Aplikace mikroorganismů v biotechnologii

Transkript

1 Aplikace mikroorganismů v biotechnologii bíos + techné + lógos život + dovednost/umění + slovo/rozum Mgr. Ing. Marta Greplová Ph.D. CRH, Oddělení molekulární biologie Postupy výroby různých produktů, využívající živé organismy a poznatky o jejich metabolismu Jakakoliv technologie, která využívá biologické systémy, živé organismy nebo jejich části k určité výrobě nebo jejich přeměně či jinému specifickému použití. Zemědělství Průmysl Potravinářství Energetika (Definice OSN v dohodě o Medicína biologické diverzitě, 1993) Ochrana životního prostředí Klasické - mají základ v empirii a používají se od počátku lidské společností při výrobě různých potravin (kvašené okurky a zeli, mléčné výrobky) a nápojů (víno, pivo). Moderní - postupně zaváděny od druhé poloviny 20. století nejen jako důsledek pokroku biologie, biochemie, chemie, genetiky, ale i rozvoje technických oborů (nové objevy v elektronice, informatice a inženýrství, miniaturizace technických součástek, konstrukce mikroanalytických přístrojů). ČERVENÁ (medicína a farmacie) ZELENÁ (technologie aplikované v zemědělství) MODRÁ (průzkum a využití mořských živočichů) BÍLÁ (průmyslová výroba chemických látek) ŠEDÁ (životní prostředí - environmentální) 1

2 Historie biotechnologie Mezníky vědy, které ovlivnily rozvoj biotechnologií Starověk / středověk: nevědomé využití mikroorganismů 6000 BC Sumerové - výroba piva zkvašováním cukru 5000 BC Babyloňané - výrobu kyseliny octové z ethanolu 4000 BC Egypťané kvasinky pro fermentaci chlebového těsta Číňané konzervace mléka kvašením, výroba sýrů, vína a octa 1276 AD Irsko - první palírna whisky (oficiálně 1608 dekret Jamese I) 15.století technologie kvašeného zelí a jogurtu 1590 Zacharias Janssen - první pevné mikroskopy, dvoučočkové 1675 Antonie Philips van Leeuwenhoek jako první pozoroval bakterie (povlak ze zubů) a ve vodě prvoky animalcules V minulosti byly biotechnologie spíše uměním (řemeslem) než aplikací vědeckých poznatků, příkladem čehož je výroba vína, piva či sýrů. Výrobní postupy těchto procesů byly velmi dobře zvládnuty a bylo dosaženo vysoké reprodukovatelnosti bez znalosti molekulárních mechanismů Georg Ernst Stahl studium fermentačních procesů ( Zymotechnia Fundamentalis ) 1830 objeveny proteiny 1833 izolovány první enzymy Hlavní Mezníky oblasti vědy, použití které ovlivnily biotechnologie rozvoj biotechnologií posledních let Mezníky vědy, které ovlivnily rozvoj biotechnologií 1855 objevena bakterie Escherichia coli později hlavní výzkumný a produkční nástroj v biotechnologiích 1863 Mendelovy poznatky (křížení hrachu) položily základy klasické genetiky 1857 Louis Pasteur potvrzena úloha bakterií při kvašení Objevil mikroorganismy ve vzduchu, příčiny, podstatu kvašení, hniloby a nemoci, sterilizace teplem (pasterizace), očkování proti vzteklině a Bacillus anthracis 1877 Robert Heinrich Herman Koch - techniky izolace, fixace a barvení bakterií, nové způsoby pěstování čistých bakteriálních kultur, objevil původce cholery, tuberkulózy a anthraxu. 19. století - mohutný rozvoj evropského pivovarství Stavovská inženýrská škola v Praze Pivovarská škola ve Weihenstephanu Výzkumný a vzdělávací pivovarský institut v Berlíně Na přelomu 19. a 20. století dochází v průmyslových biotechnologických procesech k odklonu od původně dominantního pivovarství. Biotechnologie se stávají alternativou chemických výrob organické kyseliny (mléčná, citrónová, máselná). Jsou zakládány sbírky čistých mikrobních kultur (1884 Praha, 1906 Dánsko ad.) smíšená mikrobní populace ( aktivovaný kal ) byla použita pro čištění odpadních vod v Manchestru (Anglie) 2

3 Mezníky vědy, které ovlivnily rozvoj biotechnologií Hlavní obory přispívající k rozvoji biotechnologie 1928 Alexander Fleming - penicilin, první antibiotikum vhodné pro lidi V následujících desetiletích paralelně s objevy v biologických disciplínách probíhá významný rozvoj technických řešení biotechnologických procesů Norman Heatley, Howard Florey - průmyslová produkce penicilinu 1944 Selman Abraham Waksman - streptomycin, účinný proti tuberkulóze 1953 časopis Nature publikoval práci Watsona a Cricka popisující dvoušroubovicovou strukturu DNA Mikrobiologie zvláště fyziologie a genetika mikroorganismů Molekulární genetika zejména metody genové manipulace Genetika vyšších organismů zejména somatická genetika Bioinženýrství hlavně zdokonalování technické stránky fermentačních výrob, vývoj bioreaktorů pro enzymové technologie a speciálních technik pro kultivaci živočišných a rostlinných buněk Procesní inženýrství zvláště automatizace biotechnologických výrob Biochemie a fyzikální chemie separačních procesů Analytická chemie aplikace speciálních metod pro analýzu biologických materiálů Konstrukce výrobních zařízení pro biotechnologie včetně měřící techniky a čidel Interdisciplinární povaha biotechnologií Hlavní oblasti použití biotechnologie posledních let ZEMĚDĚLSTVÍ výroba enzymů, doplňků krmiv, ochucovadel, aminokyselin, nových typů krmných antibiotik, zvyšování odolnosti kulturních rostlin, zavádění nových typů kultivarů a kulturních plodin, genetické dopování rostlin s cílem snížit nebo úplně odstranit potřebu jejich hnojení, produkce nových typů biopesticidů a rostlinných vakcín, diagnostika rostlinných chorob POTRAVINÁŘSKÝ PRŮMYSL tradiční bioprocesy pivovarství, vinařství, drožďárenství, sýrařské technologie, výroba široké škály potravinářských produktů (pečivo, sýry a další mléčné výrobky, konzervované potraviny), nápojů (pivo, víno, destiláty) a aditiv CHEMICKÝ PRŮMYSL výroba alkoholů, organických kyselin, aminokyselin, nukleotidů, degradabilních polymerů, provádění náročných kroků organických syntéz a přeměn labilních meziproduktů, výroba opticky aktivních látek pomocí enzymové katalýzy MEDICÍNA A FARMACEUTICKÝ PRŮMYSL produkce monoklonálních protilátek, očkovacích látek (vakcín), interferonů, peptidových hormonů, bílkovin se specifickými účinky, purifikovaných genů, nových typů antibiotik, zefektivnění výroby vitamínů a léčiv 3

4 Hlavní oblasti použití biotechnologie posledních let Biotechnologicky proces OCHRANA ŽIVOTNÍHO PROSTŘEDÍ zpracování a recyklace městských, průmyslových a zemědělských odpadů; biologické čistírny odpadních vod; kompostování; produkce bioplynu; kontrola znečištění; odstranění toxických látek z životního prostředí OSTATNÍ PRŮMYSL získávání kovů z důlních odpadů a z chudých rud; zpracování lignocelulosových odpadů za vzniku nových chemických surovin, energetického etanolu, metanu a vodíku ( zelená energie ) GENOVÉ INŽENÝRSTVÍ do jednoho organizmu cíleně vnáší určitý gen či geny jiného organizmu. GMO se dnes ve velké míře využívají v medicíně (výroba insulinu a dalších hormonů) potravinářství (například rekombinantní chymosin pro výrobu sýrů) zemědělství (rostliny cukrové třtiny tolerantní k mrazu; salátová zelenina nemající tendenci ke hnědnutí; sója odolná k herbicidům; banány obsahující dávky vakcín pro děti; ovoce a zelenina s vyšším obsahem vitamínů; pomalu zrající broskve a rajčata; dlouho kvetoucí květiny, modré růže ap.; skot odolávající vyšším teplotám, nedostatku vody, odolný vůči masařkám ap.) Typické produkty: buněčná biomasa, kvasnice, proteiny produkty buněčného metabolismu (primární a sekundární) anaerobní (alkoholy, kyseliny, CO 2 ) aerobní (kyselina citronová, glutamát, laktáty, antibiotika ) produkty enzymatické katalýzy SUBSTRÁT 1. fáze = upstream processing 2. fáze = biologický proces PRODUKT 3. fáze = downstream processing Výhody nižší energetická náročnost neagresivní prostředí levné suroviny (odpady) řešení problematiky odpadů, výživy a péče o zdraví lidí vysoká selektivita Nevýhody sterilní podmínky vyšší nároky na kontrolu problémy se zajištěním biomasy (skladování) náročnější izolace (práce ve větším zředění) Suroviny: fytomasa (obnovitelné zdroje)-melasa, syrovátka, sulfitové výluhy, sláma, plevy, řepné řízky, bagasa (často odpadní látky) 4

5 Biologicky proces Biologicky proces Povrchová kultivace používají se podlouhlé perforované nádoby s polotuhým médiem (v 1-10 cm vrstvě), které se po zaočkování umístí v místnosti s kontrolovanou teplotou a vlhkostí nebo kultivace probíhá v pomalu se otáčejících bubnech s kontrolovanou teplotou a vlhkostí (výroba plísňových enzymů) médium se připravuje smícháním otrub s vodou a přídavnými živinami; po sterilizaci se přenese do nádob není možné zabránit sekundární kontaminaci - očkují se vysoké dávky inokula, aby nedošlo k přerůstání kontaminující mikroflórou max. enzymová aktivita po h kultivace snadné čištění enzymových preparátů a vyšší výtěžnost časově náročné bez míchání potřeba hodně prostoru Submerzní kultivace růst mikroorganismů v třepaných baňkách nebo bioreaktorech volně v médiu sterilní podmínky medium je trvale promíchávané a provzdušňované možnost přesné regulace a kontroly celého procesu mikroorganismy mnohem efektivněji využívají živiny a intenzivněji se množí v průmyslových aplikacích se využívají fermentory (bioreaktory) o různém objemu 0,5l m 3, využívá se 80 % objemu doba fermentace h v závislosti na organismu a produktu Růst biomasy růstová křivka Růst biomasy růstová křivka vyjadřuje změny početnosti buněk v závislosti na čase růst buněčné kultury prochází několika fázemi: Lag-fáze počáteční fáze, počet buněk nejprve mírně klesne a pak poměrně rychle vzrůstá. Buňky se adaptují na kultivační prostředí a připravují se k buněčnému dělení. Log-fáze (též logaritmická nebo exponenciální fáze) počet buněk exponenciálně roste. V této fázi zachytíme nejvíce buněk v mitóze, což lze využít pro chromozomové vyšetření. Stacionární fáze (plató) rychlost růstu populace postupně klesá, projevují se inhibiční mechanismy (např. kontaktní inhibice, produkce růstových inhibitorů) a postupné vyčerpávání živin z média. Fáze úbytku buněk dochází k postupnému odumírání buněk způsobenému nedostatkem živin, snížením ph (následkem zvýšení koncentrace CO 2 a dalších kyselinotvorných látek v médiu) a hromaděním toxických produktů buněčného metabolismu. 5

6 Fermentace Optimalizace bioprocesu Kvašení (fermentace) je přeměna látky za účasti enzymů mikroorganismů, při němž probíhají v důsledku metabolické aktivity mikroorganismů chemické přeměny organických látek, obvykle sacharidů a vznikají látky energeticky chudší nebo se nové látky syntetizují. V potravinářství tento termín označuje procesy, jichž se zúčastní mikroorganismy (např. kvašení piva, vína, těsta). Kvašení anaerobní probíhá bez přítomnosti kyslíku, například kvašení alkoholické, máselné, mléčné. Kvašení aerobní probíhá za přítomnosti kyslíku, například kvašení octové, citrónové. Hlavní faktory, které určují kvalitativní a kvantitativní výsledky bioprocesu: konstrukce a/nebo selekce produkčního kmene optimalizace složení média výběr typu kultivace podle optimalizovaného parametru, technických možností a dalších kritérií optimalizace kultivačních parametrů (ph, teplota, aerace, míchání ) je nutné pro růst a metabolismus mikroorganismů tvoří vnější prostředí, které ovlivňuje chování mikroorganismů (růst, metabolismus, fyziologie) ovlivňuje výtěžnost, rychlost tvorby a složení produktu musí obsahovat dostatečné množství živin živiny růst buněk, získání energie pro syntézu produktu a zachování buněčné integrity Návrh složení média je nutno znát biochemii kultivace vliv na metabolismus a fyziologii buněčné populace účel kultivace > složení média cena (tvoří přes 50% ceny konečného produktu), stálost jeho složení formulace média - kompromis mezi nutričními požadavky, cenou a dostupností složek média chemické složení média určí se ze složení biomasy a produktu, výtěžnostních koeficientů a doplňkových experimentů je potřeba brát v úvahu také bezpečnost a zdravotní nezávaznost elementární složení všech mikrobiálních buněk je relativně podobné obsah hlavních prvků (C, H, N, O, S, P) 6

7 Syntetické definované složení - minerální soli - čisté esenciální složky - zdroj uhlíku a energie Komplexní organický zdroj živin - hydrolyzáty proteinů (peptony) - extrakty masa, kvasnic zdroj energie hlavní anorganické ionty (Na +, K +, Ca 2+, Mg 2+, Cl - ) stopové prvky (Mn, Co, Ni, Cu, Fe, Zn) aminokyseliny (kyselina L-glutamová) pufrující složku (CO 2-3 /HCO 3-, HPO 2-4 /H 2 PO 4-, TRIS, HEPES ) vitamíny a jiné složky různých enzymů mastné kyseliny a lipidy specifické proteiny a peptidy podporující buněčné dělení (růstové faktory) antibiotika (pro snížení rizika kontaminace bakteriemi) nebo inhibitory acidobazický indikátor (fenolová červeň) sérum (zpravidla fetální bovinní sérum) odpěňovací prostředky povrchové napětí Zdroje uhlíku pro mikroorganismus jsou obvykle také hlavním zdrojem energie sacharidy: sacharosa, glukosa, fruktosa, laktosa, surový řepný cukr, škrob, celulosa komplexní substráty (sacharidická média): melasa, sladká syrovátka, celulózové substráty, sulfitové výluhy rostlinné oleje a živočišné tuky: sójový, slunečnicový, palmový, řepkový, bavlníkový, sádlo, rybí tuk petrochemické zdroje: uhlovodíky z ropy (C 10 -C 20 alkany), syntetické alkoholy, organické kyseliny Zdroje dusíku amonné soli: síran amonný (NH 4 ) 2 SO 4 rozpustný ve vodě, levný chlorid amonný NH 4 Cl fosforečnan amonný (NH 4 ) 3 PO 4 amoniak: také pro úpravu ph fermentačního média močovina (NH 4 ) 2 CO čisté aminokyseliny: často se používají také jako růstové látky komplexní zdroje: kukuřičný výluh odpad při výrobě kukuřičného škrobu šroty a mouky odpady při výrobě olejů sušená syrovátka peptony kvasničný extrakt 7

8 Kvasničný extrakt Produkovaný z odpadu pekárenských a pivovarských kvasinek; jiným zdrojem je Kluyveromyces marxianus kultivovaná na syrovátce nebo Candida utilis na etanolu, případně odpady ze zpracování dřeva a papíru. Zdroje fosforu Fosfor - klíčový prvek v energetickém metabolismu a je tímto limitující pro růst fosforečnany: fosforečnan amonný (NH 4 ) 3 PO 4 (také zdroj dusíku) komplexní zdroje: kukuřičný výluh mouky a šroty (arašídové, sójové) masové, masokostní a rybí moučky Stopové prvky anorganické soli (především sírany a chloridy) laboratorní podmínky kukuřičný výluh, sójová a arašídová mouka, řepná melasa, syrovátka - průmysl Bioreaktory Pěnění je typickým průvodním jevem většiny průmyslových fermentačních půd s vysokou koncentrací substrátů. struktura pěny je ovlivněna řadou faktorů (ph, teplota, viskozita, míchání ) každý použitý substrát určitým způsobem ovlivňuje tvorbu pěny nadměrné pěnění - ztráty v objemu kultury, možnost kontaminace odpěňovací prostředky (přírodní rostlinné nebo živočišné a syntetické) často zároveň slouží i jako zdroj uhlíku obecně by pro ně mělo platit, aby působily již v nízké koncentraci a dlouhodobě, aby nebyly toxické vůči danému mikroorganismu používají se přírodní oleje a tuky, vyšší alkoholy, deriváty sorbitanu, polyethery a silikony různého složení Pojmy fermentor a bioreaktor jsou synonyma pro totožná zařízení, která jsou považována za srdce výrobní linky biotechnologického procesu. Probíhá v nich růst buněk a tvorba produktů, nebo konverze substrátu na jeden či více produktů, přičemž proces je katalyzován buď volnými buňkami, nebo buňkami vázanými na nosič, nebo jedním či více enzymy vázanými na nosič. 8

9 Výběr bioreaktoru Parametry bioreaktoru Musí odpovídat především biologickým vlastnostem kultivovaných mikroorganismů nebo buněk. Kromě toho je ale třeba respektovat i chemické, fyzikální ale i technologické parametry. Biologické vlastnosti = velikost mikroorganismů a jejich morfologie (vláknité, jednobuněčné, plovoucí, přisedlé ) a také citlivost vůči střižným sílám Charakter substrátu = pevný, polotekutý, kapalný, plynný Provzdušňování = povrchově nebo submerzně Sterilizace = nutno vždy odstranit ostatní mikroorganismy Velikost kultivačního zařízení = přechod v rozsahu jednoho objemového řádu Nároky na energie, cena zařízení a jeho provozu Materiály vhodné pro konstrukci fermentorů odolné vůči korozi nesmí uvolňovat do média kovy netoxické vůči populaci buněk schopné sterilizace parou o vysokém tlaku odolné vůči deformaci míchadla, vstupní porty transparentní materiály (sklo) Bioreaktory Bioreaktory - typy Základní částí: přívod a odvod média přívod inokula míchací zařízení s motorem ventil na přívod vzduchu zařízení na odběr vzorků vyhřívání teploměr, tlakoměr měřící a regulační články ph, koncentrace O 2, antifoam peristaltické pumpy řídící jednotka dle fází jednofázové (kapalný substrát s rozpuštěným enzymem) dvoufázové (kapalina x částice / kapalina x mikroorganismy) třífázové (plyn x kapalina x mikroorganismy) čtyřfázové (tuhý substrát x plyn x kapalina x mikroorganismy) dle způsobu vedení fermentace batch (vsádková, diskontinuální) - jedno naplnění kontinuální (průtoková) - průběžné doplňování živin a odběr produktu v průběhu fermentace "fed-batch (semikontinuální, přítoková, příkrmová) - s postupným přidáváním živin 9

10 Batch fermentace Fed-batch fermentace nejjednodušší technologická varianta fermentace všechny živiny se přidávají před začátkem procesu konstantní objem po celou dobu fermentace zpomalení růstu po vyčerpání živin možná inhibice růstu toxickými látkami ukončení kultivace po zpomalení růstu kultury nebo poklesu koncentrace produktu začátek procesu je stejný počáteční koncentrace substrátu je nízká dokrmování - periodické přidávání živin (postupně nebo konstantní rychlostí) zvýšení produkce biomasy a výtěžku produkt zůstává v reaktoru až do konce procesu možná inhibice růstu toxickými látkami Kontinuální fermentace Kontinuální fermentace nepřetržitý pomalý přítok živin do systému za současného nepřetržitého odebírání kultivačního media, čímž je zajištěn dostatek živin po celou dobu kultivace a zároveň se naředí i případné toxické metabolity prodloužení exponenciální fáze růstu kultury buňky jsou udržovaný v trvalé aktivním fyziologickém stavu provádí se v režimu turbidostat, chemostat nebo auxostat několik týdnů až měsíců vyšší riziko kontaminace Růst mikroorganismů v logaritmické fázi: dx dt = μx dx D = μx DX = 0 dt μ rychlostní konstanta, tzv. specifická růstová rychlost X koncentrace mikroorganismů Rychlost množení mikroorganismů při kontinuální fermentaci: D = F V Závislost specifické růstové rychlostí na rychlost zřeďovací: D > μ D < μ D = μ kultura se vyplavuje kultura přerůstá rovnovážný stav zřeďovací rychlost F rychlost průtoku prostředí V jednotka objemu 10

11 Kontinuální fermentace Kontinuální fermentace Turbidostat dodáváme nadbytek živin a kultura roste maximální rychlostí zřeďovací rychlost mírně kolísá kolem hodnoty maximální specifické růstové rychlostí náročný na řízení (nutno průběžně sledovat počet buněk) Chemostat rychlost růstu je limitována koncentrací jedné živiny zřeďovací rychlost je menší než maximální specifická růstová rychlostí po určité době se ustaví rovnovážný stav a v prostředí je určitá koncentrace buněk samoregulační schopnost kontinuální kultury Auxostat konstantní parametr spjatý s růstem (ph-auxostat, po 2 -stat, CO 2 -stat) Bioreaktory - typy Bioreaktory - typy dle technického provedení otevřené (volně otevřené prostředí) uzavřené (kontrolované uzavřené prostředí) membránové (část prostoru oddělena pomoci membrány) fotobioreaktor (organismy vyžadující světlo) dle způsobu míchaní nemíchané mechanicky míchané (mechanické míchadlo, rotační pohyb reaktoru) hydraulicky míchané (míchání proudem kapaliny) pneumaticky míchané (probublávané) dle aktivní biologické složky enzymové (mohou být volné nebo imobilizované, tedy uchycenné) virální (např. produkce vakcín) mikrobní (volné, imobilizované) buněčné (rostlinné či živočišné kultury dle objemu laboratorní (do cca 30 l) čtvrtprovozní (30 až 100 l) poloprovozní (100 až 5000 l) provozní (nad 5 m 3 ) 11

12 Bioreaktory - typy dle aerace aerobní (za přístupu kyslíku) mikroaerobní (minimální přístup kyslíku) anaerobní (přístup kyslíku je zamezen) dle typu sterilizace nesterilizovatelné autoklávovatelný (skleněná nádoba) in-situ sterilizovatelný (nerezová nádoba, sterilizace parou) dle tvaru válcové s kulatým dnem cirkulační věžové Hlavní typy průmyslových bioreaktoru Míchací tank (Stirred tank) mechanické míchadlo (lopatkový rotor) zajišťuje homogenní distribuci tepla, živin a kyslíku (dispergace bublin aeračního plynu) nárazové kryty napomáhají míchání díky nárůstu víření, zabraňují tvorbě středového víru a eliminují mrtvý objem více než 70 % průmyslového použití přísná kontrola jednoduché čištění omezená velikost Základní typy míchadel Turbinové míchadla Vysoké střižné síly způsobují dispergací vzduchových bublin a dělicí kotouč zabraňuje zkratovému toku vzduchu kolem hřídele. Čerpací kapacita je omezená. Vrtulové míchadla Vyznačují se vysokou čerpací kapacitou, menšími střižnými sílami, axiálním tokem čerpané suspense a) vrtulové b) turbinové s narážkami c) turbinové bez narážek 12

13 Hlavní typy průmyslových bioreaktoru Hlavní typy průmyslových bioreaktoru Vířivý reaktor (air lift reactor) vysoký reaktor míchaný pouze vzduchem a rozděleny na 2 častí pomocí sací trubky (vnitřní provzdušňovaný region a vnější neprovzdušňovaný) gradient hustoty vyvolává neustálou cirkulací omezená střižná síla jednoduchý design a údržba malá spotřeba energii větší spotřeba vzduchu a vyšší tlak používaný pro čištění odpadních vod, savčí tkáňové kultury, biologické procesy (biokatalýza), farmaceutický průmysl Reaktor s pevnými nosiči (packed bed reactor) buňky mikroorganismů jsou imobilizované na velkých částicích a umístěné v koloně, kde se pak přidávají živiny průtok se mění během procesu kvůli postupné změně pórovitosti nosiče kvůli postupnému stlačování nosiče může doházet k poklesu tlaku napřič koloně obtížné čištění a výměna mikroorganismů malá spotřeba energii vysoký výtěžek používaný hlavně pro čištění odpadních vod Hlavní typy průmyslových bioreaktoru Sterilizace Membránový reaktor zařízení kombinující proces bioreakce a membránové separace do jednoho celku kultivace tkáňových kultur, kmenových buněk, čištění odpadních vod Sterilita = nepřítomnost živých mikroorganismů Sterilizace média, bioreaktoru a veškerého dalšího zařízení a portů (potrubí, ventily, filtry, senzory, vzduch, vzorkovač, atd.) nasycenou párou ºC, 0.2 MPa horkým vzduchem ºC chemický etanol, chlornan sodný, fenol, β-propiolakton, formaldehyd UV, X-rays, β-zaření ultrafiltrace plyny, roztoky velké reaktory in situ (SIP), malé v autoklávu 13

14 Kultivační podmínky Úzký rozsah podmínek, za kterých mikrobiální procesy probíhají Reaktory jsou vybaveny senzory a zařízeními pro měření a řízení základních procesních parametrů. Teplota optimální růstová teplota kmene, obvykle C urychluje řadu metabolických reakcí ale při vyšších teplotách rychlejší denaturace bílkovin a dezaktivace enzymů (využití při sterilizaci) lze využit pro změny rychlostí růstu a produkce teplo je generované samotnou metabolickou aktivitou a také mícháním regulace teploty díky cirkulaci vody v dvojitém plášti nebo pomocí elektrický ohřívané dečky Kultivační podmínky ph optimální růstové ph kmene, většina mikroorganismu ph 4-8 růst mikroorganismů velmi citlivý na hodnotu ph (enzymová aktivita závisí na ph) s hodnotou ph souvisí i odolnost vůči vyšším teplotám čím vyšší odchylka od ideálního ph, tím nižší odolnost vůči vysokým teplotám lze omezit kontaminaci vliv složení média indikátor metabolismu regulace automatizované dávkování H + a OH - (NaOH, KOH, NH 3, H 3 PO 4, H 2 SO 4 ) (kaskáda) Kultivační podmínky Příprava inokula Aerace podle metabolizmu produkce sterilní vzduch je dodávány pod tlakem ze spodu fermentační nádoby důležitá je koncentrace rozpuštěného kyslíku (DO - dissolved oxygen): otáčky míchadla průtok vzduchu tlak rychlost rozpouštění kyslíku zaleží na velikosti bublin vzduchu velikost vzduchové bubliny zaleží na průměru přívodové trubičky limitace kyslíkem v různých fázích řízení dostupnosti energie změny metabolismu převedení zakonzervované buněčné kultury ve stavu klidu do živného média do produktivního stavu růstu a množení zabránit možnostem kontaminace média několik tisíc buněk několik set litrů kultury transfer do produkční nádoby se provádí na konci exponenciální fáze růstu inokulum se do kultivační nádoby obvykle dodává v množství okolo 1-5 % objemu 14

15 Scale-up 15