 1000x, případně 1500x. Hranice zvětšení ve světelném mikroskopu je dána vlnovými vlastnostmi světla. Obrazy z mikroskopu pozorujeme zrakem, takže o výsledné kvalitě obrazu rozhoduje nejen technická dokonalost mikroskopu, ale také psychofyziologická kondice uživatele. Základní díly mikroskopu: Stativ Úplný mikroskop se skládá z mechanického tělesa, které tvoří stativ se stolkem, tubusem a osvětlovací soupravou s kondenzorem, a z optických dílů: okulárů a objektivů v otočném revolverovém nosiči. U běžných mikroskopů nejsou jednotlivé díly pevnou součástí stativu, lze je vyměňovat a sestavit tak mikroskop různým způsobem podle požadavků metody, kterou chceme použít. Mluvíme pak o stavebnicových mikroskopech. Jednotlivé díly mikroskopů se často nazývají "moduly". Zaostřování obrazu v mikroskopu se provádí změnou pozorovací vzdálenosti dvojitým souosým knoflíkem na obou stranách stativu mikroskopu. Vnější - větší - knoflík je pro hrubé nastavení, vnitřní - menší - knoflík pro jemné zaostřování. Knoflík jemného posunu bývá opatřen stupnicí, nejmenší dílek odpovídá obvykle posunu o 1µm. Posun může být opatřen nastavitelnou zarážkou, vymezující pohyb ve směru zmenšování pozorovací vzdálenosti - to ulehčuje návrat do roviny ostrosti při výměně vzorků. Rovněž je obvyklé, že můžeme nastavit odpor proti pohybu při zaostřování (samostatným prstencem na společné ose se zaostřovacími knoflíky). Zaostřování se u vzpřímených mikroskopů děje svislým pohybem stolku, při zaostřování inverzních mikroskopů se může pohybovat revolverový nosič objektivů - stolek má pak pro uložení preparátu pevnou základní desku, která je součástí stativu a po ní se pohybuje vodič preparátu. Stolek mikroskopu slouží pro uložení pozorovaného vzorku do optické osy mikroskopu. Preparáty jsou nejčastěji na standardních podložních sklíčkách (76x26x1mm), bývají většinou zakryty krycím sklíčkem. U krycího sklíčka je nutno dbát na jeho kvalitu, má mít tloušťku přesně 0,17mm, být zcela čiré a planparalelní. Na tloušťku 0,17mm jsou vesměs korigovány objektivy, není-li tato hodnota dodržena, může to mít za následek zhoršení obrazu. Některé dražší objektivy jsou vybaveny korekcí na tloušťku krycího skla. To má význam hlavně u inverzních mikroskopů, kde preparát často pozorujeme přes Petriho misku nebo dno skleněné kultivační nádoby. 18

19 Dříve měly jednoduché mikroskopy stolky, opatřené dvěma svorkami, které přidržovaly podložní sklíčko s preparátem - vyhledávání se provádělo ručním posunováním sklíčka po stolku. Moderní mikroskopy mají vodič objektu (vodič preparátu), do kterého se upíná podložní sklíčko (nebo jiný nosič) s preparátem. Posun se provádí po ploše stolku ve dvou osách dvojitým souosým vrubovaným knoflíkem, umístěným většinou na pravé straně stolku tak, aby jej bylo možné pohodlně obsluhovat. Většinou je pohyb možné sledovat na stupnicích s milimetrovým dělením. To usnadňuje vyhledání místa na preparátu. Vodiče objektu mikroskopů NIKON Eclipse jsou upraveny k současnému uložení až dvou podložních sklíček. Povrch stolku je často vystaven působení různých chemikálií, bývá opatřen odolným nátěrem nebo volitelně keramickou vrstvou. Stolky inverzních mikroskopů jsou upraveny pro uložení velkých objektů - Petriho misek, Terasakiho komůrek nebo kultivačních lahví. Polarizační mikroskopy mají kruhové otočné stolky, opatřené stupnicí (360 ). Tubus je základním dílem stativu a vsazuje se do něho nástavec pro okuláry, vesměs výměnný a upravený pro jeden nebo dva okuláry (monokulární nebo binokulární tubus), případně s dalším optickým výstupem (trinokulární tubus). Na opačném konci je k tubusu je připevněn otočný revolverový nosič objektivů, do kterého se závitem upevňují objektivy. Optická a mechanická délka tubusu patří k základním parametrům mikroskopu. Osvětlovací souprava se skládá ze síťového transformátoru na 220V/50Hz s regulací výstupního napětí (6 nebo 12 V=), kterým se napájí halogenová žárovka o výkonu 20 až 100W. Mikroskopy s vyšším výkonem žárovky mají samostatnou lampovou skříňku, nutnou pro lepší odvádění tepla, která se ke stativu připevňuje bajonetem. Velké mikroskopy mají v samostatné skříňce také napájecí transformátor. Regulace světelného výkonu žárovky se pak může provádět buď na tomto zdroji, nebo je přenesena do stativu (volitelné). Vzhledem k tomu, že se jen malá část výkonu žárovky promění ve světelné záření a zbytek (kolem 90%) v teplo, je nutné dbát na to, aby kolem lampové skříňky mohl volně proudit vzduch. Otočný revolverový nosič objektivů může pojmout pět až šest objektivů, které se do něj upevňují závitem. Revolverový nosič je připojen ke stativu buď trvale, nebo je výměnný. Výměnný revolver je výhodný při používání více druhů objektivů, pro metodu DIC je to podmínka (revolverový nosič pro tuto metodu musí být upraven pro zasunutí hranolů). Kondenzor. Abychom mohli osvětlení v mikroskopu účelně nastavit, je v dráze paprsků osvětlovací soustavy kondenzor, který je součástí osvětlovací soustavy mikroskopu. Rozlišovací schopnost objektivů mikroskopu může být dokonale využita jen tehdy, je-li osvětlení preparátu provedeno pomocí kondenzoru kuželem paprsků o určité nejmenší apertuře. Kondenzor je umístěn (u vzpřímených mikroskopů) pod stolkem, nesoucím preparát. Bývá většinou svisle posuvný v samostatném pomocném stolku, ze kterého jej lze snadno vyjmout. Důležité je, aby optická osa osvětlovací soustavy procházela středem kondenzoru. Toho dosáhneme přesným vystředěním jeho polohy pomocí středících šroubů. Kondenzor je opatřen irisovou clonou, ovládanou páčkou. V lepším případě se tato páčka pohybuje podél stupnice, udávající numerickou aperturu kondenzoru. Tuto hodnotu potřebujeme ke správnému nastavení. Numerická apertura kondenzoru má být vždy menší, než je apertura objektivu (přibližně 70%). Při nastavování osvětlení (včetně kondenzoru) postupujeme podle návodu, který navrhl Köhler (tzv. Köhlerovo nastavení - je popsáno dále). Základní typy kondenzorů jsou většinou podle svého konstruktéra jsou označeny jako Abbeho kondenzory, jsou vhodné pro objektivy se zvětšením od 4x až do 100x. Při použití objektivů s malým zvětšením mohou nastat potíže, protože se neosvětlí rovnoměrně celé zorné pole. Pro objektivy s malým zvětšením (2x až 0,5x) jsou k dispozici kondenzory s nízkou numerickou aperturou. Takové kondenzory se však nehodí pro objektivy s velkým zvětšením. Velmi kvalitní obraz při použití objektivů s olejovou imerzí zajišťují kondenzory pro olejovou imerzi - na ně se - podobně jako na preparát - nanese kapka imerzního oleje, takže paprsky procházejí po výstupu z kondenzoru homogenním prostředím se stejným indexem lomu. Zvláštní konstrukcí se vyznačují tzv. univerzální kondenzory. Mají vestavěný karusel, ovládaný zvenčí, do kterého jsou vloženy volitelné moduly: fázové prstence, prstenec pro tmavé pole, případně může být tento kondenzor vybaven moduly pro diferenciální interferenční nebo Hoffmanův kontrast. Vložené prstence jsou obvykle příslušné k objektivu. Pro fázový kontrast bývají označeny jako Ph1, 19