MENDELOVA ZEMĚDĚLSKÁ A LESNICKÁ UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA

Transkript

1 MENDELOVA ZEMĚDĚLSKÁ A LESNICKÁ UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA DISERTAČNÍ PRÁCE BRNO 2009 ING. NATÁLIE BŘEZINOVÁ BELCREDI

2 MENDELOVA ZEMĚDĚLSKÁ A LESNICKÁ UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA Ústav pěstování, šlechtění rostlin a rostlinolékařství Doktorská disertační práce Variabilita vybraných antioxidantů v zrnu ječmene jarního Ing. Natálie Březinová Belcredi Školitel: Prof. Ing. Jaroslava Ehrenbergerová, CSc. Doktorský studijní program: Fytotechnika Studijní obor: Speciální produkce rostlinná Brno 2009

3 Prohlášení: Prohlašuji, že jsem disertační práci na téma: Variabilita vybraných antioxidantů v zrnu ječmene jarního vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém soupisu literatury. Souhlasím, aby práce byla uložena v knihovně Mendelovy zemědělské a lesnické univerzity v Brně a byla zpřístupněna studijním účelům. V Brně, dne

4 Děkuji Prof. Ing. Jaroslavě Ehrenbergerové, CSc. za odborné vedení, všestrannou pomoc a cenné rady, které mi při zpracování disertační práce poskytovala. Současně děkuji všem kolegům na Ústavu pěstování, šlechtění rostlin a rostlinolékařství, kteří jakýmkoliv způsobem přispěli ke zdárnému dokončení této práce. Rovněž bych chtěla poděkovat RNDr. Pavle Havlové a RNDr. Jaroslavu Prýmovi za uvedení do problematiky, jejich odborné rady a také děkuji pracovníkům Sladařského ústavu v Brně, VÚPS, a.s. za možnost provedení chemických rozborů v jejich laboratořích. Děkuji Ing. Jiřímu Čuperovi, Ph.D. za technickou pomoc při psaní disertační práce. Vypracování disertační práce bylo podpořeno těmito grantovými projekty: FRVŠ 420/2005 a MŠMT VC 1M0570.

5 Anotace ANOTACE Analýzy aktivity vitamínu E, jeho izomerů a aktivity enzymu superoxiddismutasy (SOD) byly provedeny ve vzorcích zrna ječmene jarního z polního pokusu s individuálně pěstovanými rostlinami ( ) a ve směsnými (bulk) vzorcích zrna a sladu z maloparcelního pokusu (2004), který byl veden ve dvou systémech pěstování. Oba polní pokusy byly založeny na Školním zemědělském podniku MZLU v Žabčicích. Dále byly vytvořeny nové hybridy a v raných filiálních generacích (F 3 ) u nich byl rovněž stanoven vitamín E a SOD. Vitamín E byl stanoven ve vyextrahovaném nezmýdelněném podílu vzorku metodou HPLC s fluorescenční detekcí. Aktivita SOD byla stanovena pomocí modifikované metodiky diagnostickým setem Ransod (RANDOX). Nejvyšší aktivita vitamínu E, obsah celkových tokolů a α-izomerů byly zjištěny u zrna linií Kompakt x Wabet a Wabet x Washonubet z obou polních pokusů. Vyšší aktivita vitamínu E a obsah jednotlivých izomerů byl zjištěn v zrnu ječmene oproti sladu. Během mikrosladovcí zkoušky došlo ke statisticky významnému poklesu tokolů v zrnu ječmene a největší pokles byl zaznamenán u odrůd Tolar a Annabell. Systémy pěstování neměly významný vliv na hladinu vitamínu E ve sladu a zrnu ječmene s výjimkou δ-izomerů. Nejvyšší aktivita SOD byla stanovena u zrna linie Krona x Kompakt a Kompakt x Wabet v obou polních pokusech. Průměrná aktivita SOD byla statisticky významně vyšší ve sladu oproti zrnu. Systémy pěstování měly statisticky významný vliv na stanovovanou aktivitu SOD, ale rozdíl průměrných hodnot variant ošetření nebyl z praktického hlediska velký (5 U.g -1 ). U nově vytvořených hybridů v raně filiálních generací nedošlo ke statisticky významnému zvýšení aktivity vitamínu E, celkových tokolů, tokoferolů, tokotrienolů ani aktivity enzymu SOD oproti rodičovským odrůdám.

6 Obsah OBSAH 1 ÚVOD LITERÁRNÍ REŠERŠE BOTANICKÁ TAXONOMIE HISTORIE A SOUČASNOST PĚSTOVÁNÍ JEČMENE ŠLECHTĚNÍ JEČMENE UŽITKOVÉ SMĚRY JEČMENE PĚSTOVÁNÍ JEČMENE, ZDRAVOTNÍ ASPEKTY A JEHO VYUŽITÍ V POTRAVINÁŘSTVÍ Zdravotní aspekty konzumace a výrobků z ječmene Potravinářské využití ječmene ve světě Potravinářské využití ječmene v České republice LÁTKY ANTIOXIDAČNÍ POVAHY VYSKYTUJÍCÍ SE U OBILNIN Antioxidační ochrana organismu Vznik a působení volných kyslíkových radikálů Oxidační stres Vitamín E Historie objevení vitamínu E Struktura a nomenklatura vitamínu E Vyjádření aktivity vitamínu E používané jednotky Biochemie vitamínu E a jeho vliv na zdravotní stav člověka Antioxidanční vlastnosti vitamínu E Doporučený příjem a onemocnění způsobená nedostatkem vitamínu E Účinky vitamínu E v klinických studiích Přírodní zdroje vitaminu E a jeho izomerů Zastoupení vitamínu E v zrnu ječmene Vliv potravinářského zpracování na obsah vitamínu E Enzym superoxiddismutasa (SOD, E.C ) Funkce enzymu superoxiddismutasy Kyslíkové radikály a reaktivní formy kyslíku vyskytující se v reakci s enzymem superoxiddismutasou Chemická struktura enzymu superoxiddismutasy Metody používané při stanovení volných radikálů a enzymu SOD Výskyt enzymu superoxiddismutasy Enzym superoxiddismutasa v zrnu ječmene CÍL PRÁCE MATERIÁL A METODIKA CHARAKTERISTIKA POKUSNÉ LOKALITY A METODIKA PĚSTOVÁNÍ POLNÍCH POKUSŮ Charakteristika lokality Žabčice Pokusný rok

7 Obsah Pokusný rok Pokusný rok Metodika polních pokusů Pokus s individuálně pěstovanými rostlinami Maloparcelní pokus se směsnými vzorky (bulk) rostlin STRUŠNÁ CHARAKTERISTIKA ODRŮD A LINIÍ JEČMENE JARNÍHO Sladovnické odrůdy - donory vysoké výnosové úrovně Donory zvýšeného obsahu vitamínu E a β-glukanů Linie z křížením donorů zvýšeného obsahu vitamínu E a donorů vysoké výnosové úrovně Bezpluché KM linie METODIKA STANOVENÍ VITAMÍNU E A JEHO IZOMERŮ Přístroje a zařízení Chemikálie Pracovní postup Zmýdelnění Extrakce Stanovení pomocí HPLC METODIKA STANOVENÍ ENZYMU SUPEROXIDDISMUTASY Přístroje a zařízení Chemikálie a jejich příprava Pracovní postup Příprava vzorků zrna ječmene/sladu Měření absorbance Výpočet aktivity SOD Validace metodiky stanovení superoxiddismutasy v zrnu ječmene Kalibrační křivka Linearita a citlivost Opakovatelnost METODIKA ZPRACOVÁNÍ EXPERIMENTÁLNÍCH VÝSLEDKŮ VÝSLEDKY POKUSY S INDIVIDUÁLNĚ PĚSTOVANÝMI ROSTLINAMI Vyhodnocení variability aktivity vitamínu E a obsah jeho izomerů v zrnu odrůd/linií jarního ječmene ( ) Hodnocení aktivity vitamínu E v zrnu odrůd/linií ječmene Obsah celkových tokolů v zrnu odrůd/linií ječmene Obsah α-tokoferolu v zrnu odrůd/linií ječmene Obsah β+γ-tokoferolu v zrnu odrůd/linií ječmene Obsah δ-tokoferolu v zrnu odrůd/linií ječmene Obsah α-tokotrienolu v zrnu odrůd/linií ječmene Obsah β+γ-tokotrienolu v zrnu odrůd/linií ječmene Obsah δ-tokotrienolu v zrnu odrůd/linií ječmene Vliv roků na aktivitu vitamínu E a obsah jeho izomerů v zrnu ječmene Shrnutí výsledků aktivity vitamínu E a obsahu jeho izomerů... 70

8 Obsah Hodnocení variability aktivity enzymu superoxiddismutasy v zrnu odrůd/linií Hodnocení vztahů studovaných antioxidačních látek v zrnu odrůd/linií ječmene jarního Obsah tokolů ve vztahu k výnosotvorným prvkům VYHODNOCENÍ A POROVNÁNÍ VARIABILITY VYBRANÝCH ANTIOXIDANTŮ Z MALOPARCELNÍHO POKUSU (2004) Vyhodnocení aktivity vitamínu E a jeho izomerů ve sladu a zrnu odrůd/linií Aktivita vitamínu E Obsah celkových tokolů Obsah α-tokoferolu Obsah β+γ-tokoferolu Obsah δ-tokoferolu Obsah α-tokotrienolu Obsah β+γ-tokotrienolu Obsah δ-tokotrienolu Vyhodnocení aktivity enzymu superoxiddismutasy ve sladu a zrnu odrůd/linií Aktivita superoxiddismutasy v zrnu ječmene Aktivita superoxiddismutasy ve sladu HYBRIDY RANÝCH FILIÁLNÍCH GENERACÍ DISKUSE...88 VITAMÍN E...88 SUPEROXIDDISMUTASA (SOD) ZÁVĚR LITERATURA PŘÍLOHY SUMMARY

9 Seznam zkratek SEZNAM ZKRATEK ATBC Alpha-Tocopherol, Beta-Carotene Cancer Prevention Trial CHAOS Cambridge Heart Antioxidant Study FDA Food and Drug Administration Správa pro potraviny a léky GISSI Gruppo Italiano per lo Studio della Sopravvivenza nell Infarto miocardico; GSH Gluthation redukovaný HOPE Heart Outcomes Prevention Evaluation; HPS Heart Protection Study HTS Hmotnost tisíce semen IU Mezinárodní jednotky vitamínu E KM linie Linie vyšlechtěné v Zemědělském výzkumném ústavu Kroměříž, s.r.o. Ko Kompakt Kr Krona LDF Langův dešťový faktor LDL Light density lipoprotein PPP Primary Prevention Project PUFA Polynenasycené mastné kyseliny (polyunsaturated fatty acids) ROS Reaktivní druhy kyslík (reactive oxygen species) SOD Superoxiddismutasa ŠZP Školní zemědělský podnik T Tokoferol T3 Tokotrienol U Mezinárodní jednotka USJ Ukazatel sladovnické jakosti USP United States Pharmoacopoeia Svaz lékáren Spojených států VÚPS Výzkumný ústav pivovarský a sladařský, a.s. Wb Wabet Wnb Wanubet Wsnb Washonubet WHO World Health Organization -Světová zdravotnická organizace ZVÚ Zemědělský výzkumný ústav Kroměříž, s.r.o.

10 Seznam tabulek SEZNAM TABULEK a jejich umístění v disertační práci Tab. 1 v textu Klinické studie s vitamínem E a efekt léčby na výskyt koronárních příhod Tab. 2 v textu Použité odrůdy a linie z pokusu individuálně pěstovaných rostlin a maloparcelním pokusu se směsnými vzorky rostlin Tab. 3 v textu Seznam linií a použitých zkratek Tab. 4 v textu Podmínky pro stanovení superoxiddismutasy Tab. 5 v textu Složení soupravy Ransod Tab. 6 v textu Ředění standardu k sestrojení kalibrační křivky Tab. 7 Tab. 8 Tab. 9a Tab. 9b Tab. 10 Tab. 11 Tab. 12 Tab. 13 Tab. 14 v příloze Analýza variance pro aktivitu vitamínu E a obsah jeho izomerů souhrnně za roky ( ) v příloze Analýza variance pro aktivitu vitamínu E a obsah jeho izomerů v jednotlivých letech (2004, 2005 a 2006) v příloze Průměrná aktivita vitamínu E, obsah celkových tokolů a jednotlivých tokoferolů (mg.kg -1 ) v zrnu ječmene odrůd/linií se směrodatnými odchylkami ( ) v příloze Průměrný obsah jednotlivých tokotrienolů (mg.kg -1 ) v zrnu ječmene odrůd/linií se směrodatnými odchylkami ( ) v příloze Průměrná aktivita vitamínu E, obsah celkových tokolů a jednotlivých izomerů (mg.kg -1 ) v zrnu ječmene odrůd/linií v roce 2004 v příloze Průměrná aktivita vitamínu E, obsah celkových tokolů a jednotlivých izomerů (mg.kg -1 ) v zrnu ječmene odrůd/linií v roce 2005 v příloze Průměrná aktivita vitamínu E, obsah celkových tokolů a jednotlivých izomerů (mg.kg -1 ) v zrnu ječmene odrůd/linií v roce 2006 v příloze Průměrná aktivita vitamínu E, obsah tokolů a jednotlivých izomerů (mg.kg -1 ) v zrnu ječmene za sledované roky ( ) v příloze Porovnání variancí F-testem

11 Seznam tabulek Tab. 15 v textu Analýza variance a komponenty rozptylu pro enzym superoxiddismutasu v zrnu ječmene ( ) Tab. 16 v textu Analýza variance pro enzym superoxiddismutasu v zrnu ječmene Tab. 17 v příloze Průměrná aktivita enzymu superoxiddismutasy v zrnu ječmene v letech Tab. 18 v textu Průměrná aktivita enzymu superoxiddismutasy zrna ječmene za sledované tříleté období ( ) Tab. 19 v příloze Korelační koeficienty pro vztahy mezi sledovanými antioxidanty v zrnu odrůd/linií ječmene v letech (n = 114) Tab. 20 v příloze Výnosová charakteristika individuálně pěstovaných odrůd/linií ječmene jarního Tab. 21 Tab. 22 Tab. 23 Tab. 24 Tab. 25 Tab. 26 Tab. 27 v příloze Analýza variance aktivity vitamínu E a obsahů jednotlivých izomerů vitamínu E v zrnu a sladu z odlišných systémů pěstování v příloze Analýza variance aktivity vitamínu E, jednotlivých izomerů v zrnu ječmene jarního z odlišných systémů pěstování v příloze Mnohonásobné porovnání průměrné aktivity vitamínu E, obsahu celkových tokolů a izomerů vitamínu E (mg.kg -1 ) v chemicky ošetřených a neošetřených vzorcích sladu a zrnu odrůd/linií ječmene v příloze Mnohonásobné porovnání průměrné aktivity vitamínu E, obsah celkových tokolů a izomerů vitamínu E (mg.kg -1 ) u odrůd/linií sladu a zrna ječmene v příloze Průměrné hodnoty aktivity vitamínu E, obsahu celkových tokolů a izomerů vitamínu E (mg.kg -1 ) v zrnu ječmene z odlišných systémů pěstování v příloze Průměrné hodnoty aktivity vitamínu E, obsahu celkových tokolů a izomerů vitamínu E (mg.kg -1 ) ve sladu ječmene z odlišných systémů pěstování v příloze Porovnání variancí F-testem Tab. 28 v textu Analýza variance aktivity enzymu superoxiddismutasy v zrnu a sladu

12 Seznam tabulek Tab. 29 v příloze Průměrné hodnoty se směrodatnými odchylkami aktivity superoxiddismutasy (U.g -1 ) v zrnu a sladu odrůd/linií z odlišných systémů pěstování v roce 2004 Tab. 30 v příloze Analýza variance pro aktivitu vitamínu E a obsah jeho izomerů (2006) Tab. 31 v příloze Průměrná aktivita vitamínu E, obsah jeho izomerů (mg.kg -1 ) a SOD (U.g -1 ) v zrnu hybridů/linií/odrůd v roce 2006 Tab. 32 v textu Srovnání průměrných hodnot obsahu celkových tokolů a izomerů vitamínu E v zrnu/sladu ječmene popsaných v disertační práci s hodnotami uvedenými v literárních zdrojích

13 Seznam grafů a obrázků SEZNAM GRAFŮ A OBRÁZKŮ Graf 1 Graf 2 Graf 3 Graf 4 Graf 5 Graf 6 Graf 7 Graf 8 Graf 9 Graf 10 Graf 11 Graf 12 Modelový chromatogram Chromatogram sladovnické odrůdy Amulet Kalibrační křivka Porovnání průměrné aktivity vitamínu E u linií a jejich rodičovských odrůd Porovnání průměrného obsahu celkových tokolů u linií a jejich rodičovských odrůd Porovnání průměrného obsahu α-tokoferolu u linií a jejich rodičovských odrůd Porovnání průměrného obsahu β+γ-tokoferolu u linií a jejich rodičovských odrůd Porovnání průměrného obsahu δ-tokoferolu u linií a jejich rodičovských odrůd Porovnání průměrného obsahu α-tokotrienolu u linií a jejich rodičovských odrůd Porovnání průměrného obsahu β+γ-tokotrienolu u linií a jejich rodičovských odrůd Porovnání průměrného obsahu δ-tokotrienolu u linií a jejich rodičovských odrůd Průměrný procentický podíl jednotlivých tokoferolů (T) a tokotrienolů (T3) u sledovaných odrůd/linií ječmene Graf 13 Průběh vybraných povětrnostních prvků ve vegetačním období let a jeho vztah k aktivitě vitamínu E Graf 14 Graf 15 Graf 16 Komponenty rozptylu pro aktivitu vitamínu E a obsah celkových tokolů (procentuální vyjádření proměnlivosti odrůd/linií způsobené danými faktoryrok, interakce odrůdy/linie s roky) Komponenty rozptylu pro majoritní izomery α-tokoferol a α-tokotrienol Porovnání průměrné aktivity superoxiddismutasy u linií a jejich rodičovských odrůd ( )

14 Seznam grafů a obrázků Graf 17 Průběh vybraných povětrnostních prvků ve vegetačním období let a jeho vztah k aktivitě SOD Graf 18 Graf 19 Graf 20 Srovnání výnosu zrna s výnosem celkových tokolů na rostlinu u odrůd/linií Srovnání HTS s výnosem cekových tokolů na 1000 semen u odrůd/linií Průměrná aktivita enzymu superoxiddismutasy v zrnu a sladu a porovnání aktivit enzymu superoxiddismutasy zrna a sladu u odlišných systémů pěstování Obr. 1 Obr. 2 Obr. 3 Chemická struktura tokoferolu Chemická struktura tokotrienolu RRR-α-tokoferol = (2R 4 R 8 R) -α-tokoferol Obr. 4 Umístění vitamínu E v buněčné membráně (PAPAS, 1999) Obr. 5 Vznik tokoferoxylového radikálu (T-O ) Obr. 6 Regenerace vitamínu E kyselinou askorbovou (EITENMILLER a LEE, 2004) Obr. 7 Křivka ve tvaru U pro α-tokoferol (PAPAS, 2001) Obr. 8 Obr. 9 Obr. 10 Obr. 11 Pokus s individuálně pěstovanými rostlinami Maloparcelní polní pokus Pluchaté zrno (odrůda Tolar) Bezpluché zrno (linie KM1057)

15 ÚVOD 1 ÚVOD Obiloviny patří mezi nejstarší, nejdůležitější základní potravu člověka. Obilné zrno je významným zdrojem energie, bílkovin, vlákniny, minerálů, vitamínů a dalších chemických látek jako jsou kyselina fenolová, fytová, lignany a fytoestrogeny (PANFILI et al., 2008; SIEBENHANDL et al., 2007; CHOI et al., 2006). Slovo obilnina pochází ze slova Ceres, což je jméno římské bohyně sklizně a zemědělství. Počátek zájmu o obiloviny ve vztahu ke zdraví je doložen už z 5. století př.n.l. z Hippokratova doporučení celozrnný chléb má příznivý vliv na činnost střev (KALAČ, 2003), a nebo výrok významné osobnosti evropské vědy Justuse von Liebiga v jeho chemických listech z roku 1878: odstraňování pluch z obilných mouk je vlastně věcí luxusu, pro výživu člověka spíše škodou než prospěchem. Odhaduje se, že u průměrného středoevropského obyvatele pokrývají obiloviny potřebu hlavních výživových složek asi takto: % energetické spotřeby, 55 % sacharidů, až 40 % bílkovin, 10 % tuků, až 25 % železa, 15 % vápníku, 30 % vitamínu B 1, 15 % vitamínu B 2 a 25 % fosforu. Úloha obilovin se ovšem neomezuje pouze na výživu lidí (asi jedna čtvrtina), ale kolem 70 % sklizeného obilí se zkrmuje a zbytek je určen jako osivo a k jiným účelům. Lze říci, že obiloviny mají mezi ostatními zemědělskými produkty výsadní postavení, protože jsou velmi dobře skladovatelné, nepodléhají sezónním výkyvům nabídky a poptávky a nejsou tolik kontaminovány cizorodými látkami z ovzduší nebo reziduí z agrochemikálií. Riziko vzniklé kontaminace se navíc snižuje při mlýnském zpracování, kde se z větší části odstraňují povrchové vrstvy (PRUGAR, 2002). Úroveň spotřeby obilovin se mnohdy uvádí jako měřítko hospodářské vyspělosti a životní úrovně země. Čím je spotřeba vyšší, tím je životní úroveň horší. Po dlouhou dobu bylo bílé pšeničné pečivo ukazatelem zvyšující se ekonomické úrovně spotřebitelů, až nárůst civilizačních onemocnění způsobených nevhodnými stravovacími návyky a zjištění, že v rozvojových zemích byl nižší výskyt kardiovaskulárních onemocnění oproti zemím vyspělým, přiměl konzumenty k zamyšlení, aby diferencovali mezi vizuálně atraktivními pekařskými výrobky a tmavšími celozrnnými výrobky. Koncem 20. století byl ve vyspělých zemích znovuobjeven ječmen pro jeho zdravotně pozitivní účinky a byl opět zařazen ve vyspělých státech Evropy mezi perspektivní suroviny pro výrobu potravin 1

16 ÚVOD se zdravotně preventivním účinkem, narozdíl od rozvojových zemí Afriky, kde je používám ječmen jako hlavní obilovina pro přípravu každodenních pokrmů. V roce 1991 bylo v Evropské unii (12 států) využití ječmene jako potraviny v lidské dietě o 0,3 % nižší oproti Spojeným státům americkým (1,5 %) (NEWMAN a NEWMAN, 2006). Dnes víme, že obilné zrno obsahuje některé polysacharidy, které nejsou prázdným donorem kalorií, ale označujeme je pod pojmem vláknina (VACULOVÁ, 1999a; PRUGAR, 2002). Pozitivní vliv vláknině přisoudili již angličtí lékaři Trowell, Burkitt, Walker a Painter v 70. letech 20. století, kteří zjistili, že příznivě ovlivňuje fyziologické funkce trávicí soustavy (DEVRIES et al., 1999). Od této doby byla vyrobena celá řada vlákninových koncentrátů, které lze přidávat do potravinových výrobků. Kromě polysacharidů obsahuje obilné zrno také důležité chemické látky s antioxidačními účinky. Pozornost vědců je směřována na fytoestrogeny (lignany), tokoly, fenolické kyseliny, enzymy aj. V současné době se ve světě vyrábí mnoho funkčních potravin na bázi obilovin, ale vláknina bývá většinou nahrazována např. inulinem z čekanky nebo rezistentním škrobem. V málokterém potravinářském odvětví lze vyrobit tak pestrý sortiment výrobků jako je tomu právě u obilovin, a to hlavně díky zachování si vlastní identity jednotlivých lokalit jak v České republice tak na celém světě. Díky této originalitě můžeme jenom v Evropě nasčítat na tisíce druhů chleba a různého pečiva. Různorodost výrobků spočívá nejen ve využití různých surovin, ale také na použitých technologických postupech, které se mnohdy dědily z generace na generaci. 2

17 LITERÁRNÍ REŠERŠE 2 LITERÁRNÍ REŠERŠE 2.1 Botanická taxonomie Ječmen (Hordeum L.), je taxonomicky zařazen do botanické třídy Liliopsida (jednoděložné), řádu Poales (lipnicotvaré), čeledi Poaceae (lipnicovité), rodu Hordeum L. náležící ke skupině Triticeae, která sdružuje celkem asi 350 druhů a dále se dělí do dvou skupin na Hordeum sensu stricto (H. vulgare a H. bulbosum) a Critesion Raf. zahrnující všechny ostatní druhy (32) a taxy (celkem 42) (VACULOVÁ, 2006a). Podle počtu chromozomů (n = 7) se rozdělují na diploidní, tetraploidní a hexaploidní. K opylování u ječmene dochází v uzavřených kvítcích, čímž dochází k silnému samosprášení (hlavně u dvouřadých forem). U víceřadých forem může dojít k částečnému cizosprášení (4 %), neboť u nich nejprve kvete střední kvítek a pak kvítky postranní, které mají větší sklon k otevřenému kvetení (ŘEPKOVÁ a RELICHOVÁ, 2001). Rod Hordeum zahrnuje 30 druhů planých ječmenů (H. spontaneum C. Koch) a jeden druh kulturní - ječmen setý (Hordeum vulgare L.) (CAVALLERO et al., 2003, NEWMAN a NEWMAN, 2008). Planý druh ječmene byl popsán Kochem v roce V současné době jsou dvě teorie o původu a rozšíření kulturního ječmene. První teorie hovoří o tom, že H. spontaneum je prarodičem dvouřadého a víceřadého ječmene. Zastánci druhé teorie jsou přesvědčeni, že H. spontaneum jako planý druh má vztah pouze k dvouřadým formám kulturního ječmene a otázka předchůdce šestiřadých forem zůstává nevyřešena (KOSAŘ a kol., 2000). H. spontaneum a H. vulgare jsou morfologicky podobné. K ječmeni setému se řadí všechny pěstované ječmeny (ZIMOLKA, 2006). 3

18 LITERÁRNÍ REŠERŠE 2.2 Historie a současnost pěstování ječmene První pozůstatky planého ječmene byly nalezeny v pozdním paleolitu, zhruba let př. n. l. v oblasti Babylónie a Egypta, kde se v úrodném nilském údolí osadníci z doby kamenné změnili postupně z lovců na zemědělce a začali pěstovat ječmen a pšenici (BERANOVÁ, 2005; HOLDING et al., 2000). Jejich pěstování se v př. n. l. v Asii omezovalo na pahorky ležící v okolí Mezopotámie a během dvou tisíc let se rozšířilo až do oblasti ležících jihovýchodně od Kaspického moře a západně od Indu. Kolem př. n. l. se zemědělství dostalo do Evropy a do celého povodí řeky Indus (ROAF, 1998). Ječmen byl pěstován až do roku př. n. l., kdy došlo k náhlé změně, a víceřadý ječmen byl vystřídán ječmenem dvouřadým. Ječmen byl znám od počátku zemědělství, ale ve střední Evropě neměl dříve velký význam a rozšířil se zejména v pozdní době kamenné a době bronzové. Lidé znali jeho různé formy, jak pluchaté tak nahé. Pluchatý ječmen se opracovával ve stoupách, ale nejstarším nástrojem bylo drtidlo. Od 5. stol. př. n. l. se rozšiřovaly mlýnky (BERANOVÁ, 2005). Lidé používali pravděpodobně i pluhy vláčené tažnými zvířaty a znali způsoby umělého zavlažování (ROAF, 1998). Ječmen byl používán jako potravina, průmyslová surovina a krmivo. Na výrobu chleba se používal v zemích, kde se nedařilo jiným obilninám, hlavně na dalekém severu a v hornatých krajinách Tibetu. Počátek pěstování ječmene v Číně, Tibetu, Japonsku a Indii je datován do tisíciletí př. n. l. V Tibetu se potrava skládala ze dvou základních prvků, tsamby a čaje z jačího mléka. Tsamba byly ploché koláče vyrobené z mouky praženého ječmene, které se namáčely do čaje. Na americkém kontinentě patří kulturní ječmen k poměrně mladým plodinám, přivezeným Kolumbem v roce 1494 z jeho druhé plavby (NEWMAN a NEWMAN, 2006), zatímco do Austrálie byl introdukován až koncem 18. století (VACULOVÁ, 1999a). Ve starověkém Řecku hnětli placky z ječné mouky a jedli je sušené, nazývaly se máza. Bylo to obvyklé jídlo obyčejných lidí. Připravovaly se do zásoby a před použitím se vlhčily vodou. Sumerové placky pekli ve speciálních pecích, ve žhavém popelu anebo na rozpáleném kameni. Placky se staly základem budoucího kvašeného chleba. Kromě placek se z opraženého mletého ječmene vařila kaše nazývaná polenta. Tento název pro slanou kaši z mouky se udržel v Čechách až do 18. stol. a až později přešel na kaši 4

19 LITERÁRNÍ REŠERŠE z kukuřice. Kaše, nazývaná pražmo či pražma, se vařila i z nezralého zrna v tzv. mléčné zralosti. Zrno se pražilo již ve starém Egyptě, aby se stalo stravitelnějším. Egypťané dávali pražený ječmen mrtvým na cestu, zatímco Řekové brávali ječmen jako zásobu na cesty za živa (BERANOVÁ, 2005). První zmínky o využití ječmene na výrobu piva jsou ze 7. tisíciletí př. n. l. z oblasti Předního východu, ale o pivu se dozvídáme již ze sumerské mytologie. V 7. tisíciletí př. n. l. se údajně podařilo vyšlechtit z divoce rostoucího ječmene ječmen dvouřadý. Doklady základu klínopisného znaku pro pivo jsou starší než sumerština. Základem pro pivo byl ječný slad. Zrno se nechávalo vyklíčit buď přímo na poli, nebo ve větších pivovarech ve zvláštních nádobách s průduchy. Rozprostřené zrno bylo přikryto slabou vrstvou hlíny a vlhčeno. Po naklíčení byl slad prudce usušen na slunci. Při vaření byl do sumerského piva místo chmele přidáván "pivní chléb". Byl z ječné mouky s přídavkem koření, které dodnes neznáme (BERANOVÁ, 2005; NEWMAN a NEWMAN, 2006). Pivo bylo známo již v Malé Asii, v Trácii i jinde a také Xenofón uvádí, že v Arménii měli nádoby s pivem vyrobeným z ječmene (BERANOVÁ, 2005). Koncem 3. tisíciletí př. n. l. bylo v Mezopotámii známo mnoho druhů piva lišících se od sebe obsahem alkoholu a barvou. Nápoj nebyl čirý, obsahoval příměsi a plovoucí ječmen. Z tohoto důvodu se pilo brčkem (obilným stéblem) (BERANOVÁ, 2005). Také Římané znali pivo, ale výraznou přednost dávali vínu. Plinius se zmiňuje o domácí přípravě piva z ječmene ve Španělsku a v Galii. Tacitus vypráví o obilném pivu, které bylo oblíbeným nápojem Germánů. V Čechách první písemně doloženou zprávu o pěstování ječmene podal židovskoarabský obchodník a cestovatel Ibrahím ibn Jákúb v roce 973. Na Moravě byla první zmínka z roku 1227 v Hrádku u Znojma. Ječmen se používal na výrobu krup, v dobách nouze i na chléb a jen jako vedlejší surovina na vaření piva červeného oproti obvyklému pivu bílému pšeničnému (KOSAŘ a kol., 2000). Z piva se ve středověku také vařilo jídlo nebo se do jídel přidávalo. Rozšířená byla zejména pivní polévka a vyráběl se i ocet z piva (BERANOVÁ, 2005). Prvním dochovaným dokladem o výrobě piva v roce 1088 byla nadační listina vydána prvním českým králem Vratislavem II., ve které přidělil kapitule na Vyšehradě desátek chmele na vaření piva (BASAŘOVÁ, 1999). Podle Tadeáše Hájka z Hájku se ječmen ve sladovnictví v 16. století využíval jen velice zřídka a termín sladovnický ječmen se u nás vžil až ve 40. letech 19. stol. (NĚMEJC, 2001). V 17. stol. se rozšiřovalo sladování ječmene místo pšenice, což mělo za následek rozmach výstavby sladoven. Teprve během 19. století se rozvinula 5

20 LITERÁRNÍ REŠERŠE hospodářská chemie, která alespoň částečně objasnila pochody nastávající v zrnu při sladování (HÁJEK et al., 2006). V současné době je ječmen čtvrtou nejrozšířenější obilninou na světě po pšenici, rýži a kukuřici a pokrývá téměř 30 % z celosvětové obilné produkce (MAHDI et al., 2008). Ječmen se pěstuje na severní i jižní polokouli, v celé Evropě, od poloviny Jižní Ameriky po arktické oblasti Severní Ameriky a střední Asie, od přímořských lokalit až do 4500 metrů nadmořské výšky v Andách a Himalájích (VACULOVÁ, 1999a, 1999b; TASHI, 2005). Nejvíce ječmene (62 %) se pěstuje v Evropě a to díky vhodným klimatickým podmínkám, pěstitelské tradici a tradici výroby piva. Nevhodné pro pěstování jsou suché a teplé oblasti jižní Evropy a studené oblasti severní Evropy. Příznivé podmínky pro pěstování jsou v Rakousku, Francii, Německu, SR a ČR (ČERNÝ a kol., 2007). Celosvětově se v roce 2008 vyrobilo celkem 153 mil. tun ječmene na výměře 57,3 mil. ha s průměrným výnosem 4,5 t.ha -1 zrna. Pro sladovnické účely se využije asi 20 % z produkce zrna ječmene a cca 10 % se použije na jiné potravinářské účely. EU se na celosvětové produkci ječmene podílí 42 % a mezi další významné producenty patří Ruská federace (12 %), Kanada (8,2 %), Austrálie (6,5 %), Turecko (5,3 %) a Ukrajina (4,5 %). Z celosvětové produkce ječmene se v roce 2007 exportovalo 15,6 mil. tun zrna (11,2 %). Největšími exportéry ječmene jsou Austrálie, Francie, Kanada, následuje Německo, Dánsko, Velká Británie a Ruská federace (FAOSTAT, SITUAČNÍ A VÝHLEDOVÁ ZPRÁVA 2008). Také v těchto zemích se zrno ječmene využívá ze % ke krmným účelům a 15 % produkce se použije na výrobu sladu, alkoholických nápojů, škrobu, v chemickém průmyslu a pouze 5 % pro výživu lidí (HOLDING et al., 2000; MAHDI et al., 2008). 2.3 Šlechtění ječmene První zemí, kde se začal šlechtit ječmen, byla Anglie. V roce 1819 vyšlechtil Chevalier odrůdu stejného jména výběrem z krajové odrůdy a stejným způsobem postupovali šlechtitelé v celé vyspělé Evropě (KOSAŘ a kol., 2000). Počátek šlechtění sladovnického ječmene v našich zemích je součástí hospodářskopolitických změn v habsburské monarchii v 19. stol. (RŮŽIČKA, 2004). Na našem území se pěstovaly staré krajové odrůdy až do roku Tyto ječmeny můžeme rozdělit 6

21 LITERÁRNÍ REŠERŠE na staročeský agroekotyp, starohanácký (staroveský typ, hrubčický, jarohněvický typ) a jihomoravský agroekotyp. Z nich se vyvinuly krajové odrůdy. Ve druhé polovině 19. století krajové odrůdy mizely a byly nahrazovány západoevropskými odrůdami, které se však v našich podmínkách neosvědčily a byly opět nahrazeny původními ječmeny. V roce 1884 vznikla jedna z nejvýznamnějších světových odrůd sladovnického ječmene, Proskowetz Haná Pedigree, vyšlechtěná individuálním výběrem Emanuela Proskowetze z hanácké krajové odrůdy v Kvasicích na Kroměřížsku (KOSAŘ a kol., 2000). Tato odrůda se vyznačovala vynikající sladařskou kvalitou, spolehlivostí výnosu zrna, ušlechtilým tvarem zrna. Odrůda se rozšířila v Rakousku, Německu, Polsku, Švédsku, Dánsku a dala vzniknout řadě odrůd a zůstala v pěstitelské praxi až do roku 1958 (RŮŽIČKA, 2004). Významnou odrůdou vyšlechtěnou v roce 1886 ve Slezsku byl Kneiflův ječmen, ze kterého vznikla druhá nejvýznamnější odrůda Opavský. V Čechách začal se šlechtěním Nolč v Horních Počernicích v roce V roce 1920 se přikročilo ke křížení československých odrůd se zahraničními. Významným mezníkem moderního ječmenářství bylo vyšlechtění odrůdy Valtický před 2. světovou válkou. Tato odrůda se začala rozšiřovat až po roce 1945 (KOSAŘ a kol., 2000). V roce 1965 docent Bouma mutagenezí vyšlechtil z odrůdy Valtický odrůdu Daimant, která se stala genetickým zdrojem pro vyšlechtění více než 100 domácích i zahraničních odrůd. Odrůdy tzv. diamantové řady vynikaly především vyšší úrovní znaků stabilizujících výnos (odolnost k poléhání a lámání stébla, odolnost k padlí travnímu, k hnědé skvrnitosti), ale i vyšším počtem klasů na jednotku plochy v důsledku vyššího efektivního odnožování a kratším stéblem. Další významnou odrůdou byla odrůda Forum, která se vyznačovala ještě kratším stéblem, vzpřímeným neháčkujícím klasem a rasově nespecifickou odolností k padlí, kódovanou genem mlo. Hlavním cílem šlechtění u sladovnických odrůd je adaptabilita a kvalita. Nesladovnické odrůdy se využívají především ke krmným účelům, a proto by měly vedle vyššího obsahu proteinů obsahovat i vyšší zastoupení esenciálních aminokyselin. Šlechtí se také bezpluché (nahé) odrůdy pro využití v potravinářství. Specifickými geny, které řídí některé vlastnosti ovlivňující kvalitu ječmene pro humánní účely je bezpluchost (nud), vysoký podíl amylózy (amo 1), vysoký podíl lyzinu (lys3a) a waxy, (wax) tj. voskovitý endosperm s vysokým podílem amylopektinu na úkor amylózy (CHLOUPEK, 2000; NEWMAN a NEWMAN, 2008). 7

22 LITERÁRNÍ REŠERŠE U standardních nonwaxy odrůd ječmene se škrob skládá z % amylosy a % amylopektinu, ačkoliv ječmen nejčastěji obsahuje amylopektin a amylosu v poměru 3:1. U waxy odrůd je zastoupení amylopektinu zvýšeno na %, nebo zvýšen obsah amylosy na % z celkového obsahu škrobu u vysoce amylosních genotypů a samozřejmě je zvýšen podíl neškrobových polysacharidů (β-glukanů a arabinoxylanů). Gen wax je lokalizován na chromozomu 1(7H) a waxy odrůdy byly nakříženy v Kanadě a Švédsku (NEWMAN a NEWMAN, 2008). V našich pěstebních podmínkách se waxy odrůdy vyznačují mnohými hospodářsky nepříznivými vlastnostmi (nízká produktivita, náchylnost k poléhání a houbovým chorobám aj.). Tvorbu nových materiálů ječmene s waxy charakterem endospermu urychluje využití molekulárních markerů (inzerčně-deleční polymorfismus ve waxy lokusu, stanovený pomocí PCR), detekující mutantní změny v expresi klíčového enzymu škrobového metabolismu granule-bound starch synthase I (GBSS I). Nakřížením odlišných donorů genu waxy a produktivních rodičovských odrůd je indukována variabilita, ve výnosu zrna i dalších morfologických a biologických znacích, která může být dále využita v procesu vývoje ječmenů s waxy charakterem škrobu, vhodných pro pěstování v našich půdně-klimatických podmínkách (VACULOVÁ et al., 2006). Bezpluchost u ječmene je kontrolována jedním recesivním genem nud (bezpluchost)/nud (pluchatost), který je lokalizován na chromozomu 1(7H) (NEWMAN a NEWMAN, 2008). Barva bezpluchých obilek je dána barvou obalových vrstev zrna (žluté, hnědě, červené, modré, černé) a v pěstování převládá jarní forma, která se svými nároky na agrotechniku neliší od běžně pěstovaných odrůd jarního ječmene (VACULOVÁ, 1999b). Bezpluché zrno má předpoklad pro nižší kontaminaci zrna emisemi, ale embryo je více náchylné k poškození při mlácení obilí (BHATTY, 1986; EHRENBERGEROVÁ a VACULOVÁ, 2006) a po výmlatu zůstává asi 20 % obilek v pluchách. Bezpluché materiály dosahují v optimálních podmínkách až 8 tun zrna z hektaru, v běžných pěstebních podmínkách můžeme považovat % výnosu oproti pluchatým odrůdám za úspěch. Nižší výnos je však kompenzován vyšším obsahem nutričně cenných látek (NĚMEJC, 2001). Tento typ ječmene má vyšší obsah proteinu a nižší obsah vlákniny ve srovnání s pluchatými odrůdami. Obsah sušiny, dusíku i aminokyselinové složení je stejné u obou typů ječmene (BHATTY, 1986). V České republice bylo šlechtění bezpluchých forem zahájeno v 70. letech 20. stol po detekci vysokolyzinové formy Hiproly, ale největšího rozmachu bylo dosaženo až na počátku 80. let u zahraničních biochemických a genetických výzkumů, kdy byly vytvářeny materiály především pro krmné účely (NĚMEJC, 2001). V České republice prozatím nejsou 8

23 LITERÁRNÍ REŠERŠE registrovány bezpluché odrůdy, ale očekává se registrace první bezpluché odrůdy AF Lucius v roce Jedná se o linii KM1910 (vyšlechtěna Ing. Kateřinou Vaculovou, CSc., ZVÚ Kroměříž). V Německu, Kanadě, Itálii, USA, Austrálii, Maroku i Tibetu jsou bezpluché odrůdy běžně využívány jako krmivo a pro výrobu potravin. Bezpluchý ječmen se hojně pěstuje i v hornatých oblastech světa. Odborné znalosti, nároky a starost o vlastní zdraví se v ČR neustále zvyšují. Také poznatky o benefitu konzumace obilovin s vysokým obsahem dietní vlákniny, tedy i ječmene, se stávají dostupnějšími. To umožňuje i našim šlechtitelům ječmene orientovat svou práci na vývoj nových forem s odlišným chemickým složením a morfologickou charakteristikou zrna. Navíc nové odrůdy ječmene pro přímé potravinářské využití by nebyly registrovány k pěstování jen v České republice, protože zařazením do evropského katalogu odrůd se stávají přístupnými pěstitelům v celé EU. Z bezpluchých odrůd ve světě pěstovaných lze uvést nedávno registrovanou odrůdu Sustagrain a Himalaya 292 (ANDERSSON et al., 2008) se zvýšeným obsahem celkové vlákniny (o 30 %) oproti běžným odrůdám (USA, 2005), odrůdu Barleymax TM s kombinovaným vysokým obsahem rozpustné i nerozpustné vlákniny potravy a rezistentního škrobu (Austrálie, 2005) a odrůdu Millhouse, která má zvýšený obsah vlákniny a vhodné vlastnosti zrna pro mletí na standardních mlecích válcích (USA, Kanada, 2006) (VACULOVÁ, 2007). 2.4 Užitkové směry ječmene Mnohostranné využití ječmene vyžaduje specifické nároky na parametry kvality a další vlastnosti. V současné době můžeme ječmen rozdělit podle užitkových směrů na dvě hlavní skupiny. Nelze však rozlišit jednotlivé podskupiny, neboť jediným kritériem je až samotné využití zrna (MCGREGOR et al., 1993; ZIMOLKA, 2006). Sladovnické: V České republice převládá pěstování jarní dvouřadé formy a z nich jsou preferovány odrůdy Jersey, Prestige, Malz, Sebastian nebo Tolar (KAKUTA, 2006). Za sladovnický ječmen se považují ty odrůdy, které v hodnocení ukazatelů sladovnické kvality (USJ, 0 9 bodů) dosáhly minimálně čtyři body. Výběr hodnocených znaků pro USJ byl proveden pivovarskými a sladařskými odborníky z České a Slovenské republiky v roce 1995 (PSOTA, 2006). Na prvním místě z hlavních 9

24 LITERÁRNÍ REŠERŠE kritérií jakosti je obsah dusíkatých látek (bílkovin) v zrnu ječmene, podíl předního zrna a obsah β-glukanů ve sladině. Dále se hodnotí extrakt v sušině sladu, relativní extrakt při 45 C, Kolbachovo číslo, diastatická mohutnost, dosažitelný stupeň prokvašení a friabilita sladu. Nově je zařazena čirost a opalescence sladiny. Sladovnická jakost je ovlivněna jednou třetinou geneticky (odrůdou) a ze dvou třetin podmínkami prostředí. Požadavky na sladovnický ječmen uvádí ČSN Krmné: v ČR se pěstují ozimé i jarní, dvouřadé i víceřadé formy, pluchaté s vysokým obsahem bílkovin, esenciálních aminokyselin škrobu a nižším obsahem β-glukanů. Z hlediska použití různých typů zde má ječmen nejvyšší uplatnění. V ČR se asi 75 % zrna ječmene využívá ke krmení hospodářských zvířat. K těmto potřebám by bylo ale dobré využívat produkci nesladovnického krmného ječmene vysocelyzinového typu, který má zvýšený obsah bílkovin, esenciálních aminokyselin a snížený obsah β-glukanů pro krmení monogastrů. Požadavky na krmný ječmen uvádí ČSN Průmyslové: ječmen nevyhovující sladovnické, potravinářské či krmné hodnoty je určen pro výrobu ethanolu, zejména whisky, detergentů, farmaceutických, kosmetických přípravků a pro získávání škrobu s drobnějšími zrny. U bezpluché formy ječmene byla prokázána vyšší energetická hodnota a vysoká extrakční schopnost. Pícninářské: uplatňují se odrůdy ranější v metání, málo odnožující, odolnější vůči poléhání. Ječmen je využíván jako krycí plodina pro výsev víceletých pícnin. Sklízí se v mléčně voskové zralosti a využívá se na senáž, sušení, granulování apod. Potravinářské: využívají se ječmeny se zvýšeným obsahem nutričně cenných látek (β-glukanů, dietní vlákniny, tokolů) pro rozšíření sortimentu potravin v prevenci civilizačních chorob tzn. funkčních potravin (příprava různých druhů pečiva, müsli, těstovin a pochutin). Zde se uplatňují odrůdy s obsahem β-glukanů nad 5 % a bezpluché waxy typy (amylóza < amylopektin). V České republice je první odrůda přihlášena k registraci (VACULOVÁ et al., 1996; VACULOVÁ, 2006b; ZIMOLKA a kol., 2006; NEWMAN a NEWMAN, 2008) 10

25 LITERÁRNÍ REŠERŠE 2.5 Pěstování ječmene, zdravotní aspekty a jeho využití v potravinářství Zdravotní aspekty konzumace a výrobků z ječmene Lékaři doporučují pacientům s kardiovaskulárním onemocněním konzumovat celozrnné výrobky bohaté na škrob, vlákninu, vitamíny a minerální látky. Dobrým příkladem zdravé diety je středomořská strava. Tato dieta obsahuje hodně ovoce, zeleniny, cereálií, cereálních výrobků, brambor, luštěnin a ořechů. Země kolem Středozemního moře mají nízký výskyt infarktu myokardu. Dalším příkladem vyvážené diety je tradiční východoasijská kuchyně (KAPESNÍ PRŮVODCE PREVENCÍ ISCHEMICKÉ CHOROBY SRDEČNÍ, 2003). Význam ječmene jako suroviny pro výrobu nutričně hodnotných zdravých potravin byl podpořen v květnu 2006, kdy byl ječmen zahrnut americkým Úřadem pro kontrolu potravin a léčiv (FDA) do kvalifikovaného zdravotního tvrzení, týkajícího se prevence kardiovaskulárních chorob (v důsledku vysokého obsahu potravinové vlákniny) (NEWMAN a NEWMAN, 2008). Výzkum nutričního složení zrna a řada klinických studií provedených ve světě prokazuje, že konzumace zrna ječmene je účinným prostředkem ke kontrole diabetu typu II, onemocnění trávicího traktu, narušené imunity organismu a dalších civilizačních chorob. Rozsáhlé epidemiologické studie provedené v nedávné době prokázaly, že pravidelná spotřeba celozrnných výrobků může snížit nebezpečí onemocnění srdce a krevního oběhu i některé druhy rakoviny a to až o 30 %. Ječmen je výborný zdroj potravinové vlákniny, zejména β-glukanů, obsahuje mnohé důležité vitaminy (vitamin E a celou skupinu B vitaminů, především niacin), minerálních látek (zejména Mg, Fe, Zn, aj.) a další významné fytonutrienty (fenolické látky, lignany, enzymy, apod.). Ječné zrno neobsahuje cholesterol a má nízký obsah tuku na rozdíl od ovsa (VACULOVÁ, 2007; KAPESNÍ PRŮVODCE PREVENCÍ ISCHEMICKÉ CHOROBY SRDEČNÍ, 2003). V doporučení FDA je uvedeno, že půl šálku vařeného zrna ječmene obsahuje méně než 0,5 g tuku a pouze 100 kalorií. Z pohledu vyššího podílu dietní vlákniny je pak vhodnější celé zrno (jeden šálek obsahuje 6 g vlákniny) než kroupy zbavené obalových vrstev (v tomto případě jeden šálek obsahuje pouze 3,5 g vlákniny). Z celkové dieteticky příznivé vlákniny (15 24 % z hmotnosti zrna) tvoří neškrobové polysacharidy asi 86 % a z toho je 56 % (1 3),(1 4) β-glukanů a 23 % arabinoxylanů. Podstatou příznivé 11

26 LITERÁRNÍ REŠERŠE dietetické funkce β-glukanů je komplex fyzikálně-chemických vlastností a jejich vliv na celou řadu pochodů lidského metabolismu. Dietní vláknina zvyšuje viskozitu obsahu žaludku a střev, zpomaluje promíchávání jejich obsahu, omezuje přístup pankreatických amyláz a lipáz k substrátům, a tím adsorpci živin. Konzumace potravin s vysokým obsahem vlákniny je doporučována pro modulaci hladiny glukosy v krevním séru při diabetu, snižuje hladinu cholesterolu v séru a je účinná v prevenci kardiovaskulárních onemocnění. Rezistentnímu škrobu v zrnu ječmene je připisován pozitivní účinek v prevenci karcinomu tlustého střeva (EHRENBERGEROVÁ, 2006). Koncem 90. let minulého století byl v zámoří patentován rozpustný vlákninový produkt Glucagel (75% β-glukan) na bázi ječmene jako významná složka funkčních potravin, chemickým složením prakticky identický s ovesným β-glukanem. Kromě schopnosti vázat a tím snižovat krevní cholesterol, spočívají jeho přednosti též v potlačování chuti k jídlu a prodloužené absorpci glukózy po jídle. Ječný slad také obsahuje fytosteroly a další chemické látky, které by potenciálně mohly příznivě ovlivnit hladinu cholesterolu v krvi, ale tento efekt nebyl ještě dostatečně prostudován (MULLER et al., 2007). Přesto byl slad odpradávna doporučován jako léčivý prostředek při některých chorobách střev, žaludku, dvanáctníku a blahodárně by měl působit i na střevní mikroflóru. Meziprodukty při výrobě piva, např. pivovarské mláto, lze využít při přípravě pekařských produktů, mufínů, koláčů, koblih, vaflí, tortil a sušenek. V pokusu na krysách bylo zjištěno, že mláto pozitivně působí na zažívání, zmírňuje průjmy, zabraňuje zácpě a snižuje cholesterol. Urychluje posun tráveniny ve střevech, tím zabraňuje vstřebávání škodlivých látek v těle. Pozitivní efekt mláta je přisuzován proteinům bohatých na glutamin, neškrobovým polysacharidům (20 47 % arabinoxylany, 1 % β-glukany) (MUSSATTO et al., 2006) a také vysoké koncentraci tokolů. Obsah tokolů je třikrát vyšší v mlátě (152,9 mg.kg -1 ) než v zrnu ječmene (56,7 mg.kg -1 ) (PETERSON, 1994) Potravinářské využití ječmene ve světě V celosvětovém měřítku převládá pluchatý ječmen, ale bezpluchá forma má širší uplatnění jako potravinářská surovina. Počet variet bezpluchého ječmene, evidovaných ve světových kolekcích genetických zdrojů ječmene je odlišný. V USA kolekci v Beltsville je zařazeno 2863 bezpluchých ječmenů, v japonské genové bance Okayamě celkem 764 materiálů a v kolekci genetických zdrojů ječmene Zemědělského výzkumného ústavu 12

27 LITERÁRNÍ REŠERŠE obilnářského Kroměříž, s.r.o. je více než 140 materiálů ječmene s bezpluchým zrnem ve dvaceti sedmi varietách (VACULOVÁ, 2006). Bezpluchá forma je pěstována pro výživu lidí např. v Tibetu ( ha, tj. 60 % z celkové obdělávané půdy), Nepálu, Maroku, Etiopii, Egyptě a Japonsku. V současné době jsou bezpluché odrůdy registrovány v Kanadě, Austrálii, SRN nebo v Itálii (AMRI et al., 2005; BEKELE et al., 2005; TASHI, 2005). V současnosti se ječmen využívá v potravinářství především ve vyspělých zemích světa, na výrobu tzv. funkčních potravin. V rozvojových zemích a v řadě asijských států je spotřeba ječmene pro lidskou výživu vysoká, přesto má klesající tendenci (FAOSTAT). Z ječmene je vyráběn sladový extrakt a sirupy, které se přidávají do snídaňových cereálií nebo pečiva. Dále se můžeme setkat s nealkoholickými nápoji z ječmene či sladu, např. sladová káva nebo ječný čaj, který má dlouhou tradici především v Japonsku a dává se mu zde přednost před čajem zeleným. Důležitou potravinou v lidské výživě je olej z ječný klíčků, ječné výhonky, slupky a mouka, která se míchá s dalšími moukami na výrobu celozrnných chlebů (MAHDI et al, 2008). Vysokou spotřebu ječmene vykazuje například Maroko (92 kg/osoba/rok, ), ječmen zde hraje důležitou roli v historii stravování. Připravují se z něho různá jídla, jako jsou husté polévky, toughrift (plochý chléb), kuskus, aballagh, tj. mouka a krupice z ječmene se speciální vůní uskladněné ve sklepě po tři roky. Z mouky se vyrábí chléb a z krupice aftal. Celá zrna jsou Maročany konzumována jako popcorn. Tiroufin jsou celá zrna smíchaná s vodou a usmažena do podoby krekru a toto jídlo se doporučuje konzumovat dětem pro správný růst kostí (AMRI et al., 2005). V Tunisu se připravuje bazine slaný teplý druh kaše (FELAH a MEDIMAGH, 2005) a v Etiopii mají spoustu receptů pro přípravu pokrmů z ječmene jako je injera místní chléb a nápoje (tella, borde, areki) (BEKELE et al., 2005). V Tibetu je zkonzumováno 155 kg/osoba/rok. Pěstován je pouze bezpluchý ječmen. Základem pro všechny jídla je pražená ječná mouka tsangpa. Tibeťané pečou různé druhy koláčů, kde se tsangpa smísí s máslem, sušeným sýrem a cukrem (chima) nebo navíc přidají mléko (magsan) či čaj (tsog). Také k snídani je základem polévky tsangpa ke které se přidává rýže, sýr a cukr (changuel) nebo k večeři připravují z pražené mouky tsangpa s vodou, hovězím nebo jačím masem, hráškem, sušeným sýrem a zeleninou. Nejdůležitějším alkoholickým nápojem je chang, připravený ze zkvašeného 13

28 LITERÁRNÍ REŠERŠE ječmene a zahuštěný slinami. Další alkoholický nápoj se vyrábí z mírně uvařené tsangpy s kvasnicemi a směs se nechá tři dny kvasit (TASHI, 2005). V Asii jsou hojně využívány ječné kroupy, přesto jsou pozvolně nahrazovány rýží a pšenicí. V Japonsku, USA a dalších státech se vyrábí sušený extrakt z mladých listů ječmene, obsahující různorodé biologicky aktivní substance; a další doplňky, které jsou obohacené o vitamíny a stopové prvky (BADAMCHIAN et al., 1994) Potravinářské využití ječmene v České republice Ječmen byl pěstován v roce 2008 na osevní ploše 482,4 tis. hektarů s průměrným hektarovým výnosem 4,76 t.ha -1. V tomto roce bylo sklizeno 2297 tis. tun ječmene, z tohoto množství bylo 600 tis. tun použito v potravinářském průmyslu. Sladu bylo vyrobeno 540,51 tis. tun, přičemž 44 % bylo použito pro export, čímž se ČR podílela 5 % na světovém exportu sladu (SITUAČNÍ A VÝHLEDOVÁ ZPRÁVA 2008). Ječmen se u nás v potravinářském průmyslu zpracovává hlavně na kroupy, vločky a v menší míře i na mouku. Ječné kroupy byly v minulosti významnou složkou potravy, používaly se jako zavářka do polévky, jako příloha k masitým jídlům i jako samostatný pokrm. Ječná mouka byla používána na výrobu lívanců a odvar z ječmene byl využíván k rekonvalescenci (PSOTA a EHRENBERGEROVÁ, 2008). V minulém století význam ječných výrobků značně poklesl, je však snaha zvýšit zájem o jejich konzum pro obsah důležitých β-glukanů, jakožto rozpustné složky vlákniny. V České republice je průměrná roční spotřeba ječmene na osobu 24 kg (FAO). K výrobě krup se používá ječmen jarní, který oproti ječmenu ozimému neobsahuje barevná (modrozelená) zrna po oloupání. Důležitým požadavkem je vysoký výnos předního zrna (podíl zrn nad sítem 2,5 mm, ČSN ), jenž ovlivňuje výtěžnost krup (ČSN ). Výrobní postup založený na odstranění pluch spočívá ve vyčištění, tj. zbavení příměsí a nečistot i drobných zrn, pak následuje loupání na hrubém smirkovém kameni, dále broušení na vertikálních loupačkách, kde se odstraňují zbytky pluch, a nakonec luštění na pomaluběžných loupačkách. Vzniklé kroupy se pak třídí na kroupy velké, střední, malé, menší částice tvoří tzv. lámanku a perličky. Kroupy velké (č. 10), mají menší stupeň opracování než krupky, obsahují více vlákniny, vitamínů a minerálních látek. Výtěžnost krup je 73 % a 26 % tvoří ječné otruby. Užití krup je nejenom při zabijačkách, ale hlavně celoročně jako zavářka do polévek, do zapečených nákypů, na přípravu 14

29 LITERÁRNÍ REŠERŠE šlemových polévek (šlem vzniká při vaření krup), při průjmech a jako pojidlo do karbanátků (PELIKÁN a SÁKOVÁ, 2001; EHRENBERGEROVÁ, 2007). Při výrobě ječné mouky se postupuje obdobně jako u žita, avšak pro velkou houževnatost zrna je mletí obtížné, pluchy často ucpávají otvory sít, proto by se s úspěchem uplatnily bezpluché ječmeny. Ječná mouka se přidává do těst na lívance, palačinky, vafle. Dalším výrobkem z ječmene jsou vločky a dále ječné otruby, což jsou obalové vrstvy rozmělněné do malých částeček (PELIKÁN a SÁKOVÁ, 2001). Velkou výživnou hodnotu má naklíčený ječmen, který obsahuje hodně vitamínů skupiny B, vitamín E a směs enzymů. Slad se používá hlavně při výrobě piva, ale také jako sladidlo konzistence medu Sladěnka. Existuje i prášková forma sladu, tzv. Sladovit. V České republice se v současné době pro přímý konzum v podobě ječného zrna spotřebuje jen kolem 0,5 0,6 % z celkové produkce, což je asi 10,7 12,8 tis. tun ječmene (6 tis. tun na výrobu krup, krupice a mouky), 25 % pro výrobu sladu a piva, asi 75 % se využívá ke krmení hospodářských zvířat a část produkce se spotřebuje na výrobu alkoholu. 2.6 Látky antioxidační povahy vyskytující se u obilnin V ČR je mimořádný výskyt kolorektálního karcinomu a je známo, že tlusté střevo je méně odolné proti oxidačnímu stresu než střevo tenké. Rovněž stoupá výskyt Crohnovy choroby a ulcerózní kolitidy. Střevo působí jako bariéra proti mutagenům, karcinogenům a oxidantům v potravě. Ukazuje se, že zde spolupůsobí volné radikály, které jsou produkovány hlavně ve střevu, kde je velké množství reaktivních druhů kyslíku (ROS). Potravou přijímáme nejen antioxidanty, ale i volné radikály a ROS (HOLEČEK, 2006). V současné době se propaguje protizánětlivá dieta spočívající v malých, ale častých porcích jídla (5krát denně) s proteiny a vlákninou v každém jídle (HOLEČEK, 2006). Jako doplněk stravy je doporučen i přípravek Barley mladý ječmen s vysokou hladinou antioxidačních enzymů a vitamínů. Mimo to zrno ječmene má navíc důležitý obsah neškrobových polysacharidů, tzn. rozpustnou vlákninu, která hraje významnou roli v prevenci karcinomů trávicího traktu (MCINTOSH, 1998). 15

30 LITERÁRNÍ REŠERŠE Důležitost obilovin, jako zdroje antioxidantů, je často podceňována vzhledem k nízké koncentraci těchto látek, ale je dobré si uvědomit, že zastoupení cereálií a výrobků z nich je v humánní potravě vysoká. Obsah antioxidantů se snižuje mletím, extruzí a naopak vyšší obsah antioxidačních látek je v celozrnné mouce, otrubách, ovsu nebo rýži (POKORNÝ, 2007) Antioxidační ochrana organismu Za antioxidanty se považují všechny látky, které vykazují při ph 7 negativnější potenciál než +0,816V (redoxpotenciál kyslíku). Molekula antioxidantu musí reagovat s volnými radikály rychleji, než reagují s lipidy, a produkty reakce s volnými radikály nesmí být pro-oxidanty (LACHMAN, 2003). Antioxidanty můžeme dělit podle nejrůznějších hledisek - podle ovlivnění tvorby volných radikálů, původu vstupu do organismu (endogenní, exogenní), rozpustnosti ve vodě (hydrofilní, lipofilní, amfofilní), lokalizace v buňce či mimo buňku (extracelulární, intracelulární), podle velikosti molekuly (vysokomolekulární, nízkomolekulární), mechanismu účinku (katalyzátory, chelatační látky, inhibitory enzymů, redukující látky, aj.), typu volného radikálu (superoxid, hydroxylový radikál, singletový kyslík aj.) atd. (POKORNÝ, 2007; RACEK, 2003). Za nejrozšířenější způsob vzniku přírodních antioxidantů je považována syntéza antioxidantů různými mikroorganismy, houbami, dokonce i živočichy, ale nejčastěji rostlinami. Další způsobem je průmyslová výroba, která chemicky či jinak modifikuje přirozené látky při získání požadovaných vlastností. Jde o výrobu tzv. syntetických antioxidantů (např. z molekuly vitamínu E je odstraněn terpenoidní řetězec a nahrazen karboxylovou skupinou, která zvýší jeho rozpustnost ve vodě. Tato látka se využívá v analytice pod názvem Trolox místo lipofilního vitamínu E (OXIS International Inc.; RACEK, 2003). Třetí skupinou jsou antioxidanty identické s přírodními antioxidanty obsažené v potravě, ale jsou průmyslově syntetizované. Tato skupina se nazývá přírodněidentické antioxidanty. Při porovnání s přírodními antioxidanty, jsou přírodně identické antioxidanty čisté látky, relativně levné, dostupné a obsahují tedy kombinaci výhod syntetických a přírodních antioxidantů. Antioxidanty jsou do potravin přidávány ze dvou odlišných důvodů. První důvod je potlačení oxidace lipidů a tvorba volných radikálů v potravinách při dlouhodobém skladování nebo při tepelné úpravě a druhý důvod je obohacení potravin a redukce koncentrace volných radikálů in vivo po požití potraviny (POKORNÝ, 2007). 16

31 LITERÁRNÍ REŠERŠE Když shrneme pozitivní výsledky z publikovaných studií, zjistíme, že vysoká spotřeba ovoce a zeleniny bohaté na antioxidanty je asociována s nižším výskytem rakoviny. Bylo zjištěno, že dlouhověcí lidé mají vysoké aktivity vitamínu E a superoxiddismutasy (HOLEČEK, 2006). Nicméně výsledky náhodných experimentů ukazují suplementaci více vybraných antioxidantů v potravinách za rozporuplnou a byly zjištěny jak prospěšné tak škodlivé účinky antioxidační suplementace v prevenci gastrointestinální rakoviny (BJELAKOVIC et al., 2004). BJELAKOVIC et al. (2004) sepsal recenzi (681 odkazů) o vlivu antioxidantů na gastrointestinální rakovinu, kde byly podávány jednotlivé antioxidanty orálně každý den nebo střídavě po dobu 1 12 let. Při podání samostatných antioxidantů nebo v jejich kombinaci nebyl objeven významný vliv na úmrtnost sledovaných pacientů. Přesto mortalita byla významně vyšší při užívání kombinace β-karotenu s vitamínem A a β-karotenu s vitamínem E. Užívání doplňků stravy (β-karoten, vitamín A, vitamín C, vitamín E) samostatně či v kombinaci nebylo podle recenze příliš účinné v prevenci gastrointestinální rakoviny. U kuřáků bylo zjištěno, že při příjmu 50 mg/den β-karotenu byla úmrtnost zvýšena o 8 % oproti kontrolní skupině, ale užívání α-tokoferolu neovlivnilo celkovou mortalitu pacientů (HAINONEN et al., 1994) Vznik a působení volných kyslíkových radikálů Volné kyslíkové radikály vznikaly na naší planetě spolu se vznikem kyslíkové atmosféry, protože jsou produkovány především při metabolismu kyslíku. Kyslík je nezbytný pro život, ale hraje rovněž negativní roli při tvorbě nebezpečných volných radikálů. Na druhé straně tyto radikály nejsou jen škodlivé toxické látky, ale je stále zřejmější, že v organismu mají i řadu fyziologických funkcí. Volné radikály jsou molekuly, atomy nebo ionty, které mají ve valenční sféře jeden nebo více nepárových elektronů dávajících radikálům jejich vysokou reaktivitu a tím i nestabilitu. Tím způsobují oxidační stres buněk a tkání a to ve dvou situacích při jejich zvýšené tvorbě a při nedostatečné antioxidační ochraně organismu (HALLIWELL, 2002; ZIMA et al., 1996; EMMERT a KIRCHNER, 1999). Příčiny vzniku volných radikálů můžeme rozdělit na endogenní a exogenní. K exogenním příčinám patří ionizující záření, UV-světlo, vysoký obsah škodlivin ve vzduchu (doprava, průmysl, tepelné elektrárny), kouření, pesticidy, oxid siřičitý, intoxikace (polychlorované bifenyly, tetrachlormethan, chloroform, parakvat aj.), úprava a uchování potravin. Do skupiny endogenních příčin vzniku volných radikálů patří u lidí 17

32 LITERÁRNÍ REŠERŠE zejména vznik kyseliny močové (při úrazech, pooperačních stavech), rozpad fagocytů a makrofágů (záněty, popáleniny), syntéza prostaglandinů, apoptosa, zvýšený metabolismus estrogenů atd. (EMMERT a KIRCHNER, 1999; RACEK, 2003). Radikály se vytváří v oblasti membránových fosfolipidů, které tvoří jednoduše dostupný vnitřní cíl. Zvláště polynenasycené mastné kyseliny (PUFA) jsou vysoce náchylné k reakci s volnými radikály. Lipoperoxidace způsobuje snížení membránové fluidity, narušení membránové integrity a výsledkem je porušení iontového gradientu. A co více, enzymy navázané na membránu mohou významně pozměnit funkci buňky (HALLIWELL a GUTTERIDGE, 1999). Aldehydické produkty lipoperoxidace, jako je malondialdehyd (MDA), jsou vysoce toxické a ovlivňují vazby mezi membránou a proteinem. Lipidová peroxidace je považována za hlavní příčinu onemocnění a smrti buněk. Reaktivní druhy kyslíku, zvláště hydroxylový radikál, mohou atakovat buněčné struktury nebo molekuly. Oxidace proteinů poškozuje přeměnu aminokyselin. Přítomnost karbonylových skupin v proteinech je použita jako indikátor oxidativního poškození (DEZWART et al. 1999). Oxidace proteinů může vést k funkčním změnám, chemickým fragmentacím nebo ke zvýšení citlivosti k proteolytickému působení (DRÖGE, 2002), ačkoli funkce buněk může být pozměněna vznikem volných radikálů mnoha jinými cestami. Účinkem volných radikálů může také dojít i k poškození nukleových kyselin. Poškození DNA se projeví apoptózou, mutagenezí, karcinogenezí a stárnutím (ZIMA et al., 1996). Obecně lze shrnout, že volné radikály působí pomocí oxidace, přičemž vždy ničí látku, která je oxidována. Oxidace bývá často velmi užitečná je zdrojem energie a živý organismus se bez ní neobejde. Volné radikály jsou odpovědné za iniciaci oxidačních reakcí v potravinách, kde mohou reagovat s lipidy, proteiny, sacharidy a vitamíny; produkují nežádoucí nestálé chemické látky, ničí esenciální mastné kyseliny, aminokyseliny a vytváří karcinogeny. Touto reakcí tak dochází ke snížení nutriční, chemické a fyzikální kvality potravin během skladování (CHOE a MIN, 2005). V dalších případech mohou volné radikály spolupůsobit při vzniku onemocnění jako je Alzheimerova a Parkinsonova choroba, Huntingtonova choroba, roztroušená mozkomíšní skleróza, schizofrenie aj. (HOLEČEK, 2006). Volné radikály tedy poškozují buňky v průběhu nemoci a organismus se snaží oxidaci zastavit. Na tomto místě zasahují látky, které nazýváme antioxidanty (PRÝMA et al., 2000). 18

33 LITERÁRNÍ REŠERŠE Oxidační stres Buňky mají vyvinutý sofistikovaný antioxidační mechanismus k prevenci volných radikálů. Produkce reaktivních druhů kyslíků se vyskytuje u rostlin, které jsou vystaveny stresovým podmínkám (změna v intenzitě světla, sucho, teplotní stres, přítomnost herbicidů či kovů). Cytotoxické druhy kyslíku jsou vysoce reaktivní a při nepřítomnosti obranných mechanismů mohou vážně narušovat metabolismus od oxidativního poškození až po lipidy, proteiny a nukleové kyseliny (TUNA et al., 2008). Oxidačním stresem se označuje stav, kdy se reaktivní formy kyslíku v živém organismu vytvářejí v nadbytku. Tento stav nastane tehdy, jestliže koncentrace antioxidantů je velmi nízká, anebo je zvýšená tvorba volných radikálů (GREGUŠKA, 1997). Na druhou stranu i převaha antioxidantů, je-li výrazná, může mít nepříznivé následky. Blokuje totiž příznivé účinky volných radikálů, např. peroxidu vodíku nezbytného pro oxidaci jodidu na elementární jód, který je využit štítnou žlázou k jodaci aromatických jader tyroxinu. Přebytek antioxidantů může paradoxně i zvyšovat oxidační stres (RACEK, 2003). Buňky snesou mírný oxidační stres a často odpoví na tuto stresovou situaci zvýšenou syntézou antioxidačních obranných enzymů a dalších ochranných proteinů, avšak silný oxidační stres může způsobit poškození buněk nebo dokonce jejich smrt (GREGUŠKA, 1997) Vitamín E Historie objevení vitamínu E Vitamín E objevil lékař specializující se na embryologii Herbert McLean Evans se svou asistentkou Katherine Scott Bishop v roce 1922 na Kalifornské univerzitě v Berkeley při pokusech na krysách. Krysy byly krmeny speciální dietou, při které samičky nedonosily plod. Z tohoto důvodu H. McL.Evans a K. S. Bishop usoudili, že ve stravě chybí nějaká složka a přidali do jejich potravy salát a později naklíčená semena. Po této suplementaci se samičkám narodila zdravá mláďata a neznámou látku obsaženou v této potravě nazvali Faktor X. Usoudili tudíž, že Faktor X byl obsažen v lipidovém extraktu naklíčených semen a záhadná sloučenina musí tedy být rozpustná v tuku. Faktor X byl pojmenován v roce 1925 jako vitamín E. Nezávisle na doktoru Evansovi sledoval sterilitu u krys také doktor Bennett Sure na Univerzitě v Arkansasu, který navrhl pojmenování vitamínu o rok dříve. Poprvé byl vitamín E izolován z oleje pšeničných 19

34 LITERÁRNÍ REŠERŠE klíčků H. M. Evensem s O. H. Emersonem. Roku 1936 Evans se svou skupinou spolupracovníků izolovali alkohol, o kterém se uvažovalo jako o vitamínu E. O rok později izolovali β- a γ-tokoferol a roku 1938 E. Fernholt stanovil kompletní chemickou strukturu vitamínu E. Během téhož roku byl α-tokoferol syntetizován R. Karrerem. Přírodní vitamin E extrahovaný z odpadu při výrobě rostlinného oleje byl uveden na trh firmou Distillation Products Industries v roku 1940 (PAPAS, 1999) Struktura a nomenklatura vitamínu E Chloroplasty vyšších rostlin produkují značné množství chemických sloučenin, které se nepodílejí pouze na životně důležitých funkcích rostliny, ale jsou také důležité pro rostlinnou produkci a výživě u zvířat a lidí. Tokoly, známé jako vitamín E, jsou právě takovouto jednou skupinou chemických sloučenin (SHINTANI a DELLAPENNA, 1998). Vitamín E je syntetizován výhradně rostlinami a jinými fotosyntetizujícími mikroorganismy a je esenciálním komponentem lidské výživy. Obr. 1 - Chemická struktura tokoferolu Strukturním základem společným všem sloučeninám vykazující aktivitu lipofilního vitamínu E (tzv. vitagenům E) jsou tokoferol a tokotrienol, které obsahují chromanový cyklus s nasyceným nebo nenasyceným isoprenoidním řetězcem o 16 atomech uhlíku. Izoprenoidní řetězec zajišťuje vitamínu E jeho nerozpustnost ve vodě. Je odvozen od diterpenoidního alkoholu fytolu, ale obsahuje navíc methylovou skupinu v poloze C-2 a hydroxyskupinu v poloze C-6 chromanového cyklu (Obr. 1, 2). Přítomnost těchto funkčních skupin je nezbytná pro biologickou aktivitu všech těchto vitamerů. Čtyři formy vitamínu E (α-, β-, γ-, δ-) s nasyceným terpenoidním řetězcem se nazývají tokoferoly (T, Obr. 1), čtyři formy (α-, β-, γ-, δ-) s nenasyceným postranním řetězcem se nazývají tokotrienoly (T3, Obr. 2). Jednotlivé izomery se liší od sebe pouze polohou a počtem methylových skupin v chromanovém cyklu a biologickou aktivitou (VELÍŠEK, 2002; 20

35 LITERÁRNÍ REŠERŠE HOFIUS a SONNEWALD, 2003; CAVALLERO et al., 2004; FALK et al. 2004; SEN et al., 2006; NESARETNAM et al., 2007; NEWMAN a NEWMAN, 2008; PANFILI et al., 2008).Díky přítomnosti tří chirálních center (v poloze C-2 chromanového cyklu a v poloze C-4 a C-8 postranního řetězce tokolu) může každý tokoferol existovat v osmi diastereoizomerních formách (VELÍŠEK, 2002). Obr. 2 Chemická struktura tokotrienolu V rostlinách vznik přírodního tokoferolu kontrolují enzymy, které dávají na každý ze tří asymetrických vodíků jednu methylovou skupinu všechny na pravou stranu řetězce. Při výrobě syntetické formy nejsou přítomny žádné enzymy, které by zajistily připojení methylových skupin na pravou stranu, a vládne tu náhoda. Ve vědeckých pracích se k názvu přírodního α-tokoferolu přidává předpona RRR (staré označení d-α-tokoferol, Obr. 3). Syntetická neboli racemická forma je skupina osmi stereoizomerů označena jako all-rac-α-tokoferol (staré označení dl-α-tokoferol). Přepočet mezi jednotlivými formami vitamínu E je následující: d-α-tokoferol:dl-α-tokoferol:d-α-tokoferol-acetát:dl-αtokoferol-acetát:d-α-tokoferol-sukcinát = 0,92:0,68:1,36:1,00:1,31 (EITENMILLER a LEE, 2004; HOSMANOVÁ a DOUŠA, 2007). Obr. 3 RRR-α-tokoferol = (2R 4 R 8 R) -α-tokoferol Oficiálně bylo organizacemi FDA, WHO a USP deklarováno, že přírodní forma je o 30 % účinnější než forma syntetická. Komerčně je α-tokoferol vyráběn ve stabilní esterifikované formě, ve které je aktivní antioxidační skupina zablokována přidáním kyseliny (kyselina jantarová pro výrobu tablet a estery kyseliny nikotinové a linolenové 21

36 LITERÁRNÍ REŠERŠE v kosmetickém průmyslu) a tokoferol může bojovat s volnými radikály až po odstranění této kyseliny enzymy esterázami ve střevech či v kůži (PAPAS, 2001) Vyjádření aktivity vitamínu E používané jednotky U většiny prodávaných produktů s vitamínem E je aktivita vyjádřena v jednotkách UI, která ale vypovídá pouze o obsahu α-tokoferolu. Výbor pro potraviny a výživu při Národní radě výzkumu (Food and Nutrition Board of the National Research Council, USA) vyměnil jednotku UI za ekvivalent α-tokoferolu (α-te), který představuje součet jednotlivých tokoferolů a tokotrienolů se zohledněním jejich biologické aktivity. Jedna jednotka α-te se rovná 1,49 IU a 1 mg přírodnímu d-α-tokoferolu. Oproti tomu jedna jednotka UI představuje 1 mg syntetického dl-α-tokoferyl-acetátu (THAKUR a SRIVASTAVA, 1996), ale PRUTHI et al. (2001) uvádí jako ekvivalent 1 UI = 0,67 mg RRRα-tokoferolu nebo 0,45 mg all-rac-α-tokoferolu. Biologická aktivita vitamínu E a jeho izomerů se určuje obtížně a souvisí s jeho antioxidačními účinky. Tokoferoly a tokotrienoly se liší svou biologickou účinností a přítomnost dvojných vazeb v molekule tokotrienolů má za následek pokles biologické aktivity asi na třetinu ve srovnání s tokoferoly. Poměry účinností jednotlivých izomerů se uvádí v následujícím pořadí: α-t : β-t : γ-t : δ-t : α-t3 : β-t3 = 100 : : 5-8 : 1 : 29 : 5 (VELÍŠEK, 2002; HOSMANOVÁ a DOUŠA, 2007). Pořadí antioxidační účinnosti tokolů v potravinách je v opačném pořadí než je jejich biologická aktivita: δ-t > γ-t > β-t > α-t (tokotrienoly jsou méně účinné než odpovídající tokoferoly) (ZIELINSKI et al., 2001; VELÍŠEK, 2002). Ačkoliv všechny čtyři tokoferoly mají odlišnou aktivitu, převládá aktivita α-tokoferolu, která je 2-50krát větší než u ostatních tokoferolových izomerů díky afinitě jaterního α-tokoferol transfer proteinu (TBP = tocopherol binding protein) pro α-tokoferol (AJJAWI a SHINTANI, 2004; PANFILI et al., 2008). Antioxidační aktivita je vyšší u tokotrienolů než tokolů (NESARETNAM et al., 2007) Biochemie vitamínu E a jeho vliv na zdravotní stav člověka Tokoferoly byly nalezeny v plastidech a převládající formou u fotosyntetických pletiv je α-tokoferol. Obzvlášť vysoký obsah tokoferolů je v membránách chloroplastů, nejběžnější formou vitamínu E je zde α- a γ-tokoferol. Izomery vitamínu E jsou začleněny do buněk lipidových membrán (Obr. 4), kde efektivně inhibují reaktivní druhy kyslíku peroxidaci lipidového řetězce tím, že váží lipidové peroxyradikály a přerušují tak 22

37 LITERÁRNÍ REŠERŠE řetězovou reakci (RACEK, 2003). Při uvedeném mechanismu může být fotosyntetický aparát ochráněn před toxickým kyslíkem a lipoperoxidací. Obr. 4 Umístění vitamínu E v buněčné membráně (PAPAS, 1999) U nefotosyntetických tkání převažuje γ-tokoferol, který se účastní při prevenci proti autooxidaci PUFA (SHINTANI a DELLAPENNA, 1998; QURESHI at al., 2000; HOFIUS a SONNEWALD, 2003; RACEK, 2003; FALK et al., 2004; CHOI et al., 2006). Například u krys je asi 90 % celkového množství α-tokoferolu regenerováno v játrech, kosterní svalovině a adipózních tkáních. Většina α-tokoferolu je lokalizována v mitochondriích a v endoplazmatickém retikulu buněk. Po střevní absorpci a transportu s chylomikrony, je α-tokoferol většinou přenášen do parenchymatických buněk jater, kde jsou shromažďovány lipofilní vitamíny. Díky tomu lipofilní struktura vitamínu E dohlíží na akumulaci v lipoproteidech a buněčných membránách i ukládání tuků, kde reaguje s molekulárním kyslíkem a volnými radikály (THAKUR a SRIVASTAVA, 1996). Vitamín E představuje pro člověka esenciální stopový prvek podílející se 3 % na celkové antioxidační kapacitě (HOLEČEK, 2006). I když všechny tokoferoly jsou stejnoměrně absorbovány během trávení, pouze α-tokoferol, je primárně uchováván a distribuován po celém těle díky proteinu TBP (AJJAWI a SHINTANI, 2004; SHINTANI a DELLAPENNA, 1998). Absorpce vitamínu E je závislá na obsahu mastných kyselin v potravě, na žlučových kyselinách, pankreatických enzymech a na obsahu lipidů v plazmě (PRUTHI et al., 2001), kde je transportován asociovaný s lipidovou fází lipoproteinových částic LDL. Každá částice LDL lipoproteinů obsahuje 6 8 molekul vitaminu E (normální koncentrace je > 0.8 mg α-tokoferolu.g -1 celkových lipidů), zatímco z dalších antioxidantů je přítomna jen 1 molekula (EMMERT a KIRCHNER, 1999; VELÍŠEK, 2002). Molekula vitamínu E 23

38 LITERÁRNÍ REŠERŠE nejdříve pronikne do chylomikronů, které ho distribuují do tkání obsahující lipoproteinasy, pak v chylomikronových zbytcích přejde do jater a z jater je roznášen lipoproteiny o velmi nízké hustotě. Je skladován do zásoby v tukové tkáni, a proto nedostatek vitaminu E je spíše spojen s poruchami výše uvedených pochodů (MURRAY et al, 1998). Tokotrienoly, zvláště γ- a δ-tokotrienol (NESARETNAM et al., 2007), jsou schopné redukovat sérový LDL cholesterol u člověka, kuřat i prasat. Působí jako inhibitory 3-hydroxy-3methyl-glutaryl koenzymu A reduktasy (HMG-CoA reduktasa), což je klíčový enzym syntézy cholesterolu v játrech. HMG-CoA reduktasa je přítomna v endoplasmatickém retikulu všech buněk, které produkují cholesterol a její nejvyšší aktivita je prokázána v játrech, gonádách, tenkém střevu a nadledvinkách. Aktivita HMG-CoA reduktasy je ovlivněna koncentrací cholesterolu, zvýšení koncentrace cholesterolu ji snižuje a naopak. Společně s aktivitou LDL receptorů se HMG-CoA reduktasa podílí na regulaci koncentrací cholesterolu, především LDL cholesterolu (ČEŠKA, 1999; CAVALLERO et al., 2004). Izomery γ-tokotrienol a δ-tokotrienol jsou účinnější než α-tokotrienol. V potravinách je důležitější vyšší podíl tokotrienolů než tokoferolů, protože jsou důležité v metabolické regulaci cholesterolu. Při kombinaci tokotrienolů a léků dochází ke snížení celkového cholesterolu a LDL-cholesterolu o 20 % resp. 25 %. δ-tokotrienol je pokládán za nejúčinnější izomer vitamínu E pro zpomalení zanášení cév při atheroskleroze. Nejpozoruhodnější zjištění u δ-tokotrienolu byla jeho schopnost odstranit zúžení krční tepny a potenciálně tak snížit výskyt mrtvice (NESARETNAM et al., 2007). SEN et al. (2006) zjistili, že již nanomolární koncentrace α-tokotrienolu preventivně působí proti neurodegenerativním onemocněním. Současné studie ukazují na to, že tokotrienoly preventivně působí proti bujení a rozšiřování několika typů humánních rakovinných buněk a pozitivně ovlivňují i apoptosu rakovinných buněk (CAVALLERO et al., 2004; NESARETNAM et al., 2007). Spolu s β-karotenem a koenzymem Q chrání vitamín E strukturu a integritu biomembrán a membrán vnitrobuněčných organel (VELÍŠEK, 2002). Tokoferol a selen se vzájemně podporují v působení proti peroxidům lipidů. Selen je kromě toho nutný pro normální činnost pankreatu, která je nezbytná pro trávení a vstřebávání tuků, včetně vitaminu E. Vitamin E zase snižuje potřebu selenu (resp. nároky na jeho přísun) tím, že brání ztrátám selenu z organismu, anebo jej udržuje v aktivní formě (MURRAY et al., 1998). 24

39 LITERÁRNÍ REŠERŠE Antioxidanční vlastnosti vitamínu E Tokoferoly a tokotrienoly jsou monoethery příslušných hydrochinonů, a proto se snadno oxidují např. železitými ionty, hydroperoxidy lipidů, ozonem, vzdušným kyslíkem aj. oxidačními činidly (FRAGNER et al., 1961; VELÍŠEK, 2002). S klesajícím počtem methylových skupin na chromanovém kruhu klesá citlivost vůči oxidaci i biologická aktivita. Naopak stoupá antioxidační účinek. Nejúčinnějším antioxidantem v boji proti radikálům dusíku, které jsou hlavními viníky artritidy, roztroušené sklerózy a chorob mozku, je γ-tokoferol, jehož biologická aktivita je však malá (FRAGNER et al., 1961). R O O + T OH R O OH + T O Pozn. T-OH... tokoferol R-O-OH... hydroperoxid Obr. 5 Vznik tokoferoxylového radikálu (T-O ) Obr. 6 Regenerace vitamínu E kyselinou askorbovou (EITENMILLER a LEE, 2004) Při reakci vitamínu E s volným radikálem (např. hydroperoxylový radikál lipidů R-O-O resp. mastné kyseliny (Obr. 5) vzniká tokoferoxylový radikál (T-O ). Jedna molekula tokoferolu může reagovat celkem se dvěma hydroperoxylovými radikály. Vitamín E se při reakci inaktivuje a ztrácí svou antioxidační aktivitu. Navíc za určitých okolností může tokoferoxylový radikál působit jako oxidant a poškodit další biomolekuly. Protože molekul vitamínu E je v lipoproteinové částici jen omezený počet, je velice důležité zajistit zpětnou redukci z tokoferoxylového radikálu, tzn. regeneraci vitamínu E (Obr. 6) na jeho původní chemickou strukturu s aktivní hydroxylovou skupinou na aromatickém jádře. K tomuto účelu in vivo slouží kyselina askorbová, která se mění na askorbylový radikál. Protože vitamín E je lipofilní a kyselina askorbová hydrofilní, 25

40 LITERÁRNÍ REŠERŠE probíhá tato reakce na rozhraní dvou fází lipidové v buněčné membráně nebo částici lipoproteidu a hydrofilní v okolní cytoplazmě. Po těchto reakcích následuje regenerace kyseliny askorbové, kterou zajišťuje glutathion a na reakci navazuje kyselina α-lipoová a nakonec nikotinamidadenindinukleotid. Jde o řetězovou reakci v níž výsledný stav je závislý na vzájemné rovnováze a souhře jednotlivých složek. Porucha podmíněná převahou jedné může vést k prooxidačnímu působení. Proto byl u vyšších dávek vitamínu E i C pozorován prooxidační účinek, což je samozřejmě nežádoucí (ŠKRHA, 1998; VELÍŠEK, 2002; RACEK, 2003; EITENMILLER a LEE, 2004; CHOE a MIN, 2005) Doporučený příjem a onemocnění způsobená nedostatkem vitamínu E Podle Lékařského Institutu (IOM, 2000) je doporučený denní příjem 15 mg vitamínu E (22 UI z přírodního zdroje nebo 33 UI v syntetické podobě) pro ženy i muže s průměrným denním příjmem g mastných kyselin (LARKIN, 2000; PRUTHI et al., 2001; VELÍŠEK, 2002). Dalších 0,5 0,6 RRR-α-tokoferolu se uvažuje na každý další 1 g přijatých mastných kyselin. U těhotných žen se doporučuje denní příjem vyšší o 2 mg a u kojících o 5 mg (VELÍŠEK, 2002). Doporučený denní příjem 15 mg odpovídá množství, které obsahuje průměrná humánní strava, přesto vyšší konzumace vitamínu E ( IU) jsou spojovány se sníženým rizikem kardiovaskulárních chorob, rakoviny, zlepšením imunitního systému, omezením zánětů a bojem s volnými radikály, které zpomalují hojení ran aj. (SHINTANIHO a DELLAPENNA, 1998; HOFIUS a SONNEWALD, 2003). Křivka ve tvaru U pro α-tokoferol (Obr. 7) názorně zobrazuje při jakém dávkování α-tokoferolu dochází k toxicitě a naopak. Obr. 7: Křivka ve tvaru U pro α-tokoferol (PAPAS, 2001) Pozn.: Když je příjem α-t nízký, pod hranicí denního doporučeného dávkování (DDD), zvyšuje se zdravotní riziko vzhledem k jeho nedostatku. Čím je větší rozdíl mezi DDD a nízkým příjmem, tím je zdravotní riziko větší. Když se příjem zvýší a přiblíží se DDD (15 IU), sníží se relativní zdravotní riziko, které potom zůstane nízké až k hodnotám 1200 IU. Varovná oblast začíná při hodnotách 1200 IU a zvyšuje se při 3000 IU. 26

41 LITERÁRNÍ REŠERŠE Deficit vitamínu E u člověka je poměrně vzácný, ale občas se může vyskytovat u novorozenců a adolescentů. Projevuje se podobnými symptomy jako deficience selenu. Specifické selenoproteiny se také účastní transportu tokoferolů a chrání tokoferoly před oxidací (VELÍŠEK, 2002). Projevem deficitu mohou být neurologické a neuromuskulární disfunkce označované jako myopatie a encefalomalacie. Při nedostatku byla zjištěna i porucha životaschopnosti erytrocytů (THAKUR a SRIVASTAVA, 1996; ZIELINSKI et al., 2001). Velmi vážný nedostatek může být způsoben nemocemi jako je cystická fibróza, abetalipoproteinémie (PRUTHI et al., 2001, EGGERMONT, 2006; PAPAS et al, 2007), Crohnova choroba (AGHDASSI et al., 2003) vředový zánět tlustého střeva a dědičný izolovaný nedostatek vitamínu E. Tato onemocnění brání vstřebávání a transportu vitamínu E. Získaná data dokládají patogenetickou roli oxidace LDL u aterosklerózy a četné studie také ukazují, že α-tokoferol snižuje přístupnost LDL cholesterolu k oxidaci. Mnoho studií také ukazuje, že α-tokoferol nelze nahrazovat jinými antioxidanty (AZZI a STOCKER, 2000) Účinky vitamínu E v klinických studiích V poslední době se často diskutuje o podávání antioxidačních vitamínů zejména vitamínu E, i když dosud žádná větší studie neprokázala jednoznačný pozitivní efekt vitamínové léčby na kardiovaskulární mortalitu a morbiditu. Přesto některé menší experimentální práce měly poměrně slibné závěry (ŠPINAR a kol., 2003). Některé klinické výzkumy a studie jsou uvedeny v tab. 1. V řadě studií byl pozorován příznivý účinek podávání α-tokoferolu či kyseliny askorbové ve vztahu k oxidačnímu stresu, některé studie použily vyšší dávky vitamínu E (500 i více mg denně) a zůstává otevřena otázka kombinace vitamínů E a C (ŠKRHA, 1998). Byly publikovány studie, kde po suplementaci tokoferolu bylo sníženo riziko kardiovaskulárních onemocnění. Tento jev byl pravděpodobně způsoben zvýšenou koncentrací tokoferolu v částicích LDL, které jsou chráněny proti oxidativním změnám vedoucím k rozvoji aterogeneze (ZIMA, 2003). LEE et al. (2005) popsali pozitivní vliv vitamínu E na snížení výskytu kardiovaskulárních chorob a rakoviny, ale podávaná koncentrace vitamínu E neovlivnila dobu smrti pacientů. Další výzkumy se suplementací vitamínu E, probíhající od 70. let 20. století, zjistily snížení výskytu srdeční příhody o % (NHS, HPFS), o 47 % redukci srdeční zástavy (IWHS). Cambridge Heart Antioxidant Study (CHAOS) shledala 47% snížení infarktu myokardu u pacientů s koronární aterosklerózou, kteří přijímali IU vitamínu E denně (EMMERT 27

42 LITERÁRNÍ REŠERŠE a KIRCHNER, 1999). Studie CHAOS (STEPHENS et al., 1996) nalezla sice příznivý účinek vysokých dávek vitamínu E u nemocných s ischemickou chorobou srdeční na výskyt nefatálního infarktu myokardu, jehož výskyt poklesl dokonce o 77 %, ale úmrtí bylo ve skupině léčené vitaminem E o 29 % více. Přesto tento rozdíl, patrně pro malý počet pacientů, nebyl statisticky významný. Výzkumná skupina MORRISE et al. (2002) zjistila, že vitamín E v potravě nebo jako doplněk stravy, zpomaluje stárnutí. Další studie zjistily snížený výskyt rakoviny tlustého střeva, rakoviny plic, prostaty, konečníku, srdečních chorob aj. Vitamín E hraje důležitou roli v prevenci Alzheimerovy choroby a ostatních závažných nemocí mozku a příznivě působí i na pacienty nakažené virem HIV (PAPAS, 2001, AJJAWI a SHINTANI, 2004). Tab. 1 Klinické studie s vitamínem E a efekt léčby na výskyt koronárních příhod Studie n Zdroj vitamínu E Dávka Výsledek ASAP 520 přírodní 91 mg bez efektu ATBC syntetický 50 mg bez efektu CHAOS 2002 přírodní IU signifikantní snížení CHAP 1041 přírodní - signifikantní snížení FSAV bez efektu GISSI syntetický 300 mg bez efektu HOPE 9541 přírodní 400 IU bez efektu HPS syntetický 600 mg bez efektu HPFS syntetický 100 IU signifikantní snížení IWHS snížení NHS signifikantní snížení PPP 4495 přírodní 300 mg bez efektu SPACE 197 syntetický 800 UI signifikantní snížení Pozn.: n = počet pacientů ATBC Alpha-Tocopherol, Beta Carotene Cancer Prevention Study (RAUTALAHTI et al., 1997) ASAP The Antioxidant Supplementation in Atherosclerosis Prevention Study (SALONEN et al., 2000) CHAOS Cambridge Heart Antioxidant Study (STEPHENS et al., 1996) CHAP Chicago Health and Aging Project (MORRIS et al., 2005) GISSI Gruppo Italiano per lo Studio della Sopravviverza nell Infarcto Micardio Prevention Study (GISSI-PREVENZIONE INVESTIGATORS, 1999) HOPE Heart Outcomes Prevention Evaluation (JIALAL et al., 2000) SPACE Secondary Prevention with Antioxidants of Cardiovascular Disease in Endstage Renal Disease (BOAZ et al., 2000) PPP Primary Prevention Project (SACCO et al., 2003) HPS MRC/BHF Heart Protection Study (HEART PROTECTION STUDY COLLABORATIVE GROUP, 2002) HPFS Health Professionals Follow-up Study (GIOVANNUCCI et al., 2007) NHS Nurses Health Study (PAPAS, 2001) IWHS The Iowa Women s Health Study (PAPAS, 2001) FSAV Finnish Study of Antioxidant Vitamin Intake and Coronary Mortality (KNEKT et al., 1994) Nejsou ale publikovány pouze pozitivní studie. Studie ATBC (RAPOLA at al., 1997) sledovala vliv syntetického α-tokoferolu u mužů kuřáků po infarktu myokardu. Tato studie nenalezla statisticky významný vliv vitamínu E na snížený výskyt větších koronárních 28

43 LITERÁRNÍ REŠERŠE příhod. Výzkum MUNTWYLER et al. (2002) nezjistil statisticky významné snížení ani zvýšení výskytu kardiovaskulárních chorob při suplementaci vitamínu E ( IU). Výsledky HPS přinesly jasnou a přesvědčivou odpověď. Léčba koktejlem vitamínů E, C a A neměla pozitivní vliv na výskyt kardiovaskulární mortality a morbidity. Studie nesplnila ani jiný předpoklad, že vitamínová léčba pozitivně ovlivňuje snížení počtu úmrtí na zhoubná onemocnění. Pokud jde o výskyt kardiovaskulárních komplikací, ani zde nebyl žádný rozdíl mezi skupinou léčenou vitamíny a skupinou placebovou (22,7 % resp. 22,6 %). Výsledek studie HPS by měl v tomhle ohledu přesvědčit i skalní příznivce vitamínové léčby, že ke snížení kardiovaskulární úmrtnosti jsou účinnější a mnohdy i levnější cesty než konzumace farmaceutickým průmyslem produkovaných vitamínů (ŠPINAR a kol., 2003). Co říci závěrem? Zatím neexistují přesvědčivé doklady o příznivém vlivu vitamínu E užívaného jako suplementace. Nicméně je důležité aby konzumace vitamínu E byla vyšší. Svědčí pro to velký preventivní význam středomořské diety bohaté na přirozeně se vyskytující vitamíny včetně vitamínu E. Také American Heart Association doporučuje konzumaci vyvážené stravy s přírodními antioxidanty pocházejícími z ovoce a zeleniny Přírodní zdroje vitaminu E a jeho izomerů Primárním zdrojem vitamínu E jsou rostliny, ve kterých obsah a poměr jednotlivých izomerů vitamínu E závisí na druhu rostliny a jejím pletivu. Koncentrace vitamínu E v rostlinných tkáních je od extrémně nízkých hodnot u bramboru k vysokým koncentracím u semen olejnin. Nulové hodnoty tokolů byly zjištěny u žampionu (PIIRONEN et al., 1986). Převažujícím izomerem vitamínu E v nezelených částech rostlin, především v semenech a plodech, je γ-tokoferol (FALK et al., 2004). Potraviny můžeme rozdělit podle obsahu vitamínu E do tří skupin: Za nejbohatší zdroj tokolů jsou považovány oleje ze semen s vysokým obsahem tuků (hladina tokolů µg.g -1 oleje) (AJJAWI a SHINTANI, 2004). Existují však vyjímky a záleží také na typu oleje, procesu rafinace (snížení obsahu vitaminu E na % původního obsahu), teplotě, stupni vakua a délce deodorační fáze. Kokosový olej obsahuje málo tokolů (2,5 mg.100g -1 ). Slunečnicový olej (63 mg.100g -1 ) obsahuje především α-tokoferol, sojový (107 mg.100g -1 ) a kukuřičný olej (93 mg.100g -1 ) z větší části γ-tokoferol (63 %). Tokoferoly kukuřičného oleje jsou známé jako stabilizátory vůně během skladování a vaření. Nejvyšší koncentrace tokolů byla zjištěna 29

44 LITERÁRNÍ REŠERŠE u oleje z pšeničných klíčků (240 mg.100g -1 ) a olej z ječmene obsahuje 90 mg.100g -1 s 62% podílem α-tokotrienolů. Vitamín E (2 62 mg.100g -1 ) byl nalezen také v margarínech, majonéze, salátovém dresinku, sádle a másle (PAPAS et al., 2001; EITENMILLER a LEE, 2004). Ačkoliv tokotrienoly jsou primárně tvořeny v endospermu zrna jednoděložných rostlin, včetně agronomicky důležitých obilovin jako je pšenice, rýže a ječmen, byly také stanoveny v endospermu dvouděložných rostlin. Vysoký obsah tokotrienolů (až 800 mg.kg -1 ) byl zjištěn například u extraktu z palmy olejné obsahující především γ- a α-tokotrienol (NESARETNAM et al., 2007). Do druhé skupiny s vysokým obsahem vitamínu E patří mandle, vlašské ořechy, pistácie, burské a lískové oříšky. Oříšky obsahují mnoho tuku v podobě nenasycených mastných kyselin a při jejich konzumaci je menší pravděpodobnost přeměny LDL cholesterolu na povlak, který ucpává cévy. Třetí skupinu tvoří obiloviny, luštěniny a olejniny, které patří díky vláknině a proteinům mezi nejzdravější potraviny a obsahují méně, přesto rozumné množství, vitamínu E. (PAPAS, 2001; EITENMILLER a LEE, 2004; CHOI et al., 2006). Ko et al. (2003) zjistili, že zrno rýže mělo vyšší obsah celkových tokolů než zrno ječmene, pšenice, kukuřice a semeno sóji. Přičemž v sóji detekovali pouze α-, β-, γ-, δ-tokoferoly. Zrno obilovin je důležitým zdrojem tokotrienolů i přesto, že nemají vysoký obsah lipidů (ZIELINSKI et al., 2001; FALK et al., 2004). Zrno ovsa obsahuje dvakrát více lipidů oproti zrnu ječmene, přesto obsah tokolů je v ovsu poloviční (19 30 mg.kg -1 ) než u ječmene (42 80 mg.kg -1 ) (PETERSON a QURESHI, 1993). U cereálií nejvyšší hladinu tokoferolů zjistil ZIELINSKI et al. (2001) a HOLASOVA et al. (2002) ve vyluštěném zrnu pohanky a v jeho frakci endospermu s embryem převládal γ-tokoferol. α- a β-tokoferol byly hlavními izomery v pšenici, ječmeni, žitu a ovsu. β-tokotrienol byl převládající v pšenici a ovsu. V ječmeni a žitu byl dominantní α-tokotrienol, zatímco v semeni pohanky nebyly nalezeny žádné tokotrienoly. Z analyzovaných frakcí oplodí a osemení pocházela nejbohatší frakce z žita, následovaná pšenicí a ječmenem. PETERSON a QURESHI (1993) a HOLASOVÁ et al. (1998) zjistili, že v některých případech obsah vitamínu E v ječmeni převyšuje až čtyřnásobně množství nalezené u jiných obilných druhů (pšenice 15,6; tritikale 11,8; žito 17,1; oves 14,7 a ječmen 30

45 LITERÁRNÍ REŠERŠE 23,7 mg.kg -1 α-te). Naopak výsledky CAVALLERA et al. (2004) korespondují s daty ZIELINSKI et al. (2001) a ukazují na nižší obsah vitamínu E v zrnu ječmene v porovnání s dalšími obilovinami, ale zjistili vyšší zastoupení tokotrienolů a příznivější rozmístění většiny biologicky aktivních izomerů v ječném zrnu. FALK et al. (2004) uvádí, že α-tokoferol je nejdůležitějším izomerem téměř u všech pletiv zelených rostlin, přesto v jiných studiích je upřednostňován α-tokotrienol, který je účinnější při vychytávání peroxylových radikálů (BARRERA-ARELLANO et al., 1999; PANFILI et al., 2008). U nezelených částí rostlin, zvláště u semen a plodů, byl nalezen především γ-tokoferol. V semenech jednoděložných a dvouděložných se vyskytují ve vyšším množství tokotrienoly. Důvod proč je vyšší zastoupení γ-tokoferolu a tokotrienolů v semenech není prozatím objasněn. Tokoferoly jsou akumulovány v těch částech zrna, které zůstaly a byly zabudovány do nové rostliny, jsou tedy obsaženy v listech a dalších zelených částech rostlin, zatímco lokalizace tokotrienolů je v klíčku, endospermu a perikarpu a tyto izomery jsou tedy degradovány před nebo během klíčení (FALK et al., 2004) Zastoupení vitamínu E v zrnu ječmene V obilném zrnu chrání vitamín E lipidy před oxidací během dormance a klíčení. V zrnu ječmene je zastoupeno všech osm izomerů vitamínu E (KO et al., 2003; CAVALLERO et al., 2004; BŘEZINOVÁ BELCREDI et al., 2006; EHRENBERGEROVÁ, et al., 2006; ANDERSSON et al., 2008). Na základě mnoha studií se ukázalo, že tokoferoly jsou především v klíčku, zatímco tokotrienoly jsou v ostatních částech zrna. V ekologických podmínkách pěstování může docházet k určitým disproporcím ve výživě rostliny a negativní jevy se nejprve projeví v obsahu látek v rezervní části zrna a teprve poté se mohou projevit v zárodečných částech obilky (VELÍŠEK et al., 1995). Různé zastoupení jednotlivých izomerů vitamínu E v zrnu závisí také na druhu rostliny, genotypu, pěstební lokalitě a klimatu (PIIRONEN et al., 1986; PETERSON a QURESHI, 1993; VACULOVÁ et al., 2001; CAVALLERO et al., 2004; EHRENBERGEROVÁ et al., 2006; ANDERSSON et al., 2008). PETERSON a QURESHI (1993) uvádí, že lokalita ovlivnila statisticky významně obsah vitamínu E u ovsa, ale ne u ječmene. BŘEZINOVÁ BELCREDI et al. (2007a) analyzovali vitamín E v zelené biomase ječmene a detekovali přítomnost pouze tokoferolů. 31

46 LITERÁRNÍ REŠERŠE FALK et al. (2004) zjišťovali akumulaci tokoferolů a tokotrienolů v klíčku, endospermu a oplodí během vývoje obilky ječmene. Více tokolů bylo zjištěno v zrnu mléčné zralosti s 85% podílem tokotrienolů oproti zralému zrnu. V klíčku byly zastoupeny hlavně tokoferoly, v oplodí bylo akumulováno malé množství tokoferolů a mnohem více tokotrienolů, zatímco endosperm obsahoval téměř výhradně tokotrienoly. Konečný obsah γ-tokoferolu v klíčku byl stanoven ve stejné době, kdy bylo dosaženo nejvyššího obsahu lipidů v zrnu. Obsah izomeru γ-tokoferolu se až do konce zrání nezměnil, zatímco obsah α-tokoferolu se kontinuálně zvyšoval až do plné zralosti zrna. Ostatní tokoferoly byly v klíčku zastoupeny ve velmi malém množství (< 5 mg.kg -1 suš.), přičemž β- a δ-tokoferol byly detekovány výhradně v této frakci zrna. Obsah α-, β-, a γ-tokotrienolů v oplodí byl vyrovnaný v pozdně mléčné zralosti zrna. Potom se koncentrace β-tokotrienolů zastavila, zatímco obsah α- a γ-tokotrienolů vzrůstal. Izomer δ-tokotrienol byl zastoupen v této frakci zrna v nízké míře. Tokoferoly (hlavně α-tokoferol) byly detekovatelné, až po dosažení maximálního množství obsahu β-tokotrienolů (FALK et al., 2004). Hlavní izomerem vitamínu E v endospermu byl α-tokotrienol a následovaly izomery β- a γ-tokotrienoly. Všechny tokotrienoly byly zastoupeny v konstantní hladině po celou dobu vývoje obilky. V klíčku bylo zjištěno % tokolů, oplodí se podílelo na obsahu tokolů z % a endosperm obsahoval % tokolů (FALK et al., 2004). PANFILI et al. (2008) stanovili rozpětí obsahu celkových tokolů v ječném zrnu 50,3 88,6 mg.kg -1 sušiny s průměrnou hodnotou 69,1 mg.kg -1 suš., EHRENBERGEROVÁ et al. (2006) shledali ve svém souboru 12 odrůd/linií obsah v intervalu 46,72 67,57 mg.kg -1, CAVALLERO et al. (2004) v průměru šestiřadých genotypů ječmene uvádí 51,0 61,4 mg.kg -1 s průměrnou hodnotou celkových tokolů 54,5 mg.kg -1, GOUPY et al. (1999) stanovil obsah celkových tokolů 9,7 44,2 mg.kg -1, BHATTY (1986) uvádí 9,3 15,2 mg.kg -1, PETERSON a QURESHI (1993) mg.kg -1 v obilkách 30 odrůd ječmene pěstovaných na třech lokalitách a ANDERSSON et al. (2008) publikoval celkový obsah tokolů 46,2 68,8 µg.g -1 u deseti pluchatých i bezpluchých odrůd ječmene. Bezpluché genotypy jsou charakterizovány nižší hladinou všech izomerů, ale s vyšším obsahem δ- a γ-tokoferolů (CAVALLERO et al., 2004). Nejvyšší obsah celkových tokolů a aktivitu vitamínu E ve studii EHRENBERGEROVÉ et al. (2006) měla skupina waxy odrůd (67,57 60,32 mg.kg -1 ). Nejvyšší koncentraci 32

47 LITERÁRNÍ REŠERŠE celkových tokolů a aktivitu vitamínu E měla přitom bezpluchá odrůda americké provenience Washonubet (67,57 mg.kg -1 resp. 20,06 mg.kg -1 ). Sladovnické odrůdy měly významně nižší obsah jednotlivých izomerů vitamínu E a tím i nižší celkový obsah tokolů a aktivitu vitamínu E. EHRENBERGEROVÁ et al. (2006) hodnotila i krmnou linii ječmene KM1771, u které zjistila nejnižší aktivitu vitamínu E (13,52 mg.kg -1 ) a obsah celkových tokolů (46,72 mg.kg -1 ). Výsledky korespondovaly s uvedenými hodnotami VACULOVÉ et al. (2001) a BŘEZINOVÉ BELCREDI et al. (2006). U této linie bylo zajímavé to, že obsahovala velice nízký obsah α-, β+γ-tokoferolů a α-tokotrienolů, ale vynikala v obsahu β+γ- a δ-tokotrienolů (BŘEZINOVÉ BELCREDI et al., 2006). V celkovém průměru sledovaných genotypů ječmene převládaly tokotrienoly nad tokoferoly (EHRENBERGEROVÁ et al., 2006), přičemž VACULOVÁ et al. (2001) uvádějí poměr 5:1 (83,6 %:16,4 %), FALK et al. (2004) potvrdil toto zjištění poměrem 85 %:15 %, CAVALLERO et al. (2004) zjistili poměr 3,5:1 (78 %:22 %), EHRENBERGEROVÁ et al. (2006) a BŘEZINOVÁ BELCREDI et al. (2006) uvedli výsledky shodné s údaji CAVALLERA et al. (2004) s poměrem 77 %:23 % % ze všech izomerů vitamínu E bylo zastoupeno α-tokotrienolem (CAVALLERO et al., 2004; BŘEZINOVÁ BELCREDI et al., 2006; EHRENBERGEROVÁ et al., 2006; PANFILI et al., 2008), což představovalo 65 72% podíl α-tokotrienolu z celkových tokotrienolů (CAVALLERO et al., 2004; EHRENBERGEROVÁ et al., 2006; PANFILI et al., 2008). Ječmen má vysoký obsah α-tokoferolu (11 20 % z celkových tokolů), γ-tokotrienolu (9-22 %), β-tokotrienolu (5 20 %) a menší podíl tvoří izomery γ-tokoferolu (2 10 %) a β-tokoferolu (0,6 2 %) (CAVALLERO et al., 2004; PANFILI et al., 2008). PETERSON (1994) zjistil nejvyšší množství α-tokoferolu v klíčku (174,65 mg.kg -1 ), v endospermu bylo pouze 1,05 mg.kg -1, vyšší obsah byl v pluchách (9,62 mg.kg -1 ) a v celém zrnu ječmene bylo 5,96 mg.kg -1. Snížení koncentrace α-tokoferolu v celém zrnu je přičítáno odstranění pluch a ztrátě % α-tokoferolu v klíčku. S dalším opracováním obilek dochází k jejich odírání. Průměrný úbytek hmotnosti obilky bývá 0,8 3,8 mg. S hmotnostním úbytkem se sníží obsah tokolů, jejichž množství je vyšší v aleuronové a subaleuronové vrstvě než ve škrobnatém endospermu. Během sladování (klíčení) se obsah tokolů významně nemění (zrno 56,7 mg.kg -1, slad 52,0 mg.kg -1 ), zato mláto obsahuje třikrát více tokolů (152,9 mg.kg -1 ) oproti zrnu a sladu. Vyšší obsah tokolů lze vysvětlit tím, že při klíčení došlo k rozštěpení škrobu a rozpustných proteinů a tokoly zůstaly v nerozpustném podílu materiálu (PETERSON, 1994). 33

48 LITERÁRNÍ REŠERŠE Vliv potravinářského zpracování na obsah vitamínu E Během zpracování a skladování cereálií nepřesahují ztráty vitamínu E zpravidla 10 % původního obsahu (VELÍŠEK, 2002). Extruzní opracování vede k významnému poklesu obsahu tokoferolů a tokotrienolů (63 94 %). Tokoferoly a α-tokotrienoly vykazují nejnižší odolnost k hydrotermálnímu opracování. Ostatní tokoferoly jsou stabilnější, přesto stupeň degradace může být téměř 50% (ZIELINSKI et al., 2001). Někteří autoři se zamýšlí nad zvýšením obsahu tokolů v mouce mechanickými způsoby (mletí, prosévání, vzduchové třídění) (WANG et al., 1993) a následným použitím jako ingredience do potravin nebo pomocí extrakce získávat čisté složky s vysokým stupněm specializace pro kosmetické a zdravotní účely (COLOMBO et al., 1998). PETERSON (1994) uvádí, že po úpravě zrna na loupačkách se obsah α-tokoferolu o polovinu snížil oproti obsahu v celém zrnu. K největším ztrátám dochází při smažení a pečení. Při těchto tepelných úpravách rychlost odbourání tokolů záleží na podmínkách tepelného procesu a na přítomnosti polyenových mastných kyselin. Mezi nejméně stabilní je zařazen α-tokoferol, pak následují izomery β- a γ-tokoferoly a δ-tokoferol (BARRERA-ARELLANO et al., 1999). K dalšímu snížení obsahu vitaminu E může docházet při mrazírenském skladování potravin obsahujících vyšší množství polyenových mastných kyselin. Při sušení ovoce a zeleniny bývají ztráty vitamínu E % (VELÍŠEK et al., 2002). Pro fortifikaci potravin a pro farmakologické účely se používá syntetický α-tokoferol a jeho estery nebo přírodní směs RRR-α-tokoferolů, získaná jako vedlejší produkt při rafinaci (resp. deodoraci) olejů z deodoračních kondenzátů (VELÍŠEK, 2002). Fortifikovaný vitamín E byl detekován u snídaňových cereálií, oříšků, vajec, sóji, mléka, rajčatových produktů, chipsů (THAKUR a SRIVASTAVA, 1996). LEONARDO et al. (2004) zjistili, že vitamín E v cereáliích (30 IU) je biologicky dostupnější než tablety s obsahem 400 IU. Vitamín E se také přidává ve vysokých dávkách nejčastěji ve formě α-tokoferolacetátu do krmiv hospodářských zvířat pro zlepšení kvality a skladovatelnosti masa (HOSMANOVÁ a DOUŠA, 2007). Nejvíce je obsah jednotlivých vitamerů v živočišných tkáních ovlivněn složením krmiva a ročním obdobím Enzym superoxiddismutasa (SOD, E.C ) V roce 1969 objevili McCord a Fridowich (MCCORD a FRIDOVICH, 1969) vysoce aktivní obranný systém proti působení volných kyslíkových radikálů, a to metaloenzym 34

49 LITERÁRNÍ REŠERŠE superoxiddismutasu (SOD, E. C ) správně nazývaný superoxid/superoxid oxidoreduktasa (FRIDOVICH, 1986), který byl do této doby pouze předmětem mnoha výzkumů ve všech oblastech biologie (BOWLER et al., 1994) Funkce enzymu superoxiddismutasy Dnes patří SOD mezi nejzajímavější enzymy s antioxidačními účinky, protože jedinou jeho funkcí je přeměňovat nebezpečné superoxidové volné radikály na kyslík a méně reaktivní peroxid vodíku podle uvedené reakce: superoxiddismutasa 2O H H 2O2 + O2 (BENSINGER a JOHNSON, 1981; HASAN a FRIDOVICH, 1981; BAMFORTH, 1983; FRIDOVICH, 1995; PRÝMA et al., 2000; HALLIWELL, 2002; PACKER, 2002; MENG et al., 2007). Vzniklý peroxid vodíku snadno difunduje membránami, má relativně dlouhý poločas rozpadu a může tedy způsobovat oxidační poškození buněk. Ve Fentonově reakci může být přeměněn na vysoce reaktivní hydroxylový radikál působením přechodných kovů (např. Fe 2+, Cu 2+ ). Uvedenou reakcí SOD zabraňuje převedení superoxidového radikálu (O 2 - ) na hydroxylový radikál (OH ) (HASAN a FRIDOVICH, 1981). Tato spontánní reakce je při ph 7 velmi rychlá a přesto ji příroda urychlila tímto enzymem o další čtyři řády (rychlostní konstanta je pak dm 3.mol -1.s -1 ) (MALIŠKOVÁ, 2004). Úloha SOD tedy spočívá především v ochraně buněčných membrán před jejich poškozením volnými radikály. Představuje tedy ochranu rostlin zejména při nepříznivých vnějších podmínkách růstu a vývoje Kyslíkové radikály a reaktivní formy kyslíku vyskytující se v reakci s enzymem superoxiddismutasou Tvorba aktivních forem kyslíku probíhá u všech rostlin, a to i při jejich růstu v optimálních podmínkách. První sloučeninou vznikající částečnou redukcí kyslíku je superoxid. Další redukcí superoxidu vzniká peroxid vodíku. Superoxid ani peroxid vodíku nejsou považovány za nejsilnější ROS, ale jejich společný výskyt může vést ke vzniku vysoce reaktivního hydroxylového radikálu. Superoxidový anion superoxid (O 2 - ) Superoxid je nejčastěji se vyskytující radikál v živých organismech, vzniká jednoelektronovou redukcí molekulárního kyslíku a sám o sobě není příliš reaktivní, 35

50 LITERÁRNÍ REŠERŠE ale jeho nebezpečí spočívá v tom, že z něj mohou vznikat další mnohem škodlivější reaktivní formy kyslíku (peroxid vodíku, hydroxylový radikál, kyselina chlorná aj.). Ve vodném prostředí a za neutrálního ph je poměrně málo reaktivní, má oxidační i redukční vlastnosti. Superoxid vzniká v organismu v řadě enzymových i neenzymových reakcí, mezi významné zdroje patří elektronové přenašeče dýchacího řetězce v mitochondriích a při fotosyntéze v chloroplastech. Některé rostlinné tkáně vytváří superoxid působením NADPH-oxidasy, ta se aktivuje při fagocytóze či napadení rostlinného pletiva škodlivou látkou a superoxid s dalšími látkami z něho vzniklými mají za úkol mikroby usmrtit (FRIDOVICH, 1975; RACEK, 2003). Dalším způsobem vzniku superoxidového anionu je gamma záření, mikrovlnné nebo radioaktivní záření (CHOE a MIN, 2005). Peroxid vodíku (H 2 O 2 ) Vzniká v organismu dismutací superoxidu a sám o sobě je málo reaktivní. O + dismutace 2 + O2 + 2H H 2O2 + O2 Prochází snadno buněčnými stěnami a může difundovat velmi daleko od místa svého vzniku a pomalu oxidovat řadu látek. Nebezpečný je především ve spojení s ionty železnatými nebo měďnatými, kdy dává vznik hydroxylovému radikálu při Fentonově reakci: Fe 2 + Fentono var eakce 3+ + H 2O2 Fe + OH + HO V organismu je peroxid vodíku odstraňován především katalasami a peroxidasami (CHOE a MIN, 2005; ZIMA et al., 1996). Hydroxylový radikál (OH ) Ze všech reaktivních forem kyslíku je nejvíce reaktivní a je schopen atakovat všechny typy biologicky významných molekul, lipidy, proteiny, DNA. Tento radikál způsobuje oxidativní poškození v místě svého vzniku vzhledem ke svému poločasu rozpadu, který se odhaduje na 10 9 s. V organismu hydroxylový radikál vzniká za účasti iontů přechodných kovů disproporcionací superoxidu s peroxidem vodíku, kdy s OH vzniká i singletový kyslík. Reakce se označuje jako Haber-Weissova reakce (BAMFORTH et al., 1993; BOWLER et al., 1994; HASAN a FRIDOVICH, 1981; RACEK, 2003): O + H Haber Weisso var eakce 2O2 HO + OH + O2 36

51 LITERÁRNÍ REŠERŠE Chemická struktura enzymu superoxiddismutasy Rozlišujeme tři druhy SOD lišící se kofaktorem, kterým je vždy atom kovu: mangan (Mn 2+ SOD), železo (Fe 2+ SOD) nebo měď se zinkem (Cu 2+ Zn 2+ SOD) (BOWLER et al., 1992, HASAN a FRIDOVICH, 1981, MURRAY et al., 1998; RACEK, 2003; ZIMA et al., 1996). Enzymy SOD obsahující ionty Fe 2+ a Mn 2+ jsou strukturálně velmi podobné, na rozdíl od CuZnSOD, která s nimi strukturálně nesouvisí. Mechanismus katalýzy je pro všechny typy stejný, v podstatě zahrnuje proteinovou strukturu ohraničenou kladně nabitými zbytky aminokyselin, jež vytváří elektrostatický pokles pro přitažlivost superoxidových radikálů k aktivnímu místu. Kov přítomný v aktivním místě enzymu pak provede transport mezi dvěmi superoxidovými radikály a podstoupí oxidačně-redukční reakci (BOWLER et al., 1994). Přítomnost SOD v rostlinách je může opětovně chránit proti nepříznivým okolním podmínkám (BOWLER et al., 1992, 1994; GUPTA et al., 1993). FeSOD má strukturu dimeru o molekulová hmotnosti 23kDa a obsahuje dvě až čtyři identické podjednotky. Ve srovnání se zvířaty, kde se nevyskytuje, byl nalezen v několika rostlinných druzích a studie ukázaly, že pokud je přítomen, vyskytuje se v chloroplastu. MnSOD, prozatím prostudovanější než FeSOD, se objevuje v mitochondriální matrix všech doposud studovaných rostlin. Enzym je složen ze stejných jednotek buď jako dimer či tetrametr. CuZnSOD byl stanoven v širokém spektru organismů včetně kvasinek, léčivých rostlin (BOWLER et al., 1994), ze zelenin např. mrkvi, špenátu, zelí aj. (AGA et al., 1998), obilninách nebo i v krvi skotu (BENSINGER a JOHNSON, 1981) či člověka. Enzym je dimer, který je složen ze dvou identických subjednotek vyskytující se v cytosolu nebo ve stroma chloroplastu nebo tetramer nalezený v tkáních člověka (FRIDOVICH, 1986), CuZnSOD také ve stroma chloroplastu (BOWLER et al., 1994). Počet jednotlivých isoenzymů se liší od rostliny k rostlině. V zelených listech převládá především chloroplastová SOD, zatímco u klíčících rostlin a oslabeném materiálu SOD mitochondriální a cytoplasmatická. Toto rozmístění podle všeho odráží změny vyskytující se v subcelulárních místech vytváření oxiradikálů, a to během fotosyntetických reakcí, které převládají v buněčném metabolismu; proto je důležitá potřeba zvýšených SOD v chloroplastech (BOWLER et al., 1994). 37

52 LITERÁRNÍ REŠERŠE Metody používané při stanovení volných radikálů a enzymu SOD Přímé měření volných radikálů vzhledem k jejich krátké životnosti je v klinické praxi obtížné. Většina měření vychází ze stanovení látek vzniklých působením volných radikálů v organismu (ZIMA et al., 1996). Pro přímou detekci a identifikaci volných radikálů lze ale použít elektronovou paramagnetickou spinovou rezonanční spektrometrii. Přímé stanovení je zatím prováděno pro superoxid, nitroxidový radikál, hydroxylový radikál, singletový kyslík a six lines spectra (volné radikály organických látek) (HOLEČEK, 2006). Pro detekci hydroxylového radikálu je využívána reakce s radikálovými zhášeči (tokoferoly, retinoly, karotenoidy) a vzniklé produkty jsou identifikovány pomocí plynové chromatografie, HPLC, absorpční spektroskopií aj. Pro stanovení množství peroxidu vodíku se využívají metody založené na oxidaci dimethylmočoviny, radioaktivně značeného methanolu nebo cytochrom-c-peroxidasa. Spektrofotometrické metody stanovení peroxidu vodíku jsou prováděny s použitím činidel typu dichlorfenol-indofenolu nebo reakcí železitých iontů s xylenovou oranží. Lipoperoxidaci lze detekovat pomocí měření úbytku oligonenasycených mastných kyselin, úbytku antioxidantů, spotřebou kyslíku, pomocí stanovení hladiny lipohydroperoxidů a konjugovaných dienů, měřením tvorby fluoreskujících lipidových aldehydů a detekcí lipidových radikálů (HAVLOVÁ, 2006). Kumulativní efekt oxidačního stresu na celé buňky lze vyhodnotit z celkového vyčerpání antioxidační ochrany a ze zvýšené hladiny oxidovaných molekul v buňce (redoxní stav buňky) (HAVLOVÁ, 2006). K posouzení antiradikálové aktivity antioxidantů nebo jejich směsí v biologických vzorcích se často používají metody založené na zhášení stabilních barevných organických radikálů. K nejčastěji používaným patří 2,2-difenyl-1- pikrylhydrazylu (DPPH) a radikál generovaný oxidací 2,2-azinobis(3-ethybenzthiazoline- 6-sulfonové kyseliny) (ABTS) (CHVÁTALOVÁ a SLANINA, 2004). Pro stanovení celkové antioxidační hladiny krevního séra či plazmy lze také použít diagnostickou soupravu Randox Total Antioxidant Status, která je založena na reakci mezi metmyoglobinem a hydrogen peroxidem při vlnové délce 600 nm. Stanovení aktivity enzymu SOD lze provést metodami přímými a nepřímými. Ve výzkumu i v praxi jsou více využívány metody nepřímé nevyžadující komplikované uspořádání a náročnou instrumentaci jako metody přímé (HAVLOVÁ, 2006). 38

53 LITERÁRNÍ REŠERŠE Přehled nepřímých metod (BAMFORTH, 1983) Nepřímé metody jsou založeny na reakci superoxidového radikálu s vhodnými indikátory za vzniku barevných sloučenin a intenzita zbarvení je měřena spektrofotometricky. Stanovení pomocí xanthinoxidasy a cytochromu c Metoda využívá systém xanthinu a xanthinoxidasy, který vytváří superoxidový radikál redukující cytochrom c. Absorpční spektrum redukované a oxidované formy cytochromu c se liší, takže lze změnu jeho redoxního stavu fotometricky měřit při 550 nm. Aktivita SOD se měří v 1 cm plastových kyvetách, kam se napipetuje měřený vzorek, 150 µmol fosforečnanu draselného o ph 7,8; 0,3 µmol EDTA; 0,03 µmol cytochromu c; 0,15 µmol xanthinu a takové množství xanthinoxidasy, aby došlo ke zvýšení absorbance při 550 nm o 0,01 0,025/min. Reakční směs se doplní do 3 ml destilovanou vodou. Všechny reagencie se napipetují do kyvety kromě xanthinu a inkubují se při teplotě 25 C. Pro odstartování reakce se po 2 minutách přidá do kyvety xanthin. Redukce cytochromu c následně zaznamenána jako zvýšení absorbance v intervalu 3 minut. Tato metoda měla být nahrazena novou metodikou používající diagnostický set Ransod (RANDOX, Velká Británie), který je určen pro stanovení SOD ve vzorku krve. Novou metodiku jsem modifikovala (viz. Kapitola 4.4.) pro stanovení SOD ve vzorku zrna a sladu ječmene (BŘEZINOVÁ BELCREDI a EHRENBERGEROVÁ, 2009). PAGE (Polyakrylamid gel elektroforéza) Provádí se v 7% polyakrylamidovém gelu při ph 8,3 metodou dle DAVISE (1964). Stanovení pomocí nitrotetrazolové modři (Nitro Blue Tetrazolium, NBT) Redukcí NBT vzniká barevný precipitát formazan. Gel se inkubuje se substrátem, fenazin metosulfátem (phenasine methosulphate, PMS) a tetrazoliovými barvivy ve tmě při 37 C a potom se vystaví ultrafialovému záření (UV-lampa, sluneční světlo). Výsledkem jsou světlé skvrny na tmavém pozadí (negativní detekce). Přehled přímých metod Elektronová paramagnetická rezonance Metodou lze detekovat radikály až do koncentrace 10-8 mol.l

54 LITERÁRNÍ REŠERŠE Absorpce UV/VIS záření Superoxidový radikál se generuje z draselné soli v alkalickém ph a vznik radikálu se sleduje při 250 nm v přítomnosti i nepřítomnosti SOD. Jednotka aktivity se vyjadřuje jako aktivita enzymu při dismutaci dvou superoxidových radikálů Výskyt enzymu superoxiddismutasy Enzym SOD byl nalezen téměř, až na zanedbatelné vyjímky, u všech aerobních organismů (MCCORD et al., 1971; RACEK, 2003), v některých aerotolerantních anaerobech (TALLY et al., 1977), obligátních anaerobech (HEWITT a MORRIS, 1975) a zdá se, že déle žijící živočichové mají vyšší hladinu tohoto enzymu, přičemž nejvyšší hladina SOD byla zjištěna u člověka (PRÝMA et al., 2000) Enzym superoxiddismutasa v zrnu ječmene Antioxidační enzym SOD v zrnu ječmene je nejvíce lokalizován v embryu, ale menší množství se nachází v aleuronové vrstvě. Větší podíl z celkové aktivity enzymu u ovsa (62 %) byl detekován v endospermu (GIANNOPOLITIS a RIES, 1977), zatímco u ječného endospermu BAMFORTH (1983) zjistil nedetekovatelné množství. Podle GIANNOPOLITISE a RIESE (1977) obsahuje embryo u kukuřice desetkrát více enzymu SOD než endosperm a SOD je podle nich přítomna v kořenech, výhoncích, semenech pšenice, kukuřice a hrachu. V zrnu a v zeleném sladu je SOD poměrně tepelně stabilní, ale ničí se rmutováním. Množství SOD v zrnu ječmene se mění v závislosti na odrůdě a lokalitě (BAMFORTH, 1983; HAVLOVÁ, 1999; BELCREDIOVÁ et al., 2006). Jeho aktivitu je možné ovlivnit změnou podmínek při sladování, ale také teplotou při klíčení a stupněm domočení. S počtem dnů klíčení roste aktivita enzymu až do čtvrtého a pátého dne klíčení a šestý den se již hodnoty aktivit nemění, nebo dochází k mírnému poklesu (BAMFORTH, 1983; HAVLOVÁ, 1994, 1999; HAVLOVÁ et al., 1996). MENG et al. (2007) zjistili, že při delší době máčení ječmene dochází také ke snížení aktivity SOD, což je zřejmě způsobeno vyšší teplotou při sušení, kdy dojde k inaktivaci enzymu. CLARKSON a LARGE (1992) zjistili, že aktivita SOD po hvozdění sladu určeného pro výrobu ležáku byla 2krát vyšší než ve světlém sladu a BOIVIN et al. (1993) uvádějí, že také speciální slady a zejména čokoládový slad vykazují silnou antioxidační aktivitu. Aktivita SOD v zrnu ječmene byla naměřena v intervalu U.g -1 sušiny (BOIVIN, 2001; BELCREDIOVá et al., 2006), zatímco ve sladu byla aktivita vyšší, a to v intervalu U.g -1 sušiny (BELCREDIOVÁ et al., 2006). Nejvyšší aktivitu tohoto 40

55 LITERÁRNÍ REŠERŠE enzymu U.g -1 sušiny zjistili BŘEZINOVÁ BELCREDI et al. (2007b) v zelené biomase ječmene. BOIVIN (2001) uvádí, že by se SOD z ječmene mohla využívat jako antioxidant v pleťové kosmetice, podobně BŘEZINOVÁ BELCREDI et al. (2007b) doporučují její využití pro výrobu doplňků stravy. Aktivita SOD je stimulována zvýšenou tvorbou superoxidu, což se může projevit například při změnách parametrů oxidace (ZIMA et al., 1996). Malé množství superoxidu vzniká i při sladování a vede k vytvoření velice reaktivního hydroxylového radikálu (MENG et al., 2007), který je považován za hlavního iniciátora škodlivých efektů na biochemické systémy buněk, které se ve výsledku projeví sníženou stabilitou senzorických vlastností piva (BAMFORTH a PARSONS, 1985). Přítomnost superoxidového anionového radikálu v zrnu ječmene resp. sladu i pivu může mít vliv na peroxidaci lipidů, degradaci polysacharidů, inaktivaci enzymů, snížení vitality kvasinek, pokles koloidní stability, změnu barvy, nežádoucí příchutě piva během skladování (HAVLOVÁ, 1999; BOIVIN, 2001, MENG et al., 2007). Podle BAMFORTHA a PARSONSE (1985) je obsah SOD v zrnu dostačující k prevenci volných radikálů během klíčení, sušení a sladování. Pro zlepšení senzorických vlastností doporučují přidat při kvašení sojový extrakt, který zlepší senzorické vlastnosti piva, pravděpodobně díky vysoké aktivitě SOD. Na druhé straně se nedoporučuje přidávat tento extrakt během sladování. Pokud SOD u rostlin funguje pouze z části, potom produkuje rostlina více fenolických vazeb (tmavé skvrny), aby ohraničila zdravé pletivo, potom ethylen, aby zasažený list rychleji odumřel a tím ochránila zbytek rostliny a zvláště orgány tvořící výnos. Asimilační výkon zasaženého listu potom klesá. Produkci SOD podporují strobiluriny a některé azoly (např. Epoxiconazol, Prothioconazol) za předpokladu dobrého zásobení mikroprvky (Mn, Cu, Zn), a proto hnojení těmito mikroprvky je tak důležité (STUDENÁ, 2006). Snížená aktivita SOD může následkem nedostatečného odstraňování superoxidu poškodit organismus působením ROS. Řada pokusů se snažila zvýšit aktivitu CuZnSOD a MnSOD ve tkáních rostlin pomocí genového inženýrství (přenesením genu SOD z příbuzné rostliny) nebo selekcí jedinců se zvýšenou aktivitou enzymu (BOWLER et al., 1992; RACEK a HOLEČEK, 1999). Předpokládalo se, že takto pozměněné rostliny budou vitálnější, s vyšší odolností k oxidativnímu stresu a mj. i k herbicidu na bázi paraquatu, který působí poškození organismů právě zvýšenou tvorbou superoxidu. Tento předpoklad se však potvrdil jen v některých případech (RACEK a HOLEČEK, 1999). BŘEZINOVÁ 41

56 LITERÁRNÍ REŠERŠE BELCREDI et al. (2007c) sledovali vliv aplikace zinku ve formě síranu a oxidu zinečnatého na aktivitu SOD v zrnu ječmene. Zinek byl aplikován na porost šesti sladovnických odrůd v růstových fázích DC31 a 57 a byl porovnán s kontrolou. Statisticky významné zvýšení bylo zjištěno pouze u odrůdy Jersey v DC 31. U zelené biomasy ječmene z porostů rovněž ošetřených zinkem, nebyly zjištěny žádné rozdíly mezi vzorky po jeho aplikaci a vzorky kontrolními (HAVLOVÁ et al., 2005) Pokles aktivity ve stáří člověka je součástí celkového oslabení antioxidační ochrany. Absence aktivity SOD má pro organismus závažné následky, například u člověka deficit CuZnSOD vede k postižení neuronů v mozkové kůře a míše (amyotrofická laterální skleróza. Naopak zvýšená aktivita CuZnSOD ve tkáních doprovází četná tzv. onemocnění z volných radikálů, kdy zvýšená tvorba superoxidu stimuluje syntézu enzymu a u člověka tak dochází ke sklerotickému postižení cév, Alzheimerově chorobě, revmatoidní artritidě aj. SOD může být jako léčebný přípravek podána intraartikulární cestou u nemocných revmatoidní artritidou pro snížení zánětlivých projevů v kloubu (RACEK, 2003; RACEK a HOLEČEK, 1999). SOD podaná intravenózně má vzhledem k velikosti molekuly (Mr ) velmi rychlý poločas rozpadu 3 až 5 minut. Byl vyvinut přípravek Peroxinom N obsahující orgotein (hovězí SOD) v dávce 4 a 8 mg (v ČR zatím neregistrován) (ZIMA et al., 1996). 42

57 CÍL PRÁCE 3 CÍL PRÁCE Prvním dílčím cílem disertační práce byla modifikace metodiky analýzy enzymu superoxiddismutasy pomocí setu Ransod, který je určen pro stanovení enzymu v krvi, na stanovení ve vzorcích zrna ječmene jarního a sladu. Tato inovovaná metoda má nahradit původní metodu dle BAMFORTHA (1983). Druhým dílčím cílem bylo stanovení variability aktivity enzymu superoxiddismutasy a vitamínu E, obsahu celkových tokolů a izomerů tokoferolů a tokotrienolů u sledovaného souboru odrůd a linií zrna ječmene jarního. Soubor obsahoval sladovnické odrůdy registrované v České republice, waxy odrůdy (USA provenience), linie vyšlechtěné křížením předchozích dvou skupin a linie vyšlechtěné v Zemědělském výzkumném ústavu Kroměříž, s.r.o. Třetím dílčím cílem bylo porovnání dosažených výsledků vzorků zrna z pokusu s individuálně pěstovanými rostlinami s výsledky vzorků zrna a sladu z maloparcelního pokusu se směsnými (bulk) vzorky rostlin. Nad rámec disertační práce bylo vytvoření nových kříženců, stanovení a porovnání hladiny aktivity superoxiddismutasy, vitamínu E a obsahu jeho izomerů se stávajícími odrůdami a liniemi. 43

58 MATERIÁL A METODIKA 4 MATERIÁL A METODIKA 4.1 Charakteristika pokusné lokality a metodika pěstování polních pokusů Charakteristika lokality Žabčice Pozemky Školního zemědělského podniku (ŠZP) MZLU v Žabčicích leží v Dyjskosvrateckém úvalu, který je tvořen převážně sedimenty neogenními. Geologický útvar je reprezentován čtvrtohorními štěrky a částečně aluviálními naplaveninami. Půdy v katastru ŠZP jsou neutrální až slabě kyselé s nedostatkem humusu. Jsou zde zastoupeny půdy písčité, kterých je převaha, až po půdy jílovité. Nejčastěji se zde vyskytují genetické půdní typy černozemě, mírně podzolované drnové půdy a nivní půdy glejové. Pozemky jsou většinou rovinatého charakteru s průměrnou nadmořskou výškou 185 m a spadají do kukuřičné výrobní oblasti. Klima v oblasti stanoviště Žabčice není pro zemědělskou výrobu zvlášť příznivé. ŠZP leží v jihomoravské suché oblasti s typickým vnitrozemským klimatem s průměrnými ročními srážkami 480 mm ( ), za vegetační období (duben červenec, ) 221,7 mm. Srážkově nejbohatším měsícem je červen s 68,6 mm a nejsušším měsícem je březen s 23,9 mm. Suchost klimatu zvyšují větry, které způsobují velký výpar půdní vláhy. Do oblasti pokusné stanice zasahuje též dešťový stín. Vodní srážky ve vegetačním období jsou rozloženy velmi nerovnoměrně. Lokalita Žabčice je na základě Langova dešťového faktoru (LDF), který se pohybuje okolo 55, považována za oblast semihumidní a pro pěstování obilnin je nejvhodnější oblast s LDF Pozemky patří do okrsku A3, což je teplá oblast, mírně suchá, s mírnou zimou a kratším slunečním svitem v době vegetace. Patří mezi nejteplejší oblasti v ČR. Dlouhodobá průměrná roční teplota je 9,2 C ( ) a průměrná teplota za vegetační období (duben červenec, ) je 15,3 C. Nejteplejším měsícem v roce je červenec s průměrnou denní teplotou vzduchu 19,3 C a nejchladnějším měsícem je leden s průměrnou teplotou -2,0 C. Délka slunečního svitu kolísá v rozmezí hodin za rok. 44

59 MATERIÁL A METODIKA Pokusný rok 2004 Pokusný rok 2004 lze z hlediska dlouhodobého průměru ( ) považovat za normální. Průměrná roční teplota činila 9,8 C, což byla o 0,6 C vyšší teplota než dlouhodobý teplotní průměr Průměrná teplota za vegetační období (duben červenec) byla 15,8 C, což bylo o 0,5 C více než je dlouhodobý průměr. Celkem za celý rok spadlo 481,6 mm atmosférických srážek, což převýšilo dlouhodobý srážkový průměr pouze o 0,3 %. Srážek v období vegetace bylo 156,1 mm, což představuje 70,4 % dlouhodobého průměru. Rok 2004 byl považován s ohledem na množství srážek za suchý. Zásadní vliv na vývoj a stav porostů měl průběh klimatických podmínek v průběhu měsíce května (13,9 C, 28,3 mm) a června (18,0 C, 65,2 mm), kdy přetrvávalo velmi chladné počasí s dostatečným množstvím srážek, což se velmi příznivě projevilo na vývoji obilovin a slibovalo velmi slušnou úrodu. Polní pokusy byly na ŠZP MZLU v Žabčicích zasety 1. dubna 2004 a sklizeny 28. července Předplodinou byla pšenice jarní Pokusný rok 2005 Tento pokusný rok je možné považovat z hlediska dlouhodobého průměru teplot ( ) za ročník normální. Průměrná roční teplota činila 9,3 C, čímž byla teplota o 0,1 C vyšší než je dlouhodobý teplotní průměr. Průměrná teplota za vegetační období (duben červenec) byla 16,0 C, což je o 0,7 C více než je dlouhodobý průměr. Atmosférických srážek spadlo za celý rok 508,9 mm, což je 94,3 % dlouhodobého průměru. Rok 2005 byl považován s ohledem na množství srážek za normální. Měsíc červenec byl na srážky nejbohatší (103,1 mm) a nejméně srážek spadlo v březnu (5,8 mm). Úhrn srážek v průběhu vegetace byl 265,6 mm, čímž představuje 119,8 % dlouhodobého průměru. Polní pokusy byly zasety po pšenici jarní na ŠZP MZLU v Žabčicích 31. března 2005 a byly sklizeny 25. července Pokusný rok 2006 Tento pokusný rok lze z hlediska dlouhodobého průměru teplot ( ) považovat za normální. Průměrná roční teplota činila 9,8 C, což je o 0,6 C vyšší teplota než je dlouhodobý teplotní průměr Průměrná teplota za vegetační období 45

60 MATERIÁL A METODIKA (duben červenec) byla 16,8 C, což bylo o 1,5 C více než je dlouhodobý průměr. Celkem za rok 2006 spadlo 481,6 mm atmosférických srážek, což je 100,3 % dlouhodobého průměru a tento rok byl považován za normální. Za vegetační období spadlo 275,6 mm atmosférických srážek, což představuje 124,3 % dlouhodobého průměru. Na většině území byla během zimy vysoká sněhová pokrývka, která setrvala až do konce března. Vysoké teploty, které následovaly, velmi rychle sníh rozpustily a půda nebyla schopná vodu z tání pojmout a došlo k velkému zpoždění všech polních prací. Polní pokus byl zaset po pšenici jarní až 20. dubna Průběh počasí v červnu byl značně různorodý, první polovina měsíce se vyznačovala chladným počasím téměř bez srážek a ve druhé polovině měsíce došlo k jednorázovým silným srážkám s teplotami C. V červenci byla situace naprosto nečekaná. Ve všech pěstitelských oblastech byl zaznamenán velký deficit srážek a velmi vysoké teploty hlavně v druhé polovině měsíce, které na celém území dosahovaly tropických hodnot. Obiloviny vlivem vysokých teplot a vláhového deficitu spíše dosychaly než dozrávaly. V první dekádě srpna se ochladilo a nastalo dlouhé období dešťů. Pro úrodu to znamenalo velmi výrazné snížení kvality sklizeného produktu popř. jejich znehodnocení. Polní pokus byl sklizen 31. července Metodika polních pokusů Pokus s individuálně pěstovanými rostlinami Polní pokusy (Obr. 8) byly založeny ručním výsevem na ŠZP MZLU v Žabčicích v letech Parcelky s odrůdami/liniemi (Tab. 2) byly vysety ve sponu 10 x 15 cm ve dvou opakováních, přičemž v prvním opakování byl sled odrůd postupný a v druhém následovaly odrůdy/linie nejprve s lichým označením a pak se sudým. Od každé odrůdy/linie bylo vyseto 10 řádků po deseti zrnech. Osivo nebylo mořeno a v průběhu vegetace nebyly použity žádné pesticidy ani herbicidy. Pokus byl obsetý ječmenem jarním odrůdou Nordus a oplocen. Rostliny byly sklizeny individuálně vytrháváním a zrno z rostlin bylo vymláceno v klasové mlátičce. Poté bylo zrno přečištěno, byl stanoven počet zrn v klasu (ks), hmotnost zrn (g), HTS (g) a následně homogenizováno. Odebrané vzorky zrna z jednotlivých rostlin byly podrobeny chemickým analýzám. Soubor odrůd/linií byl sestaven z geneticky odlišných genotypů a předpokládal se u nich rozdílný obsah antioxidačních látek. Ve vzorcích zrna byla hodnocena aktivita enzymu superoxiddismutasy a vitamínu E včetně celkových tokolů a obsahu jednotlivých izomerů, tj. tokoferolů a tokotrienolů. Na Ústavu pěstování, šlechtění rostlin 46

61 MATERIÁL A METODIKA a rostlinolékařství jsem připravila vyextrahovaný nezmýdelněný podíl vzorku. Chromatografické stanovení vitamínu E u připravených vzorků bylo následně provedeno metodou HPLC s fluorescenční detekcí ve Výzkumném ústavu pivovarském a sladařském, a.s. (VÚPS), Sladařském ústavu Brno. Aktivitu enzymu superoxiddismutasy jsem stanovovala pomocí modifikované metodiky na spektrofotometru ve Sladařském ústavu Brno. Obr. 8 Pokus s individuálně pěstovanými rostlinami Obr. 9 Maloparcelní polní pokus Tab. 2 Použité odrůdy a linie z pokusu individuálně pěstovaných rostlin a maloparcelního pokusu se směsnými vzorky rostlin ODRŮDY ZKRATKA LINIE KM LINIE Annabell b) - Ko x Wb a) b) KM1771 b) Amulet a) b) - Kr x Wnb a) b) KM1057 a) Kompakt a) b) Ko Wb x Ko a) b) KM2387 b) Krona a) Kr Wb x Wsnb a) b) a) b) KM1910 Nordus a) - Wnb x Kr a) a) b) KM2084 Tolar a) b) - Ko x Kr a) b) a) b) KM2283 Wabet a) Wb Kr x Ko a) b) KM2092 b) Wanubet a) Wnb KM2001 b) Washonubet a) Wsnb KM2074 b) Jersey b) Pozn.: a) odrůdy/linie použité v pokusu s individuálně pěstovanými rostlinami b) odrůdy/linie použité v maloparcelním pokusu Maloparcelní pokus se směsnými vzorky (bulk) rostlin Polní pokusy (Obr. 9) byly založeny na ŠZP MZLU v Žabčicích v roce 2004 secím strojem Öyord ve třech opakováních blocích na parcelách o velikosti 10 m 2 s úplnou randomizací odrůd/linií. Pokus byl realizován ve dvou systémech pěstování: a) Konvenční způsob (high input), tj. s chemickým ošetřením - osivo bylo mořeno a v průběhu vegetace byly použity minerální hnojiva a pesticidy (Lontrel, Sekator, Falcon, Decis, Nurelle D). 47

62 MATERIÁL A METODIKA b) Bez chemického ošetření (low input) osivo nebylo mořeno a v průběhu vegetace nebyla použita minerální hnojiva a pesticidy. Parcely byly sklizeny maloparcelní sklízecí mlátičkou. Odebrané směsné vzorky (bulk) zrna z parcel byly přečištěny, zhomogenizovány a část vzorků byla sesladována (VÚPS a.s.) mikrosladovací zkouškou, která vychází z metody MEBAK (MEBAK 1997) a změny přijaté Barley & Malt Committee EBC (Perugia, ). Ze vzorků (500 g ± 0,3 g) obilek odrůd/linií ječmene se za daných podmínek vyrobil slad. Sladování se dělilo na tři části: máčení včetně vzdušných přestávek, klíčení, hvozdění, a to při těchto parametrech: Hmotnost vzorku (g) 500 Celková doba sladování (hod.) 144 ± 1 Obsah vody (%) na počátku klíčení 45 ± 1 Teplota ( C): - vody v době namáčení 15 ± 1 - vzduchu v době klíčení a vzdušných přestávek 15 ± 1 - počátek hvozdění 30 ± 2 - konec hvozdění 80 ± 2 Upřesnění: Do doby máčení byla započítána vzdušná přestávka. Zrno v průběhu máčení bylo ponořeno do vody každý den na dobu několika hodin. Namáčky byly celkem tři. Pro mikrosladování se použil podíl zrna nad sítem 2,5 mm. Mikrosladovací zkouška není normalizovanou metodou. Hlavním důvodem tohoto stavu je velká variabilita používaných mikrosladovacích zařízení, což neumožňuje podrobit tuto metodu standardizačnímu procesu (převzato z laboratorních návodů VÚPS, Dr. Ing. L. Sachambula) U vzorků zrna a sladu odrůd/linií ošetřených i neošetřených systémů pěstování byly provedeny stejné analýzy jako u vzorků popsaných v kapitole , tzn. stanovení aktivity superoxiddismutasy a vitamínu E, obsahu celkových tokolů a jednotlivých izomerů. 48

63 MATERIÁL A METODIKA 4.2 Strušná charakteristika odrůd a linií ječmene jarního Pro tuto práci byly použity materiály jarního ječmene, které lze rozdělit na: Sladovnické odrůdy - donory vysoké výnosové úrovně s pluchatým zrnem (Obr.10) Donory zvýšeného obsahu vitamínu E a β-glukanů americké odrůdy Wabet, Wanubet, Washonubet Linie vzniklé z uvedených dvou skupin donorů Bezpluché KM linie (Obr. 11) určené pro potravinářské využití Obr. 10 Pluchaté zrno (odrůda Tolar) Obr. 11 Bezpluché zrno (linie KM1057) Sladovnické odrůdy - donory vysoké výnosové úrovně ODRŮDY USJ UDRŽOVATEL REGISTRACE Amulet 6 SELGEN, a.s., ŠS Stupice 1995 Annabell* 7 Nordsaat Saatzuchtgesellschaft mbh 2001 Jersey 9 Limagrain Advanta Nederland B. V Kompakt 8 HORDEUM, s.r.o., SK 1995 Krona 8 Semundo SaatzuchtGmbH 1996 Nordus 9 Nordsaat Saatzuchtgesellschaft mbh 1998 Tolar ) 7 PLANT SELECT, spol. s.r.o 1997 Pozn.: * Odrůda byla upřednostňována jako surovina některými velkými sladovnami Donory zvýšeného obsahu vitamínu E a β-glukanů Použité odrůdy americké provenience Wabet, Wanubet a Washonubet jsou donory vysokého obsahu β-glukanů a vitamínu E s tzv. voskovým typem škrobu (waxy typ). Zmíněné odrůdy mají gen wx pro zvýšený obsah amylopektinu na úkor amylosy ve škrobu. V závislosti na odrůdě mohou bezpluché ječmeny obsahovat až 100 % amylopektinu (waxy), a nebo 50 % amylosy (high amylose). Normální poměr amylopektinu a amylosy ve škrobu je 75 %:25 %. Poměr amylosy a amylopektinu je odrůdovou záležitostí, ale obsah škrobu může kolísat vlivem pěstebních podmínek a použitou technologií. 49