Kolektiv autorů. Editoři: Marie Karlíková, Ondřej Topolčan. Protilátka a antigen. Zdroj:

Transkript

1 Imunoanalytické metody a jejich využití v biomedicínském výzkumu a klinické praxi Kolektiv autorů Editoři: Marie Karlíková, Ondřej Topolčan Protilátka a antigen. Zdroj:

2 2

3 Autoři Ing. Vladimír Bartoš, Ph.D. Katedra biomedicínských oborů, Lékařská fakulta Ostravské univerzity v Ostravě RNDr. Marie Karlíková, Ph.D. Laboratoř imunochemické diagnostiky ONM, Lékařská fakulta v Plzni a Fakultní nemocnice Plzeň Doc. MUDr. Marie Ludvíková, Ph.D. Ústav biologie LF UK Plzeň, Ústav patologie 1.LF a VFN Praha RNDr. Martin Pešta, Ph.D. Centrální radioizotopová laboratoř, Lékařská fakulta v Plzni a Fakultní nemocnice Plzeň Doc. RNDr. Kristián Šafarčík, CSc. Katedra biomedicínských oborů, Lékařská fakulta Ostravské univerzity v Ostravě RNDr. Jindra Vrzalová, Ph.D. Laboratoř imunochemické diagnostiky ONM, Lékařská fakulta v Plzni a Fakultní nemocnice Plzeň 3

4 Obsah 1. ZÁKLADNÍ POJMY A PRINCIPY IMUNOANALÝZY PROTILÁTKY REAKCE PROTILÁTKA-ANTIGEN LITERATURA IMUNOANALYTICKÉ METODY A TECHNOLOGIE DĚLENÍ IMUNOANALYTICKÝCH METOD RADIOIMUNOANALYTICKÉ METODY ENZYMOVÁ IMUNOANALÝZA LUMINISCENČNÍ IMUNOANALÝZA FLUORESCENČNÍ IMUNOANALÝZA NÁVAZNOST A STANDARDIZACE IMUNOANALYTICKÝCH METOD NÁVAZNOST MĚŘENÍ STANDARDIZACE METOD MULTIPLEXOVÁ IMUNOANALÝZA PLANÁRNÍ MIKROARRAYE PROTEINOVÉ ČIPY MULTIPLEXOVÉ REAKCE NA MIKROKULIČKÁCH (BEAD ARRAYS) LABORATOŘ NA ČIPU (LAB-ON-A-CHIP) LITERATURA PREANALYTIKA BIOLOGICKÉ VLIVY ODBĚR MATERIÁLU SEPARACE A TRANSPORT SKLADOVÁNÍ

5 5.5 LITERATURA IMUNOANALÝZA A MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE ZÁKLADY MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE PROČ VZNIKAJÍ A CO ZPŮSOBUJÍ MUTACE ZÁKLADNÍ METODY PRÁCE S NUKLEOVÝMI KYSELINAMI LITERATURA IMUNOHISTOCHEMIE A JEJÍ VYUŽITÍ METODOLOGIE IMUNOHISTOCHEMIE APLIKACE IMUNOHISTOCHEMIE

6 1. Základní pojmy a principy imunoanalýzy Kristián Šafarčík, Vladimír Bartoš, Marie Karlíková Imunoanalýza umožňuje citlivá stanovení nepatrných množství biomolekul, a to na základě využití přirozených vlastností protilátek: 1/ schopnost protilátek vázat se na široké množství přirozených i umělých sloučenin, buněk i virů, které se chovají jako antigeny. (Protilátky jsou proteinového charakteru a jejich velké množství vazebných míst je odvozeno z obrovského počtu kombinací sekvencí aminokyselin.) 2/ specificita protilátky pro reagující látku. Tato vlastnost umožňuje stanovení velmi nízkých (až pikomolárních, ) koncentrací látek za přítomnosti dalších podobných sloučenin (např. stanovení stopových množství hormonů ve vzorku krve). 3/ síla vazby protilátky s antigenem. Využití reakce protilátka - antigen in vitro je základem imunochemických metod. Imunoanalýza zahrnuje skupinu imunochemických metod, které k detekci využívají dobře měřitelné značené látky indikátoru a tím dosahuji vysoké citlivosti (detekční limity těchto metod dosahují hodnot až mol/l). Indikátorem může být radioaktivní izotop (radioizotopové metody) nebo jiná látka: enzym, fluorescenční značka, DNA, koloidní částice a pod. Indikátor je obvykle navázaný na protilátku (imunometrická analýza), nebo na antigen. 6

7 Počátky imunoanalýzy spadají do 50. let 20. století, kdy fyzikové Rosalyn Yalowová a Solomon Berson (pracovní i životní partneři) popsali princip kompetitivní radioimunoanalýzy (RIA), s jejíž pomocí změřili do té doby nedetekovatelná množství inzulinu v krvi. Yalowové a Bersonovi bylo jasné, že obdobné metody, založené na soutěži značeného a neznačeného antigenu o vazebná místa, bude možné vypracovat i pro další analyty, a tuto možnost chtěli poskytnout celému světu. Proto své poznatky uveřejnili bez patentové ochrany. V roce 1977 obdržela R. Yalowová (S. Berson se toho již nedožil) za vývoj radioimunoanalýzy pro peptidové hormony Nobelovu cenu. Později se hledaly i jiné možnosti značení molekul tak, aby byla umožněna stejně citlivá detekce. V roce 1971 se objevily metody, které místo radioizotopů využívaly enzymy. Jejich autory byli Eva Engvallová s Peterem Perlmanem ze Švédska a Bauke van Veemen s Antonem Schuursem z Holandska. Zatímco Holanďané svůj systém patentovali, Engvallová a Perlman věnovali světu metodu ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) stejně velkoryse, jako to před nimi s RIA udělali Rosalyn Yalowová a Solomon Berson. (převzato z Lapčík 2009). 1.1 Protilátky Protilátky (angl. antibody, Ab) jsou proteiny produkované vyššími živočichy jako součást imunitní odpovědi. V imunoanalýze se využívá jedna nebo několik specifických protilátek k detekci žádaného analytu. Analytem může být látka, která je přirozenou součástí organismu (např. hormony štítné žlázy) nebo je v těle produkována, ale typicky přítomna není (např. tumorové markery) nebo látky, které se v těle přirozeně nevyskytují (léky, drogy apod.) Protilátky patří mezi glykoproteiny, které nazýváme imunoglubuliny. V živém organismu se vyskytuje několik typů protilátek, které řadíme do tříd IgG, IgM, IgA, IgD nebo IgE. V krevním séru jsou nejvíce zastoupeny imunoglobuliny třídy IgG a IgM, Ty je možné oddělit od ostatních složek séra a získat tak směs imunoglobulinů. Pokud se oddělení imunoglobulinů neprovede, hovoříme o séru obsahujícím protilátky (tzv. antiséru). 7

8 Všechny třídy imunoglobulinů mají podobnou strukturu, skládají se dvou lehkých řetězců (L) a dvou těžkých řetězců (H). Lehké řetězce jsou vázány disulfidovými vazbami k těžkým řetězcům, které jsou mezi sebou rovněž vázány disulfidovými vazbami (Obrázek 1.1). Obrázek 1.1: Schematická struktura imunoglobulinu Lehký řetězec má relativní molekulovou hmotnost asi a obvykle se skládá z 220 aminokyselin, těžký řetězec má relativní molekulovou hmotnost okolo a je většinou tvořen 450 aminokyselinami. Lehké řetězce (L) mají variabilní (VL) a konstantní (CL) část. Rovněž těžké řetězce (H) mají část variabilní (VH) a konstantní (CH). Variabilní části jsou tvořeny vždy 100 až 110 aminokyselinovými zbytky na N-konci řetězců. Sekvence aminokyselin ve variabilních částech lehkých řetězců určují specifitu protilátky a vytvářejí vazebné místo pro určitou antigenní determinantu - paratop. Hlavními charakteristikami protilátek jsou: - afinita - avidita - specifita pro určitý antigen Afinita je energie vazby (síla vazby) protilátky s jednou antigenní determinantou antigenu. Je mírou síly interakce antigen-protilátka a je ji možné kvantitativně vyjádřit pomocí asociační konstanty (K as ) reakce. Kvalitní protilátky používané pro účely imunoanalýzy by měly mít K as = L.mol -1. Avidita je vazebná energie mezi celou molekulou antigenu a protilátkou, neboť většina antigenů je multivalentních, tj. má několik vazebných determinant pro různé protilátky. 8

9 Specifita protilátky je charakterizována minimální interferencí s jinými látkami, než je látka, pro jejíž stanovení je určena. Mírou specifity protilátky je procento zkřížené reakce s látkou, pro jejíž stanovení není určena. Podle způsobu přípravy a charakteru dělíme protilátky do dvou základních skupin, na: - protilátky polyklonální - protilátky monoklonální Polyklonální protilátky Připravují se cílenou imunizací zvířat (Obrázek 1.2). Je to proces, kdy se vybranému zvířeti aplikuje příslušný antigen v emulzi s tzv. Freundovým adjuvans (směs minerálních olejů, vosků a neživých bakterií, která zvyšuje imunitní reakci na podaný antigen). Doba imunizace, která je potřebná k tvorbě protilátek, je pro jednotlivé antigeny různá (2 až 6 měsíců). Během této imunizace vzniká v krevním séru zvířete směs protilátek proti různým antigenním determinantám použitého antigenu. Pokud byl k imunizaci použit jeden antigen (např. jedna bílkovina), vytvářejí se monospecifické protilátky (antisérum). Každý epitop v molekule antigenu stimuluje na tvorbu protilátek jeden klon B-lymfocytů. Protože kompletní antigeny mají více epitopů, aktivují několik klonů B-buněk. Proto imunizované zvíře syntetizuje směs monoklonálních protilátek, lišících se tím, že jejich vazebná místa mají různou afinitu a tím i specifitu k jednotlivým epitopům určitého antigenu, který vyvolal jejich tvorbu. Imunizace zvířat směsí antigenů navozuje produkci polyspecifických protilátek, obsahující imunoglobuliny proti většímu počtu antigenů (např. antisérum proti bílkovinám lidského séra používané při imunoelektroforéze). 9

10 Obr. 2: Příprava polyklonálních protilátek. (zdroj: Zichová et al. 1993). Polyklonální protilátka může obecně reagovat s několika antigenními determinantami. Příprava polyklonálních protilátek je prakticky nereprodukovatelný proces, takže opakováním nelze připravit identické antisérum. Výhody polyklonálních protilátek: vyšší citlivost vyšší avidita menší počáteční náklady Nevýhody polyklonálních protilátek: nutnost purifikace protilátky velké rozdíly v kvalitě vlivem nestejné (individuální) imunologické odpovědi není interference HAMA Monoklonální protilátky Monoklonální protilátky nejsou produkovány přímo organismem, ale buněčnou kulturou (Obrázek 1.3). Způsob přípravy těchto protilátek byl roku 1975 publikován G. Köhlerem a C. Milsteinem, kteří v roce 1984 spolu s N. K. Jernem získali Nobelovu cenu za fyziologii a 10

11 medicínu, a to za teorie pojednávají o specificitě ve vývoji a kontrole imunitního systému a za objev principu produkce monoklonálních protilátek. Obrázek 1.3 Příprava monoklonálních protilátek. (Zdroj: Zichová et al. 1993) Prvním krokem procesu je imunizace myši příslušným antigenem a následně se z její sleziny získají lymfocyty produkující protilátky. Druhým krokem je jejich hybridizace s myelomovými (nádorovými) buňkami, kdy dojde k fúzi obou typů buněk (tj. ke splynutí jader myelomové buňky a lymfocytu) a vytvoření tzv. hybridomů. Syntéza protilátky pokračuje v hybridomu., což je dáno geny imunizovaného zvířete ( lymfoidního rodiče ). Po myelomovém, rodiči získá hybridom nesmrtelnost, může se množit bez omezení po mnoho generací. Vhodnou selekcí hybridomů (tzv. klonováním), lze pak vybrat ty klony, které produkují protilátky proti vybrané antigenní determinantě antigenu. Protilátka syntetizovaná hybridomem je homogenní, s jediným typem vazebného místa, je produktem jednoho klonu lymfocytů. Hybridomy lze uchovávat za určitých podmínek (zmrazením na nízkou teplotu) a použít pro další produkci protilátek. Monoklonální protilátka tedy rozeznává jedinou antigenní determinantu, její příprava je, na rozdíl od polyklonálních protilátek reprodukovatelná. 11

12 Monoklonální protilátky (zpravidla myší) jsou jedním z nejmodernějších a nejefektivnějších způsobů diagnostiky i léčby rakoviny. Použití myších protilátek k diagnostice nebo léčbě může u pacientů vyvolat imunitní odpověď - produkci anti-myších neboli protilátek HAMA (Human-Anti-Mouse-Antibodies), která vede k falešně pozitivním, případně falešně negativním výsledkům u imunoanalytických stanovení. Výhody monoklonálních protilátek: vyšší čistota a specifita dlouhodobá kontinuální produkce (nekončí smrtí zvířete) dostupné ve velkém množství v nezměněné kvalitě lepší reprodukovatelnost výsledků nejsou zkřížené reakce rozeznávají pouze jeden epitop Nevýhody monoklonálních protilátek: vyšší počáteční investice do výroby nižší afinita možnost HAMA interference imunologické odpovědi Antigen Antigeny jsou makromolekulární látky přirozeného nebo syntetického původu, které imunitní systém rozeznává jako cizí. Jejich přítomnost v organismu stimuluje tvorbu protilátek, resp. navozuje imunitní odpověď. Vzhledem ke své funkci může být antigen kompletní (imunogen), nebo nekompletní (hapten). 12

13 Imunogen charakterizují dvě vlastnosti: imunogenicita, neboli schopnost navodit imunitní odpověď (tvorba protilátek, zapojení regulačních a výkonných lymfocytů), a specificita, tj. schopnost s těmito lymfocyty a protilátkami reagovat. Imunogen reaguje jen s těmi lymfocyty a protilátkami, jejichž tvorbu vyvolal. Hapten má malou molekulu (M r < 2000) a je schopen specifické vazby na protilátky, ale není schopen vyvolat imunitní odpověď. Je tedy pouze součástí molekuly kompletního antigenu. Typickými hapteny jsou některá léčiva, resp. jejich metabolity, nízkomolekulární hormony nebo některé peptidy. Každý imunogen se skládá z makromolekulárního nosiče a nízkomolekulárních determinantních skupin tzv. antigenních determinant neboli epitopů (Obrázek 1.4). Antigenní determinanta je tvořena 5-8 aminokyselinami nebo monosacharidovými jednotkami, které se strukturálně nacházejí blízko u sebe. Různé antigeny obsahují různé antigenní determinanty a změna jedné aminokyseliny nebo monosacharidu dává vznik protilátce se zcela odlišnými vlastnostmi. Schopnost protilátek rozlišovat i malé rozdíly epitopů je základem specifity imunitních reakcí. Obrázek 1.4 Antigen a různé epitopy s navázanými protilátkami. (Zdroj: worldofbiology09.wikispaces.com.) 13

14 Imunogen musí splňovat určité fyzikální, chemické a biologické vlastnosti. Z fyzikálních vlastností je to zejména relativní molekulová hmotnost > , rozpustnost elektrický náboj. tvar molekuly (konformační struktura) dostupnost epitopů. Z chemického hlediska mohou být imunogeny prakticky všechny biopolymery nacházející se v živých systémech stejně jako řada syntetických antigenů. K nejsilnějším imunogenům se řadí proteiny, následují polysacharidy. Čisté lipidy tvoří často pouze hapteny, jejich imunogenicita stoupá vazbou s proteiny nebo polysacharidy. Z biologických vlastností je třeba zmínit především genetickou vzdálenost. Čím větší bude rozdíl mezi zdrojem antigenu a příjemcem, tím větší bude jeho imunogenicita. Vzhledem ke svému původu můžeme antigeny dělit na přirozené a syntetické. Přirozenými antigeny jsou nejčastěji cizorodé látky z vnějšího prostředí, tzv. exoantigeny, které tvoří většinou mikroorganismy a jejich produkty. Jako alergen je pak označován exoantigen, který je schopen u vnímavého jedince vyvolat patologickou (alergickou) reakci. Autologní antigeny (autoantigeny) naopak pocházejí z organismu samotného a organismus je všeobecně toleruje. Za určitých podmínek se však mohou stát imunogenními a mohou vyvolat imunitní reakci proti strukturám vlastního organismu. V tom případě hovoříme o tzv. autoimunitních nebo autoagresivních onemocněních, která jsou charakterizována tvorbou autoprotilátek a přítomností autoreaktivních buněk. Mezi nejdůležitější bakteriální antigeny patří makromolekulární sloučeniny obsažené v bakteriální stěně. Tyto antigeny umožňují nejen sérologickou typizaci jednotlivých bakteriálních druhů, ale podílejí se i na řadě biologických aktivit baktérií. 14

15 Syntetické antigeny představují polypeptidy, polysacharidy a některé polynukleotidy připravené uměle v laboratoři. Zpravidla jsou tvořeny komplexy, které jsou složeny z přirozeného nebo syntetického nosiče, na který jsou navázány chemicky definované determinantní skupiny. Míra imunitní odpovědi na podaný antigen závisí na dávce a způsobu podání. Stejné množství antigenu, které je neúčinné při intravenózním podání, může vyvolat výraznou odpověď, je-li podáno subkutánně. Vzrůstající dávky vedou k vyšší imunitní odpovědi, nejsou však přímo úměrné zvýšené dávce imunogenu. Vzrůstající dávky mohou za určitých okolností stimulaci tvorby protilátek nejen snížit, ale mohou vyvolat i specifickou neodpovídavost nebo dokonce toleranci vůči danému imunogenu. 1.2 Reakce protilátka-antigen Při reakci antigen-protilátka vzniká protilátkově-antigenní komplex (imunokomplex). Ab + Ag AbAg Ab = protilátka, Ag = antigen, AbAg = imunokomplex Reakce je reverzibilní. Vazba v imunokomplexu je nekovalentní, závisí na několika druzích slabých sil, jako jsou hydrofobní vazby, vodíkové můstky, van der Waalsovy síly a interakce iontů. O pevnosti vazby rozhoduje rovnovážná konstanta. 1.3 Literatura 1 1. Lapčík O. Od vyvrácené hypotézy k Nobelově ceně. Vesmír 2009:88, Zichová M., Šafarčík K., Hušák V. Vyšetřovací metody in vitro v nukleární medicíně. Institut pro další vzdělávání pracovníků ve zdravotnictví, 1993, 124 p. 3. Wild D. (Ed.). The Immunoassay Handbook, 3rd Edition. Elsevier Ltd., 2005, 930 p. 15

16 2. Imunoanalytické metody a technologie Kristián Šafarčík, Vladimír Bartoš Obecně lze imunoanalytické metody zařadit mezi analytické postupy založené na specifické reakci ligandu (L) a vhodného vazebného reagens (VR) za vzniku komplexu (L-VR). L + VR L-VR Odtud plyne nejobecnější označení těchto metod jako metody "ligandové analýzy". Imunoanalytické metody, využívají reakci mezi antigenem a specifickou protilátkou, tedy imunochemický princip. Protilátka musí být specifická, tzn. musí reagovat pouze s příslušným antigenem. Pro kvantitativní vyjádření výsledku analýzy je třeba, aby některá ze základních komponent byla označena tzv. indikátorem, jehož přítomnost lze citlivě a dostupně měřit. K těmto účelům byly nejprve využívány radionuklidy, např. 125 I (označení radioimunoanalýza nebo RIA). V současné době jsou používány další substance různého charakteru: např. enzymy, fluorofory, luminofory apod. (neizotopové varianty imunoanalýzy) (Obrázek 2.1). Obrázek 2.1 Relativní velikosti látek k přípravě indikátorů 16

17 Další podmínkou sledování výsledku reakce je potřeba detekce pouze jedné části indikátoru použitého v imunochemické reakci. Jeho celkové množství je v závislosti na průběhu reakce rozděleno do tzv. volné frakce (F) a v imunokomplexu vázané frakce (B). K vyčíslení podílu jedné z nich je obvykle nutno provést jejich separaci, tedy rozdělení vázané a volné frakce indikátoru. Pro tyto účely byla a je používána řada separačních principů a tím i různých činidel. Předností imunoanalytických metod je jejich vysoká citlivost a přesnost, dovolující v různých biologických materiálech stanovovat látky obsažené v koncentracích řádově 10-9 mol.l -1 až mol.l -1 a to většinou bez předchozí úpravy vzorků (Obrázek 2.2). Moderní metody jsou snadno proveditelné a automatizovatelné. Obrázek 2.2 Charakteristické citlivosti imunoanalytických metod. ELISA = Enzyme Linked Immunosorbent Assay, FIA = fluorescenční imunoanalýza, RIA = radioimunoanalýza, LIA = Luminiscenční imunoanalýza. 2.1 Dělení imunoanalytických metod Existuje několik možností a kriterií, podle nichž lze imunoanalytické metody dělit a charakterizovat: a) podle základního metodického principu, b) podle nutnosti separace volné a vázané frakce indikátoru, c) podle druhu použitého indikátoru. 17

18 Kompetitivní a nekompetitivní princip imunoanalytické metody Podle principu jsou imunoanalytické metody rozdělovány na metody kompetitivní a nekompetitivní. Kompetitivní metody V případě kompetitivních metod je specifická protilátka (Ab), v reakci přítomna v limitovaném (omezeném) množství. O její vazebná místa soutěží (kompetují) značený antigen (Ag*) a stejný antigen (Ag) neznačený, který je přítomen v analyzovaném vzorku. Tím dochází k saturaci vazebných míst protilátky oběma antigeny: Ag + Ag* + Ab Ag-Ab + Ag* Ab + Ag + Ag* Při praktickém provádění této metody se do všech reakčních zkumavek pipetují konstantní množství protilátky a značeného antigenu, přičemž jeho množství je vždy větší než množství protilátky. Množství protilátky je ve všech případech nedostačující k navázání přítomných antigenů, které se tak mohou vázat jen částečně. Výsledkem reakce je vznik dvou komplexů, neznačeného (Ag-Ab) a značeného (Ag+-Ab), ve kterých jsou antigeny vázány na protilátku. V reakční směsi zůstávají i antigeny nenavázané (Ag*, Ag), tj.volné. V rovnovážném stavu reakční směsi je množství vznikajícího značeného komplexu (Ag*-Ab) nepřímo úměrné množství přítomného neznačeného antigenu (Ag). Podíl značeného antigenu (indikátoru), vázaného na protilátku (množství značeného komplexu), se obvykle označuje jako vázaná frakce (B - bound ). Jako volná frakce (F - free ), pak množství nevázaného indikátoru. Pro kvantitativní vyhodnocení je nutná vzájemná separace obou frakcí, která se provádí různými fyzikálně-chemickými postupy. Po jejich oddělení je nutné změřit odezvu alespoň jedné z frakcí. Podle druhu použitého indikátoru je měřenou odezvou radioaktivita, absorbance, fluorescence, luminiscence apod. 18

19 Na základě analýzy kalibrátorů lze pak (z hodnot změřené odezvové veličiny a odpovídajících známých koncentrací neznačeného antigenu v jednotlivých kalibrátorech) znázornit grafickou závislost měřené odezvy (např. poměrů B/F - osa y) na koncentraci antigenu (osa x) a tak sestrojit kalibrační závislost (Obrázek 2.3). V případě kompetitivních metod získáme v lineárních souřadnicích křivku ve tvaru hyperboly. Jestliže se za stejných podmínek jako kalibrátory analyzuje vzorek s neznámým obsahem antigenu, pak lze (po skončení reakce, separaci a změření odezvy) určit z kalibrační závislosti jeho koncentraci. Nekompetitivní metody Nekompetitivní metody jsou charakterizovány tím, že specifická protilátka je v reakci přítomna v nadbytku. S ní tentokrát reaguje antigen, který je určovanou látkou (Ag) a pro kvantifikaci tentokrát slouží vhodně označená samotná specifická protilátka (Ab*). Průběh lze opět zjednodušeně popsat vztahem: Ag + Ab* Ag-Ab* + Ab* Množství komplexu [Ag-Ab*] je tentokrát přímo úměrné množství stanoveného antigenu. Obrázek 2.3 Charakteristické kalibrační závislosti u kompetitivních a nekompetitivních metod 19

20 Nekompetitivní imunoanalytické metody jsou často označovány také jako metody imunometrické. V praxi však není obvykle používán výše popsaný jednoduchý princip reakce. Jeho nejužívanější modifikací je tzv. "two-site" imunometrická analýza, kdy vedle ligandu (stanovovaného antigenu) do reakce vstupují jako vazebné reagencie dvě specifické protilátky, obě jsou přítomné v nadbytku. Každá z nich je namířena proti jiné antigenní determinantě stanovovaného antigenu, přičemž jen jedna je vhodným způsobem označena a slouží tak jako indikátor průběhu reakce (signální protilátka). Neznačená protilátka (vychytávací capture ) bývá většinou zakotvena na stěnu reakční zkumavky nebo na jinou pevnou fázi (partikule, kuličky) a slouží k vychytání a připevnění komplexu antigen-značená protilátka na tuto pevnou fázi, čímž podstatným způsobem usnadňuje separační krok metody. V případě nekompetitivních imunometrických metod našly velké uplatnění tzv. monoklonální specifické protilátky. Schematicky je možno princip metody popsat pomocí vztahu: Ab1 + Ag + Ab2* Ab1-Ag-Ab2* + Ab1 + Ab2* I v tomto případě je množství indikátoru konstantní (tentokrát jim však je signální protilátka), a proměnlivé je množství stanovovaného antigenu (ve vzorcích nebo kalibrátorech). Pro kvantifikaci analýzy je rovněž třeba separovat vázanou a volnou frakci indikátoru. Obvykle se měří množství vzniklého značeného komplexu [Ab1-Ag-Ab2*], které, je přímo úměrné množství určovaného antigenu. Nezreagovaná (přebytečná) signální protilátka je po ukončení reakce odstraněna ze systému. Kalibrační závislost získaná na základě analýzy kalibrátorů má stoupající charakter, který je v určitém rozsahu koncentrací více či méně lineární. 20

21 Separační činidla a techniky - heterogenní a homogenní imunoanalytické metody Podle potřeby separace volné a vázané frakce indikátoru lze imunoanalytické metody rozdělit na ty, které separaci vyžadují - metody heterogenní - a ty, které ji nevyžadují a kde je detekce pouze jedné z frakcí zajištěna jiným způsobem metody homogenní. K separaci, tedy rozdělení vázané a volné frakce indikátoru byla a je používána řada principů a tím i různých činidel. Od původně nespecifických metod používaných v počátcích imunoanalýzy (spolusrážení polyethylenglykolem nebo adsorpce na povrchu aktivního uhlí) přes specifičtější metody druhé protilátky (např. prasečí protilátka proti králičím imunoglobulínům) až k současně nejužívanějším technikám, které využívají různé typy pevných fází (stěny zkumavek nebo reakčních jamek, mikročástice, různé partikule apod.). Každá separační technika má své výhody a nevýhody. Při jejím výběru je nutno přihlížet k vlastnostem jednotlivých komponent přítomných v reakční směsi i k charakteru imunochemické reakce. Obecně lze shrnout, že všechny využívané separační techniky by měly splňovat několik základních požadavků: kvantitativní oddělení obou frakcí tak, aby jedna (případně obě) mohly být měřeny, stejná účinnost pro kalibrátory i analyzované vzorky, dobrá opakovatelnost (tj. přesnost v jednom stanovení) i reprodukovatelnost (mezi jednotlivými analýzami), rychlost, jednoduchost ekonomická únosnost. Indikátory u imunoanalytických metod Obecně se jedná o antigeny nebo protilátky, které jsou vhodným způsobem označeny a tak umožňují monitorování průběhu imunoanalytické reakce. Tyto látky jsou schopny buď samy o sobě produkovat detekovatelný signál (přímo, nebo po vhodné inicializaci), případně jeho produkci zprostředkovaně vyvolat. 21

22 Základním problémem generování signálu a systému jeho detekce je především výběr takového způsobu, který je co nejlépe rozlišitelný od šumu pozadí a přitom vykazuje minimální nespecifické efekty. Imunoreaktivita značené látky má být identická s imunoreaktivitou látky neznačené. Jako první indikátory byly v imunoanalýze používány substance značené vhodným radionuklidem. Nejčastějším radionuklidem využívaným k přípravě indikátorů pro účely radioimunoanalýzy je 125 I. Vedle něj se v praxi využívají i jiné radionuklidy, například 3 H, 12 C nebo 57 Co. Obecným požadavkem na radioindikátor je, aby byl radiochemicky čistý, tedy aby obsahoval radionuklid vázaný pouze v jedné chemické formě. Později (ve snaze o získání stabilnějších indikátorů s vyšší specifickou aktivitou) byly ke značení využívány i neradioaktivní značky. Místo radionuklidů jsou používány především: enzymy látky, které přímo vykazují fluorescenci nebo luminiscenci enzymy, které katalyzují vznik takovýchto látek latexové částice molekuly, které tvoří volné radikály viry (bakteriofágy). Tyto značky (enzymy, flourofory, luminofory a další) se však podstatně liší svou velikostí a tím i možným vlivem na imunoreaktivitu značeného indikátoru. Odlišné zdroje generování signálu vyžadují samozřejmě odlišný způsob jeho detekce. Místo měření radioaktivity se tak užívá principů: kolorimetrie - měření absorpce světla roztokem zbarveným po proběhlé enzymatické reakci fluorometrie - měření fluorescence indikátorů nebo vzniklého produktu enzymatické reakce luminometrie - měření produkce světelných kvant luminiscenční reakce nefelometrie - měření rozptylu světelného záření na povrchu částic turbidimetrie - měření zeslabení světelného záření vlivem zákalu roztoku 22

23 počítání částic - počítání částic určité velikosti poté, co proběhla imunochemická reakce. Dále v textu, jsou u některých typů imunoanalytických metod blíže vysvětleny principy generovaní jejich signálu a detekce. 2.2 Radioimunoanalytické metody Jako radioimunoanalytické metody jsou označovány ty metody, u kterých je pro přípravu indikátoru imunochemické reakce použit vhodný radionuklid některého prvku. Základní principy uplatňované u tohoto typu imunoanalýz jsou odpovídající modifikací těch variant, které byly zmíněny v obecné části o imunoanalytických metodách. Pro kompetitivní metody používáno označení "radioimunoanalýza" - RIA. Pro nekompetitivní metody bylo zavedeno označení "imunoradiometrická analýza" a zkratka IRMA. Postupem času byly vyvíjeny a aplikovány i jiné principy generování a detekce signálu, potřebného pro kvantifikaci imunoanalytických metod, které nevyužívaly radioizotopy a měření radioaktivity. Zavádění neizotopových technik bylo často zdůvodňováno především snahou vyhnout se používání radionuklidů, které jsou obecně potenciálně ekologicky škodlivé a navíc ohrožují do určité míry laboratorní pracovníky radiační zátěží. Je však nutno konstatovat, že se ani některé neizotopové metody neobejdou bez užití potenciálně kancerogenních, nebo jinak nebezpečných látek. Při splnění obecných podmínek pro práci s otevřenými zářiči a likvidaci radioaktivních odpadů není riziko plynoucí z práce s radionuklidy zásadně větší než při práci s neizotopovými metodami, a je převyšováno rizikem plynoucím z práce s potenciálně infekčním materiálem (infekce HBV, HCV, HIV). Obdobně přístrojové vybavení je zhruba přibližně stejně drahé. Zásadním přínosem některých neizotopových imunoanalýz je skutečnost, že dosahují lepší citlivosti stanovení. Byla využita celá řada látek, které teoreticky dosahují vyšší citlivosti detekce než je měření radioaktivity a látky používané pro značení mohou generovat větší množství signálu. Podstatnou výhodou neizotopových imunoanalýz je možnost jejich snazší automatizace. 23

24 2.3 Enzymová imunoanalýza Použití enzymu jako indikátoru připouští řadu možných varianty uspořádání imunoanalýzy. Heterogenní enzymová imunoanalýza Heterogenní enzymové imunoanalýzy jsou úplnou analogií izotopových imunoanalytických metod. Enzym nahrazuje radionuklid s tím, že je chemicky (kovalentně) vázán buď na antigen nebo protilátku. Uspořádání je možné jak kompetitivní tak nekompetitivní. Po proběhnutí imunochemické reakce (inkubaci) je z reakční směsi obvykle odstraněna volná frakce indikátoru většinou s využitím pevné fáze. Následuje přídavek enzymového substrátu a po pevně určené době je reakce mezi enzymem a substrátem zastavena (např. přidáním "stop" činidla) a spektrofotometricky je měřeno zeslabení monochromatického světla roztokem. Pomocí kalibrační křivky lze poté odečítat koncentrace analyzovaných vzorků. Homogenní enzymová imunoanalýza Homogenní enzymové imunoanalýzy využívají efekty, které měření radioaktivity jako detekčního signálu neumožňuje. Příkladem může být například situace, kdy lze vlivem stérických podmínek během imunochemické reakce ovlivnit aktivitu enzymového konjugátu a tím i rychlost přeměny enzymového substrátu na produkt. Vzorek obsahující stanovovanou látku je v reakční směsi smíchán s indikátorem, kterým je konjugát vhodného enzymu se stanovovaným antigenem. V kompetitivní reakci pak spolu oba soutěží o limitované množství vazebných míst protilátky. Část enzymového konjugátu zůstává volná (její množství je závislé na množství stanovované látky v analyzovaném vzorku) a může tak reagovat se substrátem. Frakce konjugátu navázaná na protilátkou pak, vzhledem k zastínění aktivního centra enzymu, enzymovou aktivitu nevykazuje (Obrázek 2.4). 24

25 Obrázek 2.4 Homogenní enzymová imunoanalýza - stínění aktivního místa enzymu Enzymová aktivita je tedy tím vyšší, čím větší je množství stanovovaného antigenu v analyzovaném vzorku, protože na protilátku se ho naváže více a naopak v nenavázané formě zůstane více enzymového konjugátu. Enzymová aktivita v reakční směsi je tedy přímo úměrná množství analyzovaného antigenu. Z hlediska provedení jsou homogenní EIA jednoduché, avšak mnohem méně citlivé než metody heterogenní. Enzymové konjugáty Klíčovým problémem EIA je právě příprava vhodných enzymových konjugátů, tedy látek, kde je enzym chemicky vázán na stanovovaný antigen nebo protilátku. Základní podmínkou úspěšné EIA je rovněž výběr vhodného enzymu, který musí splňovat řadu obecných podmínek: musí mít vysoké číslo přeměny, aktivita enzymu musí být přesně a snadno měřitelná enzym musí zachovávat enzymovou aktivitu po vazbě na antigen nebo protilátku (heterogenní EIA), u homogenních EIA musí být enzymová aktivita výrazně modulována vazbou konjugátu na protilátku enzym musí být snadno dostupný enzym se nesmí vyskytovat v tělní tekutině, ve které je prováděno vyšetření 25

26 U homogenních EIA se jako enzymy používají například glukozo-6-fosfátdehydrogenáza nebo malátdehydrogenáza. Nejčastěji používanými enzymy v heterogenní EIA jsou křenová peroxidáza nebo alkalická fosfatáza. Křenová peroxidáza katalyzuje reakci peroxidu vodíku s vhodným substrátem, který se oxiduje na barevný produkt. Substráty jsou například TMB (3,3',5,5' tetramethylbenzidin), ABTS (2,2' azino-bis-(3-etylbenzthiazolin-6-sulfonát) nebo OPD (o-fenylendiamin). Alkalická fosfatáza v enzymatické reakci štěpí esterickou vazbu kyseliny fosforečné (např. štěpí bezbarvý para-nitrofenylfosfát na žlutý para-nitrofenol, fotometrická detekce při 420 nm). Štěpením umbelliferylfosfátu vzniká umbelliferon, který fluoreskuje a dá se měřit fluorometricky. Detekce enzymatických imunoanalýz Kolorimetrická (fotometrická) detekce je nejrozšířenější typ detekce u klasických enzymoimunoanalýz. Principem detekce je zeslabení intenzity světelného toku monochromatického světla zbarveným roztokem produktu enzymatické reakce. Přístroje pro měření absorbance se nazývají spektrofotometry. Nefelometrická detekce využívá enzym lysozym a jako substrát peptidoglykany. Jako substrátu bylo využito fragmentů buněčných stěn bakterií Micrococcus luteus. Paprsek monochromatického světla (např. laserového zdroje) je rozptylován tzv. Faraday-Tyndalovým jevem v zakaleném roztoku částic. Míra rozptylu světla je úměrná množství částic, tedy aktivitě enzymu. Moderní nefelometry jsou vybaveny laserovými zdroji přísně monochromatického světla, což zjednodušuje další konstrukci přístrojů. Fluorometrická detekce umožňuje dosažení vyšší citlivosti při použití stejného enzymu, například díky opakovanému generování signálu v krátkém časovém úseku. Dosahovaná citlivost metody je ovšem omezena fluorescenčním pozadím biologického materiálu v reakční směsi. To je způsobeno přirozenou fluorescencí séra nebo plazmy (vlivem přítomností sérových proteinů, nebo NADH a bilirubinu). Detekce emitovaného světelného záření může 26

27 být poznamenána i zhášením fluorescence vlivem přítomností některých molekul, které absorbují záření (excitační nebo emitované). I v homogenních EIA byly využity fluorogenní substráty. Např. redukcí vzniklý NADH emituje fluorescenční záření mezi 450 až 470 nm. Tento nebo obdobný princip detekce je využíván v celé řadě analytických systémů, například technologie MEIA na analyzátorech IMx a AxSYM firmy Abbott. Luminometrická detekce enzymo- imunoanalytických metod je odvozena od principu bioluminiscence, která je vždy s nějakou enzymatickou reakcí spojena. V tomto případě se však jedná o chemiluminiscenci, kdy je světelné záření produkováno vlivem průběhu chemické reakce iniciované působením enzymu. V praxi jsou i pro tyto účely nejpoužívanějšími enzymy alkalická fosfatáza a křenová peroxidáza. Pro první z nich jsou jako substrát využívány např. látky na bázi adamantyl 1,2 dioxetan arylfosfátů. Ty po odštěpení fosfátové skupiny vytvářejí nestabilní anion, který se stabilizuje vyzářením světla. Tento princip je využíván například u analyzátorů řady IMMULITE firmy DPC nebo analyzátorů Access firmy Beckman - Coulter. Při použití enzymu křenové peroxidázy, dochází v přítomnosti peroxidu vodíku k oxidaci luminolu. Při reakci je však produkce světelného záření slabá. Byla ale objevena řada látek, které zesilují a prodlužují produkci světelných kvant této oxidační reakce. Takovým zesilovačem je např. luciferin nebo benzthiazoly, které mají ještě vyšší kvantové výtěžky. Reakce dává s použitím těchto zesilovačů kontinuální výstup světelného signálu. Signál tak může být měřen i s časovým odstupem. Tyto metody jsou pak označovány jako zesílená chemiluminiscence "enhanced chemiluminescence". Tento systém byl propracován firmou Amersahm a byl dodáván na trh pod označením Amerlite. Nyní tento princip využívá analyzátor Vitros ECi firmy Ortho-Clinical Diagnostics. 27

28 2.4 Luminiscenční imunoanalýza Luminiscence Luminiscence je fyzikální jev, kdy látka, označovaná jako luminofor, je schopná produkovat světelné záření. Toto generování světelných záblesků je obvykle iniciováno změnou vnějších podmínek (ph, teploty, elektrického potenciálu apod.), která ovlivní fyzikálně-chemické vlastnosti některých molekul luminoforu. Dříve stabilní látka se tak dostane do energeticky nestabilního stavu s přebytkem vnitřní energie, kterou samovolně uvolňuje vyzářením elektromagnetického záření o vlnové délce v oblasti viditelného světla. Tímto procesem se molekula látky opět stabilizuje, i když v pozměněné podobě. K měření luminiscence slouží přístroje nazývané luminometry. Jak vyplývá z podstaty jevu, nevyžaduje měření luminiscence žádný excitační zdroj záření, měří se pouze světlo produkované luminoforem. Jako luminoimunoanalytické metody lze označit ty metody, u kterých je pro značení indikátoru imunochemické reakce použit luminofor. Jak bylo uvedeno výše, jsou však mezi luminoimunoanalýzy často zahrnovány rovněž enzymové imunoanalýzy s luminometrickou detekcí. Imunoanalýzy zakončené detekcí luminiscenčního záření lze tedy rozdělit na dvě kategorie: enzymové imunoanalýzy se substrátem produkujícím luminiscenční záření imunoanalýzy s luminiscenčním indikátorem Základní principy uplatňované u LIA jsou modifikací těch, které byly zmíněny v obecné části o imunoanalytických metodách. Z hlediska použitého luminoforu je možno LIA metody rozdělit na metody bioluminiscenční a chemiluminiscenční. 28

29 Bioluminiscenční metody Bioluminiscenční metody používají luminofory biologického původu. Vzhledem k tomu, že většinou využívají k inicializaci enzymatické reakce, je možno zařadit je mezi EIA s luminiscenční detekcí. Chemiluminiscenční metody Chemiluminiscenční metody využívají jako luminofory různé látky, které jsou k produkci světelného záření iniciovány na základě průběhu chemické reakce. Produkce světla chemickou reakcí je časově omezena a je proto nezbytné, aby měření proběhlo v určitém definovaném okamžiku. Mezi látky, které vykazují luminiscenci, patří např. již zmíněný luminol, izoluminol, lucigenin, sulfonamidy nebo estery akridinových barviv. Luminiscence umožňuje detekci látek v koncentraci do mol.l -1. V praxi je tento princip uplatněn v analyzátoru ACS:180 původní firmou Ciba Corning, nyní je dodáván firmou Bayer ve variantě ACS:180 SE nebo automat ADVIA Centaur a systému Architect firmy Abbott. Elektrochemiluminiscenční metody K vybuzení chemiluminiscnece indikátoru je u těchto metod používán elektrický impuls. Příkladem může být indukce luminescence rutheniových iontů, komplexně vázaných v tris(bipyridylu), která probíhá na povrchu platinové elektrody (Obrázek 2.5). Molekulová hmotnost rutheniového komplexu (pod 1 kda) umožňuje přípravu indikátoru, který neovlivňuje interakci protilátka-antigen. Tento princip využila například firma Roche u svých analyzátorů řady Elecsys nebo Modular. Imunoanalytická reakce probíhá na pevné fázi, která je tvořena magnetickými mikročásticemi s navázaným streptavidinem. Na něj se váže biotinylovaný antigen nebo vychytávací 29

30 protilátka (v závislosti na kompetitivním nebo nekompetitivním typu reakce). Detekční protilátka je označena rutheniovým komplexem. Po proběhlé imunochemické reakci je reakční směs nasáta do měřící buňky, kde jsou magnetické částice přichyceny permanentním magnetem a promyty pufrem.. Na elektrody měřící buňky je přiveden budící elektrosignál a nastartována elektrochemická reakce. Během ní dochází k oxidaci iontů Ru+2 na Ru+3 a následně jejich opětovné redukci na energeticky excitované ionty Ru+2, které se přebytečné energie zbavují emisí luminiscenčního záření o vlnové délce 620 nm. Cyklická reakce je podmíněna oxidací a následnou redukcí přítomného tripropylaminu (TPA). Celý cyklus je vratnou reakcí a může tak být několikanásobně opakován, čímž se produkce luminiscenčního záření podstatně zvyšuje. Chemiluminiscence je přímo úměrná množství analytu tvořícího imunokoplex v rozmezí téměř 6 řádů. Obrázek 2.5 Elektrochemiluminiscence - generování a detekce signálu 2.5 Fluorescenční imunoanalýza Fluorescence a její detekce Fluorescence je fyzikální jev, kdy látka - fluorofor - je schopna absorbovat energii dodávanou ve formě elektromagnetického záření, (tzv. excitační záření), a následně vyzařovat elektromagnetické záření o jiné vlnové délce (emisní záření). Energetická spektra excitačního i emisního záření úzce souvisí se základní strukturou látky, přičemž emisní spektrum je 30

31 posunuto do oblasti vyšších vlnových délek než spektrum excitační. Fotony absorbované souborem molekul jsou totiž z části degradovány na tepelnou energii, z části jsou vyslány jako fotony o nižší energii (vyšší vlnové délce), než jakou měl foton původní. Rozdíl maxim excitačního a emisního fluorescenčního spektra se nazývá Stokesův posun. Podíl počtu emitovaných fotonů k počtu fotonů absorbovaných se nazývá kvantový výtěžek fluorescence (n) a může nabývat hodnot 0 1. Požadavky na fluorescenční indikátor vhodný pro použití ve FIA lze shrnout do tří podmínek: vysoká molární absorbance vysoký kvantový výtěžek velký Stokesův posun Nejužívanějším fluorescenčním indikátorem je fluorescein. Exitační maximum má při 490 nm a emisní maximum při 520 nm. Některé sérové komponenty, (např. albumin-bilirubinový komplex), při těchto vlnových délkách interferují. Interference při měření biologických materiálů se mohou silně projevovat také rozptylem záření nebo jeho zhášením. Proto je měření fluorescence silně ovlivňováno prostředím, ve kterém se provádí. Klasická fluorescence vykazuje po krátkém excitačním osvitu určitou dobu dosvitu fluorescenčního signálu, která je rozdílná pro různé látky. Tento fluorescenční dosvit se u látek běžně vyskytujících v séru pohybuje v rozmezí 1 20 ns. U běžně používaných fluorescenčních indikátorů se pohybuje rovněž v řádu nanosekund (fluorescein 4,6 ns). Emisní spektra z různých fluorescenčních zdrojů séra tak mohou interferovat s emisním spektrem indikátoru nejen vzhledem k podobné vlnové délce svých píků, ale překrývají se rovněž časově a nedají se prakticky rozlišit. Zcela zásadní přínos pro měření fluorescence má technika zvaná časově modulovaná detekce fluorescence ( time resolved fluorescence measurement - TR fluorescence), založená na použití nových fluorescenčních indikátorů - lanthanidových chelátů - zejména europia, samaria, terbia nebo thulia (Obrázek 2.6). 31

32 Obrázek 2.6 TR-fluorescence - časový průběh měření Jejich zavedením se podařilo překonat problém fluorescenčního pozadí média, ve kterém se fluorescence měří. Jedná se o indikátory s velmi dlouhou fluorescencí, přičemž její detekce je časově modulovaná. Krátký světelný impuls ze světelného zdroje (xenonové výbojky) nebo pulzního laseru slouží jako excitační zdroj a fluorescence je pak měřena s určitým časovým odstupem. Dosvit fluorescenčního indikátoru na bázi chelátů vzácných zemin je mezi µs. Excitační spektrum má velmi široký pík, emisní pík pak velmi úzký. Navíc Stokesův posun proti běžným fluorescenčním indikátorům je mnohem větší, pík emisního spektra je posunut až do červené oblasti viditelného spektra. Měření fluorescence, po časové prodlevě v intervalu 400 až 800 µs po osvitu, oddělí parazitní fluorescenci sérových komponent, které mají podstatně kratší dosvit. Excitační osvit se opakuje tisíckrát za sekundu. Problematikou TR fluorescence a její aplikací v imunoanalýze s využitím lantanidových chelátů jako indikátorů se velmi široce zabývala firma Wallac (ve spojení s firmami LKB a Pharmacia). Byl vyvinut imunoanalytický systém DELFIA, později využitý i u automatického analyzátoru AutoDELFIA. Tímto systémem ke možno v běžné reakční směsi detekovat koncentrace mol.l -1 Eu 3+, což vysoce převyšuje detekční mez běžných fluorescenčních měření bez časové modulace ( mol.l -1 ). 32

33 Imunoanalýzy s detekcí emisního fluorescenčního záření lze opět rozdělit na dvě kategorie: enzymové imunoanalýzy se substrátem produkujícím fluorescenční záření imunoanalýzy s fluorescenčním indikátorem Základní principy uplatňované u FIA jsou modifikací těch, které byly zmíněny v obecné části o imunoanalytických metodách. Heterogenní fluoroimunoanalýza Výhodou heterogenních metod je oddělení sérové komponenty reakční směsi před měřením fluorescence, což zlepšuje odstup signálu od šumu a zlepšuje tím citlivost metody. Mohou být realizovány jak v kompetitivním, tak v nekompetitivním uspořádání. Jako pevné fáze pro separaci jsou užívány např. polyakrylamidové kuličky, na něž jsou kovalentně vázány příslušné specifické protilátky nebo antigeny. Specifická hustota kuliček je blízká jedné i refrakční index je blízký indexu vody, a proto rozptyl světla na nich je zanedbatelný. Prakticky se stanovení provádí smícháním vzorků séra s antigenem značeným (např. fluoresceinem nebo 7-hydroxykumarinem) a přidáním ke kuličkám s navázanou protilátkou. Po inkubaci a oddělení volné frakce se kuličky resuspendují v pufru a měří se fluorescence. Homogenní fluoroimunoanalýza Jedním z příkladů této realizace imunoanalytických metod je Fluorescence Polarization Immunoassay FPIA (Obrázek 2.7). Tato kvantitativní analytická metoda využívá kombinace dvou principů - kompetitivní imunochemické reakce mezi stanovovaným analytem a vhodným indikátorem o vazebná místa na specifické protilátce a měření vertikálně polarizovaného fluorescenčního záření emitovaného po excitaci vzorku rovněž polarizovaným světlem. Tato technologie je použitelná pro určení koncentrace malých molekul. Ty se totiž v roztoku otáčejí velkou rychlostí. Pokud je molekula označena vhodnou fluorescenční látkou 33

34 (fluoresceinem) a je excitována polarizovaným světlem vhodné vlnové délky, emituje fluorescenční záření do mnoha směrů. Detekce ve stejné polarizované rovině naměří jen malou část fluorescence. Pokud tato malá molekula obsadí vazebné místo na protilátce, dojde k vytvoření komplexu (velké molekuly), která se otáčí pomalu, což má za následek zvýšení fluorescence detekované v polarizované rovině. V kompetitivním uspořádání metoda poskytuje možnost stanovit koncentrace analytu bez nutnosti separace volné a vázané frakce fluorescenčního indikátoru. Postup byl vyvinut firmou Abbott a je využíván v přístrojích TDx, IMx nebo AxSYM. Obrázek 2.7 Princip kompetitivní FPIA Mezi nejpokročilejší technologie homogenní imunoanalýzy patří technologie TRACE (Time Resolved Amplified Cryptate Emission) vyvinutá firmou CIS (Obrázek 2.8). Jako fluorescenční indikátory se používají kryptáty vzácných zemin, které vykazují dlouhotrvající fluorescenci v řádu µs, což umožňuje použití časově modulované detekce fluorescence. Ion europia (Eu +3 ) je inkorporován do kavity makropolycyklické sloučeniny (trisbypyridine diaminu). Tato sloučenina je velmi stabilní a vykazuje výhodné fluorescenční vlastnosti. Sloučeninu je možno excitovat světlem vlnové délky 307 nm, přičemž emisní spektrum vykazuje píky i v oblasti červeného světla (od 550 do 720 nm). 34

35 Obrázek 2.8 Metoda TRACE Kryptáty vzácných zemin je možno kovalentně vázat buď na antigen, nebo na specifickou protilátku. K detekci imunochemické reakce v homogenním uspořádání je kromě fluorescence využíván přenos energie mezi donorem a akceptorem světelného signálu. Transfer energie mezi donorem a akceptorem se děje neradiativním transferem energie na krátkou mezimolekulární vzdálenost (FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer) (Obrázek 2.9). Obrázek 2.9 FRET -resonanční přenos energie fluorescence 35

36 Akceptor byl vybrán mezi rostlinnými proteinovými barvivy červených řas. Je jím alophykocyanin o relativní m.h s maximální absorpcí světla mezi 600 a 650 nm. Při dostatečném přiblížení donoru a akceptoru na vzdálenost pod 7,5 nm dochází k přenosu energie z excitovaného donoru (kryptátu europia) na akceptor (alophykocyanin - XL 665). K takovému přiblížení akceptoru a donoru dojde například při vytvoření komplexu obou protilátek s antigenem během sandwichové metody se dvěma protilátkami, kdy je jedna protilátka označena kryptátem a druhá alophykocyaninem. Charakteristika přenesené energie je stejná jakou vykazuje donor. Přenáší se tedy dlouhotrvající charakteristika fluorescence donoru a akceptor fluoreskuje rovněž v intervalu µs. Měření fluorescence lze uspořádat tak, aby se začalo měřit v intervalu µs od excitace, a tím se vyhnout parazitním fluorescencím pocházejícím z matrice vzorku. Problém zeslabení fluorescenčního signálu matricí vzorků se řeší měřením dvojice vlnových délek a to fluorescence donoru při 620 nm a akceptoru při 665 nm. Signál kryptátu Eu+3 slouží jako vnitřní standard pro korekci absorbance reakčního media v reálném čase. Simultánní měření obou signálů umožňuje vypočítat poměrový signál 665/620 nm. Množství analytu v reakční směsi určí, kolik molekul analytu se naváže mezi obě protilátky s navázaným akceptorem a donorem. Intenzita poměrového signálu 665/620 nm je pak přímo úměrná množství měřeného analytu ve vzorku. Systém je chráněn i pro případ vysokých koncentrací analytu ve vzorku, neboť poměrový signál je měřen kineticky od zahájení analytické reakce (tzn. že je sledován poměr 665/620 nm jako funkce času). Kinetické měření je citlivější, přesnější a umožňuje přerušit měření v případě příliš velké rychlosti reakce (vysoké koncentrace analytu) a zahájit nové měření po zředění vzorku. Systém tak představuje univerzální homogenní imunoanalýzu. Aplikovatelné jsou jak kompetitivní, tak nekompetitivní metody. Díky stabilitě indikátoru, kryptátu Eu +3, detekci dvou nezávislých signálů detekovaných časově modulovou fluorescencí, z nichž jeden signál koriguje optickou transparenci reálného vzorku, kinetickému způsobu měření a homogennímu formátu s minimálním počtem pipetovacích kroků, pracuje systém s maximální přesností a robustností. Pro praktické provádění imunoanalýz využívajících tento originální princip homogenní FIA byl vyvinut analyzátor KRYPTOR dodávaný nyní firmou B.R.A.H.M.S. 36

37 3. Návaznost a standardizace imunoanalytických metod Kristián Šafarčík, Vladimír Bartoš 3.1 Návaznost měření Obdobně jako v každé oblasti aplikované metrologie je i v případě provádění imunoanalytických kvantitativních měření různých veličin (analytů) základním požadavkem zajištění jednotnosti a správnosti měření. Důsledkem tohoto požadavku pak je dosažení smysluplné úrovně vzájemné srovnatelnosti výsledků a to jak mezi výsledky měření stejné veličiny prováděnými v jedné laboratoři ale v různém čase, tak také při měřeních realizovaných v různých laboratořích. Předpokladem pro dosažení takového stavu je, aby různé rutinní postupy používané k měření určité veličiny měly vazbu na mezinárodně uznávaný a platný referenční materiál. Tato vazba je založena na neporušené hierarchii měřicích postupů a kalibrátorů, směřující od primárního referenčního materiálu nejvyššího metrologického řádu ke kalibrátorům řádů nižších. V této nepřerušené posloupnosti je tak hodnota veličiny referenčního materiálu pomocí odpovídajících měřicích procedur postupně přenášena na kalibrátory nižšího řádu a končí až na úrovni měřicího postupu, určeného k rutinnímu měření běžných vzorků. Hodnota primárního standardu je pomocí primární referenční metody odvozena přímo od odpovídající jednotky SI. Současně s přenosem hodnot kalibrátoru je na každém stupni stanovena nejistota těchto hodnot, která se postupně, směrem ke kalibrátorům nižšího řádu, zvyšuje. Existence výše popsané posloupnosti je základem vlastnosti, označované pojmem metrologická návaznost. Ve smyslu definice podle mezinárodního metrologického slovníku (VIM ) se metrologickou návazností rozumí vlastnost výsledku měření nebo hodnoty etalonu, která 37

38 umožňuje určit jejich vztah k uvedeným referencím, zpravidla národním nebo mezinárodním etalonům, a to pomocí nepřerušeného řetězce porovnávání, jejichž nejistoty jsou uvedeny. Schematicky je model hierarchie kalibrací a návaznosti na jednotku SI zobrazen na Obrázku 3.1. Obrázek 3.1 Hierarchie kalibrace a metrologická návaznost na SI. (převzato podle ČSN EN ISO 17511:2004; CGPM Všeobecná konference pro váhy a míry, BIPM Mezinárodní úřad pro váhy a míry, NMI národní metrologický institut, ARML akreditovaná referenční měřicí laboratoř, ML laboratoř výrobce) Bohužel v případě měření, která bývají realizována pomocí imunoanalytických metod, je prokázání návaznosti často velmi problematickou úlohou. V praxi je stanovováno mnoho veličin (analytů), pro které nejsou dostupné certifikované primární referenční materiály ani měřící postupy. Díky tomu nemohou být tyto veličiny ani kompletně návazné až na jednotku SI a jejich návaznost končí v hierarchii kalibrací na některém z nižších stupňů. Těmi mohou být referenční materiály konvenčně přijaté nějakou obecně uznávanou autoritou (například organizací WHO), nebo v horším případě jen pracovní kalibrátory výrobce IVD. 38

39 Problematikou zajišťování návaznosti měření v oblasti laboratorní medicíny se zabývá Joint Commitee for Traceability in Laboratory Medicine (JCTLM), fungující na základě společné deklarace tří mezinárodních organizací CIPM, IFCC a ILAC. Cílem JCTLM je podpořit dosažení srovnatelnosti a standardnosti výsledků měření v laboratorní medicíně v zájmu naplnění požadavků směrnice Evropské komise 98/79/EC (EC IVDD). Jedna ze dvou pracovních skupin JCTML-WG1 Referenční materiály a referenční postupy poskytuje přehledy, seznamy, charakteristiky a literární informace o existujících referenčních materiálech a metodách. V databázi přístupné na stránkách JCTLM jsou k dispozici informace o referenčním materiálech a referenčních metodách [ 3.2 Standardizace metod Standardem se obecně rozumí určovaná látka (analyt) s deklarovanou koncentrací. Musí jít o čistý, homogenní, stabilní preparát analyzované látky, který má v ideálním případě definovanou strukturu a molekulovou hmotnost. Tato podmínka však v mnoha případech v praxi nemůže být splněna. Lze proto hovořit o dvou skupinách standardů v závislosti na vlastnostech látek, ze kterých jsou připravovány a pro jejichž stanovení jsou používány. Do první skupiny patří látky se známým složením (tím i strukturou a molekulovou hmotností), které mohou být produkovány chemickou syntézou s velmi vysokou čistotou (99,9%). Příkladem mohou být jednodušší biologicky aktivní látky, jako jsou steroidy, thyreoidální hormony nebo léky, které jsou komerčně dostupné v čisté formě. Tyto látky mohou sloužit pro i přípravu primárních standardů nejvyšší metrologické kvality. Pracovní roztoky standardů (kalibrátory pro měřicí metodu) je možno připravit rozpuštěním přesné navážky standardu v přesně známém objemu vhodného rozpouštědla. Do druhé skupiny patří látky, jejichž struktura naopak není úplně jednoznačně definovatelná. Tyto látky není možné připravit chemickou syntézou a získávají se tak jinými postupy, například izolací z biologických materiálů, často s obtížným zajištěním reprodukovatelnosti výsledku. U těchto preparátů mohou nastávat problémy s homogenitou, znečištěním látkami s příbuznými vlastnostmi, prekursory a metabolity. Takovéto látky nemohou být dostatečně 39

40 definovány chemickými a fyzikálními metodami, takže u nich není možné zajistit návaznost na jednotku SI a pro numerické vyjadřování velikosti odpovídajících veličin jsou pak používány mezinárodně dohodnuté jednotky (IU). Tak je tomu např. u řady složitějších biologicky aktivních látek jako například proteinových či peptidických hormonů, nádorových markerů bílkovinné povahy apod. Ze skutečnosti, že se v těchto případech nejedná o adekvátně definované analyty pak vyplývá i fakt, že pravá hodnota měřené veličiny je v těchto případech tudíž reálně neznámá. Z hlediska použití standardu v imunoanalytické metodě je rovněž nutným požadavkem, aby se jednalo o preparát, který je v maximální míře imunochemicky shodný s určovanou látkou. Standardizace imunoanalytických metod Pro analyty, které bývají stanovovány imunoanalytickými metodami, jsou referenční metody a primární referenční materiály zatím dostupné pro měření koncentrací velmi omezeného počtu látek nepeptidické povahy, jako jsou například: celkový tyroxin (T4 celkový) aldosteron testosteron 17-β-estradiol progesteron kortizol Pouze u těchto látek tak existuje předpoklad pro zajištění návaznosti jejich měření až na jednotku SI. V ostatních případech (bez takovéto návaznosti) nelze dosáhnout dostatečné míry jednotnosti a vzájemné porovnatelnosti výsledků měření. I když byly pro některé z těchto látek připraveny a schváleny mezinárodní referenční materiály, není tato skutečnost vzhledem k charakteru analytu automatickým předpokladem zajištění vzájemné porovnatelnosti výsledků měření. Vedle problémů spojených jednoznačným definováním stanovovaného analytu jako chemického individua existují rovněž problémy spojené s přípravou vhodných pracovních 40

41 kalibrátorů a kontrolních materiálů a s jejich komutabilitou, projevující se například rozdílnou imunoreaktivitou referenčních materiálů nebo kalibrátorů a měřených nativních vzorků. Kalibrační materiály jsou často připravovány izolací z produkčních žláz a tkání a nejsou například glykosylovány, zatímco zkoušené biologické materiály ano. Purifikace analytů po jejich izolaci může vést k částečné nekontrolovatelné degradaci. I látky připravované rekombinantními technikami, "pozměňují" často svoji strukturu, a v důsledku toho se zvyšuje pravděpodobnost výrazných vlivů matrice. Významnou roli pro zhoršenou porovnatelnost výsledků imunoanalytických metod sehrávají rovněž skutečnosti vyplývající z přímé podstaty imunochemické reakce, tedy vazby specifické protilátky a antigenu, ovlivněné nejen charakterem stanovovaného analytu, ale i vlastnostmi použitých protilátek. Ovlivňujícími faktory mohou být například: orientace protilátek k epitopům, nacházejícím se v málo stabilních oblastech proteinových molekul, například v oblastech podléhajících proteolýze v podmínkách in-vitro, orientace protilátek k oblastem, které nejsou nositeli specifických fyziologických vlastností molekul (hcg, TSH) používání protilátek, které nejsou schopné reflektovat různý stupeň glykosylace, ale i syalilace, sulfatace, degradace či agregace imunochemických analytů různá úroveň glykosylace často typická pro specifické chorobné stavy a projevující se často také přítomností různých izoforem imunochemického analytu (použité analytické systémy nejsou obvykle schopné postihnout ani základní poměr jednotlivých izoforem). Konečně průběh imunochemické reakce může být poměrně zásadním způsobem ovlivněn také samotnými reakčními podmínkami, jako jsou například ph, iontové síly, přítomnost detergentů apod. Tyto vlivy nejsou někdy dostatečně známy a respektovány. Ve svém důsledku jsou uvedené skutečnosti důvodem vysoké závislosti výsledků imunochemických měření na použitém analytickém systému (kombinace použitých protilátek, podmínky imunochemické reakce apod.). Z hlediska praktické aplikace tak u těchto metod neexistují předpoklady pro obecně akceptovatelné jednotné hodnoty referenčních intervalů a diagnostických rozhodovacích limitů. 41

42 4. Multiplexová imunoanalýza Jindra Vrzalová Multiplexové měření tedy měření více analytů zároveň - je logickým řešením pro popis komplexním fyziologických a patofyziologických dějů, kde nezáleží pouze na absolutní koncentraci jednotlivých členů, ale na poměrech agonistů a antagonistů, faktorů a jejich inhibitorů. Příkladem velmi komplexních regulací jsou cytokiny a růstové faktory. Cílem multiplexových analýz je popis zastoupení jednotlivých proteinů (deskriptivní proteomika), studium vzájemných vztahů proteinů, vyhledávání a validace biomarkerů, vyhledávání cílů terapie a klinická diagnostika. Přínosem multiplexového typu měření je finanční efektivita, redukce potřebného času a práce pro analýzy, snížení objemu vzorku a validita dat při porovnávání poměrů hladin jednotlivých proteinů. Multiplexové analytické technologie v oblasti proteinů jsou založeny na třech principech: imunoanalýza, separační technologie (chromatografie nebo 2D elektroforéza) a hmotnostní spektrometrie nebo na jejich kombinacích. V následujícím textu se budeme zabývat pouze multiplexovými přístupy založenými na imunoanalytických postupech. Představené technologie mají sloužit jako přehled principů, zvláštní pozornost je věnována technologii xmap. Konkrétní chemikálie, reagencie a přístroje 42

43 jsou dosažitelné od mnoha výrobců, jejich spektrum se stále vyvíjí a nejsou zde proto uváděny. Multiplexové měření je dnes nedílnou součástí mnoha výzkumů a v některých oblastech se začíná uplatňovat i v klinické rutinní praxi. Obrázek 4.1 Srovnání několika typů multiplexových metod. 4.1 Planární mikroarraye proteinové čipy Proteinové čipy se vyvinuly z technologií připravených původně pro analýzu DNA. Protilátky nebo antigeny jsou naspotovány na planární povrch silikonových čipů nebo skleněných sklíček s nitrocelulózovou membránou (FAST slides). Čipy jsou tedy prostorově uspořádané reagencie na pevném povrchu, v připadě imunoanalýzy obsahuje každá oblast neboli spot definovanou protilátku (antibody microarrays) nebo antigen. Přesná pozice (spot) specifické protilátky/antigenu na čipu definuje typ analytu, který je stanovován. Studované proteiny jsou kvantifikovány díky různým principům vytvářejícím signál a jeho zesílením kolorimetricky, radioaktivitou, fluorescencí, chemiluminiscencí, enzymovými reakcemi atd. a intenzita signálu je měřena určeným typem scanneru nebo kamery. Vyhodnocení vyžaduje speciální 43

44 software, který vyhodnotí intenzitu signálu v daném spotu a porovná ji s kalibrační křivkou, pozitivní a negativní kontrolou popř. alespoň s ostatními spoty na čipu. Čipové technologie můžou být rozděleny podle jejich filozofie přístupu: přímé technologie (forward phase arrays), reverzní technologie čipy pro studium proteinových interakcí. Na čipech přímé technologie je inkubován vždy jeden vzorek na čipu, takže může být současně stanoveno větší množství proteinů. Na reverzních čipech je imobilizováno větší množství různých vzorků. V jednom kroku tak může být stanoven jeden konkrétní protein ve velkém množství vzorků zároveň. Tato technika je také používána s malými kousky tkání nebo kousků tkání získaných mikrodisekcí. Obrázek 4.2 Protilátkové mikroarraye 44

45 Arraye na mikrotitračních destičkách Jsou přímou modifikací ELISové technologie. V každé jamce destičky je na dně naspotováno až několik specifických protilátek, které vyváží sledované proteiny ze vzorku proteiny a na principu sandwichové reakce je umožněna chemiluminiscenční nebo fluorescenční detekce. Zástupcem je např. Thermo Scientific SearchLight Protein Array technologie, která umožňuje z 50 µl vzorku zachytit až 16 různých analytů, které jsou detekovány přidáním biotinylované protilátky, následované přidáním křenové peroxidázy a chemiluminiscenčního substrátu. Produkce světla je detekována CCD kamerou a analyzována pro každý spot speciálním softwarem. ( Moody M.D., 2001). 4.2 Multiplexové reakce na mikrokuličkách (Bead Arrays) Mikrokuličky jsou velmi zajímavou alternativou k planárnímu uspořádání čipů. Používají detekci průtokovou cytometrií a jsou vhodné především pro projekty, kde je již studováno měnší množství proteinů tedy pro studie více cílené než studie na proteinových čipech. Výstupem těchto stanovení je skutečně kvantitativní určení koncentrace proteinu, na rozdíl od čipů, kde jsou výsledky často pouze kvalitativní nebo semikvantitativní. Technologie FlowCytomix Technologie Flow Cytomix je založena na sadě mikrokuliček o dvou velikostech (4 μm & 5 μm). Každá ze dvou velikostí mikrokuliček je dále rozlišena různými intenzitami fluorescenčního barviva. Na každé sadě mikrokuliček je navázána specifická protilátka, druhá protilátka je značená fykoerytrinem. Měření probíhá na běžném průtokovém cytometru a data se vyhodnocují speciálním programem. Toto uspořádání umožňuje stanovit zároveň koncentrace 20 analytů. 45

46 Technologie xmap Princip technologie xmap Multi-analyte profiling technologie (xmap) je založena na sadě 5,6 μm polystyrenových mikrokuliček. V této sadě je 100 populací mikrokuliček, které se liší vnitřním spektrálním kódem vytvořeným kombinací dvou fluorescenčních barviv v různém poměru. Multiplexová analýza je založena na specifických protilátkách navázaných na jednotlivé populace mikrokuliček. Protože jsou mikrokuličky rozlišené spektrálním kódem můžou být kombinovány v analýze a umožnují tak stanovení teoreticky až 100 analytů v jedné reakční jamce. Množství stanovovaného proteinu je určeno na základě druhé protilátky značené fluorescenční molekulou. Reakce tedy probíhá na principu sendviče. Obrázek 4.3 Rozlišení mikrokuliček pro xmap technology (zdroj: Měření probíhá na speciálním průtokovém cytometru - přístroj Luminex. Mikrokuličky z reakční jamky jsou nasáty do přístroje, kde protékají v nosném proudu jedna za druhou mezi dvěmi lasery. Fluorescenční signál po excitaci prvním laserem určuje spektrální kód kuličky tedy druh měřeného analytu a fluorescenční signál po excitaci druhým laserem určuje množství druhé protilátky, tedy množství analytu. 46

47 Obrázek 4.4 Princip xmap měření ( zdroj obrázku Pro imunochemickou reakci se používají mikrodestičky s filtračním dnem. Nenavázané látky se z reakce odmývají dnem destičky přes filtry, které udržují mikrokuličky s navázanými proteiny v jamce. Koncentrace jednotlivých analytů je vypočtena na základě kalibračních křivek zkonstruovaných pro každý měřený protein. Všechny další imunoanalytické přístupy jsou také použitelné na xmap platformě např. kompetitivní imunoanalýza, receptor-ligandová analýza nebo pro stanovení protilátek antigen navázaný na mikrokuličky. Kromě imunoanalytických stanovení umožňuje tato platforma také analýzu DNA nebo RNA molekul, které jsou přímo nebo po jejich amplifikaci multiplexově detekovány specifickými sondami vázanými na mikrokuličky. Obrázek 4.5 Protilátky navázané na mikrokuličky s vyvázanými proteiny ze vzorku a po přidání značené druhé protilátky (zdroj obrázku 47

48 Obrázek 4.6 Příklad z měření xmap technologií Multiplexová analýza 10 cytokinů Obrázek 4.7 Kalibrační křivky pro 13-plex panel lidských hormonů (Zdroj: 48

49 Reagencie pro xmap technologii xmap je otevřená technologie a v současnosti lze nakoupit reagencie pro imunoanalýzu od mnoha světových výrobců. Bohužel pro společné stanovení nelze kombinovat látky, které mají velmi odlišné biologické koncentrace, pokud jejich protilátky vykazují zkříženou reaktivitu a pokud mají příliš rozdílné požadavky na preanalytickou fázi. Obrázek 4.8 Přístroj Luminex 100 (zdroj: Obrázek 4.9 Princip přímé kvantifikace RNA na multiplexovém principu na Luminexové platformě (zdroj obrázku - 49

50 Nové typy technologie xmap V současnosti jsou již k dispozici reangencie pro Luminexovou platformu obsahující magnetické mikrokuličky (MagPlex ), což umožňuje jednodušší separaci během reakčních kroků a především jejich automatizaci na jednoduchých promývacích stanicích nebo jako součást pipetovacích automatů. FlexMAP technologie jako další generace multiplexových přístrojů od fy. Luminex umožňuje přidáním třetí rozlišovací barvy do mikrokuliček měření až 500 analytů zároveň v jedné analýze, což při použití 96-jamkové mikrotitrační destičky znamená možnost až testů za 45 minut. Zcela novým konceptem od fy. Luminex je přístroj MAGPIX. Ten umožní měření až 50 testů současně v jednom reakčním objemu a měření na tomto přístroji je založeno na principu CCD zobrazovací technologie na rozdíl od přístrojů řady Luminex xmap. 4.3 Laboratoř na čipu (Lab-on-a-chip) S tlakem na vývoj point-of-care testů dochází k stále vyšší míře miniaturizace laboratorních technologií. Miniaturizace vede k finančním úsporám, šetří životní prostředí a vede k vyšší dostupnosti a mobilitě technologií. Miniaturizace vyžaduje úplnou integraci všech kroků v imunoanalytickém stanovení a její budoucnost je v kombinaci s multiplexovými technologiemi. Laboratoř na čipu (LOC) je zařízení, které integruje laboratorní postupy na ploše o velikosti milimetrů nebo několika málo čtverečných centimetrů. Často je využívána tzv. mikrofluidika neboli pohyb kapalin v prostorách mikro čipu. Aby mohl být mikrofludický obvod na čipu použit pro analýzu, musí obsahovat: mikroskopicky malé ventily (rozváděcí nebo uzavírací), mixéry pro míchání tekutin, mikroreaktory, senzory, oscilátory a výměníky tepla. Princip laboratoře na čipu je dnes aplikován pro miniaturizaci imunoanalýz, biochemických reakcí i PCR a dalších genetických technologií. Cílem miniaturizace je tzv. µtas (micro total analysis system) to je systém, který by integroval odebrání vzorku, 50

51 transport a před analytickou úpravu vzorku, chemickou reakci a separaci i detekci reakce na jednom čipu. Větším kolegou těchto technologií je systém Avantra, který umožňuje sendvičovou imunoanalýzu 40 analytů v jednom vzorku. Základem je běžný čip s naspotovanými protilátkami, který je ale uzavřen uvnitř plastické schránky/čipu (MAX BIOCHIP ) obsahujícího vše potřebné k analýze: kanálky, senzory, komory pro reagencie ( Suché biotinylované protilátky, streptavidin, promývací pufr). Max biochip je vložen do přístroje a poté je nastříknut vzorek samotným přístrojem neprotéká žádná tekutina, celá reakce probíhá uvnitř max biochipu. Vyhodnocení reakce probíhá CCD kamerou detekující signál ze spotů na čipu. 4.4 Literatura 4 1. Kingsmore S.F. Multiplexed protein measurement: technologies and applications of protein and antibody arrays: Nature Reviews Drug Discovery 5 (4), pp , Moody, M.D., Van Arsdell S.W., Murphy K.P., Orencole S.F.,. Array-based ELISAs for high throughput analysis of human cytokines: BioTechniques (31)1, pp , Stoll D., Bachmann J., Templin M.F., Joos T.O., Microarray technology: an increasing variety of screening tools for proteomic research, Drug discovery today: Targets 3 (no.1), pp , Zhu H, Snyder M. Protein chip technology. Curr Opin Chem Biol Feb;7(1): Review. PubMed PMID: Poetz O., Schwenk J.M., Kramer S., Stoll D. et al., Protein microarrays: catching the proteome, Mechanisms of Ageing and Development 126, pp , Kellar K.L., Iannone M.A., Multiplexed microsphere-based flow cytometric assays, Exp Hematol 30 (11) pp ,

52 16. Lim C.T. et Zhang Y., Bead-based microfluidic immunoassays: the next generation: Biosensors and bioelectronics 22, pp , lab-on-chip.html 18. časopis Lab on a chip dostupný na Sista RS, Eckhardt AE, Srinivasan V, Pollack MG, Palanki S, Pamula VK., Heterogeneous immunoassays using magnetic beads on a digital microfluidic platform. Lab Chip Dec;8(12): Epub 2008 Oct 14. PubMed PMID: ; PubMed Central PMCID: PMC Tomoya Tachi, Noritada Kaji, Manabu Tokeshi and Yoshinobu Baba, Microchip-based homogeneous immunoassay using fluorescence polarization spectroscopy Lab Chip, 2009, 9, Preanalytika Jindra Vrzalová Preanalytická část je nedílnou součástí laboratorního vyšetření a lze ji rozdělit na část, která probíhá mimo laboratoř a na část, která probíhá uvnitř laboratoře před samotným měřením. Pokud posuzujeme frekvenci chyb ve výsledku laboratorního vyšetření vzniká jejich nadpoloviční většina již ve fázi preanalytické a je proto nutné se jí stále důkladněji zabývat. Součástí preanalytiky jsou na jedné straně vlivy biologické ovlivňující hladinu měřené látky a na druhé straně vlivy mechanické a tepelné při odběru, separaci, transportu a skladování, které můžou změnit studovanou hladinu v biologickém materiálu. V preanalytické fázi dochází k prolínání těchto faktorů. 5.1 Biologické vlivy Biologické vlivy lze rozdělit na ty, které můžeme ovlivnit, a na faktory neovlivnitelné, které nezměníme, ale musíme je zaznamenávat a vzít v úvahu při interpretaci výsledku třeba odlišnými normálními rozmezími v rutinní praxi nebo rozdělením studované kohorty při statistickém hodnocení výzkumu. Mezi neovlivnitelné faktory patří pohlaví, věk, etnická 52

53 příslušnost vyšetřovaného a také genetické predispozice. Všechny ostatní preanalytické faktory můžeme, alespoň částečně, ovlivnit; budeme se jimi zabývat v následujícím textu. Součástí přípravy vyšetřovaného je jeho dieta před odběrem. Přinejmenším by se měl pacient před odběry vyvarovat velmi tučných jídel, což způsobuje chylozitu séra, která často interferuje během stanovení. Existuje ovšem mnoho studií, kde je ukázán vliv složení stravy na hladiny biomarkerů, známý je např. posun v hladinách u přísných vegetariánů a souvisí s jejich pozměněným metabolismem. Vliv diety se do změn koncentrací analytů může promítnout různými mechanismy: vyplavení hormonů a enzymů před příjmem potravy,během jídla a bezprostředně po jídle metabolismus potravou přijatých látek a zvýšení koncentrací metabolitů sekundární důsledky vyplavení hormonů interference látek přijatých potravou s analytickou metodou o nižší specifičnosti (např. vanilin u stanovení katecholaminů) vliv alkoholu vliv kouření leukocytóza po jídle Sledovat můžeme u výzkumů spíše extrémy, ale ostatní změny jsou z našeho pohledu součástí biologické variability, standardem by však měl být pokud možno odběr na lačno. Je nutné brát v úvahu, že starší pacienti nebo onkologičtí pacienti můžou často trpět podvýživou. Užívané léky můžou ovlivnit hladiny stanovovaných látek třemi způsoby: působí na metabolismus stanovované látky ovlivňují vazbu sledované látky na transportní bílkoviny (změna volné frakce) lék interferuje v analytické reakci 53

54 Ideálem by bylo před odběry vysadit veškeré léky, ale to není v praxi obvykle možné. Je nutné znát alespoň interference léků a vámi studovaného parametrua to zohlednit ve statistice nebo při zařazování pacientů do studie. Bohužel u většiny nových biomarkerů není taková informace vůbec k dispozici. Hladinu mnoha biomarkerů ovlivňuje psychika a především stres pacienta nervozitou nebo strachem jsou především stresové hormony např. kortizol, katecholaminy, interleukin 6, je tedy nutné před odběrem co nejvíce vyšetřovaného uklidnit a snažit se zamezit tzv. syndromu bílého pláště. Hladinu látek v krvi také ovlivňuje poloha pacienta při odběru tedy zda je odebírán vleže (často u pacientů na lůžkových odděleních) nebo v sedě (nejčastěji u ambulantních pacientů). Pro výsledné hodnoty stanovení je rozhodující také fyzická činnost vyšetřovaného před náběrem zda vyběhl do druhého patra před odběrem po schodech (zvýšené hodnoty stresových hormonů, některých interleukinů ) nebo jel výtahem, zda přijel na kole/na koni (zvýšené hodnoty PSA), zda neuběhl den před odběrem maratón atd. Mnoho látek cirkulujících v lidském oběhu podléhá biorytmům neboli cyklickým variacím: cirkadiánní v rámci 24 hodin ultradiánní s periodou mnohem kratší než jeden den infradiánní s periodou delší než jeden den cirkanuální s periodou přibližně 1 rok Důsledkem jsou změny koncentrací látek v denním, ročním, u žen menstruačním cyklu a v průběhu těhotenství, některé látky jsou vyplavovány v pulzech. Hormony jsou často ovlivněny variacemi jiných látek/hormonů, které jsou nadřazeny při regulaci jejich uvolňování v organismu (nejznámějším příkladem je regulatorní osa ACTH pro kortizol). Základní přehled o konkrétních příkladech můžete získat např. v Encyklopedii laboratorní medicíny pro klinickou praxi, pro nově studované markery ale tyto údaje často nejsou k dispozici. Ve výzkumu je z těchto důvodů často důležité provádět náběry v definovanou denní dobu standardně mezi 7-9 hod. ranní, v definovanou fázi menstruačního cyklu pokud je jím studovaná látka ovlivněna a provádět např. statistické zhodnocení korelace data náběru a 54

55 naměřené hodnoty pro poznání sezónních vlivů. Tento problém se řeší dále opakováním odběrů nebo různými inhibičními nebo stimulačními testy, to však probíhá především v rutinní praxi. 5.2 Odběr materiálu Nejčastějším odběrem biologického materiálu je odběr periferní krve z kubitální žíly. Pro tento odběr existují tři základní pravidla, která je nutno dodržet: nezaškrcovat paži během odběru, nechat oschnout dezinfekci v místě vpichu před odběrem (jinak dochází k hemolýze) a neprovádět odběry ze stejné ruky, kde pacient dostává infuzi. Pokud je prováděn odběr z trvale zavedené kanyly, je nutné nejprve 5 ml krve vyhodit a pak teprve brát krev pro stanovení. Stěžejním pro laboratorní vyšetření je výběr odběrové zkumavky. Je nutné zohlednit, zda je třeba k vyšetření sérum (odebírá se krev srážlivá, ve zkumavce proběhne koagulace) nebo zda je třeba plazma (krev je odebrána do zkumavky obsahující protisrážlivé činidlo). Zkumavky pro odběry plazmy se liší použitým antikoagulačním činidlem- heparinát, citrát, EDTA soli. Pro imunoanalýzu se nejčastěji používají odběry s EDTA, ale laboratoř by měla pro každé vyšetření i výzkumné stanovit přesně požadavek na odběrové zkumavky, protože hladiny mezi sérem a plazmou se pro některé analysy můžou výrazně lišit. Pro tvorbu biobank by měly být skladovány jak plazmové tak sérové alikvoty a v publikacích by měl být vždy jasmě specifikován typ použitého biol. materiálu a nejlépe i odběrových zkumavek. Samozřejmostí je nutnost bezchybného a bezpodmínečného označení biologického materiálu jak primárního materiálu tak skladovaných alikvotů po separaci aby se předešlo jakýmkoli záměnám, co se týče pacienta i typu materiálu. V případě speciálních odběrů např. netradičních míst odběru nebo testů v čase je nutné jednoznačné rozlišení jednotlivých odběrů př. číslicemi nebo písmeny na zkumavkách i na žádankách. 55

56 V biologickém materiálu dochází k degradací proteinů proteolytickou aktivitou některých enzymů. Tato aktivita negativně ovlivňuje stanovitelnost proteinů především v homogenátech tkáňových vzorků, ale může být nezanedbatelná i pro imunoanalytická stanovení proteinů v plazmě nebo séru. Proteolýze můžeme předejít přidáním specifických inhibitorů proteáz nebo jejich koktejlů ke vzorku ihned po odběru u krevních derivátů nebo při homogenizaci (u tkáňových vzorků). Inhibitory proteáz můžeme rozdělit do skupin podle několika kritérií: dle typu inhibovaných enzymů podle živočišného druhu/rostliny podle typu analýzy, která bude prováděna podle typu biologického materiálu Speciálním typem inhibitorů jsou inhibitory fosfatáz, které je nutné využívat při studiích monitorujících stav fosforylace některých proteinů v signálních drahách. 5.3 Separace a transport Při transportu a skladování je nutné se vyvarovat teplotních extrémů v létě přehřátí vzorku, v zimě jeho zmrznutí používáním transportních boxů. Některé analyty vyžadují speciální teplotu transportu, např. transport v ledové tříšti, což je směs vody a ledu v poměru jedna ku jedné: led ve vodě postupně odtává, což umožňuje udržet delší dobu vzorek při teplotě těsně nad bodem mrazu. Naopak některé látky při vystavení chladu můžou měnit své hladiny ve směru falešně pozitivního i negativního výsledku. Chybou je vždy zmrznutí zkumavky s odebranou krví před separací séra/plazmy od krevních buněk, protože to vede k hemolýze. Také vystavení vzorku nadměrnému světlu např. ponechání vzorku na okně při silném slunečním svitu může způsobit degradaci fotolabilních látek. Zkumavky s náběry pro měření látek velmi citlivých na světlo by měly být transportovány např. obalené v alobalu. Vždy by mělo být zamezeno třepání a prudké pohyby se zkumavkami s krví před separací, nadměrná mechanická zátěž vede nejčastěji k hemolýze. 56

57 Důležitým krokem v přípravě biol. materiálu z krve je centrifugace separace séra nebo plazmy od krevních buněk. Jednotlivé laboratoře se liší používanými podmínkami vždy by měla být uváděna doba centrifugace a použitá centrifugační (odstředivá) síla g (uvádění v otáčkách za minutu rpm je chybné neboť nezahrnuje velikost rotoru, která ovlivňuje odstředivou sílu). Tato odlišnost je jednou z příčin nestejných výsledků mezi jednotlivými laboratořemi. Speciální nastavení je třeba např. při požadavku na tzv. bezdestičkovou plazmu pro studium některých analytů, aby nedocházelo k ovlivnění měřené hladiny vyplavením intracelulárních komponent z trombocytůseparace zajišťuje i zamezení vyplavování látek např. interleukinů z aktivovaných leukocytů. Sérum by mělo být před separací ponecháno srážet alespoň 30 min. po odběru. Naopak plazma může být separována ihned. 5.4 Skladování Biologický materiál pro výzkumné účely by měl být skladován v alikvotech odpovídajících množstvím potřebám analýzy a při dlouhodobém skladování v teplotách pod -70 o C. Moderní analytické postupy vyžadují poměrně malé množství materiálu a je tedy výhodnější skladovat více alikvotů s menším objemem. Zamezí se tak opakovanému rozmrazování, které je nežádoucí. U některých biomarkerů např. cytokeratinů víme, že opakované rozmrazování nezmění výsledek, ale u většiny nových biomarkerů nemáme tušení a proto se tzv. opakovaným freeze/thaw cyklům vyhýbáme. Důležitý je i správný výběr zkumavek pro dlouhodobé uskladnění musí být vyrobeny z plastů odolávajícím nízkým teplotám a musí mít víčka dostatečně zamezující odpařování. Dále je nutné si uvědomit, že materiál nemůže být skladován nekonečně dlouho. Maximální doba skladování se liší pro jednotlivé analysy, jejich hladiny se v průběhu let/měsíců mění. Ve výzkumu je proto důležité zvážit, zda bude vhodné jednorázové vyšetření biologického materiálu až po kompletním ukončení sběru (celé kohorty) nebo zda je výhodnější periodické zpracování např. vždy jednou za půl roku nebo dokonce kontinuální zpracování na rutinních analyzátorech, kde ale zase hrozí změna použité metodiky. 57

58 Samotná preanalytická fáze začíná již správným výběrem indikací laboratorního vyšetření, v případě výzkumných projektů výběrem studovaného biomarkeru. Je nutné nejprve zjistit, co nejvíce o preanalytických podmínkách, které jsou nezbytné, a poté jim přípravu pacientů, odběry a nakládání s biologickým materiálem co nejlépe přizpůsobit. Velkým problémem většiny studií zůstává nestejné zacházení s náběry tzv. kontrolních skupin. Náběry jsou často zpracovávány v jiných laboratořích (např. transfůzní stanice), za jiných podmínek (doba a nastavení centrifugace), náběry jsou prováděny v jiných denních dobách (např. pouze ambulantní náběry v kontrolní skupině x celodenní náběry z lůžkových oddělení v cílové skupině). Velkou neznámou, co se týče jednotnosti podmínek a popisu preanalytické fáze, zůstávají velké biobanky, kde jsou pro jednotlivé diagnózy často dlouhodobě skladovány biologické materiály získané buď z mnoha pracovišť za kratší časový úsek, nebo naopak z jednoho pracoviště za velmi dlouhé časové období. Při studiích používajících takovýto biologický materiál by mělo být vždy součástí statického hodnocení zda výsledek neovlivňuje stáří náběru a jeho původ (tedy zda se neliší výsledky náběrů získaných různými pracovišti). 5.5 Literatura 5 1. Encyklopedie laboratorní medicíny pro klinickou praxi verze 9, (prosinec 2009) dosažitelné na 2. Picotte M, Campbell CG, Thorland WG. Day-to-day variation in plasma interleukin-6 concentrations in older adults. Cytokine Sep;47(3): Arvidson NG, Gudbjörnsson B, Elfman L, Rydén AC, Tötterman TH, Hällgren R. Circadian rhythm of serum interleukin-6 in rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis Aug;53(8): Shand B, Elder P, Scott R, Frampton C, Willis J. Biovariability of plasma adiponectin. Clin Chem Lab Med. 2006;44(10): PubMed PMID: Flower L, Ahuja RH, Humphries SE, Mohamed-Ali V. Effects of sample handling on the stability of interleukin 6, tumour necrosis factor-alpha and leptin. Cytokine Nov;12(11): PubMed PMID: Thavasu PW, Longhurst S, Joel SP, Slevin ML, Balkwill FR. Measuring cytokine levels in blood. Importance of anticoagulants, processing, and storage conditions. J Immunol Methods Aug 30;153(1-2): PubMed PMID: Steptoe A, Willemsen G, Owen N, Flower L, Mohamed-Ali V. Acute mental stress elicits delayed increases in circulating inflammatory cytokine levels. Clin Sci (Lond) Aug;101(2): PubMed PMID:

59 5. Venkatraman JT, Pendergast D. Effects of the level of dietary fat intake and endurance exercise on plasma cytokines in runners. Med Sci Sports Exerc Aug;30(8): PubMed PMID: Venkatraman JT, Feng X, Pendergast D. Effects of dietary fat and endurance exercise on plasma cortisol, prostaglandin E2, interferon-gamma and lipid 7. peroxides in runners. J Am Coll Nutr Oct;20(5): PubMed PMID: 8. Rai AJ, Gelfand CA, Haywood BC, Warunek DJ, Yi J, Schuchard MD, Mehigh RJ, Cockrill SL, Scott GB, Tammen H, Schulz-Knappe P, Speicher DW, Vitzthum F, Haab BB, Siest G, Chan DW. HUPO Plasma Proteome Project specimen collection and handling: towards the standardization of parameters for plasma proteome samples. Proteomics Aug;5(13): PubMed PMID: Protease & Phosphatase Inhibitors & Proteases, A handbook & selection guide for inhibitors of protease & phosphatases & for proteases & assays dosažitelné na Inhibitory proteáz Calbiochem dosažitelné na Racek J., Preanalytické vlivy na výsledek laboratorního vyšetření v Racek J., Klinická Biochemie, druhé vydání, 2006, Galén 12. Zima T., Obecný úvod k laboratornímu vyšetření, v Zima T., Laboratotní diagnostika, 2002, Galén 13. Wilde C.: Subject Preparation, Sample Collection and Handling v The Immunoassay Handbook, Third Edition, D. Wild (Editor), 2005, Elsevier 6. Imunoanalýza a molekulární biologie Martin Pešta Můžete si položit otázku: co má imunoanalýza a molekulární biologie společného? Vždyť molekulární biologie používá jiné metody, jako je polymerázová řetězová reakce (PCR) nebo elektroforetická separace DNA či proteinů. Spojení imunoanalýzy s molekulární biologii však bylo způsobeno vývojem v oblasti přístrojového vybavení. Multiplexová technologie, která se v současnosti používaná v imunoanalýze, umožňuje řešit i otázky, které byly donedávna vyhrazeny metodám molekulární biologie. Jsou to: 1, genotypizace a stanovení bodových mutací 2, kvantifikace exprese mrna. 59

60 Jako příklad zde uvádím onemocnění a vyšetření, na které jsou komerčně dostupné soupravy pro genotypizaci a stanovení bodových mutací na přístroj Luminex (xmap-based assay) (Tabulka 6.1). Tabulka 6.1. aplikace: analyzované geny: výrobce: Genetická onemovnění, Cystic fibrosis: 25mutací, Ambion Diagnostic screning 6 polymohismů (Austin, TX) Ashkenazi Carrier Panel: 23 mutací v 8 genech SNP genotyping Y chromozom, SNPs Marlingen Biosciences, Inc Mitochondriální DNA (Ijamsville, USA) polymorfismus HLA DNA typizace HLA A, B, C, DRB1, DRB3,4,5, One Lambda, Inc DQB1 (Canoga Park,USA) Infekční onemocnění Panel akutních respiračních infekcí: Proactive Medical SARS-CoV, Influenza A and B Parainfluenza 1 and 3RVS Technologies, Inc (Austin, USA) HLA DNA typizace HLA A, B, C, DRB, DQB Tepel Lifecodes (Stamford, USA) SNP genotyping Cytochrom P450: CYP2C19, Tm Bioscience CYP2C9, CYP2D6 (Toronto, Kanada) Genetický screning tromboflních stavů Factor V, Factor II, MTHFR677, MTHFR

61 Populační genetika Y-SNP identifikace Luminex Corporation (Austin, United States) Genetika virů Tag-It Mutation Detection Kit, Genetický screning HPV genotyping (Human) 50 SNP včetně Factor V, Factor II, MTHFR677, MTHFR1298 tromboflních stavů Signet Genotyping Panel detekce mutací ovlivňujících zdravotní rizika srdce, kostí, odezity, detoxikačních funkcí antioxidantů, inzulinové senzitivity, zánětu, obezity Alzheimerovi choroby. 6.1 Základy molekulární biologie Základem molekulární biologie, disciplíny zabývající se studiem buněčných procesů na jejich molekulární úrovni, je tzv. centrální dogma molekulární biologie. To říká, že genetická informace je realizována ve směru z nukleových kyselin do proteinů. To znamená, že změna fenotypu (organismu) je možná pouze změnou genotypu (genetické informace), ne naopak, jak ukazuje Obrázek 6.1 GENOTYP FENOTYP REPLIKACE TRANSKRIPCE TRANSLACE DNA DNA RNA protein RNA do DNA REVERZNÍ TRANSKRIPCE (retroviry) Obrázek 6.1 Vztah genotyp fenotyp. 61

62 replikace - vytvoření kopie původní molekuly dvoušroubovice DNA (templát) vznikem dvou shodných molekul dvoušroubovic DNA (replik) např. při mitóze buňky transkripce - přepis genetické informace uchovávané v řetězci DNA do řetězce RNA translace - genetická informace je přeložena z RNA do sekvence aminokyselin (proteinu), následně je vytvořením struktur (buněčných) a funkcí realizován fenotyp - živý organismus Původní předpoklad jeden gen - jeden enzym (protein), bylo nutno upravit. Vlivem alternativního sestřihu RNA může vznikat více podobných proteinů. RNA, vzniklá v procesu transkripce se skládá z kódujících sekvencí (exonů) a nekódujících sekvencí (intronů). Odstraněním intronů v procesu sestřihu RNA mohou za určitých okolností, kombinací exonů, vznikat podobné proteiny. 6.2 Proč vznikají a co způsobují mutace Během života je genetická informace (DNA) v lidských buňkách vystavena různým vlivům, které mohou měnit její primární strukturu (pořadí nukleotidů). Změny nukleotidového složení DNA (mutace) vznikají vlivem fyzikálních mutagenů (UV), chemických mutagenů (alkylační činidla) či biologických mutagenů (některé viry), ale také prostřednictvím chyb při replikaci. Mutace, které nemají patologický projev, vedou pouze vzniku polymorfismu (např. jednonukleotidový polymorfismus - SNP). Mutace ale mohou také způsobit, že genetická informace se projeví ve změně produkovaného proteinu, která vede k poruše jeho funkce. To může způsobit vznik méně či více závažných onemocnění. Změny primární struktury DNA můžeme rozdělit na: 1, Genové mutace A- Bodové mutace (mutace postihující jen jeden nukleotidový pár) B- Změny rozsáhlejších oblastí: 1) inzerce 2) delece 3) duplikace (detekcí těchto mutací se zabývá molekulární biologie) 2, Chromozómové aberace (delece, translokace, inverze) 62

63 (tyto mutace detekuje cytogenetika, mohou být nalezeny i metodami molekulární biologie) 3, Genomové mutace (aneuploidie, polyploidie) (tyto mutace opět detekuje cytogenetika, mohou být však také nalezeny i metodami molekulární biologie) Leidenská mutace Jako příklad mutace s jasným klinickým projevem si uveďme Leidenskou mutaci (G1691A) mutaci faktoru V koagulačního systému. Tato mutace zvyšuje riziko trombofilního stavu a to již při mutaci jedné ze dvou alel tzn. v heterozygotním stavu. Leidenská mutace - bodová mutace exon - G1691A vede ke záměně argininu za glutamin změna struktury proteinu FV APC-R (rezistence na aktivovaný protein C; prokoagulační stav) Autosomálně dominantní onemocnění - riziko trombotických komplikací se zvyšuje již při mutaci jedné z obou alel genu Incidence této mutace v populaci je 4,2-7% Význam stanovení Leidenská mutace Prevence tromboembolické choroby v rizikových situacích: operace, trauma, úraz, imobilizace, při indikaci HAK a HRT Zjištění mutace má význam nejen pro probanda, ale i pro příbuzné - děti, sourozenci, rodiče. Stanovení Leidenské mutace na přístroji Luminex princip stanovení A, Jednoduší metodou stanovení je přímá DNA hybridizace. Té předchází amplifikace (namnožení) úseku DNA pomocí polymerázová řetězová reakce (PCR). (Obrázek 6.2) Podle typu detekovaných kuliček určíme, zda je mutace přítomna či nikoli. 63

64 SNP resp. mutace 1. PCR amplifikace se značenými primery úseku DNA obsahujícího mutaci Amplifikace 2. Denaturace produktů PCR oddělení vláken DNA Denaturace 3. Hybridizace na kuličku příslušné specifity (wild typ X mutace) Hybridizace 4. Detekce na přístroji Luminex Detekce Obrázek 6.2 Přímá DNA hybridizace s detekcí na přístroji Luminex. B, Druhá, komplikovanější metoda je tzv. kompetitivní DNA hybridizace. Princip metody spočívá v zablokování přítomné mutace resp. wild (normální) sekvence florescenčně značeným kompetitorem a následné detekci kuličky, hybridizované s kompetitorem, který se nenavázal. Tzn. že zjišťujeme, která alela není přítomna, a z toho odvozujeme, která přítomna je. Jednotlivé kroky testu jsou: 1. PCR amplifikace úseku DNA obsahujícího mutaci 64

65 2. Denaturace + kompetitivní prehybridizace se značenou sondou (zablokují se sondy s příslušnou specifitou (wild typ X mutace) 3. Hybridizace s kuličkami příslušné specifity 4. Detekce na přístroji Luminex Vše dále zobrazuje Obrázek 6.3: Cílová sekvence není přítomna prehybridizace Cílová sekvence je přítomna prehybridizace hybridizace hybridizace detekce detekce Obrázek 6.4 Kompetitivní DNA hybridizace s detekcí na přístroji Luminex. 65

66 Stanovení Leidenské mutace ASA PCR Jako příklad stanovení Leidenské mutace pomocí PCR uvádíme alelově specifickou PCR - ASA PCR. U každého probanda jsou provedeny dvě PCR, jedna zjišťující přítomnost Wild alely a druhá zjišťující přítomnost mutované alely. Na následujícím schématu vidíte, jak vypadá záznam elektroforetické separace DNA fragmentů po PCR dvou probandů a vyhodnocení. PCR je doplněna o amplifikaci faktoru IX (kontrola proběhnutí PCR) a stanovení protrombinové mutace(faktor II). Schéma záznamu ASA PCR dvou probandů: u každého proband - 2 PCR pro normální a pro mutovanou alelu (w, m), přítomnost amplikonu ukazuje přítomnost dané alely Obrázek 6.5 Fotografie stanovení protrombinové mutace a Leidenské mutace čtyř probandů metodou ASA PSR. Interpretace výsledku elektroforetického gelu: 1, normální genotyp protrombin heterozygot faktoru V (LM) 2, normální genotyp protrombin normální genotyp faktoru V 3, normální genotyp protrombin normální genotyp faktoru V 4, heterozygot protrombin (mutace) heterozygot faktoru V 66

67 6.3 Základní metody práce s nukleovými kyselinami Prvním úkolem při práci s nukleovými kyselinami je jejich izolace. Až na výjimky izolace NK předchází všechny analýzy. Ve speciálních případech je možno použít přímo buněčné sespenze. Izolace DNA Pro většinu genetických testů je třeba nejprve izolovat DNA. Platí to například jak pro metodiky PCR tak pro stanovení genotypu na přístroji Luminex xmap technologií. Metody izolace jednotlivých typů nukleových kyselin (DNA, RNA) z různých organismů a tkání jsou v podstatě vždy posloupností těchto základních kroků: 1. Získání biologického materiálu, ze kterého se nukleové kyseliny izolují (plná krev, tkáň, buněčná suspenze) 2. Uvolnění nukleových kyselin z biologického materiálu 3. Oddělení nukleových kyselin z makromolekulárních struktur 4. Purifikace nukleové kyseliny 5. Zakoncentrování izolovaných nukleových kyselin Krok 2 je obvykle realizován v roztocích o nízké osmolaritě v kterém buňky popraskají. Uvolnění obsahu protoplastů lze docílit detergenty - SDS, Triton X-100, degradace proteinů proteinázou. Oddělení nukleových kyselin z makromolekulárních struktur, proteinu a purifikace nukleové kyseliny precipitací proteinů je docíleno vysokou koncentrací solí. Např. Vysolovací metoda podle Millera (NaCl, popř. chloroform, odstranění proteinů a makromolekulárních struktur, membrán) precipitace DNA etanolem rozpuštění DNA v H 2 O. Stejného výsledku je možno docílit Fenolchloroformovou extrakcí (ph 8, - odstranění proteinů a makromolekulárních struktur, membrán) precipitace DNA etanolem rozpuštění DNA v H 2 O. Krok 3, oddělení jednotlivých fází je docíleno centrifugací, po které se svrchní, vodná fáze obsahuje rozpuštěnou DNA. 67

68 Krok 4, odebere se vodná fáze a přidá se 2,5násobek 96% alkoholu dojde k precipitaci DNA. Ta je z roztoku přenesena do nové zkumavky, vysušena a rozpuštěna ve vodě. Skladovat DNA lze krátkodobě při 4 O C, dlouhodobě při -20 O C. Problém při izolaci DNA enzymy DNázy degraduji DNA jejich inaktivace je docílena sterilizací plastů a chelatačními činidly, např. EDTA Izolace RNA Přestože izolace RNA je v principu stejná jako DNA, liší se v několika bodech. Pro izolaci RNA je nezbytná inhibice RNáz (enzymů štěpících RNA) - guanidinium isothiokyanátem. Fenolchloroformová extrakce probíhá při odlišném ph 4-5, to zajistí kromě odstranění proteinů a makromolekulárních struktur, membrán také odstranění DNA. Vzorek RNA se při izoloze snažíme neustále chladit. Následuje precipitace RNA etanolem nebo izopropanolem (- 20 O C, 1/2h) a rozpuštění RNA v H 2 O. Skladovat RNA lze krátkodobě při - 20 O C, ale ideální je teplota -70 O C. PCR polymerázová řetězová reakce Pro analýzu konkrétních genů je často nutné získat daný úsek DNA ve velkém množství kopií, tak aby mohla být provedena následná analýza. Množení vybraných úseků dvouřetězcové DNA umožňuje právě polymerázová řetězová reakce. Byla vyvinuta Kary Mullisem v laboratoři H. Ehrlicha u firmy Cetus Corp. (Kalifornie, USA) a poprvé publikována v r Saikim a Mullisem. Stala se nepostradatelnou metodou v každé laboratoři používající techniky molekulární biologie. Princip PCR je množení vybraných úseků dvouřetězcové DNA (dsdna), kdy je vybraný úsek DNA ohraničen párem primerů, každý z nich se připojí k jednomu z individualizovaných řetězců DNA (po denaturaci, zvýšenou teplotou) a stane se startovacím očkem pro syntézu nového řetězce. Tento cyklus je zobrazen na následujícím obrázku. 68

69 Množení konkrétních úseků DNA pomocí PCR spočívá v cyklickém opakování 3 základních kroků a to: 1. denaturace DNA (rozestoupení vláken dvoujšroubovice při 95 O C) 2. nasednutí primerů (startovacích úseků pro syntézu druhého vlákna) při 60 O C na komplementární sekvenci 3. polymerace vytvoření druhého (komplementárního) řetězce při při 74 O C. Jak vyplývá z předchozích řádků, hnacím motorem PCR je pravidelné střídání teplot. Grafický sled všech kroků ukazuje Obrázek 6.6. Obrázek 6.6 Schéma reakce PCR Pro realizaci PCR jsou potřebné: předloha - templát DNA, stavební kameny - dntp, startovací očka pro nové vlákna - primery (oligonukleotidy cca. 20-timery), polymeráza (termostabilní), pracovní pufr a samozdřejmě přístroj umožňující rychlou změnu teploty ve zkumavkách thermo cycler. 69

70 Na Obrázku 6.7 jsou termální cyklátory pro end point analýzu (neumožňují real-time kvantifikaci), Techne Progene a MJ Research PTC-200 Obrázek 6.7 Termální cyklátory V některých případech je nutno určit přesný počet kopií určitého úseku DNA (resp. RNA) kvantifikovat DNA (expresi mrna). Jedna z oblastí výzkumu využívající kvantifikaci je sledování exprese genů na úrovni transkripce (mrna) nebo např. kvantifikace množství přitomného patogenu (např. viru). Kvantifikaci dnes umožňuje řada metodik. Zde uvádím metodiku novou, založenou na xmap technologii přístroje Luminex a tradiční tzv. real-time PCR. Kvantifikace mrna pomocí xmap technologie na přístroji Luminex Princip stanovení exprese genů, tzn. určení množství mrna ve vzorku, je znázorněn na Obrázku

71 streptavidin-fykoerytrin amplifikátor signálu mrna Obrázek 6.8 Princip stanovení exprese genů (QuantiGene Plex Assay) Na povrchu kuličky, detekované přístrojem, jsou ukotveny sekvence komplementárně odpovídající námi sledovanému genu např. VEGF. Během přípravné fáze se RNA izolovaná s příslušné tkáně hybridizuje s těmito sekvencemi a dojde k navázání mrna genu pro VEGF na tyto sekvence sekvence. Dále se se s molekulou mrna spojí další molekuly které vytvoří zdroj signálu, svědčící o přítomnosti sledované mrna a také o jejím počtu (velikost signálu). Kuličky procházejí kapilárou přístroje Luminex, který detekcí barvy kuličky získá informaci, kterou mrna právě měří a detekcí signálu z molekul navázaných na mrna na kuličce zjišťuje počet navázaných molekul. Ukázka souprav firmy Panomics (Austin, United States) se seznamem genů, jejichž expresi je možno stanovit, je na Obrázku