Platelia EBV-VCA IgM 1 destička

Transkript

1 Platelia EBV-VCA IgM destička ENZYMOVÁ IMUNOANALÝZA KE KVALITATIVNÍMU STANOVENÍ PROTILÁTEK IgM PROTI VIRU EPSTEIN-BARROVÉ (VIROVÝ KAPSIDOVÝ ANTIGEN) V LIDSKÉM SÉRU 25/4. ÚČEL POUŽITÍ Tato imunoanalytická souprava je určena ke kvalitativnímu stanovení protilátek IgM proti kapsidovému antigenu (VCA) viru Epstein-Barrové v lidském séru. Soupravu Platelia EBV-VCA IgM je možné používat spolu s ostatními testy pro sérologii EBV (Platelia EBV VCA IgG, Platelia EB-NA- IgG a Platelia EBV-EA D IgG) při diagnostice infekční mononukleózy. 2. KLINICKÝ VÝZNAM Virus Epstein-Barrové (EBV) je běžný lidský patogen postihující 8% dospělé lidské populace v USA. Od objevu viru Epstein-Barrové v roce 964, byla EBV přisuzována etiologie řady lidských onemocnění, jako např. infekční mononukleózy. EBV byl rovněž spojován s lymfómy B buněk u imunosuprimovaných jedinců, jak u transplantovaných pacientů, tak i u pacientů s AIDS. Na základě charakteristické morfologie je EBV je klasifikován jako člen rodu herpesvirů. Všechny herpetické viry mají schopnost vyvolat u hostitele latentní infekci. Infekční mononukleóza (IM) je akutní sebeomezující lymfoproliferativní onemocnění vyvolané EBV. Ačkoli primární infekce EBV je v dětství obvykle asymptomatická, téměř polovina až dvě třetiny primárních infekcí virem u starších mladistvých a mladých dospělců končí jako zjevné klinické onemocnění infekční mononukleózou, vykazující následující symptomy: horečnatá faryngitida, tonzilitida, lymfadenopatie, malátnost, bolesti hlavy, bolesti svalstva, spleno- a hepatomegalie, vyrážka a leukocytóza. EBV infekce vede k produkci protilátek proti čtyřem odlišným komplexům: EBV indukovanému jadernému antigenu (EBNA), EBV indukovanému časnému antigenu (EA), virovému kapsidovému antigenu (VCA) a EBV indukovanému membránovému antigenu (MA). Komplex EA se dělí na dvě složky obsahující EA-D (difusní složka) a EA-R (restringovaná složka). Protilátky IgM proti VCA jsou prokazatelné v časné fázi onemocnění. Hladina protilátek začíná stoupat brzy a vrcholí po 3-4 týdnech, potom klesá až na neprůkaznou úroveň. 3. PRINCIP TESTU Enzymoimunoanalytické testy Bio-Rad (ELISA) spočívají na schopnosti biologických látek (např. antigenů) adsorbovat se na povrchy plastických hmot, jako jsou polystyren (pevná fáze). Souprava Platelia EBV-VCA IgM využívá technologii ELISA, při které je na povrch jamek mikrotitrační destičky navázán afinitně purifikovaný antigen (VCA). Když se antigeny navázané na pevné fázi dostanou do kontaktu s pacientským sérem, váží se protilátky specifické pro antigen, jestliže jsou přítomny, na antigen navázaný na pevné fázi a vytváří komplexy antigenu s protilátkou. K odstranění potenciální interference způsobované protilátkami IgG a IgM-RF se používá roztok k opracování séra. Přebytečné protilátky se odstraní promytím. Následuje přidání kozí protilátky proti lidskému IgM konjugované s křenovou peroxidázou, která se poté váže na komplexy antigen-protilátka. Přebytečný konjugát se odstraní promytím a následuje přidání substrátu tetramethylbenzidinu (TMB). Je-li v pacientském séru přítomna specifická protilátka IgM proti EBV-VCA, vznikne modré zabarvení. Po zastavení enzymatické reakce pomocí N H 2SO 4 se barva změní ve žlutou. Zabarvení, které je úměrné koncentraci protilátky v séru, lze měřit na vhodném spektrofotometru nebo spektrofotometru pro ELISA mikrotitrační destičky. Citlivost, specifičnost a reprodukovatelnost testů ELISA je srovnatelná s ostatními sérologickými testy na stanovení protilátek, jako je imunofluorescence, vazba komplementu, hemaglutinace a radioimunoanalýza.

2 4. SLOŽENÍ SOUPRAVY Všechna činidla jsou výlučně k použití pro diagnostiku in vitro. Štítek Složení reagencií Množství R Microplate Mikrotitrační destička: 2 stripů (po 8 jamkách) potažených inaktivovaným afinitně purifikovaným kapsidovým antigenem EBV (gp 25), uloženo v fóliovém sáčku se sušidlem a indikátorem vlhkosti. R2 R3 Concentrated Washing Solution (2x) Koncentrovaný promývací roztok (2 x): TRIS pufr (ph 7.2 ±,2) a % Tween 2. Konzervační činidla: Proclin 3 (, %). Non reactive kontrol Kontrola nereaktivní (lidská) na protilátky IgM proti EBV-VCA. Negativní na HBsAg, na protilátky proti HIV- a HIV-2 a HCV. Konzervační činidla: azid sodný (<, %) a pen/strep (, %). R4a Positive Control I Pozitivní kontrola I (lidská) na protilátky IgM proti EBV-VCA. Negativní na HBsAg, na protilátky proti HIV- a HIV-2 a HCV. Konzervační činidla: azid sodný (<, %) a pen/strep (, %). R4b Positive Control II Pozitivní kontrola II (lidská) na protilátky IgM proti EBV-VCA. Negativní na HBsAg, na protilátky proti HIV- a HIV-2 a HCV. Konzervační činidla: azid sodný (<, %) a pen/strep (, %). R5 Calibrator Kalibrátor (lidský) na protilátky IgM proti EBV-VCA s faktorem specifickým pro danou soupravu, vytištěným na štítku krabičky. Negativní na HBsAg, na protilátky proti HIV- a HIV-2 a HCV. Konzervační činidla: azid sodný (<, %) a pen/strep (, %). R6 Conjugate Konjugát (hotový k použití): kozí protilátky proti lidskému IgM konjugované s křenovou peroxidázou. Konzervační činidla: ProClin 3 (, %) a gentamicin. R7 Diluent II Ředící roztok II: Pufr hotový k použití (ph 7,5) se stabilizátory proteinů. Obsahuje kozí a ovčí protilátky proti lidskému IgG pro adsorpci séra k odstranění kompetice IgG. Konzervační činidlo: ProClin 3 (, %). R9 Chromogen TMB Chromogenní a substrátový roztok (hotový k použití): tetramethylbenzidin (TMB). Činidlo musí být zavřené, když se nepoužívá; jinak se může v reakčních jamkách vytvořit precipitát. R Stopping Solution Zastavovací roztok (hotový k použití): N kyselina sírová. x 6 ml x,4 ml x,4 ml x,4 ml x,4 ml x 6 ml 2 x 45 ml x 5 ml x 5 ml 5. UPOZORNĚNÍ A BEZPEČNOST PRÁCE Upozornění Kvalita výsledků závisí na správném dodržování následujících zásad správné laboratorní praxe: Nepoužívejte reagencie s prošlou exspirační lhůtou. Nekombinujte reagencie z různých výrobních šarží v jednom běhu testu. POZNÁMKA: u promývacího roztoku (R2), roztoku chromogenu se substrátem (R9), a zastavovacího roztoku (R) je možno použít s danou soupravou i jiné výrobní šarže než ty, které jsou v soupravě obsaženy, za předpokladu, že pro daný běh testu se použije vždy stejná šarže. Tyto reagencie lze použít se soupravami Platelia EBV-VCA IgG, Platelia EBV- EA-D IgG a Platelia EB-NA- IgG, které jsou uvedeny v našem katalogu. Podrobné informace vám poskytne naše firma. Před použitím ponechejte reagencie ustálit po dobu 3 minut při pokojové teplotě. Reagencie pečlivě nařeďte a zabraňte jejich kontaminaci. Test neprovádějte v přítomnosti reaktivních výparů (kyseliny, alkalické látky, aldehydy) nebo v prašném prostředí, což by mohlo ovlivnit enzymatickou aktivitu konjugátu. Používejte laboratorní sklo a pomůcky důkladně umyté a opláchnuté deionizovanou vodou nebo raději materiál pro jednorázové použití. Promyté mikrotitrační destičky nesmí na konci promývacího kroku před napipetováním další reagencie vyschnout. Enzymatická reakce je velmi citlivá na působení kovových iontů. Proto nesmí roztok konjugátu nebo substrátu přijít do kontaktu s kovy. Roztok chromogenu a substrátu musí být bezbarvý. V případě, že dojde k jeho zabarvení, je roztok nepoužitelný a musí být vyměněn. Pro každý vzorek použijte novou pipetovací špičku.

3 Promývání je kritickým krokem testu: dodržujte doporučený počet promývacích cyklů a ujistěte se, že během promývání jsou všechny jamky zcela naplňovány a poté zcela vyprázdněny. Nesprávné promytí může vést k chybných výsledků. Pro konjugát a roztok chromogenu se substrátem nikdy nepoužívejte stejnou nádobku. U pipet a ostatních zařízení pravidelně kontrolujte jejich správnou funkci a přesnost. Neměňte pracovní postup. OCHRANA ZDRAVÍ A BEZPEČNOST PRÁCE Všechny dodávané reagencie jsou určeny k použití pro diagnostiku in vitro. Při manipulaci s reagenciemi používejte ochranné rukavice pro jednorázové použití. Nepipetujte ústy. Materiál lidského původu použitý pro přípravu reagencií byl testován a shledán nereaktivním na povrchový antigen hepatitidy B (HBsAg), protilátky proti hepatitidě C (HCV) a proti virům lidské imunodeficience (HIV- a HIV-2). Poněvadž žádná metoda nemůže zcela vyloučit přítomnost infekčních agens v materiálu, zacházejte s reagenciemi lidského původu a vzorky jako s potenciálně infekčním materiálem schopným přenášet infekční onemocnění. Za infekční považujte veškerý materiál, který přišel do styku s vyšetřovanými vzorky a reagenciemi lidského původu a rovněž promývací roztok. Zamezte rozlití vzorků nebo roztoků obsahujících vzorky. Potřísněná místa musí být omyta chlornanem sodným naředěným na %. Jestliže je kontaminující materiál kyselina, musí být nejprve neutralizována hydrogenuhličitanem sodným a potom je třeba místo otřít chlornanem sodným a vysušit savým papírem. Použitý úklidový materiál se musí odložit jako infekční odpad. Vzorky, reagencie lidského původu a rovněž kontaminovaný materiál a produkty musí být před odložením dekontaminovány. Dekontaminace se provádí - buď ponořením do 5 % roztoku chlornanu sodného na 3 minut, - nebo autoklávováním při teplotě 2 C po dobu nejméně 2 hodiny. Autoklávování při teplotě 2 C po dobu nejméně jedné hodiny je nejlepší způsob inaktivace virů HIV a HBV. UPOZORNĚNÍ: ROZTOKY OBSAHUJÍCÍ CHLORNAN SODNÝ SE NESMÍ AUTOKLÁVOVAT Při zacházení s chemikáliemi a při jejich odkládání je třeba dodržovat zásady správné laboratorní práce. Vyvarujte se potřísnění kůže a sliznic substrátovým pufrem, chromogenem a zastavovacím roztokem (nebezpečí toxického působení, podráždění či poleptání). Doporučení týkající nebezpečí a upozornění v souvislosti s některými komponenty v této testovací sadě najdete na piktogramech uvedených na štítcích a v pokynech na konci návodu k použití. Bezpečnostní list je k dispozici na adrese 6. NEZBYTNÝ MATERIÁL, KTERÝ NENÍ SOUČÁSTÍ DODÁVKY Mixer Vortex Spektrofotometr k měření na mikrotitračních destičkách vybavený filtry 45 nm (*). Nádoba na nebezpečný biologický odpad. Chlornan sodný a hydrogenuhličitan sodný. Destilovaná nebo deionizovaná voda. Odměrné válce opatřené stupnicí. Ochranné latexové rukavice pro jednorázové použití. Ochranné brýle nebo maska. Savý papír. Automatické či poloautomatické nastavitelné či fixní pipety či multipipety o objemech, a µl. Manuální, poloautomatická či automatická promývačka mikrotitračních destiček (*). Zkumavky pro jednorázové použití. (*) Na vyžádání vám poskytneme další informace o vhodném vybavení doporučeném naším technickým oddělením. 7. PŘÍPRAVA A UCHOVÁVÁNÍ REAGENCIÍ Soupravu je možno uchovávat při teplotě +2-8 C až do data exspirace uvedeného na obalu (není-li uvedeno jinak). Před použitím ponechte reagencie aby dosáhly pokojové teploty (+2-25 C). Ihned po použití je vraťte zpět do chladničky. ) Reagencie hotové k použití Reagencie (R): mikrotitrační destička Rámeček obsahující 2 stripů po 8 jamkách je zabalen v zataveném fóliovém plastovém sáčku. Sáček rozstříhejte nůžkami či odřízněte skalpelem,5 cm nad spojem. Nepoužité stripy ihned vložte zpět do sáčku. Sáček pečlivě uzavřete a uchovávejte při teplotě +2-8 C. Takto uchovávané stripy jsou stabilní po dobu měsíce. Reagencie 3 (R3): nereaktivní kontrola Reagencie 4a (R4a): pozitivní kontrola I Reagencie 4b (R4b): pozitivní kontrola II Reagencie 5 (R5): kalibrátor Reagencie 6 (R6): konjugát

4 Reagencie 7 (R7): ředicí roztok II Reagencie 9 (R9): roztok chromogenního substrátu Reagencie (R): zastavovací roztok 2) Reagencie vyžadující přípravu Reagencie 2 (R2): promývací roztok 2x koncentrovaný. Roztok o pracovní koncentraci se připraví naředěním 5 ml 2x koncentrovaného promývacího roztoku destilovanou nebo deionizovanou vodou do celkového objemu,2 l. Dobře promíchejte. Po naředění uchovávejte při teplotě +2-8 C 5 dnů. 8. VZORKY Vzorky krve odeberte běžným způsobem. Test se provádí s neředěnými vzorky. Sérum oddělte od staženiny nebo erytrocytů co nejdříve, aby se zabránilo hemolýze. Silná hemolýza může ovlivnit funkčnost testu. Vzorky obsahující shluky je nutno před vyšetřením vyčeřit centrifugací. Suspendované fibrínové sraženiny nebo částice mohou zapříčinit falešně pozitivní výsledky. Jestliže budou vzorky testovány do 5 dnů, mohou být uchovávány při teplotě +2-8 C nebo mohou být zamraženy několik měsíců při -2 C. Vzorky opakovaně nezmrazujte a nerozmrazujte. Při transportu musí být vzorky zabaleny podle platných předpisů pro přepravu etiologických agens. NEPOUŽÍVEJTE KONTAMINOVANÁ, SILNĚ CHYLÓZNÍ, IKTERICKÁ, SILNĚ HEMOLYTICKÁ NEBO TEPELNĚ INAKTIVOVANÁ SÉRA. 9. PRACOVNÍ POSTUP Přesně dodržujte popsaný pracovní postup. Pro každý běh stanovení používejte kalibrátor a kontroly pro validaci výsledků testu. Dodržujte následující zásady správné laboratorní praxe:. Pečlivě sestavte schéma umístění vzorků a identifikační plán. 2. Připravte naředěný promývací roztok (R2) (viz článek 7). 3. Vyjměte rámeček mikrotitrační destičky a stripy (R) z ochranného sáčku. Do rámečku vložte potřebný počet stripů potažených antigenem. Jednu jamku vyhraďte pro reagenční blank, 3 jamky pro kalibrátor, po jedné jamce pro negativní kontrolu, positivní kontrolu I a pozitivní kontrolu II A B S2 B R3 S3 C R4a S4 D R4b S5 E R5 S6 F R5 S7 G R5 S8 H S S9 4. Všechny vzorky, kontroly a kalibrátory je třeba před použitím promíchat na vortexu. Testované vzorky, kalibrátor, negativní a pozitivní kontroly nařeďte ve zkumavkách či ředící destičce :8 (tj. µl + 8 µl) ředicím roztokem II (R7). 5. Do každé jamky napipetujte µl naředěného kalibrátoru, kontroly či testovaného vzorku. Do první jamky napipetujte µl ředicího roztoku II (R7) jako reagenční blank. 6. Mikrotitrační destičku inkubujte 3 min. ± 2 min. při pokojové teplotě (+2-25 C). 7. Obsah všech jamek odsajte a odstraňte jej do odpadní nádoby na biologický odpad (která obsahuje chlornan sodný). Do každé jamky okamžitě napipetujte minimálně 3 µl promývacího roztoku. Opět odsajte. Tento postup opakujte alespoň 4 x (celkem minimálně 5 promývacích cyklů). Jestliže je to nutné, osušte obrácenou destičku na savém papíru. Podle stejného promývacího postupu postupujte i v případě použití automatické promývačky. 8. Do všech jamek napipetujte po µl konjugátu (R6) hotového k použití. 9. Inkubujte 3 min. ± 2 min. při pokojové teplotě (+2-25 C).. Obsah všech jamek odsajte a promyjte je 5x výše popsaným způsobem.. Do každé jamky rychle napipetujte µl roztoku chromogenu se substrátem (R9). 2. Reakci nechte vyvíjet ± 2 minuty ve tmě při pokojové teplotě (+2-25 C). Během této inkubace nepřekrývejte destičku samolepicí fólií. V jamkách obsahujících detekovatelné hladiny protilátek IgM se roztok chromogenu se substrátem zbarví modře. 3. Do každé jamky napipetujte po µl zastavovacího roztoku (R). Promíchejte opatrným poklepáním na destičku. Přidání zastavovacího roztoku způsobí změnu barvy z modré na žlutou. 4. Počkejte nejméně 5 minut a měřte. Opatrně otřete dno destičky. Spektrofotometr vynulujte na jamku s reagenčním blankem a změřte optickou denzitu každé jamky. Destičku je nutno měřit nejdéle do 3 minut od přidání zastavovacího roztoku (před měřením musí být stripy vždy uchovávány ve tmě). 5. Zkontrolujte všechny výsledky, jestli se shodují v načtených hodnotách a v distribuci vzorků a s identifikačním plánem.

5 . VÝPOČET A INTERPRETACE VÝSLEDKŮ ) Výpočet průměrné hodnoty absorbance. Průměrná cut-off O.D. (optická denzita) kalibrátoru vypočtěte průměrnou O.D. kalibrátoru cut-off ze tří stanovení hodnot O.D. kalibrátoru R5. Jestliže že se některá z hodnot O.D. kalibrátoru liší od průměru o více než 5 %, vyřaďte ji a průměr vypočtěte ze zbývajících dvou hodnot. 2. Korekční faktor - aby bylo možno vzít v úvahu každodenní kolísání aktivity způsobené laboratorní teplotou a časovým průběhem testu, je pro každou šarži soupravy stanoven korekční faktor. Korekční faktor je uveden na štítku lahvičky s kalibrátorem. 3. Hodnota kalibrátoru cut-off hodnota kalibrátoru cut-off se pro každý test stanoví vynásobením průměru O.D. kalibrátoru cut-off stanoveného podle kroku korekčním faktorem. 4. Hodnota ISR vypočítejte imunní poměr (ISR) pro každý vzorek vydělením hodnoty O.D. vzorku hodnotou kalibrátoru cutoff, stanovenou podle kroku 3. Příklad: O. D. stanovené pro kalibrátor =,38,,4,,42 Průměrná O.D. pro kalibrátor =,4 Korekční faktor =,5 Hodnota kalibrátoru cut-off =,4 x,5 =,2 O.D. pacientského séra =,6 Hodnota ISR =,6/,2 = 3, 2) Validita testu. Reagenční blank (při měření blanku proti vzduchu) při 45 nm musí být <,5: O.D. RB <,5. 2. Negativní kontrola R3 při 45 nm (při měření proti reagenčnímu blanku) musí být,25: O.D. R3, Každý kalibrátor R5 při vlnové délce 45 nm (při měření proti reagenčnímu blanku) musí být,25: O.D. R5, Pozitivní kontrola R4b při vlnové délce 45 nm (měření proti reagenčnímu blanku) musí být,5: O.D. R4b,5. 5. Hodnoty ISR (imunní poměr) pro negativní kontrolu, pozitivní kontrolu I a pozitivní kontrolu II (R3, R4a, R4b) musí být v příslušných rozmezích, uvedených na štítcích lahviček. Jestliže tato kritéria nejsou v příslušných rozmezích, test je neplatný a musí být opakován. 3) Interpretace výsledků Pacientské hodnoty ISR (imunní poměr) se interpretují následujícím způsobem: Hodnota ISR Výsledky Interpretace,9 Negativní Není signifikantní hladina detekovatelné protilátky EBV-VCA IgM,9,9 Nejednoznačný Vzorky musí být opakovaně testovány, Pozitivní Signifikantní hladina detekovatelné protilátky EBV-VCA IgM. Svědčí o akutní nebo proběhlé infekci.. Doporučujeme hlásit získané výsledky následujícím způsobem: Následující výsledky byly získány testem Platelia EBV- VCA IgM. Hodnoty získané odlišnými metodami nelze zaměňovat. Stanovenou hodnotu hladiny IgM nelze uvádět do korelace s konečným titrem. 2. Přesná interpretace infekce EBV je založena na výsledcích čtyř různých EBV protilátek, které se používají k poskytnutí komplexního obrazu EBV infekce: IgG EBV indukovaný nukleární antigen (EB-NA), IgG indukovaný časný antigen (EBV EA), IgG a IgM virový apsidový antigen (ENV-VCA). Přesná interpretace infekce je založena na výsledcích všech těchto protilátek a diagnóza by se normálně neměla spoléhat na výsledek jednoho testu. 3. Vzorky, které i po opakovaném vyšetření vykazují nejednoznačný výsledek, by měly být vyšetřeny alternativní metodou, např. imunofluorescenčním testem (IFA). Jestliže i toto vyšetření vykáže nejednoznačný výsledek, je třeba odebrat od pacienta další vzorek a vyšetření zopakovat. 4) Předpokládané hodnoty Akutní fáze EBV-VCA IgM se rychle zvyšuje v časné akutní fázi a je detekovatelné před nebo současně s EBV-VCA a EB-NA- IgM a heterofilními protilátkami. EBV-VCA IgM klesá během pozdní fáze společně EB-NA- IgM, ale EBV-VCA IgG persistuje. Přechodná fáze EBV-VCA IgM pokleslo na nízkou a přibližně stejnou hladinu jako EB-NA- IgG, které se začíná zvyšovat. Přetrvává EBV-VCA IgG. Fáze rekonvalescence EBV-VCA IgM o velmi nízké hladině až negativní s EB-NA- IgG stoupajícím na vysokou hladinu. 5) Prevalence Byla testována skupina 58 sér od normální populace o různém věku, pohlaví a geografických oblastí Spojených států testem Platelia EBV-VCA IgM. V testu Platelia EBV-VCA IgM byl zjištěn počet 2,5 % pozitivních a,9 % nejednoznačných. Distribuce hodnot poměrů ISR v této studii je znázorněno v níže uvedeném grafu.

6 Následuje shrnutí normální populace rozvrstvené podle věkových skupin. Věk Negativní Nejednoznačné Pozitivní Celkem Celkem ) Omezení použití. Pracovní postup nebo praktiky mimo uvedených v tomto příbalovém letáku mohou zapříčinit problematické výsledky. Nesprávné výsledky jsou často zapříčiněny: - nedostatečným promýváním mikrodestičky, - nedostatečným časovým průběhem testu, - kontaminací negativních vzorků sérem nebo plasmou o vysokém titru protilátek, - kontaminací substrátového roztoku oxidačními agens (chlornan sodný, kovové ionty), - kontaminací zastavovacího roztoku. U kontaminovaných, ikterických, lipemických, hemolyzovaných nebo tepelně inaktivovaných sér mohou nastat chybné výsledky a neměla by se používat. Charakteristiky účinnosti nebyly stanoveny pro prostředí jiné než sérum. 2. Výsledky tohoto testu by měl interpretovat lékař s ohledem na jiné klinické nálezy a diagnostické postupy. Tento test je určen ke stanovení imunitní odpovědi k průkazu primární infekce nebo reaktivace viru. Charakteristiky účinnosti nebyly stanoveny pro pacienty s nasopharyngeálním karcinomem, Burkittovým lymfomem, jinými EBV asociovanými lymfadenopatiemi a jinými EBV asociovanými nemocemi jinými než EBV asociovaná mononukleóza. Výsledky testu Platelia EBV-VCA IgM provedeného se sérem od imunosuprimovaných pacientů musí být interpretovány opatrně. Charakteristiky účinnosti tohoto testu nebyly stanoveny pro pediatrické vzorky. Nepřítomnost detekovatelných protilátek IgM EBV-VCA nevylučuje proběhlo nebo akutní infekci. Vzorek mohl být odebrán před vznikem prokazatelné protilátky nebo již po nedetekovatelné protilátce. Jestliže je podezření na infekci EBV, odeberte druhý vzorek za 5-7 dní a opakujte testování. Často však v době projevů koncentrace protilátky poklesávají. Specifické IgG může kompetovat s IgM a může mít za následek falešnou negativitu. Naopak, revmatoidní faktor v přítomnosti specifických protilátek IgG může mít za následek falešně pozitivní reakci. Kozí nebo ovčí anti-lidský IgG v ředícím roztoku pro sérum snižuje kompetující IgG a minimalizuje interferenci revmatoidního faktoru ve vzorcích na minimum. Bylo zjištěno, že některé antinukleární protilátky mohou zapříčinit falešně pozitivní reakci v některých ELISA testech.

7 . ÚČINNOST ) Relativní citlivost a specifičnost založená na charakterizaci séra V klinické laboratoři bylo testováno 66 vybraných sér. Séra z této studie byla charakterizována jako séronegativní (bez sérologické evidence minulé nebo akutní infekce EBV), akutní (přítomny EBV-VCA IgM a heterofilní protilátky, nepřítomny EB- NA IgG), nebo séropozitivní (přítomnost EBV-VCA IgG a EB-NA IgG protilátek, bez průkazu EBV-VCA IgM nebo heterofilních protilátek, značících proběhlou infekci). Testy použité pro charakterizaci séra byly komerčně dostupné testy ELISA. Citlivost, specifičnost a souhlasnost byly stanoveny na základě této charakteristiky. Je možno předpokládat, že odpověď EBV-VCA IgM by měla být negativní pro séronegativní a rekonvalescentní sérum a pozitivní pro akutní sérum. Výsledky jsou shrnuty v níže uvedené tabulce. Platelia EBV- VCA IgM Pozitivní Nejednoznačné Negativní Celkem Akutní EBV-VCA IgM + EB-NA IgG Heterofilní Séropozitivní EBV-VCA IgG + EB-NA IgG + EBV VCA IgM Heterofilní Séronegativní EBV-VCA IgG EB-NA IgG EBV-VCA IgM Heterofilní Relativní citlivost (akutní) = 37/38 = 97,4 % 95% interval spolehlivosti = 92,2 % - % Relativní specifičnost (séronegativní) = 27/28 = 96,4 % 95% interval spolehlivosti = 89,4 % - % Relativní specifičnost (séropozitivní) = 98/99 = 99, % 95% interval spolehlivosti = 97, % - % Relativní shoda = 62/65 = 98,2 % 95% interval spolehlivosti = 96, % - % Nejednoznačné výsledky nejsou zahrnuty v této kalkulaci. Nejednoznačné výsledky nebyly opakovaně testovány. Byly uvedeny jako nejednoznačné. 95% interval spolehlivosti byly vypočítány pomocí normální metody. Upozorňujeme, že relativní se vztahuje ke srovnání výsledků tohoto testu k výsledkům podobného testu. Výsledky testu nebyly dány do korelace s výskytem nebo absencí nemoci. Nemůže být učiněn žádný úsudek k porovnání přesnosti testu k předpovědi nemoci. 2) Opakovatelnost Opakovatelnost testu Platelia EBV-VCA IgM byla vyhodnocena testováním tří sér desetkrát na stejné destičce. Výsledky jsou shrnuty v níže uvedené tabulce. Sérum n X S.D. CV % Negativní,6,3 54 Slabě pozitivní,7,6 9,2 Pozitivní 4,5,2 8, X = průměrná hodnota ISR S.D. = standardní odchylka CV = koeficient variace 3) Reprodukovatelnost Reprodukovatelnost testu Platelia EBV-VCA IgM byla vyhodnocena Testováním tří sér každého x ve třech různých dnech. Výsledky jsou shrnuty v níže uvedené tabulce. Sérum n X S. D. CV % Negativní,5,3 65,6 Slabě pozitivní,6,2 2, Pozitivní 4,47,42,6

8 4) Zkřížená reaktivita Byla testována séra obsahující IgM protilátky detekovatelné pomocí ELISA proti Herpes simplex viru a 2, Cytomegaloviru a Varicella zoster viru. Byla též testována séra obsahující revmatoidní faktor (RF). Všechny tři jiné testy byly komerčně dostupné ELISA testy. Údaje shrnuté v níže uvedené tabulce ukazují, že protilátky proti herpetickým virům a séra obsahující RF nereagují křížově v Platelia EBV-VCA IgM. Studie křížové reaktivity v testu Platelia EBV-VCA IgM. Specifičnost Platelia EBV-VCA IgM. Jiný test RF + RF + RF + RF + RF + VZV IgM + VZV IgM + VZV IgM + VZV IgM + VZV IgM + HSV IgM + HSV IgM + HSV IgM + HSV IgM + HSV 2 IgM + HSV 2 IgM + HSV 2 IgM + HSV 2 IgM + CMV IgM + CMV IgM + CMV IgM + CMV IgM +,4 -,3 -, -, -,2 -,33 -, -,4 -,8 -,3 -,2 -,2 -, -, -,6 -,5 -,3 -,4 -,7 -,4 -,4 -,6 -,87 +,82 +,73 +,8 +,85 + 3,28 + 5,46 + 4,98 + 2,34 + 2,8 + 2,53 +,65 +,34 +,32 +,76 +,6 + 2,9 +,96 +,23 +,92 + 3,83 +, LITERATURA. Epstein, M.A., B.B. Achong, and Y.M. Barr Virus Particles in Cultured Lymphoblasts from Burkitt s Lymphoma. Lancet. : Epstein, M.A., Y.M. Barr, and B.G Achong Studies wilth Burkitt s Lymphoma. Wister Inst. Sympos. Monogr. 4: Schooley, R.T. and R. Dolin Epstein-Barr Virus (Infectious Mono- nucleosis), 2nd edition. In: Principles and Practices of Infectious Diseases. Mandell, G.L., R.G.Douglas, and J.E. Bennett, eds. John Wiley and Sons, New York. Pp Henle, W. and Henle G. Epstein-Barr Virus and Infectious Mononucleosis. Human Herpesvirus Infections. Glaser and Gottlieb-Stematsky, eds. Marcel Dekker, Inc. NR. Basel Tobi, M. and S.E. Straus Chronic Epstein-Barr Virus Diseas: A Workshop Held by the National Institute of Allergy and Infectious Diseases. Ann. Intern. Med. 3 (6(pt. )): Birx, D. L., R.R. Redfield, and G. Tosarto Defective Regulation of Epstein-Barr Virus Infection in Patients with Aquired Immunodefiency Syndrome (AIDS) or AIDS-Related Disorders. New Eng. J. Med. 34 (4): Gottlieb-Sematsky, T. and Glaser, R Assocation of Epstein-Barr Virus with Neurological Diseases. Human Herpesvirus Infections. Glaser and Gottlieb-Sematsky, eds. Marcel Dekker, Inc., NR. Basel. 8. Henle, G., W. Henle and V. Diehl Relation of Burkitt s Tumor- Associated Herpes-Type Virus to Infectious Mononucleosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 59: Henle G., and W. Henle The Virus as the Etiologic Agent of Infectious Mononucleosis. In: The Epstein-Barr Virus. Berlin Sprihger- Verlag. Pp Sumaya, C.V Infectious Mononucleosis and Other EBV Infections: Diagnostic Factors. Lab. Mgmt. Oct., pp Lenelle, E.T. and W. Henle Epstein-Barr Virus Infections: Clinical and Serological Features. Laboratory Mgmt. Oct., pp Nikoskelainen, J. and P. Hanninen Antibody Response to Epstein- Barr Virus in Infectious Mononucleosis. Infect. Immun. : Sumaya, C.V Infectious Mononucleosis and other EBV Infections: Diagnostic Factors. Laboratory Management. pp Henle, W. and G. Henle Epstein-Barr Virus and Infectious Mononucleosis. New Eng. J. Med. 228: Engvall, E. and P. Perlman Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA. III. Quantitation of Specific Antibodies by Enzyme-Labeled Anti- Immunoglobulins in Antigen Coated Tubes. J. Immunol. 9: Van Weeman, B.K. and A.H.W.M. Schuurs. 97. Immunoassay Using Antigen-Enzyme Conjugates. FEBS Letter. 5: Engvall, E., and P. Perlman. 97. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, (ELISA) Quantitative Assay of Immunoglobulin G. Immunochemistry. 8:

9 8. Engvall, E. and P. Perlman. 97. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA. In: Proteins of the Biological Fluids, H. Peeters, ed., Proceedings of the Nineteenth Colloquium, Brugge Oxford. Pergamon Press. p Engvall, E., K. Jonsson, and P. Perlman. 97. Enzyme- Linked Immunosorbent Assay. II. Quantitative Assay of Protein Antigen, Immunoglobulin-G, By Means of Enzyme-Labelled Antigen and Antibody- Coated Tubes. Biochem. Biophys. Acta., 25: CDC/NIH Interagency Working Group BioSafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 3rd edition. U.S. Dept. of Health and Human Services, Public Health Service. pp Drew, W.L Diag. Med. 6: Lennete, E.T. Manual of Clinical Microbiology. 5th ed. Chapter Okano, M Clinical Microbiology Reviews. Epstein-Barr Virus and Human Diseases. Recent Advances in Diagnosis. Vol., p Baltz, M Identifying Stages of EBV Infection. In: American Clinical Lab. pp Ambinder, R.F., Mullen, M., Chang, Yung-Nien, Hayward, G.S., and Hayward, S.D. 99. Functional Domains of Epstein- Barr Virus Nuclear Antigen EBNA-. Journal of Virology, ASM. Vol. 65, No.3, pp Davidsohn, I Serologic Testing of Infectious Mononucleosis. Journal of American Medical Association. 83: Evans, A.S History of Infectious Mononucleosis. In: American Journal of Medical Science. 267: Lennette, E.T Herpesviridae: Epstein-Barr Virus. In: Laboratory Diagnosis of Infectious Diseases, Principles and Practice. Vol. II. Lennette, E.H., Halonen, P., Murphy, F.A., eds. Springer-Verlag, NY. pp Bakerman, S. 98. Enzyme Immunoassays. Lab. Mgmt. August, pp Voller, A. and D. E. Bidwell, 972. Brit. J. Exp. Pathology 56 : R. Sohier, R.J. Freund, G. de-thι, N.E. Day, A. Geser and G. Denhaut Seroepidemiology of Herpesvirus Type Epstein-Barr in Blood Donors from Communities around Lyon. American Journal of Epidemiology. Vol. 99, No.6, pp

10

11 TRINITY BIOTECH USA, 2823 Grits Road, Jamestown, NY, 47 TRINITY BIOTECH, Bray, Co. Wicklow Ireland Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 9243 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 () Fax. : +33 () /4