CHORUS DEAMINATED GLIADIN-A

Transkript

1 CHORUS DEAMINATED GLIADIN-A (36 testů) Výrobce: DIESSE Diagnostica Senese Via delle Rose Monteriggioni (Siena) Itálie

2 OBSAH 1 Úvod Princip testu Složení soupravy Další potřebné vybavení k provedení testu Skladování a stabilita komponent Bezpečnost práce Technické připomínky Vzorky a jejich skladování Pracovní postup Validita testu Hodnocení výsledků Interpretace výsledků Charakteristika soupravy Literatura Vysvětlení symbolů /12 Rif. IO-09/271; IFU Ed

3 Semikvantitativní stanovení IgA protilátek proti α-gliadinu v lidském séru na přístroji Chorus/Chorus TRIO pomocí jednorázového testovacího zařízení 1 Úvod Gluten-senzitivní enteropatie neboli celiakie je charakterizována atrofií klků tenkého střeva, která vede k tzv. ploché sliznici. Ta vzniká následkem patologické nesnášenlivosti gliadinu, alkoholem rozpustné frakce lepku pocházejícího z pšenice, žita nebo ječmene. Celiakie je způsobena konzumací lepku, a proto je možné toto onemocnění úplně vyléčit aplikací bezlepkové diety, kterou je však nutné dodržovat po celý život. Dojde-li znovu ke konzumaci lepku, symptomy se vrátí. Onemocnění je asociované s HLA (více než 95 % pacientů má DQ2 kódovaný DQA1*0501 a DQB1*0201) a projevuje se v kterémkoli věku s počáteční kulminací v útlém dětství, někdy dokonce u novorozenců. Počet případů se v evropských zemích pohybuje od 1 ze 4000 do 1 z 300. Celiakie se diagnostikuje na základě biopsie tenkého střeva (výskyt ploché sliznice) a serologických markerů. Velký význam mají protilátky proti gliadinu a tkáňové transglutamináze (ttg). Nepřímá imunoflourescence (IFT) zůstává dosud důležitým nástrojem pro diagnostiku celiakie. Při IFT byla ttg identifikována jako hlavní cílový antigen protilátek proti EMA vážících se na endomyzium (extracelulární konstituent hladkého svalstva). Kolující protilátky třídy IgG a IgA proti gliadinu lze nalézt v sérech většiny pacientů trpících celiakií, ačkoliv je specifičnost těchto protilátek ve srovnání s ttg a EMA výrazně menší. Stanovení IgG protilátek je zvláště cenné, protože zhruba 2 až 5 % pacientů s celiakií vykazuje deficit IgA, a tyto pacienty tedy test na IgA protilátky neodhalí. Protilátky proti gliadinu jsou možná jediným serologickým markerem u novorozenců, protože se v tomto věku ještě nevyskytují autoprotilátky anti-ttg a EMA. Při diagnostice celiakie jsou tedy pro pediatra protilátky proti gliadinu jedním z nejdůležitějších vodítek pro stanovení diagnózy. 2 Princip testu Jednorázový test připravený k použití na přístrojích Chorus umožňuje stanovení IgA protilátek proti gliadinu. Test je založen na principu ELISA (Enzyme linked Immunosorbent Assay). Antigen složený z vysoce purifikovaného deaminovaného α-gliadinu se naváže na pevnou fázi. V průběhu inkubace vzniká vazba mezi specifickými protilátkami vyšetřovaného séra a imobilizovaným antigenem. Po promytí, která eliminují nenavázané proteiny, se provádí inkubace s konjugátem. Konjugát je roztok s obsahem monoklonálních protilátek proti lidskému IgA značených křenovou 3/12 Rif. IO-09/271; IFU Ed

4 peroxidázou. Po další sérii promytí, které odstraní nenavázaný konjugát, se přidá substrát reagující s peroxidázou. Intenzita barvy, která vznikne, je přímo úměrná koncentraci specifických protilátek přítomných v testovaném lidském séru. Jednorázový test obsahuje všechny reagencie nutné k provedení testu na přístrojích Chorus. 3 Složení soupravy Souprava umožňuje provést 36 stanovení. Testovací jednotka 6 samostatných balení po 6 jednotlivých jednorázových testech 6 6 ks Kalibrátor µl Roztok lidského séra o známé koncentraci protilátek, obsahující Proclin a Gentamicin, v pracovním ředění Pozitivní kontrola µl Roztok lidského séra o známé koncentraci protilátek, obsahující Proclin a Gentamicin, v pracovním ředění Pracovní návod 1 ks Soupravu nechte vytemperovat na laboratorní teplotu a ze samostatných balení odeberte stanovený počet jednorázových testů pro vlastní analýzu. Zbylé jednorázové testy vraťte zpět do obalu se sušidlem (silikagel gel obsahující oxid křemičitý), vytlačte vzduch a hermeticky uzavřete stisknutím uzávěru. Skladujte při +2 C až +8 C. 4/12 Rif. IO-09/271; IFU Ed

5 Obrázek 1 Schéma jednorázového testu Pozice 8 Pozice 7 Pozice 6 Místo pro štítek s čárovým kódem Prázdná pozice Mikrotitrační jamka s potaženým antigenem Deaminovaný gliadin Pozice 5 Nepotažená mikrotitrační jamka Pozice 4 TMB Substrát 0,35 ml Tetrametylbenzidin 0,26 mg/ml a 0,01% H 2 O 2 stabilizovaný v 0,05 mol/l citrátového pufru (ph 3,8) Pozice 3 Ředicí roztok vzorků 0,35 ml Proteinový roztok obsahující 0,02% Tween-20 a 0,1% Proclin Pozice 2 Konjugát 0,35 ml Roztok monoklonálních protilátek značený peroxidázou ve fosfátovém pufru obsahujícím 0,05% fenol a 0,02%Bronidox Pozice 1 Prázdná jamka Do této jamky se přidá vyšetřované sérum 4 Další potřebné vybavení k provedení testu Tyto reagencie nejsou součástí balení. Promývací roztok pro testy na stanovení autoimunitních onemocnění Čistící roztok Sanitační roztok Ředicí roztok vzorků / Negativní kontrola Destilovaná nebo deionizovaná voda Běžné laboratorní sklo: odměrné válce, zkumavky atd. Mikropipety na přesný odběr 50 až 200 μl roztoku Jednorázové rukavice Roztok chlornanu sodného (5 %) Nádoby na potenciálně infekční materiál 5/12 Rif. IO-09/271; IFU Ed

6 5 Skladování a stabilita komponent Reagencie se musí skladovat při teplotě +2 C až +8 C. V případě skladování při nesprávné teplotě se musí zopakovat kalibrace a validovat test pomocí kontrolního séra (viz 10, Validita testu). Datum exspirace je uvedeno na každé komponentě a na štítku soupravy. Po otevření mají reagencie omezenou stabilitu. Jednorázový test 8 týdnů při teplotě +2 C až +8 C Pozitivní kontrola 8 týdnů při teplotě +2 C až +8 C Kalibrátor 8 týdnů při teplotě +2 C až +8 C 6 Bezpečnost práce Souprava je určena pouze pro diagnostické účely in vitro. Tato souprava obsahuje materiály lidského původu, které byly testovány a vykázaly negativní výsledky při použití metod schválených FDA pro stanovení přítomnosti HbsAg a anti-hiv-1, anti-hiv-2 a anti-hcv protilátek. Protože však žádný diagnostický test nemůže poskytnout úplnou záruku, že infekční agens nejsou přítomna, je třeba s veškerým materiálem lidského původu zacházet tak, jako by byl potenciálně infekční. Při zacházení s materiálem lidského původu je nutné dodržovat všechny místní předpisy týkající se bezpečnosti práce. Likvidace zbytků pro provedení testu S použitými vzorky sér, kalibrátory, jednorázovými testy je třeba zacházet jako s potenciálně infekčním materiálem a likvidovat je v souladu s platnou legislativou. Zdravotní a bezpečnostní informace 1. Nepipetujte ústy. Používejte rukavice na jedno použití a ochranu očí. Po umístění jednorázového testu do přístroje Chorus si důkladně umyjte ruce. 2. Některé reagencie obsahují nízké koncentrace škodlivých nebo dráždivých látek Pokud se některá s těchto reagencií dostane do kontaktu s kůží nebo očima, důkladně omyjte dané místo vodou. Konjugát obsahuje fenol TMB Substrát je roztok kyseliny 3. Neutralizované kyseliny nebo jiný tekutý odpad by se měl dekontaminovat přidáním dostatečného množství chlornanu sodného tak, aby konečná koncentrace dosahovala minimálně 1,0 %. Pro zajištění účinné dekontaminace ponechejte tento odpad 30 minut v 1% chlornanu sodném. 4. Rozlitý potenciálně infekční materiál je třeba okamžitě odstranit pomocí absorpčního papírového ručníku a kontaminovanou oblast umýt, například 1,0% chlornanem sodným, a to předtím, než budete v práci pokračovat. Chlornan 6/12 Rif. IO-09/271; IFU Ed

7 sodný nepoužívejte na rozlité tekutiny s obsahem kyseliny, ty musíte nejprve otřením vysušit. 5. Materiály použité k čištění potřísněných povrchů, včetně rukavic, se musí likvidovat jako potenciálně životu nebezpečný odpad. Materiály obsahující chlornan sodný nevkládejte do autoklávu. 7 Technické připomínky Pro získání spolehlivých výsledků je nutné přesné dodržování návodu. Soupravu nechte vytemperovat na laboratorní teplotu (+18 C až +30 C) a test proveďte do 60 minut. Zkontrolujte a dodržujte následující informace: Nepoužívejte jednorázové testy, jestliže je v pozici 4 modře zbarvený Substrát. Testovaný vzorek je dokonale na dně jamky rozprostřen. Zkontrolujte zda-li všechny reagencie v testu jsou přítomny a jestli není jednorázový test poškozen. Nepoužívejte testy, které nemají reagencie. Jednorázové testy jsou určeny pro použití na přístroji Chorus. Důkladně dodržujte pokyny pro použití a řiďte se návodem k obsluze přístroje. Chorus přístroj správně nastavený (viz návod k obsluze). Neměňte čárový kód umístěný na držadle jednorázového testu. Nepoužívejte testy s poškozenými štítky s čárovými kódy. Defektní čárové kódy lze vložit do přístroje manuálně. Během skladování a použití nevystavujte jednorázové testy silnému světlu ani výparům chlornanu. Použití silně hemolytických vzorků nebo vzorků s mikrobiální kontaminací může vést k nereprodukovatelným výsledkům. Než vložíte jednorázový test do přístroje, zkontrolujte, že reakční jamka neobsahuje cizí tělesa. Pipetujte sérum (50 µl) do pozice 1 jednorázového testu (viz obrázek 1). Nepoužívejte jednorázový test po uplynutí expiračního data. Zkontrolujte prosím, zda-li byl k přístroji Chorus připojen promývací roztok určený pro testy ke stanovení autoimunitních onemocnění (Washing Buffer Autoimmunity /12 Rif. IO-09/271; IFU Ed

8 8 Vzorky a jejich skladování Jako vzorek k vyšetření může být použito sérum, získané odběrem žilní krve. Zachází se s ním v souladu se všemi opatřeními předepsanými správnou laboratorní praxí. Čerstvé sérum lze skladovat 4 dny při +2 C až +8 C. Séra je možné uchovávat při -20 C a lze je rozmrazit maximálně 3krát. Neskladujte vzorky v mrazácích s funkcí vlastního rozmrazování. Rozmrazené vzorky je potřeba před použitím důkladně protřepat. Kvalita vzorku může být vážně narušena kontaminací, která vede k chybným výsledkům. Nepoužívejte silně lipemické, ikterické, hemolytické nebo kontaminované vzorky. Test nelze použít na lidskou plazmu. 9 Pracovní postup. 1. Otevřete balení, vyjměte požadovaný počet jednorázových testů a zbytek uzavřete zpět do sáčku poté, co vytlačíte vzduch. 2. Zkontrolujte stav jednorázového testu (viz 7 Technické připomínky). 3. Pipetujte 50 μl neředěného séra do pozice 1 každého testu. Při každé změně šarže soupravy použijte jednorázový test pro kalibraci. 4. Jednorázový test umístěte do přístroje. Proveďte kalibraci (je-li nutná) a vlastní stanovení podle pokynů uvedených v návodu k obsluze Chorus přístroje. 10 Validita testu Pomocí kontrolního séra ověřte správnost získaných výsledků. Použijte je v souladu s instrukcemi uvedenými v návodu na obsluhu. Pokud test ukáže, že se hodnota kontrolního séra pohybuje mimo přijatelné rozmezí, kalibraci je třeba opakovat. Předchozí výsledky budou automaticky opraveny. Pokud je výsledek kontrolního séra i nadále mimo přijatelné rozmezí, kontaktujte prosím technickou podporu: Tel: Fax: /12 Rif. IO-09/271; IFU Ed

9 11 Hodnocení výsledků Přístroj Chorus vyjadřuje výsledky v AU/ml vypočítané na základě grafu, který je uložený k příslušné šarži v přístroji. Hodnocení výsledků je popsáno v tabulce (Tabulka 1). Tabulka 1 Hodnocení výsledků AU/ml menší než 12 Hodnocení negativní 12 až 18 hraniční větší než 18 pozitivní V případě hraničního výsledku zopakujte test. Pokud zůstává test nadále hraniční, je vhodné opakovat z nového odběru. 12 Interpretace výsledků Test nelze použít jako jednou metodu pro stanovení klinické diagnózy. Negativní výsledek testu nevylučuje eventuální onemocnění. Serologický nález je třeba vždy interpretovat pouze v kontextu s výsledky ostatních laboratorních testů a s klinickým obrazem pacienta. 13 Kalibrační a Referenční rozmezí Kalibrační rozmezí se pohybuje v oblasti 3 až 100 AU/ml. Jestliže se objeví vzorky s výsledkem stanovení nad 300 AU/ml je nutné tyto vzorky naředit Negativní kontrolou/ředicím roztokem vzorků ( 83607). V normální populaci se očekávané hodnoty pohybovaly mezi 3 až 10,7 AU/ml. Tyto výsledky byly získány na základě měření 120 sér zdravých dárců. 14 Charakteristika soupravy 14.1 Analytická specifita Analytická specifita byla testována na 5 vzorcích (2 negativní, 1 CUT-OFF, 2 pozitivní) obsahujících potenciálně interferující látky: Revmatoidní faktor (44 až 220 IU/ml) Bilirubin (4,5 až 45 mg/dl) Triglyceridy (10 až 250 mg/dl) Hemoglobin (5 až 30 mg/ml) Přítomnost interferujících látek v testovaných vzorcích nemá vliv na výsledek testu. 9/12 Rif. IO-09/271; IFU Ed

10 14.2 Zkřížená reaktivita Byly testovány vzorky (3) pozitivní na Scl-70, SS-B, Cenp-B, kardiolipin, β-2 glykoprotein a ASCA. Nebyla prokázána žádná významná zkřížená reaktivita Diagnostická citlivost a specifita Pro stanovení citlivosti a specifity bylo využito srovnání výsledků na jiné referenční soupravě. Při srovnání bylo testováno 113 vzorků. Výsledky srovnání jsou uvedeny v tabulce (Tabulka 2). Tabulka 2 Výsledky srovnání zařazení testovaných vzorků Referenční souprava DIESSE Pozitivní Negativní Celkem Pozitivní Negativní Celkem Souprava vykazuje 95,5% specifitu (CI 95% 84,8 až 96,6) a 85,5% citlivost (CI 95% 75,3 až 91,9) Přesnost měření Intra-assay a Inter-assay stanovení: testované vzorky byly opakovaně změřeny; průměr naměřených hodnot, variační koeficient (%) jsou uvedeny v tabulce (Tabulka 3). Tabulka 3 Intra-assay a Inter-assay stanovení Vzorek Průměr (AU/ml) Intra-assay Variační koeficient (%) Průměr (AU/ml) Inter-assay Variační koeficient (%) ,1 4,5 3 6,1 9,3 3,5 8,9 4 13,3 6,3 10,1 8,7 5 17,2 8,7 10,8 7,9 6 30,3 7,3 13,2 8,3 7 30,2 9,1 13,9 9, ,1 16,7 9, ,5 7,7 23,7 6, ,7 7 52,9 7,3 10/12 Rif. IO-09/271; IFU Ed

11 Přesnost mezi jednotlivými šaržemi a přesnost mezi použitými přístroji: všechny testované vzorky byly analyzovány; průměr naměřených hodnot, variační koeficient (%) každého vzorku jsou uvedeny v tabulce (Tabulka 4). Tabulka 4 Přesnost mezi šaržemi a přesnost mezi přístroji Vzorek Průměr (AU/ml) Přesnost mezi šaržemi Variační koeficient (%) Přesnost mezi použitými přístroji Průměr (AU/ml)) Variační koeficient (%) ,1 4,6 15,1 1,7 6 21,6 5,7 21,6 3, ,8 25 4,3 8 28,9 7,7 28,6 2,6 9 43,9 3,5 43,9 1, ,4 1,5 53, Literatura 1. Dietrich W et al : 81997) Nat. Med Holtmeier W and Caspary WF (1998) Z. Gastroenterol. 36: Caspary WF, Holtmeier W (1999) Deutches Arzteblatt 96 (36):A Catassi C. et al (1994) Lancet 343: /12 Rif. IO-09/271; IFU Ed

12 16 Vysvětlení symbolů Datum výroby Použít do data Nepoužívat opakovaně Čtěte přiložené dokumenty Výrobce Počet testů Skladovací teplota Čtěte návod k použití Biologická rizika Katalogové číslo Diagnostický zdravotnický prostředek in vitro Číslo šarže Diesse Diagnostica Senese Via delle Rose Monteriggioni (Siena) Italy Tel /12 Rif. IO-09/271; IFU Ed