CVIČENÍ Č. 1 VYBAVENÍ LABORATOŘE B. Mieslerová, M. Sedlářová (KB PřFUP v Olomouci)

Transkript

1 CVIČENÍ Č. 1 VYBAVENÍ LABORATOŘE

2 1. Petriho misky LABORATORNÍ SKLO A PLASTY skleněné(opakované použití) xplastové (jednorázové) používají se na izolaci kultur, krátkodobou kultivaci, studium kolonií, různé testy na tuhých půdách průměr nejčastěji mm

3 2. Bakteriologické zkumavky -tloušťka cca 1mm, vběžné praxi se nepoužívají ani tenko- ani tlustostěnné Rizika: prasknutí -pokud dojde ke zranění, může být vážně ohroženo zdraví pracovníka (infekce kulturou), nebo kontaminována pracovní plocha -zkumavky pouze srovným okrajem, rozměry většinou 17x120(160)mm Rizika: zahnuté okraje zachytávání mikroorganismů zovzduší, kterými je možno kultury po vyjmutí zátky připřeočkování kontaminovat.

4 3. Fermentační zkumavky sledování schopnosti mikroorganismů fermentovat cukry Zkumavky splynovkami podle Durhmana ve zkumavce s kultivačním médiem jsou dnem vzhůru ponořeny malé zkumavky (epruvety), ve které se tvořený plyn zachycuje (bublina) Dunbarovy kvasné rourky menší průměr než běžné zkumavky, spodní část ohnuta směrem vzhůru (připomíná tvar písmena V ) kratší rameno je zataveno -hromaděníplynu Einhornovy kvasné rourky kvantitativní stanovení tvořícího se plynu skleněná rourka ohnutá do tvaru písmena U je přitavena na podložce, válcovitě rozšířené delší rameno je zataveno a kalibrováno, takže je možné přesně zjistit objem plynu vytvořeného v závislosti na čase druhé rameno rourky je kratší, baňkovitě rozšířené a uzavírá se vatovou zátkou

5 4. Fernbachovy baňky a Rouxovy láhve kultivace na tekutých médiích, při kterých je vyžadován velký povrch substrátu (kultivace plísní - např. Penicillium) Fernbachova baňka průměr dna cca 20cm Rouxova láhev +variace pro kultivace buněčných kultur

6 5. Pipety pro mikrobiologické účely je nutno vybírat takové typy,které se přesně arychle vyprazdňují, bez vyfukování na tzv.vylitý objem. skleněné pipety,násadce automatické nebo umělohmotné šroubovací nebo gumové balónky automaticképipety +jednorázové umělohmotnéšpičky Pipety a multikanálové pipety Skleněné pipety s násadci

7 6. Pasteurovy pipety Použítí: pro odběr kultur mikrobů z tekutých medií a očkování do tekutých médií pro přidávání různých reagencií či suplementů do kultivačních medií skleněné + savičky plastové jednorázové

8 7. Baňky Erlenmayerovy na kultivaci v tekutých půdách na třepačce na přípravu živných půd varné sklo 8. Odměrné válce k méně přesnému odměřování objemu kapaliny při zhotovování různých roztoků a kultivačních médií (sklo x plast) 9. Podložní a krycí sklíčka na přípravu mikroskopických preparátů

9 PŘÍSTROJOVÉ VYBAVENÍ MIKROBIOLOGICKÉ LABORATOŘE 1. Mikroskop studium mikrobiálních buněk (světelný, fluorescenční, konfokální, elektronový, atomárních sil) 2. Chladnička uchovávání vzorků, sterilních kultivačních médií vzásobních nádobách, zkumavek,petriho misek či kultur mikroorganismů Je nepřípustné v chladničce vyhrazené pro mikrobiologické účely uchovávat potraviny!!! Pravidelně je třeba chladničku vyklidit, odmrazit, řádně umýt aošetřit desinfekčnímroztokem. 3. Mrazící box, mraznička (-20 C, -80 C) kuchovávání lyofilizovaných kultur bakterií ahub, případně chemikálií Denně kontrolovat teplotu! Jednou za půlroku odmrazitavyčistit.

10 4. Laminární box kovová skříň se skleněnými výplněmi stěn, zaveden přívod sterilního vzduchu (+ plyn, voda), germicidní zářivky (UV) proudění vzduchu horizontální xvertikální, uvnitř udržován mírný přetlak Manipulace smikrobiologickým materiálem se provádí uvnitř boxu za nepřístupu vzduchu zvnějšího okolí. Očkovací box slouží kprovádění všech druhů práce s vysokými nároky na vyloučení kontaminace (přeočkování čistých kultur). Před použitím vydezinfikovat. Nutnost kontrolovat filtry na vzduch 1x za měsíc - prověřovatsterilnost atmosféry vboxu.

11 5. Inkubátory- termostaty kultivace mikroorganismů konstantníteplota skolísáním <0,5 C Termostaty vodní - kovové skříně s dvojitými stěnami, v nichž cirkuluje voda na předem zvolenou teplotu ohřátá elektrickými topnými tělesy. Výhoda: minimální pokles teploty při krátkodobémvýpadku elektrickéenergie. Pro běžné mikrobiologické rozbory jsou předepsány kultivační teploty 20 C, 37 C a43 C (stanovení koliformních bakterií a stanovení fekálních koliformních bakterií), popřípadě 44 C (stanovení termotolerantních koliformních bakterií) Vlaboratoři je potřeba více termostatů Denně provádět kontrolu teploty - maximominimální teploměr 2x za měsíc nutno čistit adesinfikovat

12 6. Váhy váhy digitální předvážky s citlivostí nejméně 0,1 g a možností navážky do 150 g analytické váhy s citlivostí 1 mg a navážkou do 10 g 7. ph metr stanovení ph kultivačních medií a roztoků 8. Třepačka pomocí elektrického motoru pohybuje v horizontální poloze krouživými pohyby pultem, na němž jsou přichyceny kultivační nádoby promíchávání obsahu kultivačního média = optimální podmínky růstu (kyslík, živiny) mikroorganismů při kultivaci v tekutém médiu

13 9. Vodní lázeň kpasteurizacivzorků pro stanovení sporulujícíchmikroorganismů pouze ve výjimečných případech může sloužit k roztápění ztuhlých kultivačníchmédií -zkumavky se pak ponoří přímo do vody ve vodní lázni

14 10. Destilační aparatura pro práci veškerého druhu v mikrobiologické laboratoři je povoleno používat pouze destilovanou (deionizovanou) vodu 11. Centrifuga je určena k separování drobných partikulí suspendovaných v kapalině odstředivou silou

15 12. UV lampa (360 nm) užívá se k vyhodnocení fluorescence u stanovení koliformních bakterií (presumptivní Escherichia coli), enterokoků, klostridií moderními metodami, které jsou založeny na enzymatické hydrolýze specifických substrátů obsahujících fluorochromové báze v molekule. Ty se při enzymatické hydrolýze uvolňují do média a v UV záření vykazují světle modrou fluorescenci. UV lampa se užívá i při vyhodnocování přirozené fluorescence ve vodě rozpustného pigmentu u typických kolonií Pseudomonas aeroginosa. (UV lampa ozáření 360 nm +20 nm. UV lampy ojiném vlnovém rozsahu (horská slunce)-ne vždy vyhovují. Chránit zrak brýlemi!!! Vyhodnocování presumptivních kolonií vuv světle se provádí vzatemnělé místnosti.

16 Potvrzené fluoreskující kolonie E. coli UV lampa a kultivační miska s mcoli testem

17 STERILIZAČNÍ ZAŘÍZENÍ Zařízení sloužící kdokonalému usmrcení všech živých mikroorganismů ajejich spor vyskytujících se včerstvě připravených kultivačních mediích nebo ulpívající na stěnách laboratorního nádobí 1. Autokláv kovová nádoba hermeticky uzavíratelná, vníž přizahřívání dochází ke vzniku zvýšeného tlaku páry,atak ikpřehřátí prostoru na vyšší teplotu než 100 C. Ve většině případů se ke sterilizaci používá přetlaku 0,1MPa což odpovídá teplotě 121 C Přístroj určený kpřípravě kultivačníchmédií má být instalován ve varně médií, samostatnýautokláv klikvidaci kultur má být umístěn vumývárně Vyškolená obsluha!

18 2. Kochův parní hrnec (sterilizátor) sloužíktzv.sterilizaci vproudící páře vtomto zařízení je dosaženo teploty max. 100 C, která usmrcuje pouze vegetativní buňky mikroorganismů. Spory při této teplotě převážně nehynou. Používá se především krozváření agarových kultivačních medií, kjejich roztápěnípřed použitím. Nikdy se nepoužívá ksterilizaci laboratorního nádobí! 3. Horkovzdušný sterilizátor schopnost spolehlivě udržovat teplotu předepsanou vrozmezí C po dobu 20 min. Registrace teploty. Slouží výhradně ke sterilizaci laboratorního skla apomůcek. Umístění do umývárny. Nelze používat ke sterilizaci kultivačních medií, membránových filtrů čipomůcek zplastů. Můžese používat jako sušička.

19 4. Sterilizační filtry principem je mechanické odstranění mikroorganismů z kultivačních medií nebo z roztoků ve speciálních filtračních zařízeních, nichž jsou použity speciální filtry s velmi malými póry, které při současném působení elektrostatických procesů na hraničních plochách pórů dokonale zadrží obsažené bakteriální buňky. Nejčastěji používané filtry: a) Chamberlandovy filtrační materiál je vyroben z porcelánu bez glazury b) Berkefeldovy podobné jako předchozí, ale vyrobené z lisované křemeliny c) Seitzovy kruhové destičky zhotovené lisováním směsi nitrocelulózy d) Skleněné připravují se zahříváním a lisováním jemného skleněného prášku e) Speciální membránové filtry na bázi celulózy a acetátu

20

21 Filtrace se provádí buď odsáváním tekutiny nalité přímo do filtračního aparátu přes vlastní filtr (pod tlakem) nebo nasáváním kapaliny zvenku dofiltru (přetlakem). Přifiltraci jenutnédodržovatkonstantní přetlak či podtlak. Zvýšení tlaku nad 0,05 MPa může způsobit průchod buněk mikroorganismů. Není to sterilizace, neboť L-formy bakterií, viry, mykoplazmata filtrem procházejí. Dále procházejí spirochéty- buňky s dokonalouplasticitou buňky. Po filtraci filtry opláchnout a řádně propláchnout horkou destilovanou vodou. Tento způsob sterilizace se používá pouze vtěch případech, kdykultivační médium nebo některé roztoky používané jako suplementy pro přípravu kultivačních medií obsahují vysoce termolabilní látky,jako např. vitamíny, proteiny,sera, cukry apod.

22 5. UV sterilizační lampa (germicidní zářivka) Používá se především ke sterilizaci ovzduší a pracovních ploch a k likvidaci aerosolů v laboratoři v nočních hodinách. Dále slouží ke sterilizaciočkovacích boxů adalších podobných zařízení Princip sterilizačního účinku UV paprsků je jejich absorpce vbuňkách mikroorganismů, kde způsobí radikální fotochemické změny, které při dostatečnédávce UV záření vyvolávají smrt mikroorganismů Nejvyšší účinnost při vlnové délce UV kolem nm, přičemž optimum je 260nm. UV lampy produkující UV záření o vln. délce 360nm používané pro vyhodnocování fluorescence, jsou prakticky neúčinné. Nelze tyto dva typy UV záření zaměňovat. Záření o vln. délce 260 nm při delší době působení může způsobovat poškození záněty rohovky.bezpečnost práce!

23 LABORATORNÍ POMŮCKY 1. Kahan Plynové kahany: Bunsenův nebo Meckerův Plyn z ocelové láhve a hořáky Lihové kahany Plyn se používá k ožíhání hrdel zkumavek, baněk i ostatních kultivačních nádob při jejich otevírání, zátek, roztíracích tyčinek, pipet, bakteriologických kliček, jehel, pinzet Meckerův kahan Bunsenův kahan Lihový kahan

24 Tecluho kahan

25 2. Očkovací klička - bakteriologická klička Pro běžné způsoby očkování je vyrobena zniklového, chromniklového nebo ocelového drátu 0,6-0,8 mm silného, na jehož konci je zhotoveno očko o průměru 2-3 mm. Délka kličky 5,5 až 6cm. Upevněna do Kolleho držáku, nebo lze zasadit do dřeva/skleněné tyčinky Pouze pro cytochromoxidázový test se používá klička zplatinového drátu. Očkovací klička se používá kizolaci čistých kultur nebo kjejich přeočkování zjednoho kultivačního media na druhé.

26 3. Očkovací jehla ze silnějšího (tužšího) drátu, na konci nemá očko používá se při očkování izolované čisté kultury vpichem do hloubky kultivačního média 4. Pinzeta používá se při fixování a barvení mikroskopických preparátů, k přenášení membránových filtrů do filtračního aparátu a na povrch kultivačního média, či na papír nasycený určitým reagens

27 5. Roztírací tyčinka dle Drigalskiho jedná se o skleněnou tyčinku, jejíž spodní část je ohnutá do malého trojúhelníku nebo tvaru písmene L Používá se k rovnoměrnému roztírání inokula po povrchu pevného kultivačníhomedia Provádí se krouživým pohybem přisoučasném otáčení Petriho misky.

28 6. Stojánky na zkumavky nejvhodnější jsou kovové z duralového plechu nebo antikorozní oceli

29 7. Pomůcky na počítání kolonií nejvhodnější pomůckou je přístroj na počítání kolonií vybavený velkou lupou, smožností volby horního či postranního osvětlení spodní části Petriho misky na světlém či tmavém pozadí a zařízením ke značení spočítanýchkolonií, kteréje obvykle zároveň spojenosmechanickým či elektronickým digitálním počítadlem

30 8. Filtrační aparát Je většinou vyroben zantikorozní oceli aje silně pochromován Skládá se ze 2-3 částí Spodní část držák na podložku pro membránový filtr, ventil na uzavření průchodu vzduchu a dlouhou trubkovitou stopku na níž se nasazuje gumová zátka Horní část většinou válcovitá nebo kónická a slouží k odměřování příslušnéhoobjemu vzorku může být ikalibrovaná. Mezi horní aspodní částí se nalézá speciální kovová průlinčitá podložka, na níž se pokládá vlastní membránový filtr. Na trubkovitou stupku se nasazuje gumová zátka, kterou se celý filtrační aparát zasazuje do odsávací baňky, z níž se motorovou nebo vodní vývěvou odsává vzduch. Doporučuje se mezi odsávací baňku a vývěvu zařadit ještě pojistnou nádobu (promývačku), která zabraňuje vniknutí profiltrované vody do vývěvy zejména vpřípadě, že je odsávačka již naplněná.

31

32 Vkládání membránového filtru do spodní části filtračního zařízení

33 Nalévání vody do horní části filtračního zařízení

34 Sada filtračních zařízení napojených na vodní vývěvu

35 STERILIZACE = přímá inaktivace (usmrcení) všech mikroorganismů i jejich klidových stadií (spor) v určitém prostředí nebo určitém materiálu Sterilizace absolutní všechno je usmrceno Sterilizace relativní jsou usmrceny pouze ty organismy, které mohou vegetovat jenom za podmínek určených složením, po případě uskladněním sterilizovaného materiálu Sterilizační postupy upravuje Vyhláška 440/2000 Sb. DEZINFEKCE = záměrné odstraňování a ničení choroboplodných zárodků pomocí fyzikálních, chemických nebo kombinovaných postupů Dezinfekční prostředky tvoří velmi heterogenní skupinu chemických látek, které vyvolávají změnynepříznivépro trvalé přežívání mikroorganismů.

36 Příprava materiálu ke sterilizaci umýt odmastit (saponát, etanol) osušit zabalit -alobal -skleněné zkumavky -kovové kontejnery -papírové/kombinované obaly (lukasterik, stericlin) (indikace uplynutí doby trvanlivosti změnou barvy proužku) velká zdravotnická zařízení -dokladování průběhu a výsledků sterilizace -protokoly

37 Typy sterilizace 1. Fyzikální sterilizace 1.A. Sterilizace vlhkým teplem (nasycenou vodní parou) 1.B. Sterilizace proudícím horkým vzduchem 1.C. Sterilizace filtrací 1.D. Sterilizace plazmou 1.E. Sterilizace radiační 2. Chemická sterilizace 3. Mechanická očista

38 1. Fyzikální sterilizace nejjednodušší fyzikální sterilizací je vyžíhání v plameni 1.A. Sterilizace vlhkým teplem pro sterilizaci kultivačních médií, zřeďovacích roztoků, různých suplementů do kultivačních medií vhodná pro sterilizaci zdravotnických prostředků z kovu, skla, dřeva, porcelánu, keramiky, textilu (len, bavlna), tamponů, obvazového materiálu nepoužívá se k sterilizaci: -laboratorního skla a pomůcek (s výjimkou filtračního aparátu), v autoklávech dochází ke zvlhnutí = riziko další kontaminace -termolabilních plastů, gumových předmětů, optických přístrojů

39 Sterilizace v autoklávu za přetlaku při teplotě vyšší než 100 C nejdokonalejší způsob sterilizace možno docílit absolutní sterility. to co usmrcuje je vlhká horká pára za odpovídajícího přetlaku stupeň účinnosti podle teploty a délky expozice při sterilizaci nasycenou parou v autoklávu za přetlaku vře voda při teplotě vyšší než 100 C závislost hodnot teploty na hodnotách přetlaku: Teplota v C 100 0, , , , , , , ,2 Přetlak v MPa 1 atm = 0,1 MPa 20 min 10 min Pouze tyto dvě hodnoty povoleny ve zdravotnictví

40 Hodnota teploty -volíme podle účelu sterilizace, ale i podle skupiny předpokládaných kontaminujících mikroorganismů Vegetativní formy mikroorganismů odumírají už při teplotě 55 C až 65 C během 10 min, zatímco jejich endospory až za 15 min při teplotě 120 C. Podobně saprofytická mikroflóra s optimem růstu při 35 až 37 C hyne při podstatně nižší teplotě a kratší době působení než striktně termofilní bakterie Čím vyšší teplota, tím kratší dobu sterilizace je nutno použít!!! Spory Bacillus anthracis Clostridium botulinum Clostridium tetani Půdní sporulujícímo Doba nutná ke spolehlivému usmrcení spor (min) 120 C 130 C 140 C 150 C 160 C 170 C 180 C

41 Malý autokláv, starší typ

42 Moderní typ autoklávu

43 Volba doby sterilizace pravidlo čím vyšší teplota, tím kratší je nutná doba sterilizace u teploty 121 C (stačí 12 min) podle normy 15 min pokud musíme provést rychlou sterilizaci, lze použít teplotu 134 C (při přetlaku 0,2MPa) - bezpečné sterility lze dosáhnout už za 36 sec. V praxi s bezpečnostním koeficientem se však provádí 6 min. bezpečnostní koeficient při dosažení požadované teploty v autoklávu ještě jednotlivé předměty nejsou na tuto teplotu předehřáté. Graf časový průběh sterilizace

44 1. zahřívání Průběh autoklávování lze rozdělit na čtyři fáze: 2. vyrovnávání teploty 3. doba sterilizace 4. ochlazování nejprve stoupá teplota v autoklávu, pak následuje doba nutná k vyrovnání teploty mezi parou a sterilizovanými předměty vlastní sterilizační doba začíná okamžikem, kdy i předměty vložené do autoklávu dosáhly teploty, a končí po průběhu zvolené sterilizační doby po vypnutí autoklávu doba ochlazování, nesmí se otevřít předčasně, až při teplotě kolem 80 C pokud bychom otevřeli autokláv při teplotě 100 C, začnou všechny kapaliny vřít!!! Doporučené doby sterilizace při různých metodách či normách platí pouze pro malé objemy, zhruba do 500 ml

45 Sterilizace v proudící páře při běžném atmosférickém tlaku v páře při 100 C používá se ke sterilizaci kultivačních médií, která by se teplotě nad 100 C znehodnotila (obsahující cukry, želatinu, mléko) formou frakcionované sterilizace (Kochův parní sterilizátor) jednorázové zahřátí při 100 C po dobu 90 min Frakcionovaná sterilizace tři po sobě následující opakování 30 min sterilizace při 100 C, se dvěma přestávkami po 24h, přinichž je sterilizovaný materiál uchováván (nejlépe ve tmě) při teplotě C způsob sterilizace vhodný pouze pro určité typy kultivačních médií, obsahujících termolabilní látky, které se přivyšší teplotě než 100 C znehodnocují k provedení se používá především Kochův hrnec, méně vodní lázeň používání domácího tlakového hrnce je nevhodné, uvnitř je teplota C! Kochův parní sterilizátor

46 Sterilizace varem k usmrcení nesporulujících mikroorganismů, pokud nejsou termofilní, obvykle postačí doba 5až 10 minut přiteplotě 100 C, zahřátí na vroucí vodní lázni při této teplotě však nejsou všechny spory usmrceny,některé spory snesou zahřívání přibodu varu po několik hodin (např. půdní sporuláti) varem se sterilizují membránové filtry, i média obsahující termolabilní organickélátky (nesnášejícívyšší teplotu než 100 C) V domácnostech jen použití pro osobní použití Var ve vodě není oficiální sterilizační metoda - pro zdravotnické účely nelze využít!!! Vodní lázeň

47 Tyndalizace Sterilizace při teplotách nižších než 100 C použití ke sterilizaci kultivačních médií, která obsahují značně termolabilní látky (mléko, vaječný žloutek, sérum) obvykle při 85 C po dobu 2 h, vodní lázeň sterilizace při teplotě 57 C po dobu 1 h, opakovaná 8 dní po sobě, s přestávkami 24 h, při nichž sterilizovaný materiál je přechováván při laboratorní teplotě (18-22 C) provádí se ve vodní lázni, nejlépe sautomatickouregulací teploty sterilizace kultivačních médií, které obsahují organické látky nesnášející teploty vyšší než 60 C (nativní bílkoviny,enzymy,krevní sérum)

48 Pasterizace částečná sterilizace, při níž je usmrcena většina mikroorganismů, ale ne všechny, zejména spory v mikrobiologii se většinou užívá na oddělení spor bacilů, klostridií apod. od vegetativních buněk (stanovení sporulujících mikroorganismů) používá se většinou teplota 80 C po dobu 15 min. aplikace v potravinářském průmyslu (mléko, víno, pivo), výrobky nejsou zcela sterilní! teplota bývá regulována podle mikroorganismů, které mají být usmrceny

49 1.B. Sterilizace proudícím horkým vzduchem je určena pro materiál zkovu, skla, porcelánu, keramiky akameniny nevhodná pro plasty,tampony,obvazový materiál, gumové předměty horkovzdušná sterilizace se provádí v přístrojích s nucenou cirkulací vzduchu připarametrech: Teplota ( C) Čas (min)

50 Horkovzdušný sterilizátor

51 1.C. Sterilizace filtrací proces, přiněmž všechny buňky (živé imrtvé) jsou zkapaliny,která má být sterilizována,mechanickyodstraněny nedocházíkodstranění metabolických produktů, toxinů apod. zmédia! používá se pro kapaliny aroztoky,které nesnášejívysoké teploty póry filtračních prostředků musí být dostatečně malé, aby se zabránilo proniknutí jednotlivých buněk bakterií je bezpodmínečně nutná sterilizacecelého filtračního zařízení vautoklávu! viry procházejí většinou bakteriálních filtrů!

52 Principem je mechanické odstranění mikroorganismů z kultivačních medií nebo z roztoků ve speciálních filtračních zařízeních, nichž jsou použity speciální filtry s velmi malými póry, které při současném působení elektrostatických procesů na hraničních plochách pórů dokonale zadrží obsažené bakteriální buňky Nejčastěji používané filtry Chamberlandovy filtrační materiál je vyroben z porcelánu bez glazury Berkefeldovy podobné jako předchozí, ale vyrobené z lisované křemeliny Seitzovy kruhové destičky zhotovené lisováním směsi nitrocelulózy Skleněné připravují se zahříváním a lisováním jemného skleněného prášku Speciální membránové filtry na bázi celulózy a acetátu

53 1.D. Sterilizace plazmou nízkoteplotní plazma - ve vakuu se nechá odpařit peroxid vodíku nebo peroctová kyselina, které pomocí vysokofrekvenčních vln vytvoří vysoce reaktivní částice teplota do 50 C používá se ksterilizacilékařských nástrojů aoptických přístrojů, termolabilní materiály sterilizaceplazmou se nepoužívá ke sterilizaci porézníhoasavého materiálu amateriálu vyrobeného na bázi celulózy Plazmový sterilizátor

54 1.E. Sterilizace radiační Ultrafialové záření (UV) optimální baktericidní účinek při vlnové délce kolem 254nm, kdy je záření maximálně absorbováno nukleovými kyselinami jako zářiče se používají obvykle germicidní lampy UV záření slouží ke sterilizaci vzduchu a pracovních ploch přímo vystavených paprskům používá se k vyzařování operačních sálů, aseptických boxů, piteven, odběrových místností v léčebnách tuberkulózy apod. vyzáření nemůže nahradit úklid pomocí dezinfekčních prostředků!

55 Ionizující (radioaktivní) záření je výhodné, protože penetruje, ale nezahřívá sterilizovaný předmět a nemění vlastnosti většiny sterilizovaných látek zdrojem gama záření v praxi je obvykle radioaktivní kobalt ( 60 Co) gama záření se používá k průmyslové sterilizaci (obvazový materiál, plasty), možno resterilizovat mezinárodně stanovená sterilizační dávka je 27kGy používá se na materiály z plastů k jednorázovému využití, které nebyly kontaminovány velmi penetrantní, slouží k bezpečnému a přitom šetrnému usmrcení patogenních mikroorganismů (kdy nesmí dojít k výrazným změnám chemického složení jejich intracelulární struktury) usmrtí i mykobakterie, ale ne veškeré viry radiační centra Řež u Prahy, Veverská Býtyška u Brna

56 2. Chemická sterilizace chemická sterilizace je určena pro materiál, který nelze sterilizovat fyzikálními způsoby (termolabilní plasty, gumové předměty, atd.), endoskopy sterilizačním médiem jsou plyny předepsaného složení a koncentrace sterilizace probíhá v přístrojích za stanoveného přetlaku nebo podtlaku povolené plyny: Sterilizace formaldehydem působení formaldehydu s vodní párou při teplotě C v podtlaku, délka 2h + odvzdušnění přístroje cca 4-5h Sterilizace ethylenoxidem působení ethylenoxidu v podtlaku nebo přetlaku při teplotě C karcinogen

57 Kontrola sterility kontrola sterilizace zahrnuje sledování správného průběhu sterilizačního cyklu, kontroly účinnosti přístrojů a kontroly sterility vysterilizovaných materiálů Kontrola kultivačními testy kontrolované nádoby se naplní přiměřeným množstvím zřeďovacího roztoku, po promíchání se odeberou 2 ml na Petriho misky, zalijí se 45 C agarovým médiem po promíchání se misky kultivují při 37 C 48h v případě, že se po kultivaci neprojeví růst kolonií na médiu, lze považovat vzorkovnice za sterilní

58 Kontrola biologickými prostředky použití biologických indikátorů Geobacillus stearothermophilus pro parní, formaldehydové a plazmové sterilizátory a Bacillus atrophaeus pro horkovzdušné a ethylenoxidové sterilizátory po sterilizaci se provádí kultivace na kultivačním médiu při 55 C (termofilní mikroorganismy) výsledky za několik dnů až týdnů - kultivace trvá určitou dobu + doba nutná k resuscitaci vysokou teplotou stresovaných spor Kontrola nebiologickými prostředky Bowie-Dick test je testem správného odvzdušnění a pronikavosti páry (savý papír, který má specifickou kresbu, která po sterilizaci mění barvu) chemické testy procesové barevnou změnou reagují již jen na přítomnost sterilizačního média; slouží k rozlišení materiálu připraveného ke sterilizaci a již vysterilizovaného Kontrola fyzikálními systémy vakuový test ověřuje těsnost přístroje a je zabudován v programovém vybavení přístroje

59 CVIČENÍ Č. 2 DEZINFEKCE = zneškodnění patogenních mikroorganismů na neživých předmětech, ve vnějším prostředí (ve vodě, ve vzduchu apod.) a v infekčním materiálu, Ostatní mohou v omezené míře přežívat x STERILIZACE = zničení všech mikroorganismů, živých i ve formě trvalých spor FYZIKÁLNÍMI NEBO CHEMICKÝMI POSTUPY

60 DEZINFEKCE Preventivní profylaktická (zdravotnictví, potravinářství) postupy, které zabraňují vzniku infekce Represivní při vzniklé infekci, cílená likvidace ohniska nákazy Účinnost závisí na rezistenci mikroorganismů k použitým prostředkům Dezinfekční prostředky tvoří velmi heterogenní skupinu chemických látek, které vyvolávají změny nepříznivé pro trvalé přežívání mikroorganizmů Podle účinků: Baktericidní Fungicidní Viricidní

61 FYZIKÁLNÍ DEZINFEKCE a) Var za atmosférického tlaku po dobu nejméně 30 min b) Var v přetlakových nádobách po dobu nejméně 20 min c) Dezinfekce v přístrojích při teplotě 90 C a vyšší po dobu 10 min d) UV záření o vlnové délce 253,7-264 nm GERMICIDNÍ ZÁŘIVKY e) Filtrace, žíhání, spalování

62 CHEMICKÁ DEZINFEKCE Skupiny dezinfekčních látek Oxidační činidla Halogeny Alkylační činidla Cyklické sloučeniny Hydroxidy a kyseliny Sloučeniny těžkých kovů Alkoholy Povrchově aktivní látky Kombinované látky

63 Požadavky na dezinfekční prostředek Co nejširší spektrum účinku Stabilní Určitá vhodná koncentrace Snadno skladovatelný Snadno ředitelný vodou Nesmí působit škodlivě na člověka Nesmí poškozovat materiály Nesmí znečišťovat životní prostředí Musíme zachovat určitou délku působení

64

65 Persteril

66 Jodofory (Betadine), jodofory + alkohol iodizol (antiseptikum)

67 Glutaraldehyd (Incidur) vyšší stupeň desinfekce

68 Chlorhexidin do spitadermu Kombinace lyzolu, krezolu účinně potlačuje původce tuberkulózy

69

70

71

72 SROVNÁNÍ ÚČINNOSTI DEZINFEKČNÍCH PROSTŘEDKŮ CÍL: Určit účinnější prostředek ze dvou použitých POMŮCKY: 10% roztok dezinfekčního prostředku, suspenze sporulujících mikroorganismů Bacillus subtilis (syn. B. atrophaeus), Pasteurova pipeta, 12 zkumavek s 9 ml tekutého média /Masopeptonový bujón/, termostat, skleněné pipety 10 ml, nástavce na pipety Dezinfekční prostředky: 10% Ajatin, 10% SAVO, 10% Incidur PROVEDENÍ: Zkumavky rozdělíme do skupin podle typu dezinfekčního přípravku, popíšeme A, B, C, D a dále pořadovými čísly 1-5, poslední zkumavka je označena K jako kontrola. Ředění provedeme podle schématu A1 1% (9ml média a 1 ml 10% roztoku dezinfekce) A2 0,1% (9 ml média a 1 ml protřepaného roztoku A1) A3 0,01% (9 ml média a 1 ml protřepaného roztoku A2) A4 0,001% (9 ml média a 1 ml protřepaného roztoku A3) A5 0,0001% (9 ml média a 1 ml protřepaného roztoku A4) K kontrola (10 ml média)

73 Každou zkumavku naočkujeme 5 kapkami suspenze spor Bacillus subtilis (syn. B. atrophaeus) azkumavky umístíme do termostatu. Kultivace: 24 hod při37 C. Po ukončení doby kultivace se zkumavky přenesou do chladničky,aby se zabránilodalšímu nekontrolovatelnémumnožení mikroorganismů. VÝSLEDEK: Zaznamenáváme růst / sporulaci bakterií u jednotlivých ředění, výsledky zapíšeme do tabulky. Všímáme si vzniku zákalu, blanky na tekutém médiu a sedimentu Stanovíme, jaké ředění daného dezinfekčního prostředku je ještě účinné pro potlačení růstu bakterií ZÁVĚR: Srovnáme účinné koncentrace jednotlivých dezinfekčních roztoků a určíme ten nejúčinnější

74 Doplňující úkol: Naočkováním na pevnou půdu potvrdit kultivací přítomnost mikroorganismů vjednotlivých směsích sdezinfekčnímpřípravkem Pomůcky: Petriho misky spevnou půdou (MPA), dávkovač aumělohmotné špičky, roztírací skleněnátyčinka (hokejka),termostat Postup: z jednotlivých zkumavek (směs dezinfekčního prostředku, kultivační půdy a kultury B. subtilis) přeneseme dávkovačem 0,1 ml roztoku na pevnou kultivační půdu MPA a rozetřeme pomocí skleněné roztírací tyčinky po celé ploše adáme kultivovat při37 C po dobu 24 h. Hodnotíme počet narostlých kolonií příslušného mikroorganismu. Vše dobře popisujeme!!

75 Bacillus Charakteristika rodu Vegetativní buňky rodu Bacillus jsou aerobní, peritrichní tyčinky, rovné s oblým nebo hranatým zakončením a poměrně velkých rozměrů: (0,5 x 1,2mm) až (2,5 x10mm). Tvorba katalasy. Je to rod grampozitivní Buňky se mohou vyskytovat samostatně nebo tvoří řetízky o počtu jednotek až stovek Významný taxonomický znak celé čeledi Bacilliaceae - tvorba jedné endospory,která se vyznačuje velkou odolností kvysokým teplotám, jedům, zářenímajiným nepříznivým podmínkám. Pro tvorbu endospor u rodu Bacillus je absolutně nezbytná přítomnost kyslíku. Spory jsou obvykle cylindrické, elipsoidní nebo sférické, ale je možné se uněkterých kmenů určitých druhů setkat istvarem ledvinovitým. Umístění spory vmateřské buňce (sporangiu) azda mají spory vegetativní buňky větší šířku než vegetativní buňka (tj. zda je sporangium zduřelé) či ne je typické pro každýdruh.

76 Rod Bacillus je rozsáhlý a v přírodě velmi rozšířený. Zástupci mohou rozkládat nejrůznější organické sloučeniny, mají bohatou enzymatickou výbavu -aktivní amylolytické enzymy, které štěpí škrob -pektolytické enzymy, které štěpí rostlinné pektiny -velmi aktivní proteolytické enzymy, takže se uplatňuje při aerobním a anaerobním rozkladu bílkovin. Kingdom: Phylum: Class: Order: Family: Genus: Bacteria Firmicutes Bacilli Bacillales Bacillaceae Bacillus

77 Řada druhů produkuje antibiotika polypeptidové povahy,znichž některá se pomocí těchto bakterií vyrábějí průmyslově (např. bacitracin). Určité druhy slouží pro průmyslovou přípravu enzymů. Bakteriální amylasy získané zbacillus subtilis se uplatňují vpivovarství avtextilním průmyslu proteinasy se používají především do pracích prostředků. Bacillus cereus -Gramovo barvení

78 Významné druhy rodu Bacillus Bacillus anthracis Je známá především jako původce onemocnění anthrax, vpřírodě je to však půdní bakterie, která tvoří spory. Primárně je tato bakterie patogenem býložravých savců, nákazy učlověka jsou zaznamenávány především vrozvojových zemích, ve vyspělých zemích pak hrozí použití této bakterie vbioterorismu. Anthrax na obarvené mikrofotografii v slezinové tkáni

79 Bacillus cereus β- haemolytická bakterie, která může způsobovat onemocnění z potravin. Onemocnění vzniká po požití kontaminovaných potravin enterotoxinogenním kmenem a z kontaminovaných kosmetických přípravků, či očních kapek. Průjmová forma (8-24 hpi) se spojuje s konzumací masových pokrmů a omáček a je podobná otravě, kterou vyvolal Clostridium perfringens. Emetická začíná 1 6 hodin po požití kontaminované potravy a je dávána do souvislosti s požitím rýžových pokrmů a těstovin. Podobnost s otravou, kterou způsobil Staphylococcus aureus. Převážně se vyskytuje vpůdě, ve vodě a na rostlinách. Kolonie Bacillus cereus na krevním agaru

80 Bacillus thuringiensis obsahuje tzv. cry toxiny, které mají insekticidní účinky na některé skupiny hmyzu a proto se užívá k produkci pesticidů a také genticky modifikovaných (transgenních) rostlin. Bacillus thuringiensis

81 Bacillus subtilis běžně naházený v půdě. Není považován za humánního patogena; může kontaminovat potravu, ale zřídka způsobuje jedovatost potravin. B. subtilis produkuje proteolytický enzym subtilisin. Spory mohou přežívat teplo, které se používá při úpravě potravin, je zodpovědný za vznik provázkovitosti v chlebovém těstě pevná, provázkovitá konzistence která je dána produkcí dlouhořetězových polysacharidů. Kolonie Bacillus subtilis na médiu

82 B. subtilis, forma atrofeus cíleně používaný ke zkoušení desinfekčních přípravků. Bacillus subtilis barvený na endospory

83 CVIČENÍ Č. 3 Vyhodnocení účinnosti dezinfekčních přípravků na růst Bacillus atrophaeus Hodnotíme: 1. Přítomnost blanky na povrchu média u zkumavek se směsí dezinfekčního prostředku a Bacillus atrophaeus (syn. B. subtilis) + Bacillus přítomen - Bacillus nepřítomen

84 2. Srovnání účinnosti jednotlivých dezinfekčních prostředků mezi sebou Které dezinfekční prostředky byly účinné i ve vyšším ředění, a které byly méně účinné? 3. Zhodnocení růstu mikroorganismů na Petriho miskách počet kolonií charakteristika kolonií: barva, tvar, profil, okraje

85 Vyzrálá kolonie Bacillus atrophaeus Mladá kolonie Bacillus atrophaeus

86 Bacillus atrophaeus

87 4. Zhotovení nativního preparátu mikroorganismu Bacillus atrophaeus -bakteriologickou kličkou se odebere část kolonie -přenese se do kapky Lugolova roztoku na podložní sklíčko -mikroskopuje se při zvětšení 400x

88 TYPY BAKTERIÁLNÍCH KOLONIÍ

89 MORFOLOGIE BAKTERIÁLNÍCH KOLONIÍ Lactobacillus plantarum Staphylococcus aureus Okrouhlý tvar kolonií

90 Mycobacterium smegmatis Zvlněný tvar kolonií Neznámý izolát Laločnatý tvar kolonií

91 Neznámý izolát Sektorovitý tvar kolonií

92 PROFIL BAKTERIÁLNÍCH KOLONIÍ Pseudomonas aeruginosa Profil zvýšený Streptomyces albus Profil vypouklý

93 Streptococcus salivarius Tvar vypouklý Neznámý izolát Tvar knoflíkovitý

94 Bacillus licheniformis Tvar bradavčitý

95 TYPY OKRAJŮ KOLONIÍ Serratia marcescens Okraje hladké Bacillus anthracis Okraje vroubkované

96 Nocardia asteroides Okraje vláknité Thiomonas sp. Okraje prstovité (caput medusae)

97 Escherichia coli S koncentrickou stavbou Neznámý izolát Okraje svraštělé

98 Paenibacillus dendritiformis ve stresových podmínkách Rhizoidní okraje

99 Hladké (smooth) x drsné (rough) kolonie bakterií Rough colonies on blood agar (right) and smooth colonies on bicarbonate agar (left) of cultured Bacillus anthracis

100 Průkaz mikroorganismů v ovzduší Cíl úkolu Zjistit, zda v ovzduší laboratoře a jiných míst pracoviště /fytotrony, sterilní boxy, skleník / se vyskytují mikroorganismy Pomůcky: Petriho misky s masopeptonovým agarem /MPA/ a Sabouraudovým glukózovým agarem /SA/ Provedení: Petriho misky odkryjeme na dobu 10 min v předem určeném prostoru. Pak misky uzavřeme víčkem, popíšeme /datum, lokalita, jméno/ a vložíme dnem vzhůru do bioinkubátoru. Mikroorganismy kultivujeme při teplotě 26 C /SA/, a 37 C /MPA/

101 Výsledek: Zapisujeme v příštích cvičeních. Počítáme veškeré vyrostlé kolonie na každé agarové misce zvlášť a popisujeme morfologické vlastnosti jednotlivých kolonií. Makroskopicky rozlišíme kolonie vláknitých hub /jsou chmýřité, vláknité/ od kolonií ostatních mikroorganismů /bakterií a kvasinek/ Masopeptonový agar s glukózou /MPA/ pro kultivaci bakterií Masový extrakt /sušina/ 2,5 g Pepton pro bakteriologii 10,0 g Chlorid sodný 5,0 g Glukóza 5,0 g Agar 15,0 g Destilovaná voda 1000,0 ml Sabouraudův glukózo-peptonový agar pro kultivaci kvasinek a mikroskopických hub Pepton na bakteriologii 10,0 g Glukóza 40,0 g Agar 20,0 g Destilovaná voda 1000,0 ml

102 CVIČENÍ Č. 4 MIKROBIOLOGICKÝ ROZBOR OVZDUŠÍ vzduch není přirozeným, ale pouze přechodným prostředím mikroorganismů, podílí se na jejich přenosu mikroorganismy se dostávají do vzduchu rozvířeným prachem z půdy, drobnými kapkami vody z vodní hladiny, kapkami slin ze sliznic počet mikroorganismů v ovzduší se liší podle místa nejvíce je jich v průmyslových aglomeracích a nejméně nad mořem, nad chudými půdami, nad zalesněnými plochami prachové částice = nosiče mikroorganismů, zůstávají v ovzduší v podobě aerosolu nebo mohou sedimentovat mikroorganismy jsou vynášeny až do výšky 10 km, běžné druhy se vyskytují do výšky 3000 m mikrobiologické vyšetření vzduchu se provádí nejčastěji v uzavřených prostorách, přičemž se stanovuje celková koncentrace směsné populace bakterií a celková koncentrace směsné populace plísní v ovzduší v současné době 3 druhy metod, kterými lze mikroorganismy v ovzduší sledovat

103 1. Aktivní nasávání vzduchu 1.A. Impaktní metody využívají pro průchod vzduchu sací hlavu s otvory, mikroorganismy jsou zachycovány na agarová média v Petriho miskách. Nejčastěji krevní agary (pro humánní patogeny) a SA (pro vláknité houby). Na tomto principu tzv. aeroskopy. 1.B. Filtrační metody zachycují mikroorganismy pomocí čerpadla nebo vývěvy na filtry, které jsou vkládány na Petriho misky a agary.

104 Aeroskop Jsou používány pro měření možného mikrobiálního rizika kontaminace z ventilačních a klimatizačních systémů Nasávají úzkou štěrbinou vzduch a vrhají ho směrem k povrchu pomalu rotující Petriho misky se sterilním živným médiem, která se za 60s otočí 360 Velikost štěrbiny je měnitelná

105 2. Sedimentační metoda Ve vyšetřovaném prostoru (místnosti, laboratoři..) se určitou dobu nechají otevřené Petriho misky se živným médiem. Do takto otevřených Petriho misek se nechají sedimentovat mikroorganismy,ulpívající na prachových částečkáchvzduchu. Expozice může trvat 10 min až 1hodinu. Stanovuje se celková koncentrace směsné populace bakterií a celková koncentracesměsné populace plísní vovzduší. Neměla by být používaná pro hodnocení prostor zdravotnických zařízení, které využívají oběhový vzduch

106 Vyhodnocení minulého cvičení SA Sabouraudův agar selektivní půda pro houby obsahuje pepton, agar a cukry (glukozu nebo maltozu), ph 5,0 kultivace při 26 C 72 h MPA Masopeptonový agar neselektivní obsahuje pouze výtažek zmasa, pepton, sole a 2% agarovou řasu je základem pro další půdy kultivace při C h

107 VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ 1. Vytvořit seznam míst, kde se nechávaly otevřené Petriho misky zvlášť uzavřené prostory! 2. Vyhodnotit počet narostlých kolonií výsledek se přepočítá na dobu expozice 1 hodina. Zvlášť pro MPA a SA. 3. Rozlišit bakteriální a houbové kolonie, popsat kolonie morfologie. 4. Seřadit odběrná místa podle intenzity kontaminace Petriho misek 5. Slovní závěr

108 TYPY BAKTERIÁLNÍCH KOLONIÍ

109 Hodnocení narostlých kolonií Rozlišení na BAKTERIÁLNÍ KOLONIE HOUBOVÉ KOLONIE

110 Typy pozorovaných bakteriálních kolonií Cf. Micrococcus Cf. Streptomyces

111 Typy pozorovaných bakteriálních kolonií Cf. Cladosporium Cf. Fusarium Cf. Chrysosporium

112 Mikroskopický preparát houbových kolonií Nesporulující mycelium Konidie cf. Alternaria Konidie cf. Cladosporium Konidie

113 Určování mikroskopických vláknitých hub 1. Typ mycelia - přehrádkované x nepřehrádkované 2. Typ spor vznikají exogenně (konidie) x endogenně (sporangiospory) 3. Velikost a tvar spor (konidií) 4. Uspořádání konidioforů 5. Zbarvení kultivační půdy

114 7 skupin konidií na základě morfologie

115 Jednotlivé konidiofory Pyknida Koremium Acervulus Sporodochium

116 Zbarvení kultivačních půd r. Fusarium

117 Cvičení č. 4. Mikrobiologický rozbor povrchové vody Cíl úkolu: Prokázat přítomnost mikroorganismů v povrchové vodě Pomůcky: Vzorky různých typů povrchových vod /říční, stojaté../ odebrané do sterilních lahví co nejčerstvěji před použitím. Sterilní zkumavky, pipety na 10 ml, 1 ml a mikropipety. Fyziologický roztok, Petriho misky s masopeptonovým agarem (MPA), Endův agar a Slanetz-Bartley agar /SB/.

118 MPA masopeptonový agar Typy použitých půd 1. pro chladnomilné bakterie kultivace 26 C 72 h (potvrdí se tím saprofytické bakterie) 2. pro kultivaci mezofilních bakterií kultivace C (24-48 h) Endův agar sytě růžový (obsahuje bazický fuchsin) diagnostická půda pro kultivaci koliformních bakterií (hlavně Escherichia coli). Kultivace při C h. Slanetz-Bartleyův agar jemně růžový. Obsahuje azid sodný. diagnostická a selektivní půda pro střevní (fekální) enterokoky. Kultivace při C (24-48 h)

119 Provedení: 1. Na povrch každé agarové plotny napipetujeme přímo z lahve 0,1 ml vzorku vody a rozetřeme hokejkou po celém povrchu. Popíšeme Petriho misky. 2. Vzorek ředíme diluční metodou (viz. Cvičení č. 2) na koncentraci 10-1 a pak provedeme viz bod Bakterie pěstujeme v bioinkubátoru, při výše stanovených teplotách a čase, po uplynutí předepsané doby odečteme výsledky, popř. přeneseme do ledničky. Výsledek: Stanovíme počet vzrostlých kolonií /KTJ/ a zhodnotíme počet násobený příslušným koeficientem ředění. Vypočteme, kolik bakterií obsahuje 1 ml zkoumaného vzorku vody. Výpočet: 10 x počet kolonií vyrostlých na plotně x koeficient ředění Posoudíme morfologické vlastnosti kolonií a zapíšeme do protokolu

120 CVIČENÍ Č. 5 BAKTERIE VE VODĚ Voda v přírodě obsahuje určité množství mikroorganismů Jejich kvalitativní i druhové zastoupení kolísá Sterilní voda v přírodě není Sladká voda je jedním z přirozených stanovišť bakterií. Ve vodě přítomné bakterie můžeme rozdělit do tří základních skupin

121 Všeobecné zásady při odběru vzorků vody 1. Volba správného místa odběru tak aby vzorek pro sledovaný zdroj vody byl reprezentativní, tj. aby správně vystihoval podmínky existující ve vodě 2. Odebíráme vodu do sterilních odběrových setů autoklávované 3. Respektovat, že při odběru vzorku pro komplexní analýzu se vzorek určený pro mikrobiologický rozbor odebírá jako první. Do sterilních lahví se zabroušenouzátkou nebo plastů bez toxických látek. 4. Pro většinu účelů stačí 300 ml. Vzorky mají zůstat neprodyšně uzavřené do otevření vlaboratoři. Pokud se provádí ichemická analýza odebírá se 1l. 5. Odběr: cm pod vodní hladinou utekoucích vod, ale nesmí se odebírat ode dna. 6. Ideální je zpracovat vzorky do 2-6 h po odběru. Nejpozději je možno vzorky zpracovat do 24h po odběru, za předpokladu, že během přepravy do laboratoře budou uchovávány přiteplotě 4-6 C. 7. Přesné protokoly místo, datum, hodina odběru, zdroj vody, jméno osoby,která vzorek odebírala, datum analýzy,použitá metoda, způsob manipulacese vzorkem, avýsledek analýzy.

122 DRUHY BAKTERIÍ VE VODĚ: 1. Autochtonní bakterie 2. Bakterie z půdy 3. Bakterie ze střevního traktu lidí a zvířat

123 1. AUTOCHTONNÍ BAKTERIE Typické vodní bakterie Chromobacterium, Flavobacterium, Micrococcus luteus, Leptothrix, Spirillum Chromobacterium violaceum, saprofytické bakterie, které se běžně nacházejí v půdě, vodě nejčastěji v tropických a subtropických oblastech, a velmi zřídka může způsobovat humánní choroby (často fatální). Flavobacterium velmi běžný rod, nachází se v půdě, na rostlinných, živočišných a potravinových zbytcích a téměř ve všech vodních systémech.

124 Leptothrix bakterie, které nacházíme ve vodních prostředích, které obsahují dostatečné množství organické hmoty Micrococcus luteus je gram pozitivní, okrouhlá, saprofytická bakterie. Je to obligátní aerob, nachází se v půdě, prachu, vodě a vzduchu a je součást normální mikrobiální flóry na kůži savců. Bakterie také může kolonizovat lidská ústa, oropharynx (ústní část hltanu) a horní cesty dýchací. Spirillum nacházíme v mnoha místech se stojatou vodou

125 Pochvaté bakterie Sphaerotilus vláknitá bakterie s pochvou, která se nachází v tekoucích vodách a odpadních vodách. Roste dobře v nízkých koncentracích kyslíku. Není známo, že by byla patogenní.

126 Fakultativně i obligátně anaerobní bakterie Clostridium, Desulfovibrio, Desulfotomaculum Clostridia jsou sporogenní, gram pozitivní anaerobové. Produkují řadu toxinů, některé z nich jsou smrtelné. Nachází se často v prostředí v půdě, odpadních vodách, mořských usazeninách a vnitřních orgánech lidí i zvířat (nebezpečné - Clostridium tetani; Clostridium botulinum)

127 Desulfotomaculum anaerobní bakterie, která redukuje sulfáty, sulfity a jiné sloučeniny síry. Okolo 20 druhů bylo objeveno v různých prostředích v půdě, vodě a geotermálních oblastech a ve vnitřních orgánech hmyzu a žaludku teplokrevných živočichů. Desulfovibrio je sulfát redukující bakterie (anaerobní). Její kmeny se nachází na mnoha stanovištích, v půdě, vnitřních orgánech a výkalech živočichů, v slaných i sladkých vodách.

128 2. PŮDNÍ BAKTERIE Do vody dostávají splavováním. Tyto bakterie osídlují pobřežní úseky vodní plochy. Se vzrůstající vzdáleností od břehu jejich počet klesá. Jedná se o aerobní bakterie tj. výskyt ve vrchních vrstvách vody. Nejčastější rody: Bacillus, Corynebacterium, Micrococcus, Streptomyces Bacillus rozsáhlý rod G+ sporulujících bakterií. Široce rozšířen v půdě a prachu (obvykle spory). Často také na mrtvém organickém materiálu a je zodpovědný za kažení potravin. Corynebacterium malé, obvykle nepohyblivé G+ nesporulující bakterie. Mnoho druhů bylo izolováno z různých stanovišť (půda, voda, krev a lidská kůže). Patogenní kmeny r. Corynebacterium mohou infikovat rostliny, živočichy včetně člověka.

129 Micrococcus luteus je nacházen na různých stanovištích jako je lidská kůže, voda, prach a půda. Micrococcus není obecně považována za nebezpečnou bakterii. Streptomyces zástupce skupiny Actinomycetes, obvykle osidluje půdu a je důležitý rozkladač. Producenti antibiotik.

130 3. STŘEVNÍ BAKTERIE ČLOVĚKA A ZVÍŘAT Patří sem především zástupci čeledi Enterobacteriaceae nebo rodu Streptococcus, Clostridium. Za určitých podmínek můžeme izolovat i patogenní bakterie (Salmonella typhi, Shigella dysenteriae), jejich výskyt je však krátkodobý, protože voda pro něnení vhodným stanovištěm. Streptococcus (S. faecalis) jedná se o různorodou skupinu, která může infikovat velké množství rozličných organismů, včetně člověka a způsobuje od streptokokové angíny až po necrotizing fasciitis infekce kůže. Velké množství kmenů je rezistentních k antibiotikům

131 Enterobacteriaceae -běžně zvané enterobakterie, je rodově i druhově početná čeleď zahrnující gramnegativní, fakultativně anaerobní tyčinky, z nichž většina žije ve trávicím traktu obratlovců jako přirozená součást mikroflóry střeva. Většina je nepatogenních, ale některé jsou podmíněně patogenní a některé druhy jsou nebezpečnými původci vážných i smrtelných nemocí (např. Salmonella, Shigella, Yersinia pestis, některé kmeny E. coli). Nevadí jim vysoká koncentrace žlučových solí, toho se využívá při přípravě výběrově diagnostických půd. Většina enterobakterií jsou saprofyté a mutualisté trávícího ústrojí, tvoří součást obligátní mikroflóry střeva. Vyskytují se také ve vodě, v půdě a na rostlinách. Tzv. koliformní bakterie, tedy Escherichia coli a další druhy štěpící laktózu, jsou indikátorem fekálního znečištění pitné vody. Rody: Escherichia, Citrobacter, Salmonella, Shigella, Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Serratia, Proteus, Yersinia, Erwinia, Edwardsiella

132 Salmonella typhi je gram negativní bakterie, která způsobuje systémové onemocněné a tyfovou horečku u lidí (břišní tyfus). V rozvojových zemích způsobuje mnoho úmrtí, díky špatné hyigeně a velké kontaminaci vody. Další druhy r. Salmonella, způsobující salmonelózy jsou Salmonela enteritidis, infantum, agona, derby

133 Shigella dysenteriae jsou to gram-negativní patogennní bakterie, původce shigellozy (známé jako bacilární úplavice). Je imunní k působení trávicích šťáv- proteázám a kyselinám a může způsobovat onemocnění již ve vlemi nízkých dávkách ( bakterií může způsobovat infekci).

134 Koliformní bakterie jsou gramnegativní nesporulující aerobní až fakultativně anaerobní tyčinky, které zkvašují laktózu na plyny, kyseliny a aldehydy. Tyto bakterie patří do čeledi Enterobacteriaceae. Jsou indikátorem fekálního znečištění pitné vody. r. Escherichia, Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter r. Escherichia Gram negativní, chemoorganotrofní fakultativně anaerobní metabolismus aerobně respirační a fermentativní tvar tyčinek, petrichální bičíky, i nepohyblivé opouzdřené (kapsula, může se rozpadat) teplota C, opt. 37 C zkvašují sacharidy produkce plynu zkvašuje laktózu produkce indolu

135 Escherichia coli komenzál v tlustém střevě teplokrevných živočichů její přítomnost v čerstvé vodě indikuje fekální znečištění a vede k vyloučení vody pro použití jakožto pitné vody. Některé vzácnější kmeny E. coli jsou nebo za určitých okolností mohou být patogenní. Mohou způsobit různé zánětlivé stavy jako např. zánět močového měchýře. E. coli je používána jako důležitý modelový organismus v genetice a mikrobiologii, který je významný zvláště pro obecné modelové studium bakterií pro svou relativní jednoduchost využívaná v biotechnologiích např. pro konzervování požadovaných úseků DNA, přenos rekombinantní DNA pomocí konjugace do jiných organizmů

136 Vyhodnocení kultivace živných půd se vzorkem 0,1 ml povrchové vody (ředěné/ neředěné) 1. Endův agar sytě růžový (obsahuje bazický fuchsin) diagnostická půda pro kultivaci koliformních bakterií (hlavně Escherichia coli). Kultivace při C h Zapsat počet kolonií (přepočíst na KTJ/ml) a popsat jejich tvar a barvu Potvrzení E.coli dalšími metodami oxidázový test a nebo Kováczovým činidlem detekce produkovaného indolu V Endově agaru je obsažena laktóza, siřičitan sodný výsledkem jejich interakce je bezbarvá látka, která se při růstu koliformních bakterií mění do červené barvy. Všechny kolonie pak mají červenou barvu. Na jiné půdě, např. s Tergitolem - mají tytéž bakterie jinou barvu žlutou.

137 Typy nalezených bakteriálních kolonií na Endově agaru Escherichia coli Jiné typy koliformních bakterií

138 2. Slanetz-Bartley agar jemně růžový (obsahuje azid sodný) diagnostická a selektivní půda pro střevní (fekální) enterokoky. Kultivace při C (24-48 h) Zapsat počet kolonií (přepočíst na KTJ/ml) a popsat jejich tvar a barvu Fekální enterokoky čel. Enterobacteriaceae

139 MPA masopeptonový agar 1. pro chladnomilné bakterie kultivace 26 C 72 h (potvrdí se tím saprofytické bakterie) 2. pro kultivaci mezofilních bakterií -kultivace C (24-48 h) Zapsat počet kolonií (přepočíst na KTJ/ml) a popsat jejich tvar a barvu Mohou zde být kvasinky, r. Pseudomonas, Serratia, Bacillus, Micrococcus

140 Typy bakteriálních kolonií na MPA, t=36 C Vláknité kolonie cf. Streptomyces Sporulující bakterie cf. Bacillus Hladké kolonie cf. Micrococcus Nepravidelné hlenovité kolonie

141 Cvičení č. 5. Průkaz bakterií v půdě 1. Celulolytické bakterie v půdě Cíl úkolu: Zjistit, zda se ve vzorcích půdy vyskytují celulolytické bakterie Pomůcky: Několik různých půdních vzorků prosetých sítem o velikosti ok asi 2 mm, nastříhané proužky filtračního papíru velikosti 4 x 1 cm, pinzeta, stříkačka s destilovanou vodou. Plastová Petriho miska. Provedení: Vzorky proseté zeminy dáme do Petriho misek, povrch zarovnáme. Vodou ze střičky zeminu mírně provlhčíme a na rovný povrch uložíme pinzetou paralelně vedle sebe několik proužků filtračního papíru. Dbáme, aby papírové proužky k zemině celou plochou přilnuly a nebyly na povrchu zeminou potřísněny. Přeneseme je do bioinkubátoru a kultivujeme při teplotě 26 C.